（食品科学专业论文）中国林蛙抗菌肽分离鉴定、cDNA克隆及其原核表达载体的构建.pdf

中国林蛙抗菌肽分离鉴定、c d n a 克隆及其原核表达载体的构建 中文摘要 背景与目的； 抗菌肽( a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ) 又叫抗微生物肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ) ，肽抗 生素( p e p t i d ea n t i b i o t i c s ) ，是由1 0 - 5 0 个氨基酸残基组成，常带正电荷，并具有广谱抗菌活 性的小肽，是生物先天免疫系统的重要组成部分。两栖动物皮肤裸露、潮湿，这无疑给微 生物提供了一个极好的生存环境。但在长期的自然选择过程中，它们逐渐形成了防御机制， 即由背部及腹部皮肤的分泌抗菌类物质来抵御有害环境因子的侵袭。蛙类皮肤生物活性肽 是抗菌肽家族的重要成员，其不但种类繁多，而且数量庞大。通过结构与同源性分析表明 这些抗菌肽属于m a g a i n i n 、b o m b i n i n 、b o m b i n i n - l i k e 、b r e v i n i n ，e s c u l e n t i n 、r m m m e r i n 、 t e m p o r i n 、r a n a l e x i n 、a u r e i n 、c a e r i n 和c i t r o p i n 等抗菌肽家族。两栖类抗菌肽具有高效、 广谱的抗菌作用，且不易产生耐药性等特点，其这些特性激起了人们极大的兴趣，在耐抗 生素病原菌株不断出现的今天，抗菌肽有望成为新一代的临床抗菌药物。本研究已成功克 隆中国林蛙抗菌肽基因全长c d n a 序列，在g e n b a n k 中进行登录( 登录号：d q 6 7 3 1 0 5 ) ， 并采用生物信息学的方法对核酸序列以及氨基酸序列进行分析，进而对蛋白的结构和功能 进行预测、分析，为中国林蛙抗菌肽分子生物学水平研究奠定了基础。同时，将编码成熟 抗菌肽基因序列亚克隆至原核表达载体p g e x - 3 x 中，构建重组表达质粒进行i p t g 诱导表 达。 方法：( 1 ) 利用反相高效液相色谱( r e v e r s ep h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y r p h p l c ) 和质谱( m a s ss p e c t r o m e u 7 ) 检测技术对中国林蛙皮肤分泌物中抗菌肽进行分 离纯化和分析，并以革兰氏阴性菌大肠埃希氏杆菌( g e c o l i ) 和革兰氏阳性菌金黄色葡 萄球菌( g + s a u r e u s ) 为测试菌株，通过琼脂扩散法对分离出的多肽进行抑菌活性测定。应 用e d m a n 降解法对有抑菌活性的多肽物质进行结构鉴定。( 2 ) 以n 末端氨基酸测序结果 ( m m 依k s m l l ) 为递交序列，结合n c b i 中b l a s m 比对结果设计蛙属抗菌肽简并引物。 ( 3 ) 采用异硫氰酸胍法在无的环境条件下制备中国林蛙皮肤组织总r n a ( 4 ) 以提 取的中国林蛙皮肤总r n a 。 为模板，采用3 r a c e ( r a p i d a m p l i f i c a t i o no f c d n a e n d s ) 技术进行中国林蛙抗菌肽基因 的c d n a 克隆，测序分析。同时，运用生物信息学软件对其全长e d n a 序列进行阅读框架、 同源性比较和相关的生物学功能分析。( 5 ) 根据e d n a 克隆所获得的中国林蛙抗菌肽基因中 编码成熟肽的序列设计合成引物，以全长e d n a 序列为模板，通过p c r 扩增，获得带有限制 性酶切位点的目的片段。( 6 ) 采用t a 克隆法将目的序列插, 入p n i d l 8 - ts i m p l e 克隆载体，测 序，正确后将酶切的目的序列亚克隆至经相应限制性内切酶消化处理的原核表达载体 p g e x - 3 x 上，构建原核重组表达载体。将重组表达质粒转化至大肠杆菌b l 2 1 感受态细胞中， 用彤i g 进行诱导表达，采用s d s - p a g e 电泳进行分析检测。 结果：( 1 ) 应用r a c e 技术成功的获得了一条中国林蛙抗菌肽基因的全长c d n a 序列。 序列全长为2 9 7 b p ，其中包括2 1 3 b p 完整的开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m eo r f ) ，含有 8 4 b p 的3 非转译区( 3 u t r ) ，推测编码7 1 个氨基酸的多肽，分子量( m w ) 为7 8 1 0 9 d a ， 等电点( p i ) 为5 0 8 。经生物信息学分析表明，中国林蛙c a m p s - 3 氨基酸序列n 末端均含 有一个相对保守的由2 2 个氨基酸组成的信号肽( s i g n l ep e p t i d e ) 序列，还包含有一个拷贝 由个3 3 氨基酸组成的成熟肽( m a t u r ep e p t i d e ) ，在信号肽和成熟体之间，是一段富含酸性氨 基酸的酸性间隔序列( a c i d i cs p a c e rd o m a i n ) 。经同源性分析，在氨基酸水平的同源性高于 核苷酸水平的同源性，该序列已被g c n b a n k 收录，登录号为d q 6 7 3 1 0 5 ( 2 ) 将编码成熟 肽的目的序列亚克隆至p m d i s - ts i m p l e 克隆载体中，经测序显示其编码氨基酸序列与原始 序列完全一致。将酶切后的目的序列插入p g e x - 3 x 原核表达载体中构建重组表达质粒 p g e x - c h e n s i r i n - 3 ，经i p t g 诱导后。表达出相对分子质量为3 0 k d a 的g s t 融合蛋白 结论：( 1 ) 从中国林蛙皮肤组织中分离出一条新的编码抗茵肽前体c a m p s 3 的全长c d n a 序列，经n c b i 网站中的b l a s t p 服务器分析发现与r a n a m e f i n 和b r e v i n i n 家族抗菌肽具有较 高的同源性，分别为9 0 - 7 2 ，7 0 - 5 3 。( 2 ) 成功的构建重组融合蛋白表达质粒 p g e x - c h e n s i r i n - 3 ，经诱导，表达出分子量为3 0 k d a 融合蛋白。为迸一步研究两栖类抗菌肽 的抑菌机制及高效表达奠定了基础 关键词；中国林蛙抗菌肽e d n a 克隆重组质粒 a b s t r a e t t h ei s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o n ，e d n ac l o n i n gf r o mc h i n 鹪ef o r e s tf r o g ， r a n ac h e n s i n e n s i sa n dt h ec o m t m c t i o no f e x p r e s s i o nv e c t o r b a c 蛔r o u n d & o b j e c t i v e a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sn a m e da n t i m i c r o b i a lp e p t i d e so rp e p t i d e a n t i b i o t i c sm et y p i c a l l y1 0 - 5 0a m i n oa c i dr e s i d u e sl o n g a m p st h a ta t ec o n s i d e r e dt ob enm a i n e l e m e n to fi n n a t ei m m u n i t y , a r enk i n do fs m a l lm wc a t i o n i cp o l y p e p t i d ew i t hb r o a d - s p e c t r u m g r o w t h - i n h i b i t o r ya c t i v i t y a m p h i b i a n s 雠c o n s t a n t l ye x p o s e dt om u l t i p l eh a r m f u lm i c r o b e s , t h e c a p a c i t yt oo v e r t i m ei n f e c t i o n si se s s e n t i a lf o rt h e i rs u r v i v a la n d , t h e r e f o r e , t h e y 狮e n d o w e d w i t h 觚e x c e l l e mc h e m i c a ld e f e n s es y s t e mc o m p o s e do fp h a r m a c o l o g i c a la n da n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s ac o n s i d e r a b l ev a r i e t yo fe n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sh a v eb e e nc h s r a c t e r i z e df r o m a m p h i b i a n s t h es k i ng i a | mo fa m p h i b i a na c t sa l li m p o r t a n tr o l ei ns y n t h e s i z i n ga n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sf r o mm a m l l l a l sa r el e s st h a na m p h i b i a ns k i np e p t i d e s , n o to n l y i nc a t e g o r y , b u ta l s oi nq u a n t i t y t h ef o r e i g nc o u n t r yh a ss t u d i e do l ld e f e n s i v es k i ns e c r e t i o n so f a m p h i b i a n sf o rf o r t yy e a r so v e r5 0 0s p e c i e s i np r e s e n t , t h ef r o g - s k i na c t i v ep e p t i d e s 丘帆 x e n o p u sa n dp h y l l o m e d e s aa m o r et h a no t h e rs p e c i e s u pt on o wt h e r ew e r eal o to f a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sf a m i l y , i n c l u d em a g a i n i n , b o m b i n i n , b o m b i n i n - l i k e ，b r e v m 砜e s c u l e n t i n , p 溘m t u e a n , t a m p o d r e n a l e 嫡n , a u r e i i i c a e r i na n dc i t r o p i n av a r i e t yo fb i o - a c t i v es u b s 如啪= c 嚣 f r o ma m p h i b i a ns k i n sw h i c hp l a y 强i m p o r t a n tr o l ei nd e f e n s ea g a i n s ti n v a d i n gf a c t o r sh a v e a t t r a c t e ds i g n i f i c e n ta t t e n t i o no ft h er e s e a r c h e r sa l lo v e l t h ew o r l d , n o to n l yh i g ha n t i m i c r o b i a l a c t i v i t i e s , w i d ea c t i 嘶s p e c t r u m , b u ta l s on o te a s yt oi n d u c er e s i s t a n tp a t h o g e n i cs t r a i u s d u r i n g t h ep a s td e c a d e , t h ee m e r g e n c eo fm u l t i p l e - d r u gr e s i s t a n ts t r a i n so fm a n yp a t h o g e n i c m i m o - o r g o n i s m sh a ss t i m u l a t e dt h es e a r c hf o rn e wc l a s s e so fa n t i m i c r o b i a lc o m p o u n d st h a tm a y h a v ec l i n i c a la p p i i c a t i s f o rt h ep r e s e n ts t u d y , an o v e la n t i m i c t o b i a lp e p f i d e sg a n e ( ( 妇l b 锄k a c c e s s i o nn u m b e r ：d q 6 7 3 1 0 5 ) w a sc l o n e df r o mc h i n e s ef o r e s tf r o g , r a n ac h e n s i n e n s i sb y3 r a c e w eu s eb i o i n f o r m a t i c sm e t h o dt oa n a l y s e st h en u c l e o t i d es e q u e n c e sa n da m i n oa c i d s e q u e n c e s , t op r e d i c tt h es t r u c t u r ea n dt h ef u n c t i o no f p r o t e i na n dc l o n e dt h ec o d e ns e q u e n c e so fm a t u r ep e p t i d e si n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o ro f p g e x - 3 xt oc o n s t r u c tr e c o m b i n a t i o np l a s m i dt o f u s i o ne x p r e s s i o n s e tf o u n d a t i o nt os t u d yo nt h el e v e lo f m o l e c u l a rb i o l o g y m e t h o d s ( 1 ) t h ep e p t i d e so ft h es e c r e t i o no fr a n ac h e n s i n e n s i sw c r cp u r i f i e db y r e v e r s e - p h a s eh i g h - p r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n dc h a r a c t e r i z e db ya m i n oa c i da n a l y s i sa n d e l e e t r o s p r a yi o n i z a t i o nm 黜s p e c t r o m e t r y a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw a se x t o r t e db yt h er a d i a l d i f f u s i o na s s a yd u r i n gt h ep e p t i d e sp u r i f i c a t i o np i o c e d u m ，s i n gt h eg m m i l e 雩【a t i 、略b a c t e r i a e s c h e r i c h i ac o l ia n dg r a m - n e g a t i v eb s c “g f i ms t a p h y l o c o c c u sa u 糟u sa st h et e s to r g a n i s m t h e p r e s e n c eo fp r e d i c t e dp e p t i d es l z u c t o r e si ns k i n $ e c - r 嘶o u sw a sc o n f i r m e db ya u t o m a t e de d m a n d e g r a d a t i o n ( 2 ) u s i n gt h e i ra m i n oa c i d ss e q u e n c eo fn - t e r m i n a t i oa ss u b m i t t i n gs e q u e n c e , t h e b l a s t 翻；v e fw a sa p p l i e dt o 删e v ca m p h i b i o t i ca n t i m i c r o b i a lp e p t i d e si nt h ep r o t e i nd a t a b a s e 幻d e s i g nad e g e n e r a c yp r i m e r ( 3 ) i nt h er n a s e 墙r e ec o n d r i o n ，t h et o t a lr n a o ft h es k i no f c h i n e s ef o r e s t f r o gw 鹬p r e p a r e db yg u e n i d i n et h i n c y a n a t e ( 4 ) t h ec d n as e q u e n c eo f a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sg e n ew a sc l o n e db yt h e3 r a c e ( r a p i da m p f i f i c a t i o no f c d n ae n d s ) a n dt h et o t a lr n ao ft h es k i no fc h i n e s ef o r e s tf r o gw a su s e da sc l o n i n gt e m p l a t e t h e b i o i n f o m m f i c s $ o f t w u ew a sa p p l i e dt oa n a l y s i st h ec d n as e q u e n c et h a tw a ss u b m i t t e dt o g e n b e n kb yt h et o o lo fb a n k i ti nt h en c b i s u c hi t so p e nr e a d i n gf l a l l l l g , h o m o l o g ya n d c o r r e l a t i v eb i o l o g i c a lf u n c t i o n ( 5 ) a c c o r d i n gt ot h ef u l l - l e n g t hc d n as e q u e n c et od e s i g na n d s y n t h e s i st h ep r i m e r ，w eu s e dp c ra m p l i f i c a t i o nt og e tt h e j u s ts e q u e n c et h a ti si n c l u d en o - s i g n a l p e p t i d e sw i t ht h es i t eo fr e s t r i c t i o n , & q l z y n l o ( 6 ) t h et a r g e ts e q u e n c ew a si n s e r t e di n t ot h e p m d l 8 - ts i m p l ec l o n i n gv e e t o rb yt ac l o n i n g a r e ri d e n t i f i c a t i o nb ys e q u e n c i n g ，t h ed i g e s t e d d n aw a sc l o n e di n t op r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp g e x - 3 xt oo d n s u u c tr e c o m b i n a t i o n p l a s m i d , e x p 他- s s e di n 晟c o b l 2 1u n d e ri n d u e t i o no f 邛t ga n di d e n t i f i e db ys d s - p a g e r e s u l t s ( 1 ) ap e p t i d ew i t hj m t i m i c r o b i a la c t i v i t yw 酗p u r i f i e df r o mt h es k i ns e 删o l l so f r a n ac h e n s i n e n s i sb y r e v e r s e - p h a s eh i g h - p r e s s m 蟹l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p - h p l c ) ( 2 ) h i g h - q u a l i t yt o t l er n aw a sp r e p a r e db yb yg u a n i d i n et h i o c y a n a t e ( 3 ) af u l l - l e n g t hc d n a s e q u e n c e ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r ：d q 6 7 3 1 0 5 ) o ft h ea n t i m i c r o b i a lp e p t i d e so fr a n a c h e n s i n e n s i sw 酗c l o n e db y3 r a c e t h ec d n ac o n s i s t so f2 9 7 b pw i t h2 1 3 b po p e nr e a d i n g f l a m ee n c o d i n g7 1a m i n oa c i d sw i t h7 8 1 0 9 d a ( p i - - 5 0 s ) e n d8 4 b p3 u t r a c c o r d i n gt ot h e a n a l y s i so fb i o i n f o r m a t i c ss o f l w m - e , t h ec o n s e r v e dp r e p r o r e g i o nc o m p r i s e sah y d r o p h o b i cs i g n a l p c p t i d e0 f 2 2r e s i d u e sf o l l o w e db ya1 6r e s i d u ea c i d i cp r o p i e c ew h i c ht e r m i n a t e sb yat y p i c a l p r o h o r m o n ep r o c e s s i n gs i g n a ll y s - a r g , i n c l u d e do n ec o p y3 3r e s i d u ea c i d i cm a t u r ep e p t i d e ( 4 ) t h ed n a s e q u e n c ee n c o d i n gm a t u r ep e p t i d e , w a ss u c c e s s f u l l yc l o n e di n t ot h ep m d l 8 - ts i m p l e c l o n m gv e c t o r , a n dt h e ni n s e r t e di n t op g e x - 3 x t h eg s tf u s i o np r o t e i nw i t hr e l a t i v em o l e c u l a r w e i g h to f 3 0 k d a , w a se x p r e s s e di nt h ec o n s t r u c t i o np r o k a r y o t i cv e c t o r c o n c l u s i o n ( 1 ) t h eu o v c lf u l l - l e n g t hc d n ao fa n t i m i e r o b i a lp e p t i d ec a m p s 。3h a sc l o n e d f r o mc h i n e s ef o r e s tf r o g , r a n ac h e n s i n e n s i s i th a r ea b o u t 9 0 - 7 2 ，7 0 5 3 i d e n t i t yw i t ht h e c o r r e s p o n d i n gl e g i o n so fr a n a t u e r i na n db r e v i n i n ，r e s p e c t i v e l y ( 2 ) t h eg s tf u s i o np r o t e m0 0 k d a ) w a se 砷r e s s e di ni ne c o b l2 1u n d e ri n d u c t i u no f i p t g k e yw o r d sr a nc b e m i n e n s l sa a f l m k r e b l a lp e p t i d e e d n a c l o n i n g r e c o m b i n a n tp l a s m i d s 宣签窒些銮鲎塑主兰篁丝塞 主望茎墼垫堕然坌壹釜塞：! 竺苎塞墼基堡塾壅茎茎堡箜垫蕉 缩略词英汉对照表 缩写 英文全称中文全称 a m pa m p i c i l l i n氨苄青霉素 a m p s a i 删涮m p 印咖a 抗菌肽 c d n a c o m p l e m c u m r y d n a 互补d n a d f a c d i e o 时lp y r oc a r b o r e 焦磷酸二乙酮 e 日白c 南酬裱址c 0 4 1 大肠埃希氏蕾 0 十g i 坤硒wb a j 曩革兰氏阳性蕾 g - g i m 锗嘣 h 阳i i革兰氏阴性笛 o 炒o b c i 甘氨酸 g s tg l u 纽t hg l u t a t h i s 椭m 自 谷胱甘肽s - 转移爵 i p t g h c 嗍 蛐i o 列t o l 聊如o s i d c异丙基一8 一d 一碱代半乳糖苷 l b蛐b c 咖i m e d i m 胰蛋白腺酵母提取物培养基 o d 0 1 吨i c 幽n 蝣妒光密度 o r f o p a l 鼬a d i 岵f 劬e 开放阅读框架 p c r 粕蛳m e c h 血删聚合酶链反应 r a c e r 印i d 柚叫壤c m 阻o f 删a d s c d n a 末靖快速扩增 r t - p c r i r , e v a , s e 柏m 廿i p i 越p 0 忉m s c h a i n r m a i o n反转录一聚合酶链式反应 & 删，咖瓯叫纠缸矗何埘胛螂金黄色葡萄球菌 s d s - p a g e s d s - p o l y a c t y l a m i d c 窖dd 帅p h 商ss d s - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 t e t d s - e d t a - n a c ib 山f e r t r i s - e d t a - n a c i 缓冲藏 t e m e d w n n j r - t a r a m c t h y l d 螂r l e d i 锄i 脯n ，n 。n 。n - 四甲基乙二胺 t d s 埘曩0 啪m 哪m 嘶d 蚰血咖删h 蛳三羟经甲基氨基甲烷 阳l 纠，f d m 0 4 吐l 鳅卜，- i n i i 口妒l 争阻孕l 喇。鳓出孓淡车氯- 3 吲e 舡争m 半乳薯苷 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文巾不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使_ j 过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 学位论文作者签名： 嚯g 签字日期： 埘7 年，月卵 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印，缩印或扫描等复制下 段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名：懦茑 签字日期：御年厂月，角 别币等施西州吣耿) 。i 签字眺叩年月确 1 抗菌肽简介 刖再 抗菌肽恤l t i b a c i 硝a lp e p t i d 筋，m 皿s ) ，又称抗微生物肽( p e p t i d ea n t i b i o t i c s ) ，广义上是 指存在于生物体内具有抵御外界微生物侵害，清除体内突变细胞的一类小分子多肽，被认 为是从细菌到昆虫乃至高等哺乳动物体内均普遍存在的一类防御性多肽是生物先天免疫防 卫系统的一个重要组成部分。称之为“第二防御体系和“第二免疫体系”。在诱导条件下， 动物免疫防卫系统产生一类对抗外源性病原体的防御性阳离子肽类活性物质，是生物先天 免疫防卫系统的一个重要组成部分 抗菌肽分子量相对较小，一般小于1 0 k d a ，由基因编码、核糖体合成【l 】，其理化性质 稳定、水溶性好、热稳定、广谱抗菌、抗病毒、抗癌能力，并具有活性浓度低，无致畸变 作用，无蓄积毒性、不易引起病原产生耐药性等优点 2 4 1 ，是理想的抗生素替代品。 不同来源、不同结构的抗菌肽的一级结构( 即氨基酸序列) 具有较强的保守性，且具有以 下共同特点：| n 端富含极性氨基酸，这一特征使抗菌肽具有表面活性剂活性；绝大多 数抗菌肽的第二位氨基酸残基是t r i o ，它对抗菌肽杀菌活性的高低起着至关重要的作用； c 端通常酰胺化，可能与抗菌肽的广谱抗菌活性有关；抗菌肽中间富台 p r o ，直接影响抗 菌肽的杀菌活性1 5 l 。 对抗菌肽分类有很多种方法。根据抗菌肽的来源，可以将其分为哺乳动物抗菌肽、两 栖类抗菌肽、昆虫抗菌肽、鱼类抗菌肽、贝类抗菌肽，原索动物抗菌肽、鸟类抗菌肽、植 物抗菌肽和原核生物抗菌肽等。根据结构不同可把抗菌肽分为5 类：逗) 单链无半胱氨酸( c y s ) 的抗菌肽，或由无规则卷曲连接的两段a - 螺旋组成的肽。该类包括天蚕素c e e r o p i n s ， m a g a i n i n s 等。m a g a i n i n s 最初是从非洲爪蟾的皮肤中发现的 0 1 富含某些氨基酸残基但 不含c y s 的抗菌肽。富含脯氨酸( p r o ) 或甘氨酸( g i y ) 残基的抗菌肽。如鞘翅肽 c o l e o p t e r i c i l l 和半翅肽h e m l p t e r i c l n 的全序中富含g i 妒。含一个二硫键的抗菌肽，该二硫 键的位置通常在肽链c 端。如爪蟾皮肤细胞中产生的b 懒，i n i l i 妒。包含两个或两个队上 二硫键，具有争折叠结构的抗菌肽。如绿蝇防御素( p h o r m i n d e f e n s i n ) ，分子内有6 个c y s 形成3 个分子内二硫键，肽链c 末段是带有拟p 转角的反向平行的p 片层田。实验证明，分 子中的二硫键在其抗菌作用中至关重要。 2 两栖类抗菌肽的研究概况 许多研究表明蛙类皮肤中存在大量的抗菌肽类物质。蛙类是两栖纲中形态比较特殊的 一个类群，它们分布广泛，除南极外全球均有分布，以温差小而湿度大的热带、亚热带为 多【9 ，埘。蛙类皮肤裸露、潮湿，这无疑给微生物提供了一个极好的生存环境。但在长期的自 然选择过程中，它们逐渐形成了独特的防御机制，即由背部及腹部皮肤的分泌物来抵御有 害环境因子的侵袭。两栖类的防御系统共有三种：物理屏障，粘液腺分泌大量糖蛋白和 蛋白聚糖形成“多肽网”( p o l y p e p t i d e m e s h ) 1 1 】，包裹于皮肤外表面从而构成一道天然屏障，阻 碍病原菌的侵入；获得性免疫系统，两栖动物皮肤中含有抗体i g g 【1 2 j ；先天免疫系统， 主要由大量的抗菌肽构成。分泌物的主要成分是多肽，包含神经肽、毒素、麻醉剂、激素、 抗微生物和抗真菌剂等i l 1 4 1 2 1 两栖动物皮肤 两栖动物的皮肤除具有体温调节、水分调节、排泄、呼吸、繁殖以及伪装等功能外【l 卅， 还可以抵抗和防御栖息环境中的病原微生物和食肉动物的侵袭【幡1 9 1 。两栖动物皮肤为双层 结构，即表皮( e p i d e r m i s ) 和真皮( d e r m i s ) 。真皮层中存在多种腺体和腺体聚集体，主要包括 粘液腺( m u c u s g l a n d ) 和颗粒腺( g r a n u l a r g l a n d ) 。粘液腺外形比颗粒腺小，数量则远较颗粒腺 多，大概是颗粒腺数目的十倍，周身体表都有分布，尤其背部分布很密。粘液腺分泌出清 澈粘液的主要成分是糖胺聚糖和蛋白聚糖 2 0 , 2 ，其覆盖在身体表面形成一层湿润的薄膜， 具有防御、繁殖、保湿、皮肤呼吸、温度调节、p h 调节等作用。粘液颗粒腺形体较大，分 布不均匀，在头部、肩部、背部、尾部分布较多。颗粒腺可在局部聚集形成特殊的腺体结 构 2 2 , 2 3 。颗粒腺上皮细胞之间无明显的界限，细胞之间也没有桥粒等连接，因而一般认为 颗粒腺上皮细胞为合胞体( s y n c y t i u m ) 2 2 两栖动物抗菌肽发现和分离 在无尾两栖动物中，人们很早就发现其皮肤中含有大量的生物活性物质1 9 7 0 年， c s o r d a s 等在研究欧洲铃蟾皮肤分泌物中的向性细胞性物质( c y t o c o p i cs u b s t a n c e s ) 时发现 了第一个具有溶血作用的蛙皮抗菌肽b o m b i n i n l 2 4 ； 1 9 8 7 年，z a s l o f f 从非洲爪蟾的皮肤分 泌物中提取得到m a g a i n i n 蛙皮抗菌肽。迄今为止，国外对蛙类分泌物中生物活性肽的研究 2 有4 0 多年的历史，涉及5 0 0 多种蛙类。据不完全统计，目前已经从无尾两栖动物铃蟾属 ( b o m b i r m ) 、肛褶蛙属( k a s s l , m ) 、雨滨蛙属c l i t o r i a ) 、时泡蛙屡( p h y l l o m e d u s a ) 、多指节蟾属 ( p s e u d i s ) 、蛙属( r a n a ) 、耳腺蟾属( u p c l e i a ) 、爪蟾属( x e o p u s ) 8 个属约4 0 多种的皮肤中提 取出了抗菌肽。研究发现蛙类含有种类繁多的生物活性多肽，其中非洲爪蟾属( x e n o p u s ) 和 叶泡蛙属( p h y l l o m e d u s a ) 两栖动物体内生物活性多肽尤为丰富 2 5 2 6 1 。目前发现的蛙类抗菌 肽家族很多，主要有m a g a h 吐n 、b o m b i n i n 、b o m b i n i n l i k e 、b r e v i n i n 、e s c u l e n t i n 、r a n a m e r i n ， t e m p o r i n 、r a n a l e x i n 、a u r e i n 、c a e r i n 和c i t r o p i n 家族等 2 7 * 3 2 3 两栖类抗菌肽的种类 由于两栖类皮肤抗菌肽的分子结构具有复杂的多样性，因此很难找到一种涵盖众多抗 菌肽的分类方式。目前，简单地从结构上可以分为两大类，一类为线性a 螺旋多肽，它们 不舍二硫键，如来源于非溯爪蟾的m a g a i n i n ( g i g k f l h s a k k f g k a f vg e i m n s ) ；另一类 是具有一个二硫键的环性肽，含有分子内二硫键，如在r a n at i g e r i n a 皮肤分泌物中发现的 九环肽t i g e f n i n 3 2 。 2 4 两栖类抗菌肽的分子结构 蛙皮抗菌肽一般由1 1 个氨基酸残基( 如t i g e m i n - 1 ) 到4 7 个氨基酸残基( 如p m u s t f i n - 3 a ) 构成。些来源于b o m b i n a 属的抗菌肽如b o m b i n i nh 含有d 氨基酸；5 0 左右的这些抗菌 肽c 一端酰胺化；部分两栖类抗菌肽含有两个半胱氨酸残基，形成含一个二硫键的分子。 除t i g e r n i n - 1 分子的二硫键包含9 个氨基酸残基，j a p o n i c i n - 2 分子的二硫键包含8 个氨基酸 残基外，其余蛙皮抗菌肽分子的二硫键都只包含7 个氨基酸残基。几乎所有的蛙皮抗菌肽 分子都含有较多的亮氨酸和异亮氨酸残基，因此决定了蛙皮抗菌肽的疏水特性；同时也含 有一些精氨酸和赖氨酸残基，因而又是阳离子肽。绝大多数肽分子在水溶液中为无规则卷曲 构象，不容易形成二级结构，但在亲脂性溶液( 如5 0 的三氟乙醇溶澜中或与带负电荷的 微生物细胞膜表面接触时，由于电荷相互作用，多数氨基酸残基形成两亲洳螺旋 3 3 - 3 6 。 2 5 两栖类抗菌肽的生物学功能 幺5 1 抗菌活性 3 目前发现的蛙类抗菌肽家族很多，如来源于非洲爪蟾( x e n o p u s l a e v i s ) 的抗菌肽m a g a i n i n 家族就是一类广谱抗菌肽，对于革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌、酵母以及原生生物都具 有抑制作用。赖仞等从棕点湍蛙( m f o u s - s p o t t e dt o r r e n tf r o g ) 皮肤分离纯化出来的 b r e v i n i n s - 札对于大肠埃希氏( g ，e s c h e r i c h i ac o i l ) 、痢疾杆菌( g - ，b a c i l l u sd y s e n t e r i a e ) 、 金黄色葡萄球菌( g + ，s t a p h y l o c o c c u s8 u r e t i $ ) 和真菌中的白色念珠菌( c a n d i d aa l b i c a a s ) 均有 较好的抑制作用，最小抑菌浓度分别为5 5 0 g m l 、6 5 0 1 g m l 、2 2 0 i i g m l 和7 5 0 p g m l 哪j 。 大多数抗菌肽都是碱性多肽，很容易与酸性膜层状排列的脂质双分子层相结合，依靠舡螺 旋结构的特点形成跨膜通道，介导一系列的生物效应 3 s , 3 9 。j a c o b 等认为抗菌肽是依靠两亲 的伽螺旋结构作用于细菌细胞膜的层状捧列的脂质双分子层，使细菌的细胞膜破裂，并最 终导致细菌细胞壁的溶解【钟】。 2 5 2 抗肿瘤活性 s o b a l l e 等观察到抗菌肽m 赡a i l l i i l 也显示出一定的抗癌活性1 4 抗菌肷的抗癌机理与抗 菌机理类似，抗菌肽对癌细胞的作用主要是使癌细胞膜上形成孔洞，内容物外泄，线粒体 出现空泡化，峭脱落，核膜界限模糊不清。有的核膜破损，核染色 a k d n a 断裂，并抑制染 色同k d n a 的合成，细胞骨架也受到一定程度的损伤洲。抗菌肽对正常哺乳动物细胞及昆虫 细胞无不良影响，但对癌细胞株有明显杀伤作用。抗菌肽还可以调节机体的免疫机能，增 强机