（食品科学专业论文）海产品加工副产物的生物技术开发与利用.pdf

l i i1 11 1 1 1 1 1 1 l 5 7 0 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论文的规定，大连轻 工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和 纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 建) ，保密期至列丫年眦月? 日为止。 学生签名：量篷筮导师签名：型么蠡 叼年垆月，z 日 i i l，l f 。气 | ：。 i 0 气 r 摘要 摘要 本研究采用碱性内切蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、a s l 3 9 8 中性蛋白酶、复 合蛋白酶和复合风味蛋白酶酶解扇贝裙边，通过亚油酸一硫氰酸钾法和邻苯三酚法测定 酶解液的抗氧化活性，筛选蛋白酶，确定最适水解时间，并进行单因素实验；通过正交 实验，确定蛋白酶水解扇贝裙边的最佳条件，选择最佳蛋白酶，将其抗氧化活性与v c 、 b h t 、b h a 比较，并研究了抗氧化活性与水解度的关系；以沪酿3 0 4 2 与a s 3 3 5 0 为 菌种，豆粕、麸皮、扇贝裙边为原料，两菌种分别制曲、混合制曲及分别制曲后按一定 比例混合，进行低盐固态发酵海鲜酱油。研究结果表明g 正交实验确定了最佳蛋白酶为碱性内切蛋白酶，其最佳水解条件为t = 6 0 。c ，p h = 7 ， s = 1 2 ， e s = 1 1 ，水解时间为1 5 h ；邻苯三酚法测得抗氧化率为6 3 9 4 ，亚油 酸一硫氰酸钾法测得抗氧化率为4 0 5 8 。经过比较，碱性内切蛋白酶水解液的抗氧化性 与抗氧化剂v c 、b h t 、b h a 的抗氧化效果接近，水解过程中水解度不断增大，抗氧化 活力先增强后减弱，不随水解度的增大而增大。 制曲原料豆粕：麸皮：扇贝裙边为4 ：3 ：3 ；沪酿3 0 4 2 与a s 3 3 5 0 单独制曲后按一定 比例混合发酵的酱油质量最好；最适制曲时间为4 8 h ，制曲温度3 5 。沪酿3 0 4 2 与 a s 3 3 5 0 单独制曲后混合比例为4 ：l ，拌入成f h l1 5 倍的1 3 0 b e 盐水，4 5 保温发酵2 0 天，测定头油、二油、三油的理化指标。海鲜酱油的全氮利用率8 7 8 4 ；氨基态氮生成 率5 3 5 5 ；全氮出品率1 3 7 0 9 g 蛋白；氨基态氮出品率1 4 6 7 9 g 蛋白。 海鲜酱油色泽棕红，具有浓郁的海鲜味，味醇鲜美，酱香浓郁，营养丰富。 关键词：扇贝裙边，蛋白酶，抗氧化活性肽，海鲜酱油 ， a b s t r a c t a b s tr a c l ： i nt h i st h e s i s , a l c a l a s e , a s l 3 9 8 ，n e u t r a s e , p a p a i n , p r o t a m e xa n df l a v o u r z y m ew e r e a d o p t e dt oh y d r o l y z es c a l l o pa p r o nf o ro b t a i n i n gt h ea n t i o x i d a t i o np e p t i d e s p r o t e i n a s e sw e r e s e l e c t e da c c o r d i n gt ot h ea n t i o x i d a t i o na c t i v i t yo ft h e i rh y d r o l y s a t eb yl i n o l e i ca c i d k s c n m e t h o da n dp y r o g a l l o lm e t h o d t h eb e s tp r o t e i n a s ea n di t sb e s th y d r o l y z a t i o nc o n d i t i o n sa r e c o n f i r m e db yt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s t h e nt h ea n t i o x i d a t i o na c t i v i t yo fi t sh y d r o l y s a t e w a sc o m p a r e dw i t hv c , b h aa n db h tt h em a i nm a t e r i a l sf o rt h es e a f o o ds a u c ea r eb e a n c a k e s ，b r a na n ds c a l l o pa p r o n h u n i a n g3 0 4 2a n da s 3 3 5 0a r eu t i l i z e dt op r e p a r es e a f o o d s a u c 宅k o j is e p a r a t e l y t h e ya r ea l s ou t i l i z e dt op r e p a r es e a f o o ds a u c ek o j it o g e t h e r s e a f o o d s a u c ei sf e r m e n t e db yl o w s a l ts o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t et h a t ： t h er e s u l t so ft h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t sa r ea sf o l l o w s ：t h eb e s tp r o t e i n a s ei sa l c a l a s e i t sb e s t h y d r o l y z a t i o nc o n d i t i o n i s t = 6 0 c ，p h - 7 ， s = 1 2 ， e s = 1 l a n dt h e h y d r o l ，r z a t i o nt i m ei s 1 5 h t h ea n t i o x i d a t i o nr a t ea c c o r d i n gt ot h ep y r o g a l l o lm e t h o di s 6 3 9 4 a n da c c o r d i n gt ot h el i n o l e i ca c i d k s c nm e t h o di s4 0 5 8 t h ea n t i o x i d a t i o ne f f e c to f t h eh y d r o l y z a t eb ya l c a l a s ei sc l o s et ot h a to fv c ，b h aa n db h t h y d r o l y z a t i o nd e g r e e e n h a n c e si nh y d r o l y t i cp r o c e s s t h ea n t i o x i d a t i o na c t i v i t yi sw e a k e n e da f t e rs t r e n g t h e n i n g f i r s t t h ep r o p o r t i o no fb e a nc a k e s ，b r a na n ds c a l l o pa p r o ni s4 ：3 ：3 h u n i a n g3 0 4 2a n d a s 3 3 5 0a r eu t i l i z e dt op r e p a r es e a f o o ds a u c ek o j is e p a r a t e l yf o r4 8 h t h e nt h es e a f o o ds a u c e k o j ii sm i x e d t h ep r o p o r t i o no ft h em i x e ds o ys a u c ek o j iw h i c hi sp r e p a r e db yh u n i a n g3 0 4 2 a n da s 3 3 5 0i s4 ：1 i ti sf e r m e n t e df o r2 0d a y sw i t h1 5t i m e sb r i n eo f1 3 0 b eu n d e r4 5 c t h e q u a l i t yo f t h i ss e a f o o ds a u c ei st h eb e s t t h e nm e a s u r et h ep h y s i c sa n dc h e m i s t r yi n d e xo ft h e f i r s ts h o w e r i n gl i q u i d ，t h es e c o n ds h o w e r i n gl i q u i da n dt h et h i r ds h o w e r i n gl i q u i d t h et o t a l n i t r o g e nu t i l i z i n ge f f i c i e n c yo f t h er a wm a t e r i a l si s8 7 8 4 t h ep e r c e n to fc o n v e r s i o na m i n o a c i dn i t r o g e ni s5 3 5 5 t h er a t i oo ft o t a ln i t r o g e np r o d u c ti s1 3 7 0 9 g p r t h er a t i oo fa m i n o a c i dn i t r o g e np r o d u c ti s1 4 6 7 9 g p r t h es e a f o o ds a u c ei sb r o w na n dr e da n di th a ss t r o n gs e a f o o df l a v o r i tt a s t e sd e l i c i o u s l y a n di ti sr i c ho fn u t r i t i o n a b s t r a c t k e yw o r d s ：s c a il o pa p r o n 。p r o t e i f l a s e ，a n t i o x i d a t i o na c t i v i t y ，s e a f o o ds a u c o i 目录 目录 第一章绪论1 1 1 扇贝简介1 1 1 1 扇贝裙边的营养成分1 1 1 2 扇贝裙边的生理活性功能2 1 1 3 扇贝裙边加工利用现状2 1 2 生物活性肽3 1 2 1 抗氧化活性肽介绍3 1 2 2 氧化机理及其危害4 1 2 3 抗氧化活性肽作用机理4 1 2 4 评价抗氧化活性肽抗氧化能力的方法5 1 3 水解动物蛋白5 1 3 1 水解动物蛋白的方法5 1 3 2 国内外水解动物蛋白的发展动态6 1 3 3 酶技术在食品工业中的应用6 1 3 4 动物蛋白水解酶的分类、及选择6 1 4 海鲜酱油的研究7 1 4 1 酱油简介7 1 4 2 国内海鲜酱油的研究现状7 1 4 3 国外对海鲜酱油的研究利用9 1 5 本论文的研究意义9 1 6 本论文的研究内容1 0 第二章实验材料与方法11 2 1 实验材料1 1 2 1 1 实验材料及药品1 l 2 1 2 实验仪器1 2 2 2 实验方法1 3 2 2 1 扇贝裙边蛋白质含量测定1 3 i v 目录 2 2 2 麸皮淀粉含量测定1 4 2 2 3 蛋白酶活力的测定( 福林法) 1 5 2 2 3 1 酪氨酸溶液标准曲线的绘制：1 5 2 3 抗氧化活力测定1 5 2 3 1 改进的亚油酸- 硫氰酸钾方法1 5 2 3 2 邻苯三酚法1 6 2 4 蛋白酶水解扇贝裙边最适条件的研究1 6 2 4 1 最适温度测定1 6 2 4 2 最适p h 值测定1 6 2 4 3 最适底物浓度测定1 7 2 4 4 最适酶与底物浓度比测定1 7 2 5 正交实验1 7 2 6 抗氧化活性比较1 8 2 6 1 清除氧自由基能力比较1 8 2 6 2 抑制油脂自氧化能力比较1 8 2 6 3 水解度测定1 8 2 7 制种曲1 9 2 7 1 方法与步骤1 9 2 7 2 种曲孢子数测定1 9 2 8 制曲2 0 2 9 成曲蛋白酶活力测定2 0 2 1 0 成曲糖化酶活力测定2 l 2 1 l 成曲液化酶活力测定2 2 2 1 2 水分的测定2 2 2 1 3 总酸和氨基态氮的测定2 3 2 1 4 氯化物的测定2 4 2 1 5 酱油技术经济指标计算2 4 第三章实验结果与分析2 5 3 1 扇贝裙边、豆粕、麸皮蛋白质含量测定2 5 3 2 豆粕、麸皮中淀粉含量测定2 5 3 3 蛋白酶活力测定2 6 v 、 l l 目录 3 4 酶的筛选2 6 3 5 最适水解条件的确定2 8 3 5 1 最适温度的确定2 8 3 5 2 最适p h 值的确定2 9 3 5 3 最适底物浓度的确定3 0 3 5 4 最适酶与底物浓度比( e l i s ) 的确定3 l 3 5 5 蛋白酶水解扇贝裙边的单因素最适条件小结3 2 3 6 正交实验3 2 3 7 正交实验小结4 0 3 8 抗氧化活力比较4 l 3 8 1 测定v c 清除氧自由基活力( s a ) 4 l 3 8 2 测定b h t 、b h a 抑制油脂自氧化活力( 从) 4 l 3 9 碱性内切蛋白酶水解液抗氧化率和水解度比较4 2 3 9 1 水解度计算4 2 3 9 2 邻苯三酚法及亚油酸法测定抗氧化率与水解度比较4 2 3 1 0 制取扇贝裙边酱油4 4 3 1 0 1 种曲外观检验4 4 3 1 0 2 种曲孢子数测定4 4 3 1 0 3 确定制曲原料配比4 4 3 1 0 3 1 沪酿3 0 4 2 单独制曲4 4 3 1 0 3 2a s 3 3 5 0 黑曲霉单独制曲4 7 3 1 0 4 确定制曲时间及最佳接种比例5 0 3 1 0 4 1 确定制曲方案及最适制曲时间5 0 3 1 0 4 2 确定沪酿3 0 4 2 与a s 3 3 5 0 单独制曲后混合比例5 l 3 1 l 制取扇贝裙边酱油小结5 4 第四章结论5 6 参考文献5 7 附录6 0 致谢6 3 v i 第一章绪论 1 1 扇贝简介 第一章绪论 扇贝是一种海产贝类，属于软体动物门、扇贝科。扇贝味道鲜美，营养丰富，含有 优质蛋白质、肝糖、各种游离氨基酸、琥珀酸、谷氨酸等人体必需的营养物质；脂肪含 量少，组织柔嫩，易被消化吸收，是老少皆宜的高蛋白海味珍品。国内外科技工作者都 曾对其营养成分进行过细致深入的研究n 1 。目前，扇贝已成为我国重要的经济海产品之 一，由其干制的贝柱是非常珍贵的海珍品。近几年来，沿海地区人工养殖扇贝业发展迅 速，扇贝的养殖已相当普及，冻贝柱及干贝柱的加工和出口量非常大，成为我国大宗出 口的水产品。在扇贝丁加工过程中产生了大量的下脚料，其中下脚裙边( 包括内脏部分) 约占整个扇贝的3 0 幢1 。扇贝边的蛋白质营养价值较高，是一种很理想的高蛋白低脂肪 低糖类食物b 1 。在以往的加工中，小部分扇贝裙边作为虾饲料低价出售，大部分弃于海 边任其腐烂，造成了极大的资源浪费和环境污染。因此，如何对其加工利用，提高其附 加值，已成为迫切需要解决的问题h 1 。 1 1 1 扇贝裙边的营养成分 最近研究表明，扇贝裙边的营养成分十分丰富，营养价值并不逊色于扇贝柱，可被 开发利用，是生产药物和保健品的宝贵资源。大量研究发现，扇贝裙边提取物( e s s ) 富 含微量元素硒以及蛋白、维生素、多糖、磷脂及其他多种微量元素( 铁、锌、锰、镁、 钙、铜等) 和生理活性物质嘲。扇贝裙边中的氨基酸组分和含量相当于牡蛎和贻贝的软体 部，且八种必需氨基酸在全边和纯边间无区别。科研工作者对扇贝边的营养成分及深加 工进行了研究】，分析结果表明：扇贝裙边中的氨基酸种类相当齐全，达十八种以上， 而且各种氨基酸相对含量比较符合联合国粮农组织和世界卫生组织建议的理想蛋白质 中必需氨基酸含量的模式谱口1 。其中甘氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、精氨酸等呈味氨基 酸的含量较高，八种必须氨基酸的含量约占总氨基酸的3 0 9 6 。扇贝裙边也含有脂肪酸， 研究表明：扇贝柱和扇贝裙边都以饱和脂肪酸为主，扇贝裙边和扇贝柱中不饱和脂肪酸 分别占脂肪酸总含量的6 6 2 9 痢6 5 6 ，在单不饱和脂肪酸中，扇贝裙边的含量高出扇 贝柱近一倍，在多不饱和脂肪酸中，扇贝裙边e p a 和d h a 总量稍低于扇贝柱，但由于 第一章绪论 扇贝裙边粗脂肪含量高于扇贝柱，因此e p a 和d h a 在扇贝裙边中的绝对含量比扇贝柱 高得多。这些营养价值对于扇贝裙边的开发利用具有十分重要的意义阳3 。 1 。1 2 扇贝裙边的生理活性功能 近年来，国内外学者对扇贝裙边中的生理活性物质的提取及其药用价值的研究较 多。研究发现：扇贝裙边提取物作为一种天然富硒提取物，可调节血脂代谢、提高机体 抗氧化能力，且具有抗动脉粥样硬化的作用，可通过增强宿主免疫功能和提高机体氧化 能力而抑制肿瘤的生长。扇贝裙边的提取物中还含有牛磺酸、糖蛋白、氨基多糖、e p a 和d h a 、维生素b 1 2 、叶酸，以及微量元素硒、钙等多种生理活性物质。牛磺酸又称 牛胆碱、牛胆素，是一种含硫氨基酸。牛磺酸在动物体内具有特殊的生理功能：可促进 脂肪和脂溶性物质的消化吸收；促进糖代谢；促进蛋白质、氨基酸代谢；促进矿物元素 的代谢；增强细胞抗氧化和对细胞的保护作用；提高机体免疫力；影响激素分泌；促进 生长；影响繁殖性能等n 仉n 1 。扇贝裙边中的糖蛋白己初步证明具有抗肿瘤活性n 2 3 ；氨基 多糖是蛋白多糖的糖链部分，现代医学研究表明：氨基多糖具有抗凝血、降血脂、抗肿 瘤、抗炎、抗病毒等功效。e p a 和d h a 对心血管疾病、支气管哮喘、关节炎、糖尿病、 尿毒症、癌症等有显著疗效，并且能促进脑血管血液循环，健脑益智。可见，扇贝裙边 具有促进脑细胞生长发育、改善大脑机能、提高记忆力的功效。因此，扇贝裙边不仅营 养价值高，而且有一定的药理作用。 1 1 3 扇贝裙边加工利用现状 一些科学家较系统的研究了扇贝裙边的营养价值，从而为科学的加工利用扇贝裙边 提供了理论依据。目前，国内对扇贝裙边的加工利用主要有以下几种形式： ( 1 ) 利用扇贝裙边制取保健食品 利用扇贝裙边( 外套膜) 与内脏分离后制作速冻小包装食品、原汁扇贝裙边罐头、 珍味贝裙脆片、保健贝籽脯、海之味扇贝裙边小食品等硌。但扇贝裙边中生殖腺、内脏 团的存在会影响产品质量，在加工过程中需要大量的人工来分离扇贝裙边和内脏团，生 产效率低，而且得率也不高，因此难以实现大规模生产。目前运用先进的食品工程和生 物酶解技术，使扇贝裙边的每一部分都得以充分利用，杜绝了二次污染的发生。 ( 2 ) 扇贝裙边丝 利用扇贝加工时大量废弃的裙边，制作调味焙烤品扇贝裙边丝，经1 冰醋酸软化处 2 第一章绪论 理1 5 s ，1 5 0 焙烤6 m i n 。制品形状美观、色泽嫩黄透明、口感软嫩、昧鲜美、档次较 高，保质期达6 个月以上。 ( 3 ) 扇贝裙边香肠 扇贝边经过清洗除杂、热烫整理、冷却、嫩化、冷冻、打碎、配料斩拌( 腌制 猪肉绞碎混合其他辅料) 、滚揉、定量灌装、杀菌、恒温、检查等工艺制作出扇贝裙边 香肠。扇贝裙边香肠这一研究课题的完成，为扇贝的综合利用开辟了一条新途径。 ( 4 ) 扇贝裙边调味品 近年来，利用扇贝裙边中含有丰富的呈味成分及其他风味物质和营养成分，将其加 工成水产天然调味料，己成为科研工作者和生产企业的研究热点m 1 。已经报道的有扇贝 调味汁、扇贝香味料、扇贝边火锅调味料及扇贝鱼油等，都是以新鲜扇贝汁为原料精制 而成，或采用酶解方法研制成营养丰富、味道鲜美的复合调味料，工艺简单、操作方便、 便于推广，可以满足人们对海鲜的需求，深受亚洲市场的青睐，能出口创汇，是具有良 好经济效益的高附加值产品，。 1 2 生物活性肽 生物活性肽是一类具有生理活性的肽类，其中许多具有抗肿瘤、抗艾滋病、抗真菌、 抗病毒、防治心脑血管疾病、免疫调节以及抗氧化、抗衰老的功效。生物活性肽分子量 小于6 0 0 0 d ，其分子结构复杂，程度不一，可从简单的二肽到环形大分子多肽，而且这 些多肽可通过磷酸化、糖基化或酰基化而被修饰。依据其功能，生物活性肽大致可分为 生理活性肽、抗氧化肽、调味肽和营养肽四种，但因一些肽具有多种生理活性，因此分 类只是相对的。 1 2 1 抗氧化活性肽介绍 抗氧化活性肽是生物活性肽的一种，通过减少氧自由基、羟自由基，从而起到抗衰 老的功效。随着各种生物活性肽的不断发现，抗氧化活性肽的研制开发成为一大热点。 抗氧化活性肽如肌肽、谷胱甘肽、大豆蛋白酶解物等由于低毒、高效等特点，作为天然 抗氧化剂显示出在医药、食品和饲料行业的应用优势n 5 “1 引。目前，对抗氧化活性肽的 研究主要集中在一些陆地蛋白资源上，比如大豆蛋白、乳蛋白n 钔、玉米蛋白旧1 ，而从海 洋蛋白资源中获取抗氧化活性肽的研究还比较少。海洋生物的生活环境与陆地有着极大 的不同，蛋白质的结构和氨基酸序列都有其独特性。通过酶解，海洋生物会为人类提供 3 第一章绪论 许多结构新颖、功能独特、生理活性很强的抗氧化活性肽类啪2 。目前，扇贝裙边蛋白 质经蛋白酶酶解，其酶解物的抗氧化性己成为研究焦点，其肽产物具有分子量低、乳化 效果好、适热能力强、易被机体吸收和具有新的生物活性等优点，使海洋生物肽可以被 应用到更多的领域泣1 。对抗氧化活性肽的结构、抗氧化作用以及应用前景的研究，为 抗氧化活性肽的开发提供了可借鉴的信息。 1 2 2 氧化机理及其危害 在化学结构上，自由基是指未配对电子的基团、分子或原子，化学上也称为“游离 基 ，是含有一个不成对电子的原子团。由于原子形成分子时，化学键中电子必须成对 出现，因此自由基就到处夺取其他物质的一个电子，使自己形成稳定的物质。在化学中， 这种现象称为“氧化。我们生物体系主要遇到的是氧自由基，例如超氧阴离子自由基、 羟自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基，加上过氧化氢、单线态氧和臭氧， 通称为活性氧。正常情况下机体拥有一套完整的由抗氧化酶和抗氧化剂组成的防御体 系，可以清除自由基，防止脂质过氧化，维持生物体内自由基代谢平衡。但是当机体年 老或受到环境、毒物等的影响时，机体内的自由基代谢出现紊乱，活性氧和其它自由基 就会对机体产生明显的毒性作用。尽管活性氧的半衰期很短，却可以与d n a 、蛋白质 和多元不饱和脂肪酸( p u 】作用，造成d n a 链断裂和氧化性损伤、蛋白与蛋白交联、 蛋白与d n a 交联及脂质过氧化。由于多元不饱和脂肪酸是生物膜的基本组成成分，当 它被活性氧引发的脂质过氧化所损伤后，极易造成生物膜结构和功能的破坏，从而使细 胞失去了完整性，导致广泛性损伤和病变，从而引起多种疾病。如心脏病、老年痴呆症、 帕金森病和肿瘤等。此外，外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使人 体产生更多活性氧自由基，使核酸突变，这是人类衰老和患病的根源。 1 2 3 抗氧化活性肽作用机理 抗氧化活性肽通常通过以下五种途径来达到抗氧化目的：( 1 ) 抑制脂质过氧化反应； ( 2 ) 直接清除活性氧自由基；( 3 ) 清除氧；( 4 ) 螯合金属离子；( 5 ) 激活机体本身内在抗氧 化防御系统。五种途径实际上都是围绕阻断脂质过氧化链式反应来进行的。由于过量自 由基容易引发体内脂质过氧化链式反应，而机体内脂质过氧化是导致组织损伤的主要原 因，所以研究抗氧化剂，防止体内脂质过氧化的能力就显得特别重要。抗氧化剂通过捕 获或猝灭过氧自由基，从而抑制微粒体脂质过氧化和多元不饱和脂肪酸的氧化变性，维 4 第一章绪论 持生物膜结构和功能的完整性。通过对外源性抗氧化剂的研究，可以帮助人们寻找防治 肿瘤、冠心病和衰老等由过量自由基引发的疾病的药物和保健食品。 1 2 4 评价抗氧化活性肽抗氧化能力的方法 评价生物抗氧化剂抗氧化能力的方法有很多，主要包括以下几类：( 1 ) 抑制亚油酸 过氧化试验( 亚油酸硫氰酸钾方法，亚油酸_ 硫代巴比妥酸方法) ；( 2 ) 抑制离体动物肝 脑脂质、卵黄脂质过氧化试验；( 3 ) 清除自由基试验( d p p i h 分析法、邻苯三酚法、化学 发光法、e s r 方法) ；( 4 ) 建立在f e n t o n 反应基础之上的其它方法( 邻二氮菲一亚铁方法、 2 一脱氧核糖一硫代巴比妥酸方法等) ；( 5 ) 动物试验方法。 1 3 水解动物蛋白 水解动物蛋白( h a p ) 是原料经酸、碱、酶水解而得到的蛋白质、小分子多肽和氨基 酸产品的总称。h a p 的蛋白质含量高达9 0 以上，主要为低分子多肽，具有优异的保水 性、乳化性，不易产生沉淀，有良好的抗氧化性，对易变质食物起保护稳定作用，能有 效改善和调整食品的风味和结构品质，水溶性好，极易被人体吸收利用，是一种优质的 蛋白源。 1 3 1 水解动物蛋白的方法 水解动物蛋白的方法通常有酸水解法和酶水解法。目前对扇贝裙边等海产品大多采 用酶水解法，水解率高，可得到各种所需氨基酸和生物活性物质，进而研制天然海洋生 物活性肽和海鲜调味品。主要有单酶酶解技术、双酶酶解技术、多酶复合酶解技术幢4 1 。 单酶法只用一种酶对原料蛋白质进行水解。王维香等以扇贝裙边为原料，利用中性蛋白 酶，在大量正交实验基础上，摸索出最佳工艺条件n 劓。双酶法是用两种酶对原料蛋白质 进行水解的方法。这两种酶要对蛋白质底物的特异性有互补作用，由于单一酶对蛋白质 水解总是有限的，邓尚贵等用枯草杆菌中性蛋白酶和胃蛋白酶这两种外源酶对扇贝裙边 进行水解，获得了较好的水解效果晒1 。多酶复合法是用两种以上的酶对原料蛋白质进行 水解，可使原料蛋白质水解更充分。 5 第一章绪论 1 3 2 国内外水解动物蛋白的发展动态 通过酶解海洋生物制备活性肽的研究己在进行，并取得一定进展。从扇贝裙边中制 备活性多肽的研究工作也已展开。研究主要集中在酶解工艺及其产物的功能，营养效价， 生理活性及分离纯化技术的研究。国外应用超滤技术进行分离纯化，获得三个部分的肽 片段。北京化工大学博士生导师黄明智教授等研究的组合酶制备水解胶原蛋白项目“水 解明胶新技术及其开发应用与推广一首次采用组合酶技术对明胶进行水解，成功的消除 了水解胶原蛋白的异腥臭味，极大地提高了水解胶原蛋白的贮存稳定性，突破性的解决 了困扰中国水解胶原蛋白应用领域多年的两大技术难题，并使产品的品质获得了极大的 提升，已经达到甚至在若干指标上己经超过了国外同类产品的水平。中科院南海海洋生 物研究所利用离子交换分离技术分离生理活性肽，华南理工大学以聚砜中空纤维为膜材 料的超滤装置对扇贝裙边酶解液进行分离，在色泽、风味、澄清度等方面很理想，营养 成分保持较好，氨基态氮保存率较高啪1 。 1 3 3 酶技术在食品工业中的应用 应用于食品工业中的商品蛋白酶制剂主要有微生物蛋白酶、植物蛋白酶和动物蛋白 酶三大类。目前，酶在食品工业中的主要应用有：生产食品原料、直接参与食品的生产 过程；改善食品质量、制备生物活性成分、食品保鲜和贮藏；最为广泛的用途是用于奶 制品、淀粉及糖的转化，其次是啤酒、烘焙产品以及水果和蔬菜加工。 1 3 4 动物蛋白水解酶的分类、及选择 动物蛋白水解酶可采用针对动物蛋白水解专用的复合酶制剂，其主要由蛋白内切酶、 外切酶和风味酶等组成。内切酶从中间切断蛋白质内部的肽链，外切酶从多肽链的末端 切断并释放出氨基酸，而风味酶对水解的苦味与风味起着优化作用。动物蛋白水解酶可 广泛应用于动物蛋白鸡、猪、牛等肉类的水解及水产鱼、虾、牡蛎、蛤蚌等海产品功能 肽的提取脚嚣1 。 用于水解蛋白质的酶按来源分主要有三种类型：一、动物来源的蛋白酶。如胃蛋白 酶，胰蛋白酶等；二、植物性蛋白酶。如木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等；三、微生物蛋白 酶。如来源于枯草杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌产生的酶；来源于黑曲霉、毛霉、 青霉等微生物产生的酶。动植物蛋白酶虽有一定优势，但来源少，价格昂贵，一般仅限 于实验室研究工作，不适于工业化生产。随着生物技术的进步，微生物产酶技术日趋成 6 第一章绪论 熟，微生物蛋白酶价格便宜，来源广泛，是一种比较理想的酶来源。 1 4 海鲜酱油的研究 1 4 1 酱油简介 酱油是中国传统调味品，具有色、香、味一体，五味调和的特色，食用十分普遍。 从科学角度分析，酱油是营养丰富的调味品，含有十八种氨基酸，其中有八种人体之必 须氨基酸汹3 。这些营养成分主要来源于高蛋白质物料( 脱脂大豆) 和高淀粉原料( 麸皮和 玉米渣) ，经微生物长期发酵而成，色泽红褐发亮，体态澄清透明，历来被人们称为“天 然色素 ，是烹调着色佳品啪1 。 当前，酱油的消费领域越来越广泛，已不仅仅是存在于过去的调味和佐料，而是作 为人们生活必不可少的营养、保健消费品，向食品工业领域的深度和广度延伸和发展啼。 目前，传统酱油的产量基本保持稳定，产销两旺；酱油新品种层出不穷，产销量不断增 长，具有广阔的市场空间和发展前景。 1 4 2 国内海鲜酱油的研究现状 海鲜酱油调味品是将鱼、虾、扇贝类等的下脚料发酵生产出的美味调味品泐堋1 。 近年来，利用扇贝边中含有丰富的呈味成分及其他风味物质和营养成分泓3 副，将其加工 成水产天然酱油调味料，已成为科研工作者和生产企业的研究新热点。国内许多学者、 科技工作者致力于海鲜酱油的开发利用。 ( 1 ) 红曲扇贝裙边酱油 红曲扇贝裙边酱油是充分利用扇贝裙边中丰富的蛋白质，不饱和脂肪酸，牛磺酸等 多种营养物质，以及海带下脚料中含有的碘，采用经过优选的，性状优良的红曲霉和特 征性酵母菌，通过协同发酵生产具有功能性的海鲜调味汁嘶1 。其产品既去除了腥味，又 保持了海产品特有的鲜味，且含有多种丰富的氨基酸和适量的碘及其他营养成分。该项 技术达到了国际领先水平，填补了国内空白。 ( 2 ) 鱼鲜酱油 鱼鲜酱油是以产量丰富的海洋中上层鱼类的加工下脚料为主要原料，经深层发酵酿 制而成的一种新型保健调味品b ，它与普通酱油或鱼露类产品有质的区别：鱼鲜酱油中 的氨基酸总量是普通酱油的2 - 3 倍，钙磷等含量是普通酱油的八倍汹1 ，并富含牛磺酸， 7 第一章绪论 维生素等营养成分，且口味鲜美啪1 。其在技术上的瓶颈问题是鱼肉并不适合传统的固体 制曲，将其直接用于发酵会造成蛋白利用率低下，且产品有一定的鱼腥味，因此，可在 酱油发酵时引入米糠，这样可分解鱼体内的三甲胺，有效去除鱼腥味。或在鱼肉中加入 肽酶水解，可有效去除鱼腥等异味，但成本较高。目前，采用鱼肉液体制曲法，既可提 高蛋白利用率，又可利用制曲过程中分泌的酶系分解去除鱼腥昧。实践表明，制曲温度 4 0 ，制曲时间为2 4 h ，种曲添加量为0 4 时，液体曲的蛋白酶活力2 4 5 砌i i l l ，三甲 胺去除率7 4 7 ，为鱼鲜酱油的发展提供了一定的技术支持“1 4 2 1 。 ( 3 ) 无色海鲜酱油 目前，国际市场上出现了无色酱油和系统彩色酱油，日本市场上出现了含蔬菜的调 味料和天然调味料，即以动物蛋白，鱼贝类等为原料，进行自溶而制得的调味料，其价 格远远高于普通酱油m “3 。国内的无色酱油迟迟不能面市，主要原因是发酵酱油如要 脱去颜色，需耗用大量脱色剂，脱色过程中使发酵所产生的香味成分损失殆尽，失去了 发酵酱油的特色，而且脱色过程使其颜色变淡易，使颜色脱尽成无色酱油较难，因而脱 色后，感官及风味均较差，无法满足日益提高的市场消费要求。扇贝裙边经蛋白酶水解 处理，精细加工，可制取营养丰富，味道鲜美的无色海鲜酱油“ 。 结果表明：以蛋白酶1 6 6 为生物催化剂，在p h 7 0 、5 5 。c 的温和条件下水解，经脱 腥配制，可能制取氨基态氮等主要质量指标优于一级粮食发酵的酱油。由扇贝裙边制取 的无色海鲜酱油，体态呈透明淡黄色，色泽清淡悦目，用其调配菜肴，不改变菜肴的天 然色泽，并且风味独特宜人。因此，由扇贝裙边制取无色海鲜酱油，开辟了生产无色酱 油的新途径，同时为缓解粮食紧缺，实现代粮发酵制取调味品开辟了一条切实可行的崭 新途径。如进一步利用海鲜酱油的无色基料与各种天然色素相配合，可生产出系列高档 彩色酱油，将对调味料的进一步发展起到积极作用。 ( 4 ) 利用多菌种制曲的海鲜酱油 以扇贝裙边为主要原料，在制曲中添加a s 3 3 5 0 黑曲霉和a s 3 9 8 6 红曲霉，改变单 一菌种，采用分开制种曲，混合制大曲，再经低盐固态发酵，浸淋等一系列过程，生产 出了高质量，风味独特的优质海鲜酱油，已成为海鲜酱油市场上的又一亮点。对添加 a s 3 3 5 0 黑曲霉和a s 3 9 8 6 红曲霉和未添加两菌的两个批次的低盐固态酿造的海鲜酱油 进行比较，发现添加a s 3 3 5 0 黑曲霉和a s 3 9 8 6 红曲霉的酿造酱油，其各项理化指标明 显高于未添加a s 3 3 5 0 黑曲霉和a s 3 9 8 6 红曲霉的酿造酱油，且酱油的全氮利用率和酱 油出品率均可大幅提高，无盐固形物、还原糖的含量大量增加，酱油色泽可提高4 0 9 6 左 右，氨基态氮提高1 5 左右，还原糖的含量可提高3 0 0 5 左右。 8 第一章绪论 所以，要想生产出优质的酿造酱油，则必须改进传统的生产工艺，对制曲工艺进行 调整。目前，除了选用多菌种制曲，国内已有加盐制曲法，该法采用8 0 b e 盐水代替清 水润料制曲，具有升温缓和、不烧曲、方便发酵操作、提高蛋白质利用率和产品质量高 等优点，将其应用于海鲜酱油的生产，值得进一步研究和应用。 1 4 3 国外对海鲜酱油的研究利用 目前，国外开始关注微量营养元素缺乏导致的营养不良，如缺铁性贫血。在一些发 展中国家，如越南，铁缺乏症、缺铁性贫血严重，是急需解决的问题。而在食物中添加 铁是解决这一问题的最有效途径。越南的鱼鲜酱油是人们必不可少的消费品。在鱼鲜酱 油中添加铁，既可以使人们享受美味的酱油，又补充了人体缺乏的铁元素。n a f e e d t a 是水溶性的可被人体吸收的铁，将其添加到鱼鲜酱油中，不会引起鱼鲜酱油质地、口感 的变化，w h o 和f a o 已经证明：n a f e e d t a 在食物中添加量为0 2 m g f e k g b o d y w t d 是安全的。实践证明，在鱼鲜酱油中添加n a f e e d t a ，可有效的提高铁含量，可充分显 示其生理活性，n a f e e d t a 也被添加到糖、咖喱粉中，成为高效的铁补充剂。因此，在 鱼鲜酱油中添加n a f e e d t a 是降低越南缺铁性贫血的有效手段呻、蛐堋5 。 亚洲的许多国家如泰国、菲律宾、日本都有其传统的海鲜酱油，通常是以远洋的鱼 虾为原料，与海水按比例混合浸泡放于陶瓷罐或木罐中发酵制成院1 。酿造好的酱油各有 其特色：泰国的n a m p l a 是澄清的红棕色液体具有卤肉的特征滋气味；菲律宾的p a t i s 蛋 白质含量极高，营养丰富，味道鲜美；日本的k o a m i 色泽金黄，海鲜味浓郁，老少皆宜， 可用于调色，而o u n a g o 是黏稠的酱油，类似蜂蜜，也具有卤肉的味道，这些种类的海 鲜酱油已成为全球调味品市场的主流旧1 。 这些海鲜酱油不仅可食用，还具有许多生理生化功能。越南的海鲜酱油中己分离出 产胶原酶的菌株f s 2 和产碱性蛋白酶的菌株c n 2 ；一种蓝贝肉海鲜酱油具有强抗氧化能 力，其经过纯化的肽的羟基自由基清除率为8 6 5 哺眠驯。 1 5 本论文的研究意义 现在低值鱼和贝类海产品的比例越来越大，而大量的海产品加工“去粗取精的过 程造成了原料的巨大浪费。如广西北海每年的6 0 万吨海产品中，低值鱼贝类超过一半， 而该市场的7 0 多家水产品加工企业，年加工量3 0 多万吨，丢弃的下脚料占了三分之一。 这些下脚料仅被简单加工成养殖用的饲料，大部分被弃于海边任其腐烂，造成极大的资 9 第一章绪论 源浪费和环境污染。低值鱼富含蛋白质、氨基酸等营养物质，低值鱼( 面条鱼、沙丁鱼、 黄姑鱼、金钱鱼等) 出肉率只有3 5 ，加工废弃物约6 5 ，造成大量蛋白质白白浪费。贝 类下脚料如扇贝裙边营养丰富，扇贝裙边含有丰富的动物蛋白和易于吸收的氨基酸，并 且含有丰富的脂肪酸。扇贝裙边的提取物中含有牛磺酸，糖蛋白，氨基多糖，维生素 b 1 2 ，叶酸以及微量元素硒、钙等多种生理活性物质，具有抗肿瘤，抗病毒，抗衰老等 多种生理功能，但由于扇贝边组成复杂，难于加工，影响了它的食用价值。因此，提高 海产品的深加工水平，提高低值鱼贝的附加值，对扇贝裙边新产品进行研发，实现其充 分利用，是迫切需要解决的问题。 1 6 本论文的研究内容 ( 1 ) 利用复合风味蛋白酶、复合蛋白酶、碱性内切蛋白酶、a s l 3 9 8 蛋白酶、中性蛋 白酶和木瓜蛋白酶对扇贝裙边进行单酶酶解，以抑制油脂自氧化能力及消除氧自由基能 力为指标，筛选蛋白酶并确定其水解的最适时间。 ( 2 ) 对所筛选的蛋白酶进行单因素实验，确定正交实验的因素水平。以抑制油脂自 氧化能力及消除氧自由基能力为指标，进行正交实验，确定各个蛋白酶水解的最佳条件。 ( 3 ) 选择抗氧化能力最佳的蛋白酶，将其水解液抗氧化率与v c 、b h t 、b h a 比较。 ( 4 ) 确定制取海鲜酱油的原料配比。 ( 5 ) 制种曲，确定菌种比例。 ( 6 ) 确定制取海鲜酱油的条件。 ( 7 ) 对酱油进行感官评定，测定海鲜酱油的理化指标。 1 0 第二章实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 实验材料及药品 第二章实验材料与方法 扇贝裙边 豆粕 麸皮 面粉 沪酿3 0 4 2 a s 3 3 5 0 黑曲霉 碱性内切蛋白酶 胃蛋白酶 胰蛋白酶 f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶 n e u t r a s e 中性蛋白酶 a s l 3 9 8 中性蛋白酶 p r o t e m a x 复合蛋白酶 木瓜蛋白酶 酪蛋白 l _ 酪氨酸 结晶牛血清蛋白 干酪素 无水碳酸钠分析纯 氢氧化钠分析纯 硫氰酸铵分析纯 亚油酸分析纯 邻苯三酚分析纯 大连新盛水产市场 大连华农 大连正升食品有限公司 市售 上海酿