（微电子学与固体电子学专业论文）聚合酶链式反应芯片系统的研究.pdf

聚合酶链式反应芯片系统的研究 聚合酶链式反应芯片系统的研究 邹志青( 微电子与固体电子学) 指导老师：赵建龙研究员，徐元森院士 摘要 聚合酶链式反应芯片p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n c h i p ( p c r c h i p ) 系统是近年来 快速发展的- - i 1 新兴学科。它利用微机电系统( m e m s ) 技术在石英、硅、有机聚合 物等基片上制作一系列微通道、微池等空间结构元件以及微传感器、微执行器等控制 元件，利用芯片体积小、比表面大、热传导效率高的特点，在芯片上实现d n a 片段 的快速扩增，已经开始在生命科学、医药诊断、环境监测、战场检测等领域得到应用。 本论文系统研究了p c r 芯片系统，建立了一套从p c r 芯片设计、制作、温度控 制到扩增实现的研究方法。 本论文的主要工作有： 1 总结了前人p c r 芯片及系统的研究情况，提出了自己的研究方案； 2 设计并优化了集成a u 和p t 材料的微加热器和温度传感器的p c r 芯片，提高 r 温控效率，缩短了扩增时间，热循环速度是常规p c r 的4 倍； 3 设计了对应的小型温度控制系统，并针对集成式p c r 芯片进行了调试和校准， 具有体积小、功耗低、操作简单、温控迅速准确等优点； 4 应用该p c r 芯片系统进行d n a 扩增实验，解决了芯片温度控制、芯片密封、 内壁表面清洗和修饰和体系优化等相关技术，实现了微量d n a 的快速扩增； 5 通过条件优化，尝试了p c r 芯片扩增产物的在片荧光检测。 本论文研究表明，p c r 芯片系统具有体积小、功耗低、扩增时间短等优点。但 是要真正推向实际应用，还需要进一步改进宏微接口，进一步降低芯片的制作成本， 扩大p c r 芯片的应用范围。 关键词：p c r 芯片，微加热器和温度传感器，温度控制，有限元分析 中国科学院上海微系统与信息技术研究所博士学位论文 a b s t r a c t s t u d yo np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nc h i ps y s t e m z o uz h i q i n g ( m i c r o - e l e c t r o n i c sa n ds o l i d e l e c t r o n i c s ) d i r e c t e db y ；p r o f x uy u a n s e na n dp r o f z h a oj i a n l o n g a b s t r a c t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nc h i p ( p c rc h i p ) s y s t e mi sn e w l yd e v e l o p e dr e s e a r c h f i e l d i ti sam u l t i d i s c i p l i n a r yt e c h n o l o g y , w h i c hh a sr o o t si nm i c r oe l e c t r om e c h a n i c a l s y s t e m ( m e m s ) ，e l e c t r o n i c s ，b i o c h e m i s t r ya n ds u r f a c ec h e m i s t r y t h em i c r o c h a n n e l s ， m i c r o c h a m b e r s ，m i c r o h e a t e r sa n dt e m p e r a t u r es e n s o r so nt h ec h i pa r ef a b r i c a t e db yu s i n g m e m st e c h n o l o g yo nt h es u b s t r a t eo fg l a s s ，s i l i c o n ，p o l y m e re t c i th a sb e e na p p l i e df o r l i f es c i e n c e ，m e d i c a ld i a g n o s t i c s ，f o r e n s i c sl a b o r a t o r i e s ，s a f e t yt e s t i n g ，b i o l o g i c a lw a r f a r e d e f e n c ee t c i n t h i sd i s s e r t a t i o n ，p c rc h i ps y s t e mh a sb e e ns y s t e m i cs t u d i e d ，i n c l u d i n gc h i p d e s i g n ，m i c r o f a b r i c a t i o n ，t h e r m a lc y c l i n ga n dp c rr e a l i z a t i o n ih et o p i c so ft h i sd i s s e r t a t i o na r ep r e s e n t e db e l o w ： 1 r e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to np c rc h i pi sr e v i e w e d t h e nn e wp r o j e c t sw e r e c a r r i e do u t 2 s e v e r a ln o v e lp c rc h i p si n t e g r a t e dw i t hh e a t e r sa n ds e n s o r sa r ed e s i g n e d t h e d e s i g n e ds y s t e mh a ss u c c e s s f u l l yd e m o n s t r a t e dat e m p e r a t u r ef l u c t u a t i o no f 0 5 d u r i n gt h e r m a lm u l t i p l e x i n go fu pt o2 2c h a m b e r s ，af u l ls p e e do f3 0m i nf o r3 0 一c y c l e p c r 3 d e s i g na n dc o n s t r u c t e dap e r i p h e r a lt h e r m a lc o n t r o ls y s t e mf o ri n t e g r a t e dp c r c h i p s t h et h e r m a lc o n t r o l l e rh a sa d v a n t a g e so fs m a l lv o l u m e ，l o wp o w e rc o n s u m p t i o n a n dr e a l t i m ea c c u r a t et e m p e r a t u r es e n s i n ga n dc o n t r 0 1 4 。t h ee f f e c to f t e m p e r a t u r ea d j u s t m e n t ，c h i pc a p p i n g ，s u r f a c et r e a t m e n t ，p o l y m e r a s e c o n c e n t r a t i o na n dc h i ps t r u c t u r ea r es t u d i e s r a p i dp c ro nc h i pi sd e m o n s t r a t e d 5 c h i pp c rp r o d u c t sc a nb ei ns i t ud e t e c t e db yl a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ，t h e m e t h o dr e s o l v e dt h ed i f f i c u l t yo f m i n i m a ls a m p l ei ns i t ud e t e c t i o n t h ed i s s e r t a t i o ns h o w e dt h a tp c rc h i ps y s t e mh a ss o m ea d v a n t a g e ss u c h 宣sl o w s a m p l ec o n s u m p t i o n ，l o wp o w e rc o n s u m p t i o na n dr a p i dt h e r m a lc y c l e b u th o wt o d e c r e a s et h ec o s to fp c rc h i ps y s t e ma n de n h a n c ei t ss t a b i l i t yn e e df u r t h e rw o r k s k e yw o r d s ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nc h i p ；m i c r o h e a t e ra n dt e m p e r a t u r es e n e o r ； t h e r m a lc o n t r o l ；f i n i t ee l e m e n ta n a l y s i s 中国科学院上海微系统与信息技术研究所博士学位论文 i i 。 聚合酶链式反应芯片系统的研究 第一章绪论 1 1 引言 自从1 9 8 5 年由m u l l i sk 等 1 】人建立了聚合酶链式反应f p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ，p c r ) 技术以来，因其展现了前所未有的灵敏度和特异性，受到人们的高度 重视，已经成为基因研究的关键技术，广泛应用于生物医学的各个领域，包括分子生 物学、疾病诊断、免疫学、人类基因组工程、法医学、古生物学及动物和植物学等。 m u l l i s 等人因发明此项技术于1 9 9 3 年获得诺贝尔化学奖。 现在的p c r 热循环仪需耗用较多昂贵的生物试剂，加热和冷却的速度慢，反应时 间长。所以向微型化、集成化和生化全分析系统的方向发展，已经成为当前研究的热 点。聚合酶链式反应芯片( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nc h i p ，p c rc h i p ) 就是利用微机电 系统( m i c r oe l e c t r om e c h a n i c a ls y s t e m ，m e m s ) 技术，在硅片、玻璃片等基片材料上 制作微管道、微池等空间结构元件以及微阀、微加热器和温度传感器等控制元件，利 用芯片体积小、比表面积大、可集成度高等特点，实现在芯片上的d n a 快速扩增。 与常规的p c r 扩增技术相比，p c r 芯片具有试剂用量少、扩增时间短、可集成和便携 化等优点，已广泛应用于生命科学的各个领域。 1 9 9 3 年n o r t h r u pm a 等| 2 1 人首先采用m e m s 技术在硅片上设计和制作了微型的 p c r ：岱片，成功的实现了芯片上d n a 的扩增，最近几年，不仅可以制作微池阵列， 实现多个d n a 样品的同步扩增，而且将微型的温度传感器和加热器等集成在芯片卜， 成为微型p c r 仪器，最显著的优点是缩短了检测分析的时间和便携化便携化。 围绕p c r 芯片系统的原理、方法和应用的研究工作，本章就以下几个方面进行 论述，并提出本工作的研究思路。 1 、p c r 原理及其特点； 2 、p c r 芯片系统技术的历史及其发展； 3 、p c r 芯片与微全分析系统。 中国科学院上海微系统与信息技术研究所博士学位论文 第一章绪论 1 2 聚合酶链式反应( p c r ) 的发展 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 简称p c r ) ，又称无细胞分子克隆技术 或特异性d n a 序列体外引物定向酶促扩增法，可将极微量的靶d n a 特异的扩增上 百万倍，能检测单分子d n a 的样品，从而大大提高对d n a 分子的分析和检测能力， 是基因技术的一次重大发明。因而此方法立即在生物医学的各个领域得到广泛应用和 迅速发展。 p c r 技术是由c e t u s 公司和加利福利亚大学1 9 8 5 年联合创造的，主要贡献者为 k a r ybm u l i s 和h e n e r yae r l i c h 。该方法首先被应用于人b 一珠蛋白d n a 的扩增及镰 刀状红细胞贫血病的产前诊断。自8 5 年首次报道p c r 方法以来，p c r 被广泛应用于 分了生物学、遗传工程、肿瘤学、微生物学、生物化学、法医学、预防医学及病毒和 病原体的诊断等众多领域，并发挥越来越大的作用。因而发明人k a r ybm u l i s 获1 9 9 3 年诺贝尔化学奖。瑞典皇家科学院评价：“p c r 方法已经广泛应用于生物医学中。该 方法i 刊d n a 测序法结合起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工具。” 后来使用了1 9 7 6 年c h i e n 等分离的热稳定性t a qd n a 聚合酶，使p c r 操作大 为简化；1 9 8 7 年k a r ym u l l i s 等完成了自动化操作装置，使p c r 技术进入实用阶段。 1 2 1p c r 技术的原理 p c r 是一个由温度控制和酶催化过程组成的不同温度下三步反应周期性重复的 过程，如图1 _ 1 所示 图1 1p c r 扩增温度循叫v 原理 反应全过程分d n a 模板变性、引物退火及引物延伸三个步骤。首先d n a 模 板变性，通过9 4 高温使靶d n a 双链热解成两单链；第二步引物退火，通过温 度降低，约5 0 6 5 时一对引物分别与d n a 模板双链的特异性杂交；第三步引 物延伸，7 2 。c 左右在d n a 聚合酶催化下，引物沿着模板d n a 的3 末端向5 末端 方向延伸，合成了一条与模板完全互补的新链，使得靶d n a 的数量增加了一倍。 中国科学院上海微系统与信息技术研究所博士学位论文 聚合酶链式反应芯片系统的研究 如此重复变性、退火及延伸三个过程，靶d n a 的数量呈指数性增加，经过n 次循 环扩增后，p c r 扩增产物中的模板分子的数量可以表示为： n = n 0 2 ”( 1 1 ) 实际上应考虑每次循环模板与引物的结合率即扩增效率，则可表示为： n = n o ( 1 + 毋”( 1 2 ) 式巾，e 为扩增效率，一般为o 8 0 9 。由此可见特异性扩增产物呈指数性增加，大 大提高了微量基因的检测效率。 p c r 扩增的影响条件很多，主要分扩增体系条件和温度控制条件两类。前者有 模板、引物、缓冲液、m g ”浓度、耐高温酶活性等。后者主要包括三个温区温度和 时间、升降温速度以及循环次数等。 分析d n a ，一般分二阶段进行，第一阶段是p c r 扩增，第二阶段是扩增产物的 检测，根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可分析扩增 产物d n a 链的长度，d n a 探针杂交除可鉴定扩增产物外，还有助于产物的分型； s o u t h e r n 杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小，增加检测的特异性 与敏感性，此外还有一系列产物分析法( p c r - e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ， p c r e l i s a ；p c r e n z y m ei m m u n o a s s a y ，p c r e i a ；p c r o l i g o n u c l e o t i d el i g a t i o n a s s a y ，p c r o l a 等) 均有助于产物的精确分析。 1 2 2p c r 技术的特点 ( 1 ) 特异性高：刚开始p c r 所用的d n a 聚合酶是大肠杆菌的d n ap o l y m e r a s ei 的k l e n o w 大片段，其酶活性在9 0 。c 会变性失活，需每次p c r 循环都要重新加入 k l e n o w 大片段，同时引物是在3 7 。c 延伸( 聚合) 易产生模板一引物之间的碱基错配、 导致特异性较差。1 9 8 8 年s a i k i 等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定 的t a qd n a 聚合酶，在热变性处理时不被灭活，不必在每次循环扩增中再加入新酶， 可以在较高温度下连续反应。同时显著地提高p c r 产物的特异性，序列分析证明其 扩增的d n a 序列与原模板d n a 一致。扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、 其错配率一般只有约万分之一，足可以提供特异性分析。 ( 2 ) 高灵敏度：理论上p c r 可以按2 ”倍数扩增d n a 十亿倍以上，实际应用已证 实可以将极微量的靶d n a 扩增成百万倍以上到足够检测分析量的d n a 。能从1 0 0 万个细胞中检出一个靶细胞，或可检出病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含 o 0 1 p g 的感染细胞的特异性片段样品。 ( 3 ) 快速及无放射性：一般在2 小时内约可完成3 0 次以上的循环扩增，加上用电 泳分析。只需3 - 4 小时便可完成，不用分离提纯病毒，染色体d n a 及总r n a 均可 中国科学院上海微系统与信息技术研充所博士学位论文 第一章绪论 作为反应起始物，可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、 活体组织等粗制的d n a 的提取液来扩增，省去费时繁杂的提纯程序，扩增产物用一 般电泳分析即可，无放射性易于推广。 ( 4 ) 简便：扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱繁琐的基因方法，可 直接从r n a 或染色体d n a 中或部分d n a 已降解的样品中分离目的基因，省去常规 方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可 检测。如在p c r 引物端事先构建一个内切酶位点，扩增的靶d n a 可直接克隆到m 1 3 ， p u c l 9 等相应酶切位点的载体中。 ( 5 ) 可扩增r n a 或c d n a ：先按通常方法用寡聚胸苷酸引物和逆转录酶将m r n a 转变成单链e d n a ，再将得到的单链e d n a 进行p c r 扩增，即使m r n a 转录片段只 有1 0 0 n g e d n a 中的0 0 1 ，也能经p c r 扩增l n g 有2 4 2 碱基对长度的特异片段，有 些外显子分散在。段很长的d n a 中，难以将整段d n a 大分子扩增和做序列分析。 若以m r n a 作模板，则可将外显子集中，用p c r 一次便完成对外显子的扩增并进行 序列分析。 1 2 3 p c r 技术的应用 p c r 技术的问世大大加快了各种生物基因组织结构研究的进展。即使是高度复 杂的基因组，如果已知其任一区域侧翼的核苷酸序列，即可应用此技术在数小时内完 成对该区域序列的特异性扩增。实际卜，应用p c r 技术通过“拷贝和连接”可以对 任何d n a 进操作。因此p c r 技术在分子生物学、疾病诊断、免疫学以及基因组工程 等领域都有非常广泛的应用： 分子生物学基因克隆；d n a 测序：分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控 蛋白质结合d n a 序列；转座予插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成基因的构建； 构建克隆或表达载体；检测某基因的内切酶多态性； 疾病诊断细菌( 螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、 致病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等) ，病毒( h t l v 、h i v 艾滋 病病毒、h b v 乙肝病毒、h p v s 人乳头状瘤病毒、e v 、c m v 、e b v 、h s v 、麻疹病 毒、轮状病毒、细小病毒b 1 9 等) ；寄生虫( 疟疾等) ，人遗传病( l e s h - n y h a n 综 合症、地贫、血友病、b m d 、d m d 、囊性纤维化等) 等地基因诊断； 免疫学t 细胞受体或抗体多样性的定性；自身免疫病基因绘图：淋巴因予定量 等。 人类基因组工程遗传图谱的构建( 检测d n a 、多态性或精子绘图) ；物理图谱 的构建；测序，表达图谱的构建： 中国科学院上海微系统与信息技术研究所博士学位论支 第一章绪论 作为反应起始物，可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、 活体组织等粗制的d n a 的提取液米扩增，省去费时繁杂的提纯程序，扩增产物用一 般电泳分析即可，无放射性易于推广。 ( 4 ) 简便：扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱繁琐的基因方法，可 直接从r n a 或染色体d n a 巾或部分d n a 已降解的样品巾分离目的基冈，省去常规 方法中须先进行克隆后再作序列分析的儿繁程序。己固定的和包埋的组织或切片亦可 检测。如在p c r 引物端事先构建一个内切酶位点，扩增的靶d n a 可直接克隆到m 1 3 ， p u c l 9 等相应酶切位点的载体中。 ( 5 ) 刖扩增r n a 或e d n a ：先按通常方法用寡聚胸苷酸引物和逆转录酶将m r n a 转变成单链e d n a ，再将得到的单链e d n a 进行p c r 扩增，即使m r n a 转录片段只 有1 0 0 n g c d n a 中的。川，也能经p c r 扩增l n g 有2 4 2 碱基对长度的特异片段，有 些外显子分散在段很长的d n a 中，难以将整段d n a 大分子扩增和做序列分析。 若以m r n a 作模板，则可将外显子集中，用p c r 一次便完成剥外显子的扩增并进行 序列分析。 123 p c r 技术的应用 p c r 技术的问世大大加快了各种生物基因组织结构研究的进展。即使足高度复 杂的基因组，如果已知其任一区域侧翼的核苷酸序列，即可应用此技术在数小时内完 成对该区域序列的特异忖：扩增。实际上，应用p c r 技术通过“拷贝和连接”可以对 任何d n a 进操作。因此p c r 技术在分子生物学、疾病诊断、免疫学以及基因组工程 等领域都有非常广泛的应用： 分子生物学基因克隆；d n a 测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与凋控 蛋白质结合d n a 序列；转座子捕入位点的绘图；检测基冈的修饰；合成基因的构建； 构建克隆或表达载体；检测某基凼的内切酶多态性； 疾病诊断细菌( 螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆曲、 致病大肠杆菌、痢疾杆茼、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等) ，病毒( h t l v 、h i v 艾滋 病病毒、h b v 乙肝病毒、h p v s 人乳头状瘤病毒、e v 、c m v 、e b v 、h s v 、麻疹病 毒、轮状病毒、细小病毒b 1 9 等) ；寄生虫( 疟疾等) ，人遗传病( l e s h - n y h a n 综 合症、地贫、血友病、b m d 、d m d 、囊性纤维化等) 等地基因诊断： 免疫学l 细胞受体或抗体多样性的定性；自身免疫病基因绘图：淋巴因子定量 等。 人类基因组工程遗传图谱的构建( 检测d n a 、多态性或精于绘图) ：物理图谱 的构建：测序，表达图谱的构建； 的构建；测序，表达图谱的构建； 中国科学院上海微系统与信息技书研究所博士学桩论文 聚台酶链式反应芯片系统的研究 法医犯罪现场标本分析； 古生物学考古与博物馆标本分析； 动物学动物传染病的诊断等； 植物学检测植物病原等； 1 3 p c r 芯片系统 “用更小的样品体积、更短的操作时间、更快的分析方法、并使用越来越少的材 料来完成更多的p c r 叫”，这是p c r 发展的方向，而芯片技术是p c r 微型化、集成 化、便携化的必由之路。通过在硅片或玻璃片等基片上加工一系列微管道、微池等空 间结构元件以及微阀、微加热器和温度传感器等控制元件，可以完成p c r 微系统。 1 3 1p c r 芯片的特点 芯片式p c r 微系统具有以下优点： 扩增时间短p c r 芯片体积小、热容小、传热距离短、可集成微型加热器和温度 传感器元件提高热传递效率，因此p c r ：枣片可以达到很高的加热和致冷速度( 1 0 5 0 s ) ，扩增时间是常规p c r 热循环仪的1 4 1 1 5 ； 扩增效率高由于p c r 芯片的比表面积极大，样品与周围环境的热交换性能增 加，样品温度的热平衡时间大大缩短，这样就提高了d n a 变性和退火的效率，并可 使聚合酶保持较高的活性，最终p c r 扩增效率得到显著提高，检测灵敏度也比常规 p c r 的要高； 可集成化通过已有的薄膜淀积和微加工技术在芯片底部集成微加热器与温度传 感器元件，实现在片温度控制和在片检测；另外，也可将p c r 芯片与微全分析系统 的其它功能单元( 如样品预处理、毛细管电泳分离) 集成于一体，实现整个分析的微型 化、自动化，提高分析速度。 1 3 2 p c r 芯片的发展和现状 聚合酶链式反应芯片( p c rc h i p ) 根据其反应液体流动形态可以分为微流控p c r 芯片( c o n t i n u o u s f l o wp c r m i c r o c h i p ，c f p c rc h i p ) 、p c r 微池芯片( m i c r o - c h a m b e r p c rc h i p ，m c p c r c h i p ) 。其中c f p c r 芯片反应速度快、温度控制简单，但是芯片 的清洗复杂、表面修饰困难，制作麻烦；而m c p c r 芯片体积小、热传导性能佳、 反应速度较快、表面修饰处理简单，并且工艺可以和c m o s 芯片制作工艺兼容，因 此受到了很多研究机构和研究人员的青睐，对它的研究也最详细。 ( 1 ) 微流控p c r 芯片 中国科学院上海微系统与信息技术研究所博士学位论文 第一章绪论 c f p c r 主要原理是让p c r 反应液在微管道中沿三个不同温区连续流动实现扩 增。该方法溶液的升降温速度快，一个2 0 个循环的p c r 最快只需要1 5 分钟。1 9 9 8 年k o p pmu 等”1 首先报道了一种c f p c r ：芯片，芯片由石英玻璃片经光刻、腐蚀和 键台的方法制作而成。三个温度区( 9 5 、7 7 和6 0 。c ) 由恒温铜块来实现，加热 器的功率为5 w ，温度由标准p i d ( p r o p o r t i o n a l i n t e g r a l d i f f e r e n t i a lc o n t r o l l e r ) 控制， 温度传感器为固定在玻璃背面的p t 热电阻，该芯片可在1 5 n 1 8 7 m i n 扩增1 7 6 b p d n a 的特异性片段。 2 0 0 1 年德国的s c h n e e g a l 3i v o n n e 等 5 - 6 1 改进和提高了这种c f p c r 芯片( 如图 1 2 ) 。芯片采用硅光刻腐蚀微管道状，并且在玻璃盖板上也腐蚀了对应的微管道， 硅一玻璃键合后的微管道截面呈椭圆状，可提高液体的流动性能。此外，为了提高芯 片的温度控制效率和三个温区温度的实时精确控制，集成了微加热器和p t 温度传感 器，在温区间刻蚀了热隔离槽，用来降低温区间的热交叉。该p c r 芯片在3 5 m i n 成 功扩增了1 0 6 ，3 7 9 和7 0 0 b p 的d n a 片段。 图1 2 硅一玻璃材料的c f p c r 芯片。 左一j 笛片正面微管道结构，芯片尺寸为2 6 m m 5 0 r a m ，微管道的宽2 5 0 “m ，深1 0 0 u x n ， 总长1 5 1 2 m m ，共有2 5 个温度循环；右一芯片反面集成微加热器和温度传感器结构， 采用p t 薄层金属，其中变性、延伸温控区分别有3 个温度传感器和2 个微加热器， 退火温区有3 个温度传感器，无加热器 随后关于c f p c r 研究和应用报道逐渐增多，f u k u b at 等【7 l 报道了一种基于聚合物 材料p d m s ( p 0 1 ) r d i m e t h y ls i l o x a n e ) 一玻璃结构的c f p c r 芯片，软刻蚀加工技术和 i t o ( i n d i u mt i no x i d e ) 玻璃的应用，降低了制作成本，提高了芯片的性能。s u nk 1 等设计的全透明的i t o 玻璃一玻璃结构的c f p c r 芯片可直接进行在片荧光检测。2 0 0 3 年o b e i dpj 等1 9 1 报道了一种集成反转录和p c r 的连续流动式p c r 芯片，在普通c f - p c r 的三温区增加了第四温区用于r n a 的反转录复制，同时在微通道中增加了一系列微 孔可以选择扩增循环的数目2 0 、2 5 、3 0 、3 5 或4 0 。2 0 0 4 年美国德州大学g a s c o y n e p 等 中国科学院上海微系统与信息技术研究所博士学位论丈 聚合酶链式反应芯片系统的研究 ”o 报道了用于疟疾检测的集成微流体芯片，整个j 占片分三个功能单元：介电电泳一 场流分离的细胞分离单元、细胞隔离和裂解单元、p c r 的扩增及检测单元，该芯片可 以完成对疟疾感染的细胞分离、裂解、p c r 和检测等多个功能。 微流控p c r 芯片反应迅速快、扩增时间短，但是该p c r 芯片由于管道比较长，比 表面积极大，因此无论式管道的清洗、修饰，还是加工制作都比较麻烦，并且很容易 产生气泡，堵塞微管道，限制了该芯片的进一步应用。 近年来，微流控p c r 芯片采用了一些新的结构和驱动方式，通过微型泵驱动样品 在不同温控区进行循环或者往复运动实现p c r 扩增。该驱动力包括气压i 、电场力 l l2 1 、电磁场力i 、液体对流【”i 、蠕动泵f 1 5 - 1 6 ，或电浸润”1 等多种方式。b umq 等m i 报道了一种蠕动式的p c r 芯片( 如图1 3 ) ，该芯片具有三个温度控制区域，流体在 蠕动泵驱动下，在微管道内往复运动实现升降温过程，完成p c r 扩增。整个芯片采用 硅玻璃材料，集成了三对p t 微加热器和温度传感器实现三个温度控制区域。p c r 反应 液体积量为1 此，在微管道内运动，采用压电蠕动泵驱动方式，通过集成的p n 型二极 管和光纤探头确定液体的运动位置，从而实时控制和检测液体的流动状况。这类p c r 芯片结构新颖，控制巧妙，为p c r 芯片的发展作了大胆尝试，但是液体的驱动控制复 杂，忽略了样品密封、样品温度控制效率等因素，对p c r 芯片扩增缺乏全面性的考虑。 图1 3 压电驱动往复蠕动式p c r 芯片结构示意图 ( 2 ) 微池式p c r 芯片 与c f p c r 芯片的原理完全相反，m c p c r 芯片的样品不流动，温度循环通过外 中国科学院上海微系统与信息技术研究所博士学位论文 第一章绪论 部或内部对其加热和致冷操作来实现。由于芯片采用m e m s 技术制作，微池体积很 小、比表面大、集成度高、易于整合其它功能芯片形成“芯片实验室”( l a b o n a - c h i p l 。 关于该类p c r 芯片的研究和应用的报道较多，是p c r 芯片系统的研究和发展的主流。 m c - p c r 芯片系统的完整结构包括p c r 芯片、加热和致冷装置、温度控制系统 和扩增信号检测系统等部分。图1 4 是香港科技大学的l a oaik 等i ”i 报道的p c r 芯 片系统的总体结构示意图。正面的微池用于生物试剂的贮存密封；反面集成微加热器 和温度传感器元件用于实时温度控制。温度控制系统对芯片的温度传感器检测信号采 集和分析，通过计算机核心分析和控制，并输出微加热器控制信号，从而实现对p c r 芯片温度的程序控制。最后p c r 扩增产物通过c c d 检测器或其它检测设备进行在片 实时检测。其中，p c r 芯片是整个系统的核心。 l e a ? re 0 随0 ? fp a d 图1 4p c r 芯片系统的整体结构示意图 m c p c r 芯片的研究主要集中在提高微池的数量、缩短p c r 扩增时间、以及p c r 芯片扩增实现等几个方面。 微池式p c r 芯片结构简单、制作容易，因此很容易在单个芯片上集成多个微池， 实现高通量扩增检测5 忡1 2 3 l 。这方面研究比较典型的是m a t s u b a r ay 等2 0 1 设计和制 作的p c r 微池阵列芯片，该p c r 芯片具有1 2 4 8 个微池( 如图1 5 ) ，每个微池体积 仅为4 0 n l ，p c r 反应液用点样仪加入每个微池，表面用石蜡油密封，扩增产物用荧 光p c r 技术实时检测。用该芯片对f l - a c t i n ，s r y , r h d 等基因扩增检测，成功得实现 了0 4 拷贝微池浓度的模板的扩增检测。该p c r 芯片极大得提高了p c r 的检测通量 和榆测灵敏度，可用于大批量生物样品的高灵敏扩增检测；但是该结构也存在着诸多 缺陷，例如进样操作复杂、芯片密封性差、样品问很容易交叉污染，此外芯片温度依 靠外围装置控制，温度控制效率低，且所有样品的温度控制条件。 o e 国科学院上海微系统与信息技术研究所博士学位论文 聚合酶链式反应芯片系统的研究 图1 5 微池数目为1 2 4 8 的p c r 芯片阵列( 左) ，和不同模板数量下p c r 微池阵列的扩 增产物在片荧光检测结果f 右) 如前所述要提高芯片温度控制效率，需要在芯片上集成小型温度控制元件，随着 m e m s 微加工技术的发展，在芯片上集成微加热器和温度传感器元件成为可能，近 几年来，p c r 芯片集成小型温度控制元件进行在片温度控制得到了迅速发展l “。2 ”。 p o s e rs 等口4 】基于m e m s 微加工技术在p c r 芯片背面集成了n i c r 微加热器和p t 温度 传感器( 如图1 6 ) ，成功地进行了快速p c r 扩增检测，其设计的微加热器和温度传 感器采用插指电极的形式，这样的好处是电极和传感器可以充分接近，芯片温度控制 效率显著改善：当加热功率2 5 w 时，加热速度可达8 0 s ；稳定在9 4 。c 时功率为 1 2 5 w ；芯片冷却速度可以达到一4 0 。c s ，温度波动性为0 1 。与常规p c r 技术相 比，该p c r 芯片功耗低、整体结构小、p c r 扩增迅速灵敏，集中体现了p c r 芯片的 优点。 图1 6 基于m e m s 技术的m c p c r 的典型结构。 左一正面微池结构：右一反面微加热器和温度传感器结构 其中，a 一玻璃盖片；b 一硅正面结构；c 一硅反面结构；1 一进出样孔；2 一微池密封 玻璃；3 一标记孔；4 一微池；5 一热隔离通道；6 n i c r 微加热器；7 一p t 温度传感器 如前所述p c r 芯片可分别实现高通量扩增和快速p c r 扩增，如将两者方法结合 中国科学院上海微系统与信息技术研究所博士学位论文 9 第一章绪论 在一起，就可以实现不同温度控制条件下的多个样品的并行p c r 扩增 3 0 - 3 3 l 。w i l d i n g p 等 ”研制了一种具有独立温度控制元件的p c r 芯片阵列，如图1 7 ，j 占片制作采用 标准c m o s 工艺，在2 6 m m 2 6 n g n 芯片上集成了1 0 1 0 个p c r 微池阵列，每个 p c r 微池底部集成了独立的温度控制元件，呈5 0 0 9 m 5 0 0 9 m 硅岛结构，含有多晶 硅微加热器和p n 结热电偶温度传感器，硅岛相互间距为5 0 0 r t m ，两者通过厚4 9 m 的 s i 3 n 4 s i 0 2 连接，因此热交叉影响很小，解决了p c r 阵列的加热效率和温度隔离的问 题，可以实现温度梯度p c r 。但是该芯片制作工艺复杂、成本高，并且微池为敞开 结构，也存在着样品密封、进出样困难以及样品污染等问题，影响了该芯片的进一步 应用和发展。因此既能保持芯片优异的独立温度控制的性能、又能降低芯片制作成本、 提高j 笛片密封性能是p c r 芯片阵列发展和应用的关键。 a t o pv i e w i 蕊 i 熬午 l 太蛋盘 c c r o s s s e c t i o n a iv i e w o 。 m c m u i r 图1 7 温度梯度p c r 芯片阵列 a p c r 芯片阵列的整体结构示意图：b 一砖岛正面微加热器与温度传感器控制结构 示意图；c 一硅岛侧面结构示意图；d 一硅岛结构正面照片 z o uq u a n b o 3 4 1 报道了一种低成本的独立温度控制阵列的方法。如图1 8 集成有微 加热器和温度传感器的硅基片通过倒装焊接的方式直接封装在同一个p c b ( p r i n t e d c i r c u i tb o a r d ) 板上，形成4 x 4 阵列的加热平台，p c r 芯片采用聚合物材料制作， 进行p c r 扩增时，将聚合物p c r 芯片贴放在微型加热平台上完成p c r 温度循环过 程。该储装焊接封装的芯片结构中，芯片散热除了空气对流散热外，还可利用p c b 板热传导散热，因此散热效率大大提高；此外该p c r 芯片加工制作方法简单，微池 间的热交叉很小，可以实现不同温度控制条件下的多个样品的同时扩增。但是由于微 池与加热器采用分离式结构，两者接触不紧密，热效率低是该芯片的主要缺点。 中国科学院上海微系统与信息技术研究所博士学位论文 厕面 剥 聚合酶链式反应芯片系统的研究 图1 8 热隔离的p c r 微加热器件 a 一聚合物材料的m c p c r 阵列芯片；b 一倒装焊接的微加热硅片阵列 聚合物材料制作p c r 芯片可以显著降低成本。近年来，关于聚合物材料制作的 p c r 芯片的研究报道也越来越多，常用的聚合物材料包括p d m s ( p o l y d i m e t h y l s i l o x a n e ) 3 5 - 3 6 ，s u 8 1 3 ”，聚酰亚胺( p o l y i m i d e ) ，p m m a ( p o l y m e t h y lm e t h a c r y l a t e ) 等。 聚合物材料制作的p c r 芯片具有加工简单、成本低、可大批量生产等优点；但是也存 在热传导性能差、表面处理复杂、集成微加热器和温度传感器困难等缺点，若能改善 这些性能，聚合物材料的应用将会大大增加。 p c r 芯片的扩增实现是p c r 芯片的另一个主要研究内容，其包括了芯片表面处 理、扩增条件优化、芯片密封等关键技术。其中，关于芯片表面处理的研究报道较多 f 3 v - 4 4 1 ，这是由于p c r 芯片随着比表面积的增加，芯片内壁很容易吸附p c r 反应液的 各种组分，引起p c r 芯片扩增效率的降低甚至完全抑制p c r 芯片。常见的内壁处方 法包括物理修饰和化学修饰两类，物理修饰有：表面淀积氧化层、化学涂层；化学修 饰主要采用硅烷化处理方法。g i o r d a n ob 等l 圳详细对比了各种化学涂层对p c r 芯片 扩增的影响，如p e g ( p o l y e t h y l e n eg l y c 0 1 ) 、p v p ( p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ) 、 h e c ( h y d r o x y e t h y l c e l l u l o s e l 、e p d m a ( e p o s y ( p o l y ) d i m e t h y l e a c r y l a m i d e ) 等，虽后发现 e p d m a 处理后的p c r 芯片扩增效率较高。f e l b e lj 4 3 1 则对比研究了几种硅烷试剂对 芯片内壁表面处理效率。y a n gj 等h 习通过p c r 扩增条件优化，提高了p c rj 墨片的扩 增灵敏度，成功实现了1 0 个e c o l i ( 即5 0 f g 基因组d n a ) 的模板浓度下的p c r 芯片 扩增。芯片密封性能对扩增结果影响很大，z h a oz 等l “j 采用有效的密封方法，降低 溶液气泡的产生，保证j - p c r 芯片的扩增结果。 中国科学院上海微系统与信息技术研究所博士学位论丈 第一章绪论 1 3 3p c r 在片检测方法及研究现状 ：薛片式p c r 仪的体积已经越来越小，扩增速度越来越快，因此对扩增产物的检 测技术的要求也有很大提高，快速灵敏、便携化、小型化是芯片检测技术的发展趋势。 p c r 扩增产物的在片检测的方法也有多种多样，例如光纤荧光检测、l e d 荧光检测、 电化学检测、d n a 杂交检测等。 t a y l o rtb 1 4 7 1 研究t p c r ：e ；片扩增产物的在片荧光检测，通过优化p c r 芯片表面 处理条件和扩增体系提高了在片荧光检测效率。g u l l i k s e na 等h 划和s c h a b m u e l l ecg j d g - 5 0 1 在p c r 芯片扩增产物的在片荧光