（生物医学工程专业论文）磁性纳米颗粒的制备及其在药物作用靶点生物淘洗中的应用.pdf

磁性纳米颗粒的制各及其在药物作用靶点生物淘洗中的应用我们对合成的磁性纳米粒子的物化特性进行了一系列的表征观察：包括应用透射电子显微镜对磁性颗粒纳米颗粒结构进行观察，利用x 一射线衍射验证氧化铁磁性颗粒的晶形，利用激光粒度散射仪测量磁性颗粒的水合粒径分布，利用磁滞回线分析颗粒的顺磁特性，利用元素分析确定磁性纳米粒子中的高聚物组分，以及利用化学反应来检测磁性颗粒表面的活性基团功能等等。实验结果显示合成的磁性颗粒为分散良好的纳米粒子，水合粒径在8 0 衄左右，颗粒内的单个粒子粒径为l o 纳米左右，在表面有羧基基团存在，且可以通过化学反应连接表面修饰分子，合成的磁性颗粒不易聚集，可以稳定存在于水溶液中。将制备的磁性纳米颗粒应用于m r i 成像实验，结果表明有较好的增强t 2 信号效应。进一步地，我们尝试了应用纳米磁性颗粒在水溶液中分散均匀良好，但又易于收集的特点，选择中药丹参中的有效成分丹酚酸b 作为模型药物，将丹酚酸b 连接在磁性粒子表面，通过修饰后的磁性粒子与噬菌体蛋白展示库的相互作用，利用磁场分离和富集与丹酚酸b结合的噬菌体，进行多次生物淘洗。对最终获得的噬菌体进行测序，获得其编码的基因和多肽序列，并通过b l a s t 寻找相关蛋白。通过多轮筛选，我们获得了一系列丹酚酸b 可能作用的靶点序列。并选取其中的一个噬菌体克隆应用毛细管亲和电泳技术表征了丹酚酸b 与其的特异性结合，确认了通过磁性粒子生物淘洗研究小分子药物和中药上海交通大学博士学位论文活性成分作用靶点的可能性。本论文从磁性纳米颗粒的制备入手，发展了一种新的应用高分子模板制备纳米级超顺磁性单分散纳米粒子的方法，对制备的磁性纳米颗粒在磁共振造影增强方面的应用进行了初步尝试，并将其应用在药物有效成分的作用靶点的生物淘洗研究中，建立了一种通过磁分离表征药物与蛋白相互作用的方法，表明可以有效从噬菌体展示库中筛选出具有特异性结合作用的克隆。关键词：超顺磁性纳米颗粒，噬菌体展示库，丹酚酸b磁性纳米颗粒的制备及其在药物作用靶点生物淘洗中的应用p r e p a r 汀i o no fm a g n e t i cn a n o n 气r t i c l e sa n di t sa p p l i c a t i o n 【nb i o p an n d i go fsa im a n o l i ca c i dbi n t e r a c t i v ec d n ad i s p l a yp h a g ec l o n e sa b s t r a c tm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r ew i d e l yu s e di ne e l li s o l a t i o n 、b i o l o g i c a lm i c r o m o l e c u l a rs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o ns u c h 鹊p r o t e i na n dn u c l e i ca c i ds e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r ea l s ou s e di no t h e rf i e l d ss u c ha sd r u gt a r g e t e dt h e r a p y , h y p e r t h e r m i a ,l y m p hn o d ea n db l o o di m a g ew i t i lt h er e s e a r c hd e v e l o p e m e n t t h er e s e a r c h e r sh a v ed e v e l o p e dm a n yk i n d so fm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sf o rd i f f e r e n ta p p l i c a t i o n si nb i o m e d i c a lf i e l d s i nt h i sp a p e r , w ed e v e l o p e da na p p r o a c ht os y n t h e s i z es u p e r p a r a m a g n e t i ci r o no x i d en a n o p a r t i c l e si nt h ep r e s e n c eo fan o v e lp o l y m e rm a t r i x ，w h i c hi ss y s t h e s i z e du s i n gl a c t i ca c i db yp h o t o c a t a l y s t t h ep o l y m e ru s e di nt h ep a p e rw a ss y n t h e s i z e du s i n gl a c t i ca c i d sb yp h o t o c a t a l y s tn o ts i m i l a rt ot h ep o l y l a c t i ca c i d s t h en o v e lp o l y m e rh a sm a n yc a r b o x y l a t ea n dh y d r o x i d eg r o u p sw i t hw a t e rd i s p e r s e dw e l l t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h es y n t h e s i z e dn a n o p a r t i c l e sc o n s i s t e do fc l u s t e r so fi r o no x i d em o n o c r y s t a l s ，e m b e d d e di n s i d et h ep o l y m e rc h a i n s t h es y n t h e s i sc o n d i t i o n so fp h ，t i t r a t i o nv e l o c i t ya n dm o l a rr a t i o no ft h ei r o ni o na n dt h ep o l y m e rw e r eo p t i m i z e da c c o r d i n gt ot h em o n o d i s p e r s e da n dp a r t i c l e ss i z e s t h er e s u l t e dp a r t i c l e sw e r em o n o d i s p e r s e ，n a n o s i z e d ，s t a b i l i z e dw h e nt h er a t i oo fp o l y m e rt of ei o ni s1 0 0 m gp o l y m e rp e r4 2 2 r a mf ei o na n dt h ep hi sa b o u t1 0 上海交通大学博士学位论文s o m ep h y s i c sa n dc h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n so ft h es y n t h e s i z e dp a r t i c l e sw e r ef u r t h e rd e t e r m i n e d ，i n c l u d i n gt h es t r u c t u r eo b s e r v a t i o nb yt e m ，t h ec r y s t a lt y p e sa n a l y s i sb yx - r a yd i f f r a c t i o n ，s i z ed i s t r i b u t i o na n a l y s i sb yp h o t o nc o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y , p a r a m a g n e t i s md a t ac o l l e c t i o nb yv i b r a t i n gs a m p l em a g n e t o m e t e r , p o l y m e ro nt h es u r f a c eo ft h ep a r t i c l e sd e t e r m i n a t i o nb ye l e m e n ta n a l y s i s ，t h er e a c t i v eg r o u p sd e t e c t i o nb yc h e m i c a lr e a c t i o ne ta 1 t h ee x p e r i m e n t sr e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e s u l t e dp a r t i c l e sw e r ew e l lm o n o d i s p e r s e da n ds t a b i l i z e d v e i l ，t h eh y d r o d ) 7 n a m i cd i a m e t e r sw e r ec l o s et o8 0r i m , t h ed i a m e t e ro fm o n oc r y s t a li np a r t i c l e sw e r ea b o u t1 0 h m ，t h e r ew e r ea b u n d a n ts u r f a c ec a r b o x y lg r o u p so nt h ep a r t i c l e ss u r f a c ew h i c hc o u l dl i n ko t h e rm o l e c u l a r st h o u g hc h e m i c a lr e a c t i o n t h em r ii m a g ee x p e r i m e n t so f t h ep a r t i c l e si n d i c a t e dt h a tt h et 2s i g n a l so ft h ep a r t i c l e sc o u l db ee n h a n c e di n m r la sf o rt h ec h a r a c t e r i z a t i o no fs t a b i l i z a t i o na n de a s yc o l l e c t i o no ft h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ，t h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r ec o n j u g a t e dw i t hs a l v i a n o l i ca c i db ，t h ee f f e c t i v ec o m p o n e n to fd a n s h e n ，ak i n do fc h i n e s et r a d i t i o n a ld r u g s ，w h i c hw a ss e l e c t e da st h ee x p e r i m e n t a lm o d e ld r u g ，s oa st os c r e e nt h es p e c i f i cp r o t e i n so rp e p t i d e sb i n d i n gw i t hs a l v i a n o l i ca c i dbb yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sa n dp h a g ed i s p l a yl i b r a r y t h ep h a g e sc l o n e ss p e c i a l l yb i n d i n gw i t ht h ed r u gs a l v i a n o l i ca c i dbw e r es e l e c t e db yb i o p a n n i n g a n dt h es e q u e n c e so ft h es e l e c t e dp e p t i d e so rp r o t e i n sw e r eb l a s t e di ng e n ed a t a b a s eb a n k ，s ot h a ts o m ep o s s i b l ep o t e n t i a lt a r g e t so ft h ed r u gs a l v i a n o l i ca c i dbc o u l db ea c q u i r e d t h es p e c i a lb i n d i n gb e t w e e nt h ep h a g ec l o n ea n ds a l v i a n o l i ca c i dbc o u l db ef u r t h e rc h e c k e db yc a p i l i a r ye l e c t r o p h o r e s i s t h er e s u l t sa b o v ec o u l dp r o v i d es o m es u g g e s t i o n st ot h er e s e a r c ho nt h ed r u gm e c h a n i s mo fs a l v i a n o l i ca c i db t h i sp a p e rd e v e l o p e dt h em e t h o d so ft h em o n o d i s p e r s es u p e r p a r a m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sp r e p a r a t i o nu s i n gan e wp o l y m e rt e m p l a t e s o m ep r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e df o rt h ea p p l i c a t i o n磁性纳米颗粒的制备及其在药物作用靶点生物淘洗中的应用a st h ec o n t r a s ta g e n te n h a n c e m e n ti nm a g n e t i cr a d i a t i o ni m a g i n g t h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r eu s e df o rb i o p a n n i n gt h ee f f e c t i v ec o m p o n e n tt a r g e t e dp r o t e i n so fc h i n e s et r a d i t i o n a ld r u g m o r ew o r kw a sr e q u i r e dt ob ed o n ef o rt h ef u r t h e ra p p l i c a t i o na n dr e s e a r c ho ft h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s k e yw o r d s ：s u p e r p a r a r n a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s , p h a g ed i s p l a yl i b r a r y ,s a l v i a n o l i ca c i db附件一上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者躲夯p h日期：2 0 0 6 年1 2 月0 1 日附件二上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密回。( 请在以上方框内打“4 ”)指导教师签名日期：年月日研侈日者u l僻侔娜“敝印磁性纳米颗粒的制备及其在药物作用靶点生物淘洗中的应用符号说明b r m m c4 - b r o m o m e t h y l - 7 - m e t h o x y e o u m a r i n4 - 溴甲基7 甲氧基香豆素t e mt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e 透射电子显微镜x r dx r a yd i f f r a c t i o nx 射线衍射分析f t i rf o u r i e rt r a n s f o r m e di n f r a r e ds p e c t r o m e t e r 红外富利叶转换分析p c sp h o t o nc o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y 光子相关性光谱分析a f ma t o mf o r g em i c r o s c o p e 原子力显微镜v s mv i b r a t i n gs a m p l em a g n e t o m e t e r 振动样品磁强计s e p h a d e xg 2 5 葡聚糖凝胶g 2 su s p i ou l t r a s m a hs u p e r p a r a m a g n e t i ci r o no x i d e 超小超顺磁性氧化铁s p i os u p e r p a r a m a g n e t i ei r o no x i d e 超顺磁性氧化铁m i o nm o n o c r y s t a l l i n ei r o no x i d en a n o p a r t i c l e s 单晶氧化铁纳米颗粒c l l 0c r o s s u n k e di r o no x i d e 交联氧化铁颗粒m r im a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g 磁共振成像b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白d m s od i m e t h y is u l f o x i d e 二甲基亚砜p b sp h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e 磷酸盐缓冲液生理盐水m o l ，lm o l e l i t e r 摩尔每升t r i st r i sh y d r o c h l o r i d e 三( 羟) 甲基氨基甲烷p e gp o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇p f up l a q u ef o r m i n gu n i t 空斑形成单位p hh y d r o g e ni o nc o n c e n t r a t i o n 氢离子浓度l bl u r i ab r o t hl b - 培养基e d c1 - e t h y i - 3 - ( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y ) c a r b o d i m i d eh y d r o c h l o h d el - 隆二甲氨基丙基) 每乙基碳二亚胺盐酸盐m e s2 - n m o r p h o u n o - e t h a n e s u l f o n i ca c i d2 - ( n 一吗啉代) 乙烷磺酸n h sn h y d r o x y s u e c i n i m i d en 羟琥珀酰亚胺c ee a p i l i a r ye l e c t r o p h o r e s i s 毛细管电泳gg r a m 克p gm i c r o g r a m 徽克p lm i c r o l i t e r 微开m lm i l l i t e r 毫升m i nm i n u t e 分钟4上海交通大学博士学位论文1 引言第一章磁性纳米颗粒的研究综述1 1 纳米科学在生物医学领域的应用1 9 5 9 年，诺贝尔奖得主费曼( r i c h a r df e y n m a n ) 就设想：。如果有一天人们可以按照自己的意志排列原子和分子，那会产生什么样的奇迹! ”，“毫无疑问，如果我们对细微尺度的事物加以控制的话，将大大扩充我们可以获得物性的范围”，他首次提出了“纳米”材料的概念。今天，纳米科技的发展使费曼的预言已逐步成为现实。纳米材料的奇特物性正对人们的生活和社会的发展产生重要的影响。纳米科技经过近半个世纪的长足发展，正在人类生活的各个方面得到实际应用。特别在生物医学领域，胶体金已经广泛应用于生物分子的检测和诊断，如免疫细胞化学分子标记、d n a 探针、医学诊断试剂等 1 。磁性纳米粒子用于药物输送、肿瘤热疗，生物分子和细胞的分离纯化，m r i 造影剂等e 2 3 。量子点可以作为荧光探针检测生物分子，单色或多色荧光标记细胞进行检测或成像，标记生物组织进行影像学观察等 3 ，4 羟基磷灰石和其他复合物应用于人工活性骨和作为药物缓释载体等 5 。可以预计，具有独特优良性质的各种纳米材料将在生物医学领域得到越来越多的应用。1 2 磁性纳米颗粒及其在生物医学方面的应用磁性氧化铁纳米颗粒是指粒径小于l p m 的颗粒，包括顺磁性纳米颗粒和超顺磁性纳米颗粒。顺磁性( p a r a m a g n e t i s m ) 是指磁化率随温度的变化服从居里一外斯定律的磁性纳米颗粒的制各及其在药物作用靶点生物淘洗中的应用物质的磁性在原子尺度上，磁矩受到热扰动的影响，以致在没有外加磁场时，这些磁矩是无规则分布的，从而物质不显示磁性当外加磁场时，这种磁矩就获得沿外磁场方向有较多统计分量的现象。在通常的磁场和温度下，磁矩在外场的能量远小于热扰动能量，因此顺磁性物质的磁化率接近零，数值很小，仅为i 0 - 2 _ i 0 5 在一定的外加磁场中，由于分子热运动影响磁矩的排列，所以物质的磁性随温度的升高而减小。顺磁性物质的磁化率随温度的关系服从居里外斯定律，一即质量磁化率xo = 二一r e式中c 称为居里常数o 对一定物质是一常数，它可以大于、等于或小于，零。当o ；0 时，x = 导，称为居里定律。铁磁性金属在距离点以上是顺磁性的，反铁磁性金属在奈耳点以上是顺磁性的。超顺磁性( s u p e r p a r a m a g n e t i s m ) 是指一种将铁磁性或亚铁磁性物质微粒化后所出现的与原物质本身不同但类似于顺磁性的一种磁性。若将铁磁性或亚铁磁性物质破碎成十分细小的单畴微粒，或在非铁磁性合金基体中析出很细小的单畴微粒，当颗粒小到一定程度以后与大块铁磁物质相比，它们显示出不同的性质。设颗粒的磁化强度为m s ，体积为n 磁各向异性常数为正如果体积矿减小到使k v = k t 程度，即使不加磁场而由于热扰动就可以使粒子内的自发磁化方向发生变化由于每个微粒的磁矩_ = m s v , 如加以外场日，则外场将力图使微粒的的磁矩按日方向排列，但热扰动则力图阻止这一排列，因此从整体上看，个个颗粒的磁矩起着与顺磁性物质中各个原子磁矩相同的作用，有这样的微粒所组成的集合体的磁性行为和通常的顺磁性物质相似，因此称为超顺磁性。超顾磁性与通常的顺磁性不同之处在于：在通常的顺磁性物质中。每个原子( 离子) 的磁矩约为几个波尔磁子而在超顺磁性物质中，每个微粒的磁矩大约为1 0 4个波尔磁子，因此可在通常磁场中磁化到饱和，超顺磁性的一个重要特征是没有磁滞现象。即肼和量k 皆为零。通常出现超顺磁性的粒子的直径约为1 - l o n m 。顺磁性和超顺磁性对于活体内应用很重要 6 ，7 ，具有顺磁性或超顺磁性的纳米颗粒在磁场撤离后能够使磁性颗粒重新均匀分散，被广泛用于生物分子的分离纯化，同时超顺磁性颗粒还可以作为m r 成像造影剞。6上海交通大学博士学位论文磁性纳米颗粒在生物医学方面的应用主要有以下几个方面：1 2 1 用于细胞等生物成分的分离磁性颗粒已经广泛应用于生物的各种成分如生物细胞、细胞器、病毒、细菌、抗体、d n a ，r n a ，蛋白等的分离或纯化或免疫分析。用于细胞分离的磁性颗粒目前已经有多个产品投放市场，其中在市场上应用比较广泛为d y n a b e a d s ( d y n a l ，o s l o ，n o r w a y ) ，为各种具有不同粒径( 2 8 p m ，4 5 岬，5 o p m 等) 的多孔聚苯乙烯( p o l y s t y r e n e ) 微球，其孔洞中包含纳米磁性粒子因而具有顺磁性。颗粒的表面可以被处理为活化的甲苯磺酰基，用于连接蛋白等生物成分，也可以通过物理作用在颗粒表面包被蛋白 8 ，9 其他还有b i o m a g ( p e r s e p t i v eb i o s y s t e m s ，f a r m i n g h a m ，m a ，u s a ) 的磁性颗粒，粒径为lum 左右，为硅烷化( s i l a n i z a t i o n ) 的氧化铁颗粒，颗粒表面有活性一c o o h 基团或- - n h 2 基团，可以连接多种生物分子( 1 0 ，1 l ，1 2 还有m a c sm i c r o b e a d s ( m i i t e n y ib i o t e c ，b e r g i s c h ，g 1 a d b a c h ，g e r m a n y ) 的磁性颗粒，粒径为5 0 n m ，是以葡聚糖( d e x t r a n ) 为模板合成的磁性颗粒 1 3 ，1 4 ，1 5 。用于生物成分分离的单个磁性颗粒一般是由许多具有顺磁性的更小粒子组成，这样磁性颗粒在有磁场的情况下，能够容易收集，在没有磁场的情况下，能够容易分敖开。利用磁性颗粒分离生物活性成分，方法简单，步骤少，可以直接纯化含有杂质的样品，外加磁场很容易就将生物活性成分分离出来。在分离洗脱时，可以不使用有机溶剂，有利于保持生物细胞、病毒等的活性 1 6 ，在分离后还可以通过磁场作用对被分离成分进行浓缩 1 7 。1 2 2 在交变磁场下对肿瘤进行温热治疗；肿瘤治疗的目标是使肿瘤细胞死亡而正常细胞不受到损伤，但目前包括化学疗法，放射线疗法在内的很多治疗方法，都会对正常组织细胞有较大的损伤。研究表明：肿瘤细胞在温度在4 l 4 2 时会因温度敏感而凋亡，而正常细胞却不凋亡。所以有一些研究者将磁性粒子注入肿瘤组织，施加交变磁场，磁性粒子在磁场下运动产生热，可以将局部的肿瘤组织升温到4 5 4 7 ，从而杀磁性纳米颗粒的制备及其在药物作i 靶点生物淘洗中的应朋死肿瘤细胞，而周围健康组织不受到影响 1 8 ，1 9 。2 0 ，2 1 】近年来还有研究者将磁性颗粒的温热疗法和基因治疗结合起来进行治疗肿瘤的研究 2 2 ，2 3 】1 2 3 用于药物输送；人们还提出了利用磁场靶向输送药物的概念，即将药物装载在磁性颗粒上，通过外磁场的作用，将载体定向输送到病灶组织，使药物定位释放这样药物可以集中在病交部位发挥作用，达到高效、速效和低毒的目的这方面的实验研究已有一些报道 2 4 ，2 5 ，2 6 ，2 7 ，如k u b o 等将载阿霉素磁性脂质体与游离阿霉素药液分别静注至右后肢荷骨肉瘤0 s 5 1 5 的叙利亚仓鼠中，并把一块永久磁铁( o 4 t ) 种植到实体瘤内，结果显示静注阿霉素磁性脂质体组肿瘤组织中药物浓度约为游离药物组中药物浓度的4 倍 2 7 我们实验室也在载药磁性粒子的制备方面做了一些工作，制备的阿霉素磁性脂质体的t e m 图片见图1 图1 制备的阿霉素磁性脂质体( 本实验室制备)f i g u r e1 a d mm a g n e t o l i p o s o m e另外，德国科学家cp l a n k 通过将磁性颗粒和基因载体或病毒混合，加入到细胞中，在磁场的作用下进行转染，发现基因的转染效率有较大提高 2 8 ，2 9 ，3 0 ，3 1 ，3 2 】。1 2 4 用于细胞膜操纵的研究：机械力作用于细胞，对其许多功能具有影响，如细胞的生长。基因的表达和蛋白的合成等。在连接了磁性颗粒的配体和细胞表面受体结合后，将磁场扭3上海交通大学博士学位论文转，产生机械力直接作用于细胞膜表面及细胞骨架磁性扭转细胞仪( m a g n e t i ct w i s t i n gc y t o m e t r y ，m t c ) 被用于探测作用于细胞上的机械力，记录细胞的反应，可以对细胞膜进行操纵和研究 3 3 ，3 4 。该方法也可用于研究药物和激素对经过机械作用刺激的细胞的作用c 3 3 ，3 5 】。1 2 5 作为造影剂以改善磁共振成像质量：磁性纳米颗粒作为造影剂的应用，比较成熟的有超顺磁性氧化铁纳米颗粒( s p i o ) ，已经作为产品上市其他如超顺磁性氧化铁纳米颗粒a m i - 2 5 ，被用于肝脏造影，能够使非肿瘤的肝组织信号减弱，使肝组织和肿瘤的信号对比增强 3 6 。正在进行临床实验的还有超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒( u s p i o ) 等，如a m i 一2 2 7 ，在血液中循环的血浆半衰期为8 1 m i n ，可被作为血池造影剂或者载入巨噬细胞进行淋巴造影研究【3 7 。进一步，人们期望通过在超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒表面连接具有结合特异性的生物分子如抗体等，作为体内特定靶分子的显示和造影增强剂。靶向造影剂的研究已经成为磁性纳米颗粒造影剂研究的重要方向。1 3 磁性纳米颗粒制备方法近年来，纳米磁性颗粒在生物细胞分子分离，核磁共振的造影成像，以及药物输送等方面存在巨大的应用价值，有关磁性纳米颗粒的制备研究也越来越多。磁性纳米颗粒的制备方法有许多种【2 ，3 8 ，在生物医学中最常用的方法为共沉淀法( c o p r e c i p i t a t i o n ) ，共沉淀法是将铁离子和亚铁离子溶于溶剂中，滴加碱溶液或氧化剂，生成磁性纳米颗粒胶体混悬液。共沉淀法制备的颗粒具有纯度高、化学组成控制简单准确等优点。应用共沉淀法进行制备，由于产生的纳米颗粒粒径表面能很大，很容易聚集产生沉淀，所以常常需要在分散溶液中加入高分子聚合物，提高磁性颗粒的稳定性。文献中最常用的一种方法是在共沉淀形成颗粒后，加入高分子聚合物溶液作为分散剂，通过进一步物理分散获得磁性纳米粒字。加入的高分子有合成的或天然的生物相容性高分子如葡聚糖( d e x t r a n ) 3 9 ，4 0 ，淀粉( s t a r c h ) 4 1 ，9磁性纳米颗粒的制备及其在药物作用靶点生物淘洗中的麻用白蛋白( a l b u m i n ) 4 2 ，4 3 ，壳聚糖( c h i t o s a n ) 4 4 ，4 5 ，硅烷 4 6 ，4 7 。4 8 等。1 9 8 2 年m o l d a y 等在合成氧化铁共沉淀后，加入适量葡聚糖进行分散，制备出磁性纳米颗粒，应该是磁性纳米颗粒制备中比较经典的方法 4 0 。s c h r o d e r 等用合成出的氧化铁颗粒和淀粉酶水解后的淀粉混合制备出表面具有羧基的磁性纳米颗粒，并且在磁性颗粒上连接了单克隆抗体后，粒径在1 0 0 - 3 0 0 h m 之间【4 1 。c h a n g 等在合成出氧化铁共沉淀后，加入适量的羧甲基化的壳聚糖，超声波分散6 0 分钟，然后离心分离得到分散均匀的壳聚糖包被的磁性氧化铁纳米纳米颗粒 4 4 b o d n m 等则将壳聚糖表面的- n h 2 基团和小分子三元酸通过连接剂n n 一羰基二噫啶( c d i ) 进行化学共价连接，制备得到分散均匀的纳米磁性颗粒，颗粒粒径平均为3 0 0 h m 左右1 4 5 】。z h a n g 等在利用还原法合成出氧化铁沉淀后，将人白蛋白包被在磁性颗粒的表面，制备出磁性的纳米颗粒，颗粒直径平均为2 0 0 n m 左右 4 2 b r u c e 等用3 一丙氨基三乙氧基硅烷( 3 - a m i n o p r o p y l - t r i e t h o x y s i l a n e ，a p e s ) 修饰在合成好的氧化铁的表面，颗粒表面由于有一n 也基团而带正电，易于吸附带负电的d n a 核酸序列，从而可以用于核酸的分离 4 6 。而k o h 通过将3 一丙氨基三乙氧基硅烷修饰在氧化铁的表面后，利用表面的- n h ：基团连接生物活性分子抗体进行生物细胞的识别，连接后的颗粒直径有3 2 n m 左右 4 7 。k o l l l e r则将羧基修饰的p e g 和3 一丙氨基三乙氧基硅烷连接，然后依靠表面的羧基和氨基之间的氢键将生物活性分子组装在磁性颗粒的表面，具有用于m r i 成像和靶向识别等的潜力 4 8 】。在共沉淀形成颗粒，分离后加入高分子聚合物分散制备的磁性纳米磁性颗粒，其中的氧化铁晶核的粒径一般较大，在几十纳米以上同时很容易形成几百纳米的聚集体。这是由于一方面在共沉淀形成氧化铁颗粒时，成核和生长的过程均不易控制，导致生长过快过大，而且粒径分布不均：另一方面是由于颗粒形成后必然有聚集现象，即使后加入高分子分散剂并进行物理分散也很难完全使颗粒均匀分散。1 0上海交通大学博士学位论文所以，有研究采用另一种方法，即在共沉淀前，加入高分子聚合物分散剂，在高分子聚合物溶液中，制备磁性氧化铁纳米颗粒。高分子聚合物可以同时作为合成磁性颗粒的模板和分散剂。一方面控制磁性颗粒的生长，另一方面阻止磁性纳米颗粒的聚集，起悬浮稳定的作用。文献报道中用于磁性纳米颗粒合成模板的高分子有淀粉( s t a r c h ) 4 9 、具有羧基的氧化树枝状分子( 0 x i d e d e n d r i m e r ) 5 0 、葡聚糖( d e x t r a n ) 或葡聚糖衍生物 5 l ，5 2 、聚乙烯醇( p o l y v i n y la l c o h o l ，p v a ) 5 3 等。k e n n e t h 在还原型的葡聚糖溶液中制备的磁性纳米颗粒粒径小于3 0 n m 5 1 ，p a l m a c c i 等利用葡聚糖制备的t i o 磁性纳米颗粒粒径在1 0 2 0 n m 之间 5 2 。l e e 等将铁离子和亚铁离子在p v a 的水溶液中滴加o h 沉淀出纳米颗粒，结果表明在p v a 浓度增加时，合成的颗粒晶体的粒径减小，在p v a 溶液为1 ( 重量比) 时合成的溶液磁性颗粒悬浮液稳定，制备的磁性颗粒粒径在4 - t n m 之间 5 3 。e e l l a r 等将可溶性的马铃薯淀粉和铁离子和亚铁离子按一定的比例混合，加入o h 形成沉淀，然后用氯酸钠氧化包被在氧化铁的表面的淀粉，氧化的淀粉在氧化铁的表面起到稳定纳米颗粒的作用，作为磁共振血管造影剂进行了初步实验 4 9 各种高分子模板的结构不同，制备的磁性颗粒形貌也有所不同。以葡聚糖为模板合成的磁性颗粒主要为单个粒子或几个粒子组成，见图2 ( a ) t e m 图片。以聚乙烯醇为模板合成的磁性颗粒的粒子之间呈线形排列，t e m 见图2 ( b ，c ) ，作者认为颗粒之间为线形分子连接 5 4 。磁性纳米颗粒的制备及其在药物作用靶点生物淘洗中的应j j图2a t e m 图片氧化铁葡聚糖纳米磁性颗粒s c a l eb a r = 5 0 肌。b t e m 图片氧化铁聚乙烯醇纳米磁性颗粒s c a l eb a r = 5 0 蛆c t e m 图片氧化铁聚乙烯醉纳米磁性颗粒s c a l eb a r - 2 0 ( f r o mh e at hp a r d o e 5 4 】)f i g u r e2t e mi m a g e so r a ) m a g n e t i cp a r t l c l e - d e x t r a np r e p a r a t i o n ：s c a l eb a r = 5 0 姗( ”m a g n e t i cp a r t i c l e - p v ap r e p a r a t i o n ：s c a l eb a r = 5 0r i m ，a n d ( c ) m a g n e t i cp a r t i c l e p v ap r e p a r a t i o n ：s c a l eb a r = 2 0n m ( f r o mh e a mp r o d o e 【5 4 1 ) s t r a b l ee 等利用羧基化的树枝状分子( c a r b o x y l a t e dp o l y ( a m i d o a m i n e )p a ! i 【从d e n d r i m e r ) 合成能在混悬液稳定的存在的磁性纳米颗粒，颗粒粒径在2 0 一3 0 h m 之间在对照中普通d e n d r i m e r 或a m i n e - t e r m i n a t e d 或h y d r o x y l t e r m i n a t e dd e n d r i m e r s ( g e n e r a t i o n5 ) 出现沉淀，制备的磁性颗粒的t e m 照片见图3 5 0 。作者认为最终形成的结构的示意图见图4 ，磁性纳米颗粒周围很多个树枝状分子包围。1 2上海交通大学博士学位论文图3d e n d r m e r 合成的氧化铁纳来颗粒的t e m 图片， ，b ，c d 为不同的合成条件( f r o , *f i g u r e3t e mo f d e n d d m e r - m a g n e d cp a r t i c l e sa 、b 、c 、dw e r et h er m n o p a r t i c l e sw i t hd i f f e r e n tc o n d i t i o n sp r e p a r e d ( f r o ms t r a b | eee ta 1 【5 0 】)簿啭图4 由树枝状分子制备的磁性纳米颗粒示意图( f r o ms t r a b | eee ta 1 【s o )f i g u r e4t h em a g n e t i cn a n o p a n i c l e sm o d e lp r e p a r e db yc a r b o x y l t e r m i n a t e dp o | y ( a m i d o a m i n e )d e n d r i m e r ( f r o ms t r a b l eee ta 1 【5 0 】)磁性纳米颗粒的制备及其在药物作用靶点生物淘洗中的应用对合成获得的纳米磁性粒子的表面进行修饰，以连接生物活性分子，往往需要在粒子表面引入易进行化学反应的活性基团。对于羟基葡聚糖包覆的磁性颗粒，葡聚糖的羟基大多已和磁性颗粒表面形成氢键 5 5 ，只能利用表面剩余的部分羟基进行活化反应但是基团活性弱，难于直接有效连接生物活性分子。w u n d e r b a l d i n g e rp 等则是在c l i o ( c r o s s l i n k e di r o no x i d e s ) 表面交联的溴乙酸和聚乙烯醇( p v a ) 上连接带有氨基的化合物，如乙二胺等，使表面有活性基团一n h 2i s 6 s t r a b l ee 等则在作为模板的树枝状高分子上进行修饰修饰反应的难易，以及反应效率等，对发展纳米磁性粒子的应用有非常重要的意义。1 4 本论文的研究目标论文探讨建立一种新的超顺磁纳米颗粒的制各方法，使用一种新的醇酸聚合物作为合成纳米氧化铁的高分子模板。该聚合物是由乳酸光催化合成的枝杈状聚合物，具有良好的水溶性和生物相容性。由于枝杈状聚合物本身的分散性，以及表面的羧基和羟基等亲水性基团，获得的超顺磁性纳米颗粒不易聚集，具有良好的分散性和悬浮稳定性该合成方法工艺简单，易于产业化，而且颗粒表面含有具有较高活性的羧基基团，可以直接反应连接各种生物活性分子或药物，连接效率较高。进一步地，我们应用所合成的纳米磁性粒子，研究了其作为m r i 造影增强剂的潜力，并特别建立了一种通过磁分离进行生物淘洗研究药物与蛋白相互作用的方法。4上海交通大学博七学位论文第二章磁性纳米粒子的制备1 实验仪器材料和方法i 1 买验仪器材料荧光光谱检测仪f - 2 5 0 0h i t a c h i ，日本光子相关光谱分析仪( p c s ) z e t a s i z e r3 0 0 0 h s a ，m a l v e r n ，美国高速离心机，e p p e n d o r f5 8 0 4 r ，美国透射电子显微镜( t e m ) c m l 2 0 ，p h i l i p s ，荷兰傅立叶变换红外光谱仪( f t i r ) p a r a g o n1 0 0 0 ，p e r k i ne l m e r ，美国d 8a d v a n c ex 射线粉末衍射仪( x r d ) b r u k e r a x s ，b r u k e r ，德国元素分析仪( c h n s oa n a l y z e r ) p e2