（环境工程专业论文）活性污泥中产氢细菌的筛选及其产氢特性研究.pdf

活性污泥中产氢细菌的筛选及其产氢特性研究 摘要 能源短缺以及由能源生产、消费引起的环境污染问题成为2 1 世纪人类面临 的两大难题，寻找清洁能源已是当前的紧迫任务。h 2 因其无色、无味、无毒且 燃烧后仅生成h 2 0 而被认为是理想的清洁能源。生物制氢是通过微生物发酵或 者光合作用，在生理代谢过程中产生分子氢。暗发酵细菌产氢是一种具有直接应 用前景的生物制氢技术，其反应在常温常压、接近中性的温和条件下即可进行， 而产氢研究的热点之一就是高效暗发酵产氢细菌的筛选。 本文以木薯淀粉废水厌氧处理过程中的活性污泥为对象，探讨酸处理( 不同 酸处理p h 值和不同酸处理时间) 对污泥产氢性能和发酵特性的影响。以期获得 适宜的酸处理条件，为降低处理能耗和相关技术研发提供参考依据。厌氧活性污 泥经过酸处理后，发酵产氢活性均得到增强。最佳的酸处理条件为调整污泥p h 为4 0 放置o 5h ，以葡萄糖为碳源，在初始p h 为7 0 条件下，经过4 8h 发酵， 污泥的产气量和产氢量最高，比空白对照分别增加了1 4 0 和6 0 3 。 再利用三层平板厌氧培养技术，从活性污泥中成功分离筛选到一株暗发酵产 氢细菌d 2 。1 6 sr e i n a 基因序列测定表明，d 2 属于梭菌属。c ，d 册砌z 删s p d 2 的产氢现象一般发生在细胞生长的对数期的前期和中期；分析了p h 值、碳源、 起始糖浓度等因素对细菌产氢活性的影响，确定该菌株间歇发酵产氢的最佳条件 为：在培养液初始p h 为7 o ，葡萄糖浓度7 og l 时有较高的产氢能力，为2 1 3 1 lm l h 2 儋葡萄糖。菌株d 2 有较低的最适生长、产氢的葡萄糖底物浓度，可 减少发酵产氢的成本；其发酵产氢在初始p h 为中性条件时即可获得较高的产氢 量，也能大大提高菌株的使用。研究为优化该菌株产氢条件，并提高产氢性能奠 定了基础。 关键词：木薯淀粉厌氧污泥酸处理分离鉴定产氢特性 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e i u s t l c so f b i o h y d r o g e n p r o d u c i n gb a c t e i u u mf r o ma c t i 、厂a t e ds l u d g e a b s t r a c t i i lt h e2ls tc e n t l l 吼h u m a l lb e i n g sa r ef k i i l g 谢m 帆op r o b l e m s e n e t g ) ，s h o r t a g e 锄de n v 衲i l i l l e n t a lp 0 1 1 u t i o n h 2i sc 0 n s i d e r e da i li d e a lc l e a i le n e r g y ，b e c a u s eo fi t s c o l o r l e s s ，o d o d e s s ，n o n - t o x i ca i l dc o m b u s t i o np r o d u c t s m i c r o o 曙a n j s mc a np r o d u c e h 2t l l r o u g hm er n e t a b o l i s m ，w h i c hi sn o n - p o l l u t i o na t l dl o wc o s t h 灿g e n - p r o d u c i n g r e a c t i o no f 时kf e 彻e n t a t i v eb a c t e r i ac a nh 印p e nu | 1 d e rn o n n a lt e m p e 期n i r e ，i l o m a l a t m o s p h 出c 觚dn e u t 】mc o n d i t i o n s ，m e r e f o r c i t i sap r o l m s i n gb i o h y d r o g e n p r o d u c t i o nt e c l l i l o l o g y s c r e e l l i n gb i o h 班i r o g e n - p r o d u c i n gb a c t e r i ah a sb e e nh o t s p o t t bo b t 撕na p p r o p r i a t ea c i d 仃e a t m e n tc o n d i t i o n s ，r e d u c ee n e 理；) ，c o n s 啪p t i o na n d p r 0 v i d er e f e r e n c et 0m er c l a t e dt c c 腼q u e s ，t l l ee 仃i e c to fa c i dt r e a t m e n t ( p hv a j u ea 1 1 d t i m e ) o nc a s s a v as t a r c ha c t i v a t e ds l u d g ef o rh y d r o g e np r o d u c t i o nw e r ei n v e s t 追a t e d t 1 1 ea c t i v 时o f 仃e a t e ds l u d g ew a s 量l i 曲e rm 锄t h a to ft h eu 嘶e a t e d t h eb e s tc o n d i t i o n w 舔p ha t4 0f o ro 5h w i t l lg l u c o s ef o rc a r b o ns o u r c ea 1 1 di i l i t i a lp h a t7 0 ，s l u d g e y i e l d e dt 1 1 e 莎e a t e s tg a sp r o d u c t i o na i l dh y d r o g e np r o d u c t i o nm e r 4 8hf e m e n t a t i o n c o m p a r e d 、i t l lb l a l l l 【，i ti n c r e 硒e d14 o a i l d6 0 3 ，r e s 】p e c t i v e l y t h ea i l a e r o b i c 旬r a i l l i n gt e c h m q u e s 、e r ea d o p t e df o rb a c t e r i as c r e e 血g ，16 s r d n ag e r l es e q u e n c ed e t e m i l l i n ga 1 1 d 仃a i t so fb i o h y d r o g e n - p r o d u c t i n gb a c t e r i a d e t e 订n i n i n g a c c o r d i n gt ot l l ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，h y d r o g e nc o m m o l l l yo c c u ri nt h e e a d y0 rm i d d l ec e l lg r o 伽11 0 9 a r i t h i i ls t a g e u n d e rb a t c hc o n d i t i o n so fg l u c o s e c o n c e n t r a t i o no f7g l ，p ha t7 0c o l 均r 0 1 l e d ，t h eh i g h e rh y d r o g e ny i e l dw a s213 1 l m l g s ol o ws u b s 雠ec 0 n c e 蛐眦i o na 1 1 dn e 曲闭 c o n d i t i o nc a i lr e d u c e h y d r o g e n - p r o d u c t i n gc o s ta n dg r e a t l yi m p r 0 v et h eu s eo fs t r a i n ( 伽护z 击“所s p d 2 i i t h er e s e a r c hw a saf 0 删o no fo p t 抛g h y d r o g e n - p r o d u c t i n gc o n d i t i o l l s 锄d i i l l p r 0 v i i l gh y d r o g e ny i e l d k e yw o i m s ：c 弱s a v as t a r c h ；a 1 1 绷b i cs l u d g e ；a c i d 仃e a 缸i l e n t ；i s o l a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o n ；c l l a 】m t e r i s t i c so fh y d r o g e np r o d u c t i o n h i 淀粉活佳污泥中产氢细r 的筛选及产氢特性研究 1 1 引言 第一章绪论 能源是社会发展和国民经济的重要物质基础，也是国家战略安全的保障基 础。现代化的世界经济，主要得益于化石能源( 如煤炭、石油、天然气) 的广泛 应用。随着社会的进步和工业化程度的提高，人类社会对能源数量的需求越来越 多，对能源质量的要求也越来越高。根据b p 世界能源统计2 0 1 0 显示，世界 剩余资源量己不容乐观。截至2 0 0 9 年年底全球已探明的可采石油量( 包括油砂储 量等) 为1 3 3 3 1 亿桶，若以当年的开采速度计算，石油可开采4 5 7 年，而天然气 为6 2 8 年，煤炭为1 1 9 年。人类对化石能源的依赖不仅面临着能源枯竭的危险， 而且化石燃料燃烧释放出的c x h x 、c 0 x 、s o x 、烟雾、灰尘等有害物质造成了全 球性大气污染和温室效应。大气污染不仅会造成土壤酸化、植被破坏和粮食减产， 而且会引发呼吸道疾病，直接威胁着人类的身体健康。同时温室效应也使得地球 生态环境面临着严重挑战。能源短缺以及由能源生产、消费引起的环境污染问题 已经成为2 1 世纪人类面临的两大难题。因此，寻找可再生能源是当前的紧迫任 务，寻找清洁的可替代能源也就成为各国政府能源战略的主导政策。 在所有的可替代能源中，h 2 被认为最具吸引力的替代能源。h 2 燃烧产物为 水，没有其它任何污染物。其燃烧热值高，每千克h 2 燃烧产生的热量约为焦炭 的4 5 倍，酒精的3 9 倍，汽油的3 倍；能量密度大，为汽油的3 倍；热效率高， 比传统的化石能源高3 0 6 0 。h 2 有“未来石油 之誉，将对全球能源系统的持 续发展起到显著作用，并在全球生态环境中产生巨大的影响。h 2 作为一种极为 理想的“绿色能源 ，它已经引起了发达国家的高度重视，提出了“氢文化”理 念，并投入了大量人力和财力进行相关研究和开发。h 原子量为1 0 0 7 9 ，熔点为 2 5 9 1 4 ，沸点为2 5 2 8 7 ，是存在于自然界最丰富的元素，据估计其构成了 宇宙质量的7 5 。另一个巨大的氢资源库来源于微生物产氢。利用工农业废弃物 或有机废水直接发酵获取h 2 ，在未来的生物制氢中存在着巨大的潜力。因为蔗 糖、淀粉和果品等生产或加工过程中会产生大量有机废弃物和有机废水，其都可 以作为生物制氢的廉价原材料。 1 广西大掌硕士掌位论文淀粉活性污泥中产氢细童r 的筛选及产氢特性研究 目前h 2 的制备方法主要有电解法和化石燃料法，此外生物制氢法、光解法 等还处于研究阶段。据统计，h 2 的生产4 来源于电解，1 8 来源于煤炭，3 0 来源于重油和石油，4 0 来源于天然气【l ，2 】。 h y d r o g e np a t h w a y s 图1 1 制氢方法及氢的应用h 1 f i g il l1 1 1 ep r o d u c t i o np a t l l w a y s 锄da p p l i c a t i o n0 fh y d r o g ( 1 ) 电解水制氢法：即提供电能使水分解制得h 2 。其工艺简单，无污染， 效率在7 5 8 5 ，但耗电量大，每立方米氢气电耗约为4 5 5 5k w h 。目前主要 应用于工业生产过程中要求纯度高、用量不多的企业。 。 ( 2 ) 化石燃料制氢法：是当今制取氢气的最主要方法。将煤、石油、天然 气与水蒸气反应生成水煤气，然后将水煤气和水蒸气一同通过灼热的氧化铁( 作 催化剂) 生成二氧化碳和氢气，再经过气体分离即可得到h 2 。 ( 3 ) 生物制氢法：利用微生物自身的新陈代谢作用将水或有机质转化为h 2 ， 实现能源产出。 ( 4 ) 其他制氢方法：太阳能直接光电制氢；烃类热裂解法或等离子体法分 解制氢；氨裂解制氢；n 扭h 4 催化水解制氢；硫化氢分解制氢；辐射性催化剂制 氢；电子共振裂解水；陶瓷和水反应制氢等。 以上各种制氢方法中，除生物制氢法外，都需要消耗大量的电力或不可再生 资源，不仅使得h 2 生产成本偏高，而且在其制取过程中产生的污染物会对环境 造成破坏，不能从根本上解决能源短缺和环境污染等问题。而生物制氢具有不消 耗矿物资源、生产成本低和无污染等很多突出的优点，是一项符合可持续发展战 2 广西大等瞻暇士掌位论文淀粉活性污泥中产氢细菌的鲥f 选及产氢特性研究 略的新技术。 1 2 生物制氢技术的研究现状 从n a k 锄啪于1 9 3 7 年最早报道了生物产氢现象，到2 0 世纪7 0 年代第一 次世界性能源危机爆发，生物制氢以其独特的可行性和实用性受到了世界许多国 家的高度重视。2 1 世纪世界所面临的能源短缺和环境污染的双重压力，使得生 物制氢研究再度兴起。人们从获取h 2 的角度进行各种生物产氢类型和产氢技术 的研究，现代生物技术在生物制氢领域的应用，进而推进了生物制氢技术的快速 发展。 1 2 1 生物制氢技术 生物制氢是指利用微生物自身的新陈代谢作用将水或有机质转化为h 2 ，实 现能源产出。根据微生物种类及其产氢途径的不同，生物制氢法可分为藻类产氢、 光合细菌产氢和暗发酵细菌产氢。有关光合细菌产氢研究国外报道的较多m ， 国内学者也开展了这方面的研究【8 。1 0 】。相比，特别是9 0 年代之后，国内对暗发 酵产氢的研究处于国际前列【1 1 1 3 1 ，已完成了暗发酵产氢的中试研究【1 4 耶】。 ( 1 ) 藻类产氢 藻类的研究始于2 0 世纪3 0 年代。 藻类产氢就是通过藻类的光合作用系统及其产氢酶系将水分解为h 2 和氧 气，且在产氢过程中无二氧化碳生成。根据所用酶系的不同，分为固氮酶产氢、 可逆产氢酶产氢。其光合作用路线图见图1 2 。 藻类产氢过程：h 2 0 p s l i p s l f d h y d r o g e n a s e h 2 。 上 o ， 3 广西大掌硕士掌位论文淀粉活性污泥中产氢细菌的鲥i 选及产氢特性研究 低 蠢 图1 2 藻类光合作用路线 f i g 1 2p o t o s y n t l l e s i so fh y d r o g e n - p r o d u c t i n ga l g a l 藻类进行光合作用时首先是利用其类囊体膜表面的捕光色素吸收光能，吸收 的光能传递到p h o t o s y s t e m i i 的反应中心后将水分解旷和0 2 ，释放e ( 太阳能被 固定) 。接着e 。在类囊体膜电子传递链上经过以细胞色素b 复合体( c ”b c o n l p l e x ) 和p h o t o s y s t e m i 为主的电子传递体后，再传递给铁氧还原蛋白 ( f e n e d o x i n ，f d ) ，并还原n a d p + 产生n a d p h 。同时，在电子传递过程中细胞 质或叶绿体基质里的一会被跨膜运输到类囊体腔中，形成矿梯度。类囊体腔中 的旷再经过位于类囊体膜上a t p 合成酶转运回细胞质或基质，随后在酶的催化 作用下形成h 2 。 近年，人们发现了许多能够应用于产氢的藻类。莱茵衣藻劬，口叼砌聊d 刀傩 旭砌办绷出f f 就是一种熟知的微藻。绿藻斜生栅藻明p d 缸所埘d 6 脚“螂、海洋绿 藻锄肠加c o c c “m 胁f o 阳k 、p 切锄。孢嬲应加，小s 扣，掰s 和小球藻 幻愆，肠酗c 口等 都具有产氢能力。蓝细菌有固氮菌鱼腥藻彳胛口6 口s p 、海洋颤藻仇c 黼砌s p 、 丝状蓝藻c c 如咖扛s p 和非固氮菌聚球藻跏p c 办d c d c c 甜s p 、g 肠p 6 口c 胞，s p 等。 5 0 多年前g a f j 的n 等【1 6 】就发现了真核单细胞绿藻& 碧刀口比s 聊淞d 6 脚材郴，其 过程属于直接光解水产氢。 骶e n b a 啪等【1 7 】研究表明，在低光强度和低氧气分压下，a 妇叼砌m d ，l 伽 陀伽办讲西f f 的太阳能转化率为l o 。 j a c kk h o m e r 等【1 8 】对莱茵绿藻c i l z 砌砂面聊d 疗口耵彤加办绷出疗的产氢代谢敏感 性进行了研究。 广西大学硕士掌位论文淀粉活性污泥中产氢细菌的研i 选刀u 氢特性研究 t a ：t ) ，锄vl a u 血a v i c h e n e 等【1 9 1 结果表明，切断莱茵绿藻肠叼砌聊d ，2 嬲， 彤加蝴f 中硫可以提高其产氢量。 ( 2 ) 光合细菌产氢 光合细菌产氢的基础性研究始于4 0 年代。 光合细菌产氢是指在一定光照条件下，通过光合微生物分解有机物产生h 2 。 其光合作用路线图见图1 3 。 光合细菌产氢过程：( c h 2 0 ) n f e 玎e d o x 址一n i 呐g e n a s c h 2 。 t b a c t e r i a l t a t p _ 一p h o t o s y s t e m a t p o a 妒h r 一嚣机 图1 3 细菌光合作用路线 f i g 1 3p o t o s y n t h e s i so f h y d r o g e n - p r d u c t i n gp h o t o b a c t e r i a 光合细菌和藻类产氢一样是太阳能驱动下的光合作用结果。不同的是，光合 细菌只有一个光合作用中心( 相当于藻类的p s i ) ，缺少起光解水作用的p s i i ，所 以只能进行以有机物为电子供体且不产生氧气的光合作用。其光合作用是先利用 捕光色素复合体上的叶绿素和类胡萝卜素吸收光子后，再将光子传递给p s i 光反 应中心蛋白复合体，使复合体处于激发状态并发射出电子。其固氮酶则利用光合 磷酸化过程中产生的a t p 及n a d p h 提供的旷和e ，同时在氢酶的协同作用下 将h + 还原为h 2 。 光合产氢菌主要有红假单胞菌属( r 厅d 如筇p z 砌脚d ，娜) 、红螺菌属 ( 尺 d 面印，护f 舰m ) 、红硫细菌属( c i l z d 删口疗“所) 、外硫红螺菌属 ( & 幻砌面砌d 如妒打口) 、红微菌属( 尺办d 如聊耙d 而f 姗z ) 等7 个属2 0 多个株菌，其 5 广西大g 蝠页士掣唯心论? 文淀粉活性污泥中产氢细菌的筛选及产氢特性研究 精一：溉潍 6 广西大譬啊炙士掌位截汶淀粉活性污泥中产氢细菌的筛选及产氢特性研究 h s c o a c h 3 c o a c o o h h c o o h 0 s c o a c o h 化酶 2 h ， 图1 4 b 甲酸裂解产氢过程( 肠道杆菌型) f i g 1 - 4 b1 1 1 ep m c e s so f f 0 傩i ca c i dd e c o m p o s i t i o n ( p ”纪加妇 暗发酵细菌产氢发生于丙酮酸脱羧作用，可分为2 种方式：一为梭状芽孢杆 菌型( 图1 4 a ) 。该产氢过程为丙酮酸经丙酮酸脱羧酶脱羧后形成硫胺素焦磷酸 酶的复合物，同时将此电子转移给铁氧还原蛋白，还原的f d 又被铁氧还原蛋白 氢化酶重新氧化，并产生h 2 。二是肠道杆菌型( 图1 - 4 b ) 。该产氢过程为丙酮酸 脱羧后形成甲酸，随后甲酸全部或部分裂解转化为h 2 和c 0 2 。 研究发现，暗发酵产氢细菌主要包括杆菌属( 肋c 讲f 姗) ，梭菌属 ( c d 咖肋姗z ) ，肠杆菌属( 勘陀，d 6 口c 册) 和埃希氏肠杆菌属( 毋i 2 p ，七忍妇) 四类。 以梭菌属和肠杆菌属的研究最多。不同种类的微生物对同一底物的产氢能力不 同，通常梭菌属高于肠杆菌属，同种微生物不同菌株的产氢能力也有区别。 最具代表性的研究【2 8 】是以哈尔滨工业大学任南琪教授带头的发酵法生物制 氢技术，1 9 9 0 年他提出了以厌氧活性污泥为菌种的有机废水发酵法生物制氢技 术。该技术突破了生物制氢技术的局限须采用纯菌种或固定化技术，开创了非 固定化技术产氢的新方法，并创建了世界上首例生物制氢示范工程【2 9 1 。主要有 发酵法产氢的原理、方法及类型的研究【3 0 ，3 ，不同产酸发酵微生物产氢能力的 分析和各种提高产氢方法的研究，比如发酵产氢培养基的选择及糖蜜废水发酵产 氢的研究【3 2 】等。 l e v i n 等嘲研究了c 如册访材脚历p ，所d 卯刀z 删2 7 4 0 5 利用纤维素类物质进行发酵 产氢的能力。 l i nc h i u - y u e 等【3 4 3 6 】对驯化后的混合菌群利用蔗糖发酵产氢进行了研究。 1 2 2 研究现状分析 两次能源危机后氢能成为了各国政府能源政策的支持重点，而生物制氢技术 7 “ 晦 f f 2 2 a 心 氐、卅v， 广西大学硕士学位论文淀粉活性污泥中产氢细菌的筛选a u 氢特性研究 被公认为最有应用前景的生产技术，使其成为目前能源科学技术领域的研究热 点，从而促进了该技术的诸多进展。其研究开始于美国、日本等发达国家，近年 来中国的一些高校及科研单位也开始生物制氢研究。总结国内外信息，生物制氢 研究方向主要为产氢机理、产氢菌种、产氢工艺条件、产氢工艺路线、产氢动力 学、产氢酶、原料转化效率以及反应器设计等。 表1 1 不同生物制氢方法比较 f a b l el lc o m p a r a 晡o no f d i 妇奄l - e n tb i o h y d i o g e n p r o d u c 缸n gm e t h o d s 类型 优点 不足 乱产氢原料为水a 太阳能转化效率低 b 产氢量低 藻类 c 体系存在0 2 威胁 d 吸氢酶会回收放出的氢 e 光生物反应器研制未成熟 乱可利用的光谱范围较宽a 太阳能转化效率偏低 b 不存在0 2 的抑制作用b 电子供体昂贵 光合细菌c 需克服大的自由能f 3 7 】 d 吸氢酶会回收放出的氢 e 光反应器设计困难 a 产氢过程不需要光照，且可a 发酵液在排放前需处理 连续产氢 b 产氢原料丰富 暗发酵细菌c 可产生有利用价值的代谢产 物 d 不存在0 2 的限制问题 e 产氢速率相对最高 f 系统易于实现放大试验 可见，暗发酵细菌产氢最具发展前景。其产氢反应在常温、常压及接近中性 的温和条件下即可进行。而且暗发酵微生物可以利用工农业有机废物或有机废水 为产氢原料，既能实现废弃物资源化，又能降低产氢成本，是一种前景广阔的环 8 广西大学习配b 学位论文淀粉活性污泥中产氢细菌的筛选及产氢特性习柏；巴 境友好型的产氢新方法。 1 3 暗发酵细菌产氢 生物制氢技术尚未完全成熟，随着人们对能源的高度重视及对生物制氢技术 的深入认识，国内外越来越多多的工作者投入到此研究中。目前暗发酵产氢的主 要研究成果及发展方向为以下几个方面： 1 3 1 产氢菌种 产氢菌株是产氢技术的核心，高效产氢菌株的筛选不仅是生物产氢的最基础 研究课题，也为产氢菌株的生理生化和遗传育种研究提供重要的资源。按照所需 电子供体的不同，将发酵产氢细菌分为：兼性厌氧发酵产氢细菌：以细胞色素 为电子供体，如大肠杆菌；绝对厌氧发酵产氢细菌：如丁酸梭菌，通过丙酮酸 式二碳单位或丙酮酸产氢；特殊类型的发酵产氢细菌：在五硫源的条件下代谢 产氢，如脱硫弧菌。 发酵产氢细菌的种类很多，主要包括梭菌属( c f d s 护触“m ) 、肠杆菌科 ( 勘纪，d 6 钟纪，蛔础) 、拟杆菌属( 肋c 纪加埘鲻) 、类芽孢菌属( 助p 刀汤口c 讲淞) 、 嗜热盐丝菌属( 砀p 朋d 扫) 砒刀f 删) 等。 目前，发酵法生物制氢技术的研究仍处于实验室或中试研究阶段，发酵产氢 细菌的产氢能力不高成为了限制该技术发展的重要因素。传统的菌种分离筛选方 法效率低又繁杂，而先对样品污泥进行预处理，使微生物种群结构定向进化形成 优势功能菌群结构，则可有效地提高菌种的筛选效率。主要因为一些产氢微生物 不容易被杀死，而是能够形成对热、化学物质( 如酸、碱、盐) 和超声波等具有 较强耐受能力的孢子，一旦环境条件合适，此孢子便将萌发成为营养细胞【3 8 】， 大多数耗氢微生物则不具有这种特性。预处理方法主要有热处理【3 9 1 、酸处理、 碱处理、盐处理、超声波处理等。对接种污泥进行预处理后，可以淘汰污泥中的 产甲烷菌群、硫酸盐还原菌群和同型产乙酸菌群等耗氢微生物【加1 。目前，利用 酸处理来抑制污泥中耗氢微生物的研究较多，对样品污泥进行酸处理，一方面可 以抑制产甲烷阶段；另一方面，在n a d 椭a d h 的平衡调节产h 2 中也需要酸性 条件。如刘常青等【4 l 】直接用酸处理污泥样品作为基质进行发酵产氢间歇试验。 9 淀粉活性污泥中产氢细菌的筛选刀。一氢特性研究 x i a 0 等【叼以酸处理p h 为2 0 、处理时间t 为1 2h 的预处理活性污泥作为基 质进行发酵产氢批量试验，当初始p h 为7 0 时产氢量为3 2 5m l h 2 g v s ，发酵 液终止p h 为4 1 8 。 c a i 等f 4 3 】以酸处理p h 为3 0 、处理时间t 为o 5h 的预处理海洋环境活性污 泥作为基质进行发酵产氢批量试验，当初始p h 为7 o 时产氢量为6 9 5m 肌，发 酵液终止p h 为4 1 8 。 1 3 2 发酵产氢的影响因素 暗发酵细菌产氢的影响因素主要有：p h 、o l 冲、温度、底物种类及浓度、 金属离子等生物因子和环境因子。这些因素不仅对细菌的生长、生理代谢有重要 的影响，也会影响细菌的产氢能力。 ( 1 ) p h 的影响： p h 是一个重要的影响因素，不仅会影响微生物的生长和繁殖，也会影响发 酵产物的组成和微生物的产氢活性。反应系统p h 的改变，直接影响到酶活性中 心的存在形式，进而改变酶分子及底物分子的带电状态，从而会影响酶与底物的 结合。此外，p h 的改变还会影响细胞质膜的渗透性、结构稳定性以及营养物质 的溶解性，从而影响微生物对营养物质的利用。 宗文明等1 利用间歇培养实验研究p h 对s 护砌甜ms p 0 8 2 l 产氢的影响， 结果表明，起始p h 控制在5 5 时获得了最大的产氢量。 x i a 0 等【4 5 1 也采用间歇培养实验研究起始p h 对z x 1 的产氢影响，结果发现 z x 一1 对p h 很敏感，其最适的产氢起始p h 为5 0 。 ( 2 ) o r p 的影响： 0 l 冲( 氧化还原电位) 也是微生物正常生长、繁殖而不可缺少的环境因子之 一。发酵产氢基于厌氧发酵过程，其发酵微生物是属于严格厌氧或兼性厌氧细菌， 须在厌氧的环境下才能进行正常的发酵代谢。一般要求发酵体系的o i 冲低于3 5 0 m v 。 ( 3 ) 温度的影响： 影响微生物生长繁殖的另一重要因素就是温度。因为微生物的生长繁殖是通 过一系列的生化反应来完成的，而酶促反应特性要求反应在一定的温度范围才能 l o 广西大写炙士掌位论文淀粉活性污翱 中产氢细菌的筛选a j 氢特性司院 正常进行。此外，温度还影会响细胞质膜的流动性。温度高，其流动性大，有利 于物质的运输，从而影响微生物对营养物质的吸收和代谢。 l i n 等阳采用厌氧恒化器进行了活性污泥产氢研究，控制温度在1 5 3 4 。产氢结果表明，与3 5 1 相比，常温条件下1 5 2 5 的产氢量和 产氢率均低于后者。 ( 4 ) 底物种类及浓度的影响： 微生物对产氢底物具有选择性，且对某种类的底物具有优先选择性。暗发酵 产氢细菌的最适底物为碳水化合物，特别是葡萄糖和蔗糖。 岳莉然等【4 7 1 间歇培养实验研究产氢细菌s u e s 1 对不同单双糖的产氢利用 与效能，结果表明：双糖( 蔗糖) 的产氢量大于等浓度单糖( 葡萄糖) 的产氢量， s u e s 1 能更好地利用双糖进行产氢。 王东阳等【4 8 1 以高效产氢新菌b 面坳钟疗删r 3 为研究对象，探讨以乳糖作为 产氢底物时，不同的乳糖质量浓度对i u 的产氢效能和生长的影响。实验发现， 召勿枷口鲥聊2r 3 能很好地利用乳糖进行生长和产氢。当起始p h 为6 0 、乳糖浓 度为1 5g l 时，b 幻枷叩玎甜聊i u 的产气量为4 5 0m i ，i ，。 王相晶等【4 9 1 采用间歇培养实验研究了葡萄糖浓度对发酵产氢新菌种b 4 9 的 影响，结果表明b 4 9 生长及产氢的最适葡萄糖底物浓度为1 0g l ，葡萄糖利用达 到1 0 0 。 李永峰等【5 川则采用了间歇试验测定产氢菌r e 衄a l l q i l y f 3 3 的细菌生长和产氢 情况，实验表明，在葡萄糖浓度为1 2 5g i ，l 时菌株r e 曲a n q i l ) 仍3 具有最大的细 胞生长量及比产气率。 ( 5 ) 金属离子的影响： 金属离子则是一类微生物生长必不可少的营养物质，如m g ，f e ，z n ，p ，s ， k ，c a ，n a ，c u ，m n ，m o 和c o 等。大量元素参与细胞结构的组成、原生质胶 体状态的维持、能量转移以及控制细胞渗透作用等；微量元素多是酶的活性基组 分或激活剂。 研究表明，许多厌氧微生物在无n i 培养基中生长很差，加入n i 可明显地促 进其生长，并且氢酶活性能增加3 3 【5 l 】。而金属离子浓度超过一定范围时会引 起细菌中毒。梭菌和肠杆菌在缺f e 培养基中能生长，但不能产氢。丁杰【5 2 】就n a + ， 淀粉活性污泥中产氢宣日菌的筛选及产氢特性司院 m n 2 + ，f e 2 + ，z n 2 + ，m 孑+ ，n i 2 + 等金属离子的影响进行了系统研究，优化了产氢 细菌培养基。 1 - 3 3 混合菌种产氢 目前大多数是对纯菌种进行产氢研究，而对混合菌种，特别是利用厌氧活性 污泥产氢的研究较少。实际上，混合菌种产氢有一定的优越性，它不存在杂菌污 染问题，且在实际应用中操作简单、管理简便，提高了暗发酵细菌产氢工业化生 产的可行性。 活性污泥是多种微生物的混合体，存在产氢微生物，也存在耗氢微生物，于 是在厌氧发酵过程中，产氢微生物所产生的部分h 2 会迅速被耗氢微生物利用。 为了淘汰接种污泥中存在的产甲烷菌群、硫酸盐还原菌群和同型产乙酸菌群等耗 氢菌群，加快发酵系统的污泥驯化进程，并提高产氢效能，以不同类型的活性污 泥启动连续发酵制氢系统的研究已逐渐深入。增加产氢微生物的数量及提高微生 物的产氢活性，是提高系统产氢效能的重要途径。通过预处理，如热处理、酸处 理、碱处理、抑制剂处理、微波处理等可以抑制活性污泥中的耗氢微生物，从而 提高反应体系的产氢能力。目前，利用酸处理污泥抑制耗氢菌的研究较多。如刘 常青等【4 1 】直接以酸处理污泥作为基质进行发酵产氢批量试验，) ( i a o 等【4 2 】以酸处 理污泥为接种物进行发酵产氢批量试验。但对于酸处理方法缺乏系统的研究，污 泥发酵产氢效果会受到酸处理p h 、酸处理时间等因素的影响。此外，酸处理后 厌氧发酵产氢体系中微生物种群多样性的研究也缺乏。 发酵法生物制氢技术成为生物制氢工业化生产中最具前景的研究方向，由于 菌种采用的是活性污泥，因此，其反应系统产氢效能直接取决于系统的微生物种 群。存在于活性污泥的微生物种类极其丰富，而用研究活性污泥微生物多样性的 传统纯培养分离技术呈现出很大的缺陷，不能获得未被分离培养的微生物信息， 只能分离出占总数o 1 l 的微生物种类。对微生物多样性实行分子生物学监 测成为了目前生态学研究和微生物诊断的重要手段。基于1 6 s 枞的d n a 指 纹技术就可以监测未被分离培养的微生物种属，其中变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 是现代微生物种群动态性和遗传多样性研究的最有力分子生物学技术之一【5 3 】。 1 3 4 细胞固定化 1 2 广西大掣啊页士学位论文淀粉活性污泥中产氢细菌的筛选殁产氢特性研究 为达到持续且高效的产氢目标及工业化生产，有效措施之一就是提高反应系 统的产氢速率和细胞持有量。研究者则利用微生物包埋剂或载体，对产氢细菌的 固定开展了一系列的工作。 研究表明，细胞固定化技术能提高系统的产氢速率，使其稳定性也有了提高。 但是，该技术的复杂性、制氢成本以及工作量决定了它的应用只适用于实验室研 究，无法进行大规模的工业化生产。而且，载体基质会占据反应器的大量有效空 间，反应器比产氢率的提高也会受到限制。 1 4 本课题的研究意义、内容及技术路线 1 4 1 选题的研究意义 生物制氢技术是一种理想获取h 2 的方法，特别是暗发酵生物制氢，是一种 极具工业化前景的制氢方法。目前，生物制氢技术仍然处于初级研究阶段，许多 关键性问题，如高效产氢菌种的获得、制氢成本的降低以及混合产氢菌群的深入 研究等仍未能得到解决，则限制了生物制氢技术的快速发展及广泛应用。本研究 一 针对目前生物制氢技术中的研究热点来展开多方面的实验工作。 ( 1 ) 课题以木薯淀粉废水处理过程中的活性污泥为研究对象，探讨酸处理 对污泥发酵特性的影响，获得适宜的酸处理条件，补充酸处理方法的系统研究， 也为降低处理能耗和相关技术研发提供依据； ( 2 ) 通过产氢细菌的筛选鉴定及其产氢特性的研究，既为优化其产氢条件、 提高产氢活性奠定基础，也为其应用到处理实际废水提供参考。 1 4 2 研究内容和技术路线 本实验研究内容为： ( 1 ) 活性污泥预处理产氢研究 考察不同酸处理条件对污泥暗发酵产氢的影响，并对反应系统中产氢菌群进 行分析。 ( 2 ) 活性污泥中暗发酵产氢菌的分离、筛选及鉴定 以酸处理污泥为发酵产氢接种物，采用三层平板厌氧培养技术从厌氧活性污 泥中分离出高效暗发酵产氢细菌。并进行细菌形态和培养特征的观察、生理生化 1 3 广西大掌硕士掌位论文 淀粉活性污泥中产氢细菌的筛选及产氢特性研究 的i | 1 1 9 定、以及1 6 sr d n a 碱基测序和比对。 ( 3 ) 产氢菌的产氢特性测定 考察碳源、初始p h 、底物初始浓度等因素对产氢菌产氢活性的影响。 技术路线如下： 圆 l 匝耍圃一匝i 匦亟五延亟圈 i 匪圈一匝画巫亟互玉巫圈 i l 匡匿匾匿巫圃一匦亟亟圈 l i 1 4 广。日大掣页士掌位论文淀粉活性污泥中产氢细菌的筛选及产氢特性研究 2 1 前言 第二章污泥预处理产氢研究 为补充酸处理方法的系统研究，本章以木薯淀粉废水厌氧处理过程中的活性 污泥为对象，探讨酸处理( 不同酸处理p h 和不同酸处理时间t ) 对污泥发酵产 氢特性的影响，以期获得适宜的酸处理条件，为降低处理能耗和相关技术研发提 供依据。然后对混合菌群基因组d n a 进行p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 扩 增，再用分子生物学技术进行基因检测分离，从而得出生物制氢系统微生物种群 多样性的信息。 2 2 实验材料与方法 2 2 1 接种污泥与预处理方法 试验用种泥取自木薯淀粉废水厌氧处理过程中的活性污泥。样品污泥经密封 4 保存，以维持细菌种群的多样性。 在研究酸处理p h 对活性污泥产氢影响时，先将待处理污泥混匀，然后取1 5 o g 分装于1 0 个1 3 0m l 的血清瓶中。将其中8 个分别用2 0 的盐酸调p h 至3 o 、 3 5 、4 o 、4 5 处理3 0m i i l 后，再将p h 调至7 o 。对第9 、l o 个血清瓶的污泥， 不作任何预处理，以作空白对照。 在研究酸处理时间t 对活性污泥产氢影响时，先将待处理污泥混匀，然后取 1 8 og 污泥分装于1 2 个1 3 0m l 的血清瓶中。将其中l o 个用2 0 的盐酸调p h 至4 0 ，分别处理lh 、2h 、4h 、6h 、1 0h 后，再将p h 调至7 0 。对第l l 、1 2 个血清瓶的污泥，不作任何预处理，以作空白对照。 2 2 2 实验装置 在活性污泥预处理产氢研究中采用间歇实验装置，实验装置如图2 1 所示。 往装有l o om l 液体产氢培养基的1 3 0m l 的血清瓶中接入1 5 9 酸处理样品污泥， 用翻口橡胶塞及医用胶布进行密封，充n 2 2m i n 后置于3 7 、1 5 0r m m 的恒温 空气浴摇床振荡培养4 8h 。然后将输液管的细针头插入血清瓶的上部空余空间， 1 5 广西大掣明炙士掌位论文淀粉活性污泥中产氢细菌的鲥i 选及产氢特性研究 产生的气体则可通过导气管导出，以排水量来计算实验的产气量。对照污泥和经 不同p h 预处理的样品污泥，其产氢实验均采用2 只培养瓶平行进行。 5 1 、发酵装置2 、发酵液取样口3 、气体输液管4 、气体收集装置5 、水槽 图2 1 间歇产氢实验装置图 f i g 2 - ls c h e m a t i cd i a g “衄o fh y d r o g e n p r o d u c i n g t e s t 2 2 3 产氢培养基 微生物为合成自身的细胞物质，需要从周围环境中摄取自身生存所必须的各 种物质，即营养物质。其中主要的营养物质是碳、氮、磷等，这些事微生物细胞 化学成分的骨架。对微生物来讲，碳、氮、磷营养有一定的比例，一般为 c ：n ：p = 1 0 0 ：5 ：1 。 液体产氢培养基( g l ) 成分如下：葡萄糖，2 0 0 ；胰蛋白胨，4 o ；牛肉膏， 2 o ；酵母汁，1 0 ；n a c l ，4 0 ；k 2 h p 0 4 ，1 5 ；m g c l 2 ，o 1 ；f e s 0 4 7 h 2 0 ，o 1 ； l 半胱氨酸，0 5 ；维生素溶液( 钴铵素，0 o l ；l 抗坏血酸，0 0 2 5 ；柠檬酸， o 0 2 ；吡多醛，0 0 5 ；核黄素，o 0 2 5 ；叶酸，0 0 1 ；对氨基苯甲酸，o 0 1 ；肌醇， o 0 2 5 ) 1 0 i n l ；微量元素溶液( m n s 0 4 7 h 2 0 ，o 0 1 ；z n s 0 4 7 h 2 0 ，o 0 5 ；h 3 8 0 3 ， o o l ；n ( c h 2 c o o h ) 3 ，4 5 ；c a c l 2 2 h 2 0 ，o 0 1 ；n a 2 m 0 0 4 ，o 0 1 ；c o c l 2 6 h 2 0 ， o 0 2 ；a l k ( s 0 4 ) 2 ，0 0 1 ) 1 0 m l ；初始p h ，6 8 - 7 0 。 培养基以微生物最容易代谢的葡萄糖作为产氢碳源，以价格较低的胰蛋白 胨、牛肉膏、酵母汁为产氢氮源；以l 半胱氨酸作强还原剂，降低培养基中的 o l 冲，从而创造无氧环境；无机盐、维生素、微量元素都参与细菌的生长与产氢。 1 6 淀粉活性污泥中产氯细菌的筛选及产氢特性研究 2 2 4 分析方法 使用p h s - 3 c 型p h 计( f e 2 0 k ，天津盛邦) 测定发酵液p h 。 细菌量可采用分光光度法和重量法进行测定。本实验采用w 18 0 0 型可见 分光光度计( 岛津，天津奥佳) 在波长6 0 0 衄处测定发酵液的吸光度值o d 6 0 0 。 采用排水法收集气体，累积产氢量按下述公式进行计算：v = v i x i 。其中： v 是总产氢量( m l ) ：v i 是第i 次收集的气体体积( m l ) ；x i 是第i 次收集气体 中氢气的百分含量( 集气瓶在每次测定气体后就将其放空) 。 使用a 西l e n t 6 8 2 0 型气相色谱仪( 安捷伦，美国) 进行氢气含量分析。检测 参数为：热导检测器( t c d ) ，不锈钢填充柱( 8 0 1 0 0 目，2m 3i l 姗) ，载气为 氩气( 流速为2 5 3 0r n l 腼n ) ，检测器温度、柱箱温度、汽化温度分别为2 0 0 、 4 0 、2 5 0 。 2 2 5d g g e ( d e n a t l l r i n gg m d i e n tg e le 1 e c 仃c ) p h o r e s i s ) 法 采用化学裂解法( s d s ，十二烷基磺酸钠) 从各反应体系的发酵液中直接提 取基因组d n a 。使用w 1 8 0 0 型可见分光光度计对提取的d n a 样品浓度进行 测定。以引物3 4 l f + g c 和5 1 8 r ( 序列如表2 1 所示) 进行1 6 sr r n a 基因v 3 区的扩增。采用m y c y c l e r 型p c r 仪进行扩增反应。p c r 扩增条件：9 4 预变 性4m i i l ，( 9 4 变性3 0s ，5 8 退火3 0s ，7 2 延伸lm i l l ) 3 0 个循环，7 2 最终延伸7m i n 。再采用b i o r a d 公司d c o d e t m 的基因突变检测仪