（环境科学专业论文）普鲁兰酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达.pdf

组： 程菌连续传1 0 代后，经接种培养、诱导发酵及p c r 反应鉴定表明，p 8 具有良好的遗传稳定性。3 通过对重组毕赤酵母p 8 发酵过程的两个阶段发酵条件的优化实验，得出卜长阶段的最佳发酵工艺为：甘油2 5 ，硫酸铵2 5 ，b i o t i n 0 0 0 0 0 4 ，1 m o l l磷酸缓冲液1 0 ，p h 5 0 ，在2 5 0 m l 的i 角瓶罩装液量为2 0 m l ，在3 0 。c 、2 4 0 r p m条件下培养4 8 h ，接种量为1 0 。通过正交实验得出诱导阶段的最佳发酵工艺为：甲醇3 o ，甘油o 2 5 ，硫酸铵2 0 ，b i o t i n 0 0 0 0 0 4 ，l m o l l 磷酸缓冲液1 0 ，d h 7 0 ，在2 5 0 m l 的三角瓶罩装液量为2 0 m l ，每隔2 4 h 补加一次初始浓度的甲醇和甘油，在3 0 。c 、2 4 0 r p m 条件下诱导培养4 8 h ，接种比率为1 ：1 。验证实验表明，在最佳发酵条件下，p 8 表达的普鲁兰酶产量平均可达( 5 0 7 3 士2 8 ) u m l 。4 基因工程菌p 8 所产普鲁兰酶的分子量约为1 1 9 9 k d a ：最适作用温度范围为4 0 。c 6 0 。c ，在p h 4 5 条件下，4 0 6 5 。c 之间酶活性变化卅i 大；最适作用p h 范围为4 5 5 0 ，温度为6 0 。c 时有较广泛的p h 稳定范围，在p h 为3 5 6 0范围内，该酶都具有较高的活性；该酶具有很好的热稳定性，6 0 。c 保温6 4 h 仍有4 5 的残余酶活，耐热性较原始菌株有所提高。该普鲁兰酶反应不需要金属离子的参与，但很多离子如a g + 、c u 2 + 、z n 2 + 、c 0 2 + 、m n 2 十、f e 斗、c d 2 + 、p b 2 + 和h 9 2 +对浚酶都有不同程度的抑制作用；添加m 9 2 + 和n i 2 十对酶活性有不同程度的促进作用：而添加k + 、n a + 、l i + 、c a 2 + 和b a 2 + 对该酶无明显的激活或抑制作用；5 1 03 m o l l 的s d s 使酶完全失活，这可能是由于该普鲁兰酶分予中缺乏二硫桥结构的缘故。以上研究结果表明，本研究构建的基因工程菌所产的普鲁兰酶表达鼍较高，实验室摇瓶发酵时，酶活可达3 5 0 8 u m l ；其粗酶的酶学和应用性质得到了进一步研究，证明工程菌所产普鲁兰酶具有较好的耐酸、耐热性；通过对发酵条件进行优化，最佳发酵条件下的普鲁兰酶产量平均可达( 5 0 7 3 士2 8 ) u m l 。因此，浚株基因_ ：程菌所产的普鲁兰酶具有广阔的工业化生产和应用前景。关键词：普鲁兰酶；b a c i l l u sn a g a n o e n s i s ( a t c c 5 3 9 0 9 ) ；基因克隆和表达；毕赤酵母；发酵条件优化：酶学性质及应用特性c l o n i n ga n do v e r e x p r e s s i o no f g e n ee n c o d i n gt h ep u l l u l a n a s ef r o mb a c i l l u sn a g a n o e n s i s ( a t c c 5 3 9 0 9 ) i np i c h i a p a s t o r i sa b s t r a c tp u l l u l a n a s e ( p u l l u l a n 一6 一g l u c a n o h y d r o l a s e ，e c3 2 1 4 1 ) i su s u a l l yc o n s i d e r e dad e b r a n c h i n ge n z y m et h a ts p e c i f i c a l l yc l e a v e sd 一1 ，6g l y c o s i d i c l i n k a g e si np u l l u l a n ，s t a r c h ，a t n y t o p e c f i n ，a n dr e l a t e do l i g o s a c c h a r i d e s t h ee n z y m ei sw i d e l yu s e di nt h es t a r c h - p r o c e s s i n gi n d u s t r y , b e c a u s ei tc a np r o m o t et h eu t i l i t ye f f i c i e n c ya n dp r o d u c t i v i t yo fs t a r c ho nal a r g es c a l e t h em o s ti m p o r t a n ti n d u s t r i a la p p l i c a t i o no fp u l l u l a n a s ei su s e di nc o m b i n a t i o nw i t hg l u c o a m y l a s eo r1 3 - a m y l a s e ，r e s p e c t i v e l y , i nt h es a c c h a r i f i c a t i o np r o c e s s ，a n di t sf u l l - b l o w na p p l i c a t i o ni su s e df o rt h ep r o d u c t i o no fd e x t r o s e ，h i g h - m a l t o s es y r u p sa n db e e rf r o ms t a r c hh y d r o l y s a t e s i nt h i sr e s e a r c hp a p e r ，t h e g e n e e n c o d i n gp u l l u l a n a s ef r o mb a c i l l u sn a g a n o e n s i s ( a t c c 5 3 9 0 9 ) h a db e e nc l o n e da n de x p r e s s e di np i c h 胁p a s t o r i sh o s ts m d i1 6 8 m o r e o v e r , t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h ee n g i n e e r i n gy e a s ts t r a i na n dt h ep r o p e r t i e so ft h er e c o m b i n a n tp u l t u l a n a s eh a da l s ob e e ns t u d i e di no u rr e s e a r c h t h i ss t u d yw o u l do f f e rt h et h e o r e t i c a lb a s i st ot h ep r o t e i ne n g i n e e r i n go ft h ep u l l u l a n a s ea n di t so v e r e x p r e s s i o na n df u t u r ea p p l i c a t i o n t h i st h e s i sc o n s i s t e do f f o u rp a r i s ：1 c l o n i n gt h ep u l l u l a n a s eg e n ef r o mb a c i l l u sn a g a n o e n s i s ( a t c c 5 3 9 0 9 ) ；2 e x p r e s s i o nt h ep u l l u l a n a s eg e n ei np i c h i a p a s t o r i s ；3 o p t i m i z a t i o no f t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f t h er e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i s ；4 s t u d y i n go np r o p e r t i e so f t h ec r u d er e c o m b i n a n tp u l l u l a n a s e t h ed e t a i l e dr e s u l t sa n dc o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s ：1 t h es p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h er e p o r t e dn u c l e o t i d es e q u e n c eo ft h ep u l l u l a n a s e t h eg e n ef r a g m e n te n c o d i n gt h ep u l l u l a n a s ew a sc l o n e dv is u c c e s s f u l l yf r o mb a c i l l u sn a g a n o e n s i s ( a t c c 5 3 9 0 9 ) t o t a ld n aw i t ht h es p e c i f i cp r i m e r s s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ec l o n e dg e n ew a si d e n t i c a lw i t ht h er e p o r t e dp u l l u l a n a s e 2 t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 k - - p u l l u l a m t s ew a sc o n s t r u c t e db yl i g a t i n gt h ec l o n e dg e n ew i t h3 - t e r m i n a lo f 一f a c t o rs i g n a ls e q u e n c eo nt h ep p i c 9 ki ne c o r1s i t e t h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rw a si n t r o d u c e di n t op i e h i ap a s t o r i ss m d l l 6 8b ye l e c t r o p o r a t i o n t h ep o s i t i v et r a n s f o r m a n t sw e r ec h a r a c t e r i z e db yp u l l u l a n a s ea c t i v i t yd e t e r m i n a t i o n ，s d s p a g e ，a n dp c ra m p l i f i c a t i o na g a i n s ty e a s tt o t a ld n a i td e m o n s t r a t e dt h a tt h eg e n eo ft h ep u l l u l a n a s eg o tp r o p e re x p r e s s i o na n dm o d i f i c a t i o nc o r r e c t l yi ns m d l1 6 8 + t h et r a n s f o n n a n tn a m e dp 8s e c r e t e dr e c o m b i n a n tp u l l u l a n a s e ，w h i c hh a dt h eh i g h e s te n z y m ea c t i v i t yo f3 5 0 8 u m l ，a b o u t1 2 9 ，9t i m e sh i g h e rt h a nt h a to f t h eo r i g i n a ls t r a i n t h ee x p e r i m e n to f f e r m e n t a t i o na n dp c rm e t h o ds h o w e dt h a tp 8h a dag o o dg e n e t i cs t a b i l i t y 3 i m p r o v e de x p r e s s i o nl e v e lo fr e c o m b i n a n tp u l l u l a n a s eb yp i c h i ap a s t o r i sw a sa c h i e v e db yo p t i m i z a t i o nb o t ht h eg r o w t hp h a s ea n di n d u c t i o np h a s ec u l t u r ec o n d i t i o n s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no ft h eg r o w t hp h a s ei sa sf o l l o w s ：2 5 g l y c e r o l ，2 5 ( n i - 1 4 ) 2 s 0 4 ，o 0 0 0 0 4 b i o t i n 1 0 l m o l lp h o s p h a t eb u f f e r , p h 5 0 ，2 4 0 r p m ，3 0 。c ，4 8 h ，a n d1 0 i n o c u l a t i o na m o u n t t h eo r t h o g o n a lt e s tr e s u l t so fi n d u c t i o np h a s es h o w e dt h a tt h eo p t i m u md e s i r e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：3 o m e t h a n 0 1 o 2 5 g l y c e r 0 1 2 0 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，0 0 0 0 0 4 b i o t i n ，1 0 l m o l l p h o s p h a t eb u f f e r , p h 7 0 ，2 4 0 r p m ，3 0 。c ，4 8 h ，1 ：1i n o c u l a t i o nr a t i o ，a n dt h es a m ec o n c e n t r a t i o no fm e t h a n o la n dg l y c e r o lw e r es u p p l e m e n t e de v e r y2 4h o u r s f i v et i m e sr e p e a t e df e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t so fs t r a i np 8u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n ss h o w e dt h a tt h ea v e r a g ep u l l u l a n a s ea c t i v i t yw a s ( 5 0 7 3 4 士2 7 6 ) u r a l 4 t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ep u l l u l a n a s ew a sa b o u t119 9 k d a t h eo p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dp hr a n g ef o rt h ee n z y m ea c t i v i t yw e r ef o u n dt ob ef r o m4 0t o6 0d e g r e e sca n df r o mp h4 5t o5 0 ，r e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r e ，t h ep u l h i l a n a s ee x h i b i t e das t a b l ea c t i v i t yu n d e rab r o a dp hr a n g ef r o m3 5t o6 0a t6 0d e g r e e sc ，as t a b l ea c t i v i t yb e t w e e n4 0d e g r e e sca n d6 5d e g r e e sca tp h 4 5 ，a n dg o o dv i it h e r m o s t a b i l i t y , w h i c hh a dar e s i d u a la c t i v i t ya f t e r6 4h o u r sa sm e a s u r e da t6 0d e g r e e sca n dp h 4 5o f4 5p e r c e n t m e t a li o n sw e r en e e d l e s si nt h ee n z y m a t i cr e a c t i o n ，b u tt h ep u l l u l a n a s ea c t i v i t yw a si n h i b i t e dm o r eo rl e s sb yt h ea d d i t i o no fs o m ei o n ss u c ha s a g + 、c u 2 + 、z n 2 + 、c o 斗、m n 2 + 、f e 斗、c d 2 + 、p b 2 + a n dh 9 2 + ，w a si m p r o v e db yt h ea d d i t i o no f m 9 2 + a n dn i 2 + a n dw a ss l i g h t l ya f f e c t e db yt h ea d d i t i o no f k + 、n a + 、l i + 、c a 2 + a n da a 2 + i na d d i t i o n ，m a yb eb e c a u s et h a tt h ep u l l u l a n a s em o l e c u l a rh a dl e s sd i s u l f i d e b o n d t h ea d d i t i o no fs d s ( 5x101 m o l l ) i n h i b i t e dt h ee n z y m ea c t i v i t ya b s o l u t e l y ,a c c o r d i n gt oa b o v e ，t h ey i e l do ft h ep u l l u l a n a s ef r o mt h er e c o m b i n a n ty e a s tw a sm o r ep r o d u c t i v et h a nt h a to ft h eo r i g i n a ls t r a i n a p p l i c a t i o np r o p e r t i e so ft h ec r u d ee n z y m ew e r es t u d i e d i ts h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o np r o d u c t so fr e c o m b i n a n ty e a s tw e r em o r es t a b l ei nt h ep hr a n g eo f3 5t o6 0a n de x h i b i t e dh i g h e rt h e r m o s t a b i l i t yt h a nt h eo r i g i n a ls t r a i n s ot h er e c o m b i n a n tp u l l u l a n a s eh a daw i d ef o r e g r o u n di ni n d u s t r i a lp r o d u c t i o na n du t i l i z a t i o n t h ee x t r a o r d i n a r yh i g hs u b s t r a t es p e c i f i c i t yt o g e t h e rw i t hi t st h e r m o s t a b i l i t ym a d et h i se n z y m eag o o dc a n d i d a t ef o rb i o t e c h n o l o g i c a la p p l i c a t i o n si nt h es t a r c h - p r o c e s s i n gi n d u s t r y k e yw o r d s ：p u l l u l a n a s e ；b a c i l l u sn a g a n o e n s i s ( a t c c 5 3 9 0 9 ) ；g e n ec l o n i n ga n de x p r e s s i o n ；p i c h i ap a s t o r i s ；o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ；e n z y m ep r o p e r t i e sa n da p p l i c a t i o np r o p e r t i e s独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：却云甄知- 上年莎月莎b学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权云南师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。学位论文作者签名：办云娥ny 。r 年f ；月占b指导教师签名：逗手壹五弓a 年6 月舌曰第一章绪论第一章绪论1 1 概述淀粉足由葡萄糖通过al ，4 一葡萄糖苷键构成的直链淀粉和a 一1 ，6 位有分支的支链淀粉组成的混合物。淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称，广泛存在于动物、植物和微生物中，它最早实现了工业化牛产并且是迄今为止用途最广、产量最大的一个酶制剂品种。表1 1 列出了几种在工业生产中常见的淀粉酶类别。表1 1 几种常地的淀粉酶类“”t a b 1 1s e v e r a ln o r m a lk i n d so f a m y l o l y t i ee n z y m e第一章绪论由于受到种种因素的影响，在以上几种淀粉酶中，解支酶的生产应用规模较小“3 。而t 业用大部分淀粉质原料含有7 5 8 5 的支链淀粉，支链淀粉不被分解则影响到淀粉的利用率。支链淀粉是若干n 一1 ，4 一葡萄糖链由d 一1 ，6 糖营键结合而成的高度分支的多糖，它每隔2 0 2 5 个葡萄糖单位就有一个支链点，所以支链淀粉含4 5 的q l ，6 糖苷键“。为改善淀粉酶对淀粉的作用效果，提高淀粉利用率，世界各国为了降低生产成本，提高效益，纷纷投入人量人力、财力研究开发解支酶。直链淀粉和支链淀粉及其结构如图1 1 所示。一口。o 。键蜘啕。口。口口口j )一簇。图1 1 直链淀粉( 1 ) 和支链淀粉( 2 ) 及其结构示意图f i g 1 1t h es t r u c t u r eo f a m y l o s e ( 1 ) a n df r a g m e n to f t h es t r u c t u r eo f a m y l o p e c t i n ( 2 ) ( t h el e n g t ho f c h a i n saa n dbi n2v a r i e s )2第一章绪论能够分解淀粉o f 一1 ，6 葡萄糖营键的酶，通称为解支酶( 淀粉脱支酶，d e b r a n c h i n ge n z y m e ) ，如寡一1 ，6 一葡萄糖苷酶( e c3 2 1 1 0 ，o l i g o 一1 ，6 - g l u c o s i d a s e ) 、普鲁兰酶( e c3 2 1 4 1 ，p u l l u l a n a s e ) 、异淀粉酶( e c3 ，2 1 6 8 ，i s o a m y l a s e ) 、支链淀粉一6 一葡聚糖水解酶( e c3 21 6 9 ，a m y l o p e c t i n 6 - g l u c a n o h y d r a s e ) 以及植物来源的“r 一酶”( 植物支链淀粉脱支酶，a m y l o p e c t i nd e b r a n c h i n ge n z y m e ) 等。解支酶来源不同，性质上也会有较大筹别。其中，普鲁兰酶是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的nl ，6 一糖苷键，从而剪下整个侧支，形成直链淀粉的解支酶。它可以将最小单位的支链分解，最人限度地利用淀粉原料，因此是一神工! 岐t 有重要应用价值和需求量犬的酶类。由于人们最初注意到这种酶能水解普鲁兰糖的n i ，6 一键，故称普鲁兰酶”。普鲁兰糖( p u l l u l a n ) 是由u l ，6 键连接的麦芽三糖单元构成的线性多糖。微生物来源的普鲁兰酶能够分解普鲁兰多糖，它的最小作用底物是6 2 _ 麦芽糖基麦芽糖。普鲁兰酶作用于普鲁兰糖的机制如图1 2 所示“1 。n ( o 3 彩)图1 2 普鲁兰酶作用普鲁兰糖机制f i g 1 2a c t i o np a t t e mo f p u l l u t a n a s eo np u u u l a n虽然热力作用能促进水解的发生，但并非淀粉、糖原和糊精中所有a 一1 ，6 一糖瞢键都能被该酶水解，水解发生的基本条件是，在a l ，6 一糖苷键的两端至少有2 个o f l ，4 - 糖昔键相连的d 葡萄糖”。另外，w a l l e n f e l s 通过纸层析发现，普鲁兰酶作用普鲁兰糖除产生麦芽三糖、麦芽三糖基麦芽三糖外，还产生麦芽阴糖和麦芽三糖基麦芽三糖等”1 。普鲁兰酶能专一性地催化断裂支链淀粉中的a i ，6 一糖苷键的性质决定了它在改善淀粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量及丌发新的产品方面有着相当巨大的价值，在淀粉加工工业中有着重要的_ j i j 途和良好的市场前景。第一章绪论此外，由于目前淀粉原料加工过程中所用的淀粉水解酶作用条件的差异，淀粉的水解必须分步进行。淀粉制糖的酶法水解工艺分为液化和糖化两个步骤，液化过程采用中性q 一淀粉酶存9 0 1 0 5 高温下进行，糖化过程采用酸性糖化酶在5 5 。c 6 0 。c 条件下进行。目前世界上以酶法( n 一淀粉酶和糖化酶) 生产淀粉糖的最高转化率d e 值为9 6 ，是酶法牛产工艺的一个极限数值。这是因为糖化酶对淀粉中的a1 ，6 - 糖营键作用力较弱，从而影响淀粉的最终水解度。降低淀粉浆浓度或者增加糖化酶的剂量，在理论上可以突破这个极限，但前者大人增加了生产负荷、提高了成本，后者能够诱发葡萄糖的聚合反应，生成异麦芽糖，影响最终收率。一种有效的改进工艺是在淀粉制糖糖化过程中添加普鲁兰酶，水解残余的d l ，6 一糖苷键，则可使d e 值提高至9 7 以上。”。由于糖化酶作用p h 较低( p h 4 5 5 0 ) ，作用温度较高( 5 5 。c 6 0 ) 。】，在淀粉糖工业中与糖化酶配合使用的普鲁兰酶如能具有相似的作用p h 和作用温度范围，则能大大开拓其市场。i 2 普鲁兰酶的国内外研究概况和发展趋势l 。2 ，l 普鲁兰酶的主要产生菌种”1 ”1 2 1 1 酸性普鲁兰酶的主要产生菌种普鲁兰酶最初是由b e n d e r 和w a l l e n f e l s 于1 9 6 1 年通过产气气杆菌a e r o b a c t e ra e r o g e n e s ( 典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌) 发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能( 酶作用最适p h 5 5 - - 6 0 ，最适温度为5 0 。c ) 5 j 。之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同地区，微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。日本的y o s h i y u k it a k a s a k i 丁i1 9 7 5 年发现蜡状芽孢杆菌覃状变种( b a c i l l u sc e r e u sv a r m y c o i d e s ) 可同时产生两种淀粉酶：1 3 一淀粉酶和普鲁兰酶。最传作用条件为p l i 6 0 6 5 ，温度5 0 ，最大转化率( 淀粉水解产生麦芽糖) 大约为9 5 。酶学研究中发现，此酶在p t 5 0 温度6 0 。c 依然保持大部分活性。”八十年代初，丹麦n o v o n o r d i s k 公司获得嗜酸性分解普鲁兰多糖芽孢杆菌( b a c i l l u s a c i d o p u l l u l y t i c u s ) 。该公司利用它所生产的普鲁兰酶，经过投入巨资开发研究，1 9 8 3 年n o v o n o r d i s k 公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名为p r o m o z y m e 。该普鲁兰酶有p r o m o z y m e2 0 0 l ( 2 0 0 p u n g ) 和p r o m o z y m e6 0 0 l ( 6 0 0 p u n m l ) ，酶活是在4 0 c ，p i t 5 0 时测定的。温度对酶活的影响为p h 5 0 、第一章绪论6 0 | 。c 时酶活最大，4 54 c 和6 8 。c 时活力仍为6 0 4 c 的二分之一，2 0 4 c 时相对酶滔小于2 0 ；p h 对酶活的影响为温度6 0 。c 时，p h 5 0 左右酶活最人，p h 4 0 和p h 6 0时酶活降至5 0 以下，p h 3 3 时酶活接近0 ；在6 0 ，p h 4 ，5 5 5 时，7 2 h 后仍可以保留5 0 6 5 的酶活。n o v o 公司的p r o m o z y m e 占领了中国乃至世界的大部分市场份额，如今，它是应用的最广、产量最大的普鲁兰酶。”“11 9 8 6 年，h 本的y o s h i y u k iy a k a s a k i 报道了一株能产生耐热、耐酸普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，被命名为b a c i l l u ss u b t i l i st u 。此菌种所产生的为普鲁兰酶和淀粉酶的混合酶，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽糖，水解普鲁兰糖为麦芽三糖。其中普鲁兰酶最佳作用温度为6 0 c ，最佳作用p i 为7 0 7 5 ，但在p h 5 0 时亦有约5 0 的酶活。“”1 9 8 7 年，德国的e m a d i 和g a n t r a n i k i a n 等报道了株能同时产一淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种：耐热产硫梭蔺( c l o s t r i d i u mt h e r m o s u l f u r o g e n e s ) 。该菌种所产普鲁兰酶最适反应温度为7 06 c 7 5 。c ，最适作用p h 为4 9 5 2 。“。”1 事实上，早在1 9 8 5 年，美国威斯康星大学的h h h y t m和密歇根州立火学的j gz e i k u s 就有过此菌种的报道，他们深入研究了通过此菌和c l o s t r i d i u mt h e r m o h y d r o s u l f u r i c u m 同培养以提高酶产量的机理“。其实，产普鲁兰酶的菌种还有很多，象中间埃希氏杆菌e ，c h e r i c h i am m r m e d i a ，缓和链球菌s t r e p t o c o c c u sm i t i s 以及链霉菌s t r e p t o m y c e s 妒等。“。“总的柬说，在目前发现的产普鲁兰酶微生物中主要类为杆菌类。它们所产普鲁兰酶耐热性都不是太高，其最适温度最高为7 0 。c 7 54 c ，因此不适用丁淀粉的液化过程。为了配合淀粉的液化过程，希望开发出耐高温普鲁兰酶，自上世纪九 年代起，国外科学家把注意力转移至在高温下生存的极端高温微牛物，并分离出许多产耐热性的普鲁兰酶的极端微生物。主要有高温厌氧菌( 7 h e r m o a n a e r o b a c t e rb r o c k i i , 7 h e r m o a n a e r o b i u mt o k 6 一b 】t h e r m o a n a e r o b a c t e rt h e r m o h y d r o s u l f u r i c u s ，t h e r m o a n a e r o b a c t e r i u mt h e r m o s u l f u r i g e n e se m l ，t h e r m o a n a e r o b a c t e r i u ms a c c h a r o l y t i c u mb 6 a r 1 ，t h e r m o a n a e r o b a c t e rf i n n i id s m 3 3 8 9 ，t h e r m o b a c t e r o i da c e t o e t h y l i c u sd s m 2 3 5 9 ，t h e r m o a n a e r o b a c t e re t h a n o l i c u s d s m 2 2 4 6 ) 、嗜热古细莳( p y r o c o c c u s w o e s e i ，p y r o c o c c u s f u r i o s u s ) 以及d e s u f ，b r o c o c c u sm u c o s u s ，f e r v i d o b a c t e r i u mp e n n a v o r a n sv e n 5 等。这些微第一章绪论生物所产普鲁兰酶能耐7 09 c 1 0 0 高温，最适p h 为5 6 ，可用于淀粉的液化。其中p y r o c o c c u s f u r i o s u s c e 能同时产生极高产量的耐高温的淀粉酶和普鲁兰酶，但由于其最适生长温度为1 0 0 ，发酵工艺非常困难，另外这些耐高温微生物所产酶大多为胞内酶，不分泌到细胞外。“。1 ”1 因此如果直接采用这些菌株生产普鲁兰酶，很难t 业化。如果想这些耐热普鲁兰酶真正得到应用，必须采用基因工程手段构建新的菌株进行生产。1 2 1 2 碱性普鲁兰酶的主要产生菌种碱性普鲁兰酶不仅在p h 6 o 1 1 0 有较稳定的酶活，而且具有较高的热稳定性。在碱性条件下能专一陛水解茁霉多糖、淀粉、糖原、支链淀粉和相应低聚糖中的。一1 ，6 一糖苷键。可以显著提高淀粉原料的利用率，从而提高生产效率。与酸性普鲁兰酶不同的是，碱性普鲁兰酶是洗涤剂的一种有效添加剂，从而拓宽了该酶存工、生产中的应用。1 9 9 2 年，a r a 和l g a r a s h i 发现碱性普鲁兰酶以来，国外已有关于碱性普鲁兰酶的报道。”国内仅见马晓军等人选育得到1 株高产稳定、耐热的碱性普鲁兰酶生产菌株芽孢杆菌b a c h l u ss p s x 1 2 c 6 7 ”。1 2 2 基因工程技术在普鲁兰酶研究领域应用概况随着基因工程技术的发展，利用基因工程技术改造菌种，使低产菌成为高产菌并减少下游：l ：艺的成本，这在世界范围内越来越广泛地得到重视并加以应用。从上世纪八十年代起，基因工程技术逐渐应用于普鲁兰酶的研究与j f 发中。1 9 8 4 年，目本科学家利用r p 4 ：m u c t s 把k l e b s i e l t a a e r o g e n e s 中的普鲁兰酶基因体内转移入大肠杆菌并在其中得以有效表达，但此大肠肝菌的酶活水平不高且在非选择性培养基中表现型极不稳定。1 9 8 5 年，t a k i z a w a 通过把普鲁兰酶基l * i ( 包括结构基因和操纵基因) 克隆入多拷贝载体p b r 3 2 2 ，得到比野生菌株酶活水平高2 0 4 0 倍的工程菌，此工程菌能保持高酶水平二周。在上述研究中，大部分的酶都足胞内的，不分泌到胞外，而k l e b s i e l l a a e r o g e n e s 则往往在细胞表面积聚普鲁兰酶，这种现象是工业生产中所不需要的。“”1 9 9 9 年，t e a g u ew ，m a r t i n 等人从b a c i l l u sn a g a n o e n s i s ( a t c c 5 3 9 0 9 ) ( u s p t 0 6 ，3 0 0 ，1 1 5 ) 中分离出了普鲁兰酶基l 盍f ，并在原核生物表达系统枯草芽孢杆菌中得到了表达，所产生的重组普鲁兰酶6第一章绪论具有很好的应用特性。该酶在6 0 。c 时测得最适反应p h 为5 0 ，在p h 4 5 条件下测得最适温度为6 2 5 ：存p h 4 5 ，6 0 。c 保温5 5 h 仍有5 0 的残余酶活，具有较好的热稳定性“。”3 。自此以后许多普鲁兰酶基因得到了克隆和表达。特别是进入九十年代后，这些工作进展速度大大加快，相继有许多耐热普鲁兰酶基凼，特别足上述高温菌的普鲁兰酶基因被克隆、测序、在大肠和枯草杆菌中表达，并申请专利保护。但真下形成产业化的还并不多见。用于克隆和表达普鲁兰酶基因的微牛物见表1 2 。表1 2 _ 【 j 于克隆和表达普鲁兰酶基因的微生物t a b 1 2m i c r o b i a ls o u r c e sf o rc l o n i n ga n de x p r e s s i o no f t h ep u l l u l a n a s eg e n e s第一章绪论从以上这些报道中可以看出，目前关于基因工程技术在普鲁兰酶研究领域的探索还是有很多，这证实了利用基因工程手段来提高普鲁兰酶表达的有效性。但至今国内还没有从微生物中克隆出普鲁兰酶基因，构建基因工程体系，得到新普鲁兰酶的报道“。综上所述，从目前普鲁兰酶的应用和研究现状来看，以后研究和发展的方向t 要有三个方面：( 1 ) 通过基因工程手段构建基因工程菌，进一步提高酶的产量和活性，降低生产成本，真l f 实现该酶产业化；( 2 ) 利用定点突变技术进一步提高其应用特性，如改变其对底物的亲和性、p h 适性和耐热特性等；( 3 ) 从应用上来看，目前普鲁兰酶主要应用予以淀粉为原料的食品等t 业部门，特别是在淀粉糖和酿造行业中应用广泛，因此高活性液体普鲁兰酶的丌发和应用将具有巨大的市场。1 3 普鲁兰酶的应用“由于普鲁兰酶能够专一性地切开支链淀粉分支点中的a 一1 ，6 一糖苷键，从而剪下整个侧支，形成直链淀粉，故最早被应于淀粉、糖原及其它有关化合物细微分子结构的理论研究。近年来，普鲁兰酶已作为淀粉解支酶类中的一个新酶种，应用于以淀粉为原料的食品等：i ：业部门，大规模地提高了淀粉的利用率和牛产效率。普鲁兰酶呵以单独使用，亦可与其它酶配合使用，相辅相成收到良好的效果。它的应用主要表现在以下几个方面：( 1 ) 单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉直链淀粉具有凝结成块、易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油腊有良好的隔绝性，又因涂布丌展性好，故适合于作为食品的保护层。其醋酸衍生物又可作为纺织纤维，还用于浆纱、纤维卜光以及作为胶粘剂、包扎材料等等。直链淀粉还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装盛油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来，在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些力面具有8第一章绪论较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉制成直链淀粉后，也许可以制成高质量的粉丝。般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占2 0 ，支链淀粉含量约为8 0 ，工业上每牛产1 吨直链淀粉就有4 吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法得到含直链淀粉6 0 的玉米新品种，但不适- ：大 _ f 生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收得率可达1 0 0 。( 2 ) 普鲁兰酶与b 一淀粉酶配合使用生产麦芽糖饴糖足我国传统的淀粉糖产品，其中所含麦芽糖比率较高，广泛用于糖果、糕点等食品f - l k 。目前生产方法是先以细菌n 淀粉酶进行液化，再用麦芽或鼓皮中的b 一淀粉酶进行糖化，这样只能水解侧链部分，接近交叉地位的n 一1 ，6 一糖苷键时，水解反应停止。但普鲁兰酶与0 一淀粉酶台并水解，能使支叉丌裂，使淀粉酶提高了水解程度，降低了b 一极限糊精