（食品科学专业论文）生鲜猪肉品质评价的差异蛋白质组学初步研究.pdf

激涯工囊大学矮七学位论文 生鲜猪肉品质评价的差异蛋白质组学初步研究 摘要 生鲜猪肉品质具有复杂而多元的特性，对其形成机理、控制和评 价一直是肉品科学研究的焦点蛰迄今为止，对生鲜猪肉品质形成机理 及其评价研究大量集中在正常肉和劣质肉之间的差异及胴体瘦肉率等 方面，而对优质猪肉生鲜晶质的形成机理、控制和评价尚缺乏有效的 方法。以双向凝胶电泳技术和质谱技术为核心的蛋白质组学为生鲜猪 肉品质及形成机理研究提供了新的思路。借助蛋白质组学的强大功能， 通过寻找、筛选并鉴定与肉质性状相关的标记蛋白，探究猪肉品质形 成和遗传调控的生理生化基础，并为通过e d n a 库找到品质控制基因 提供相关依据。 本研究通过对猪骨骼肌样品制备和双向电泳条件等相关技术参数 进行比较和优化，建立了猪骨骼臃双向电泳的技术方法；并以浙江优 质地方品种金华“两头乌 猪和目前国内普遍养殖的三元杂交品种杜 长大猪为研究对象，对不同屠宰体重和储藏时间下的生鲜猪肉进行了 差异蛋白质组学的初步研究。主要实验结果如下： 1 、通过对猪肌肉组织的研磨方式、样品裂解液组成的比较研究和 优化，发现采用液氮研磨彤l 肉样品，加入8 m 尿素，2 m 硫脲，4 c h a p s 的裂解液能有效提高蛋白的抽提率，蛋白抽提率达5 2 9 64 - 0 3 4l a g m g ； c l e a nu p 试剂盒能进一步纯化蛋自，去除杂质，使考染胶面的背景更加 浙江工商大学硕士学位论文 清晰，具有较高的分辨率和良好的重复性。 2 、通过对水化方式、等电聚焦参数以及染色方法的比较研究和优 化，建立了猪骨骼肌双向电泳的方法。结果表明，采用主动水化和被 动水化相结合、渐进式升压的方式能获得较好的等电聚焦效果，减少 横条纹；改进后的银染能检测到更多的低丰度蛋白，适用于凝胶分析。 3 、取相同蛋白浓度的金华“两头乌”和杜长大猪的肌肉组织样品 进行双向电泳分离，经软件分析，实验重复性( n = 3 ) 达到7 5 ( 尸 o 0 5 ) 。比较两个品种猪肌肉的蛋白质图谱，发现具有统计学意义和分 析意义的蛋白点共有2 6 个。金华“两头乌”猪宰后7 2 h 内肌肉蛋白样 品每块胶的蛋白点数都在5 8 0 以上，有9 个具有显著差异的蛋白点( 尸 o 0 5 ) ，其中有1 个点在宰后o h 和2 4 h 时均未检测到，有1 个点在宰 后2 4 h 时未检测到，有4 个蛋白点随储藏时间延长表达量减少，2 个蛋 白点表达量增多，有1 个蛋白点在4 8 h 时丰度最高；不同体重的金华“两 头乌”猪肌肉样品经过分离得到8 个具有显著差异的蛋白点( 尸 o 0 5 ) 。 关键词：猪；肉质；机理；双向电泳；蛋白质组学；金华猪；杜长大 i l 浙江工商大学硕士学位论文 s t u d yo nd i f f e r e n t i a lp r o t e o mi c s o ff r e s hp o r kb a s e do ni t sq u a l i t y a b s t r a c t t h eq u a l i t yo ff l e s hp o r ki sac o m p l i c a t e da n dm u l t i p l e u n i tc h a r a c t e r s t u d i e so ni t si n t r i n s i cm e c h a n i s m ，e v a l u a t i o na n dm a n a g e m e n ta r ea l w a y s t h eh o t t e s tr e s e a r c hf i e l d so ft h em e a ts c i e n c e s of a r , s u c hk i n d so f r e s e a r c h e sh a v eb e e ng e n e r a l l yf o c u s e do nl e a nr a t e sa n dd i f f e r e n c e si nt h e q u a l i t yb e t w e e nn o r m a la n dp o o rm e a t h o w e v e r , m e t h o d sf o re f f e c t i v e l y e v a l u a t i n gt h eq u a li t yo f t h ef r e s hp o r ka n di t si n t r i n s i cm e c h a n i s ma r es t i l l n o tw e l le s t a b l i s h e da sf a ra sw ek n o w t w o d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 2 - d e ) a n dm a s ss p e c t r o m e t r y ( m s ) ，p r o v i d eu sw i t ht h e n e w t h o u g h tt os t u d yt h ei n t r i n s i cm e c h a n i s mo f f r e s hp o r kq u a l i t y ，a r et h e t w ok e yt e c h n o l o g i e so fp r o t e o m i c s w i t ht h ep o w e ro fp r o t e o m i c s ，t h e i n t r i n s i cm e c h a n i s mo ff r e s hm e a tq u a l i t ya n dt h ep h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lb a s i so fg e n e t i cr e g u l a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e db ys e a r c h i n ga n d s c r e e n i n gf o rp r o t e i nm a r k e r so fm e a tq u a l i t yt r a i t s t h u sp r o t e o m i c so f f e r s ar e l a t e df o u n d a t i o nf o rf i n d i n gq u a l i t yg e n e st h r o u g hc d n a t h e r e f o r e ，t h i ss t u d yw a sc o n d u c t e dt oe v a l u a t et h eq u a l i t yo ff r e s h p o r ko f t w od i f f e r e n ts p e c i e s ( j i n h u ap i g si nt h eo r i g i n a la r e ao f z h e ji a n g ， c h i n a ，t e r m e da sj h ，a n dh y b r i dp i g so fd u r o c l a n d r a c e y o r k s h i r e ， 1 i i 浙江工商大学硕士学位论文 t e r m e da sd l y ) w i t hd i f f e r e n tf e e d i n gp e r i o d sb yu s i n gt e c h n o l o g i e so f d i f f e r e n t i a lp r o t e o m i c s w eh a v ee s t a b l i s h e dt h ep o r km u s c l ep r o t e o m i c m e t h o d so ns a m p l ep r e p a r a t i o na n d2 - d ec o n d i t i o n st h r o u g hc o m p a r i n g a n do p t i m i z i n gt h er e l e v a n tt e c h n i c a lp a r a m e t e r s t h em a i nr e s u l t so ft h e p r e s e n ts t u d yw e r ea sf o l l o w s 1 t h es a m p l es e p a r a t i o no ff r e s hp o r km u s l ew a se s t a b lis h e dw i t ht h e r e l a t i v et e c h n i q u e sp a r a m e t e r si n c l u d i n gl i q u i dn i t r o g e ng r i n d i n ga n dt h e l y s i ss o l u t i o no f8 mu r e a ，2 mt h i o u r e aa n d4 c h a p s ，t h ep r o t e i n e x t r a c t i o nr a t er e a c h e dt o5 2 9 64 - o 3 4g g m g ；m o r e o v e r ，t h eo p t i m i z e d p u r i f i c a t i o nm e t h o dw a sc a p a b l eo fr e m o v i n gi m p u r i t ya n dg a v em o r ec l e a r b a c k g r o u n di nt h e2 - d ei m a g e sb yu s i n gc l e a nu pk i tw h i c hh a st h eh i g h r e s o l u t i o na n dg o o dr e p e t i t i o n 2 t h e2 - d em e t h o d so ff r e s hp o r km u s c l ew e r ee s t a b l i s h e dw i t h r e l a t i v et e c h n i q u e so p t i m i z a t i o ni n c l u d i n gr e h y d r a t i o nm o d e l s ，i s o e l e c t r i c f o c u s i n g ( i e f ) p a r a m e t e ra n ds t a i n i n gp r o t o c 0 1 s a t i s f a c t o r yi e fs e p a r a t i o n w a sa b t a i n e dw i t hr e d u c e dh o r i z o n t a ls t r i p e sb yu s i n gt e c h n i q u e st h a t r e h y d r a t i o nm o d e lo fa c t i v er e h y d r a t i o nf o r6 ha n dp a s s i v er e h y d r a t i o nf o r 6 ha n di e fm e t h o do fk e e p i n gv o l t a g ei n c r e a s i n gg r a d u a l l y ，w h i l em o r e l o wa b u n d a n c ep r o t e i n sw e r ed e t e c t e db ym o d i f i e ds l i v e rs t a i n i n gw h i c hi s s u i t a b l ef o rg e la n a l y s i s 3 p r o t e i n sf o r mj ha n dd l ym u s c l ew i t hs a m ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o n w e r es e p a r a t e db y2 - d e ，t h er e p e a t a b i l i t y ( n = 3 ) o ft r i p l i c a t eg e l sf o re a c h i v 浙江t 商大学硕士学位论文 s a m p l ew a s7 5 p o 0 5 ) 2 6s p o t s s h o w e das i g n i f i c a n c ed i f f e r e n c e b e t w e e nt h ef r e s hp o r ko fj ha n dd l yb yu s i n gs t a t i s t i c a la n dq u a n t i t y a n a l y s i s m o r et h a n5 8 0s p o t sw e r ed e t e c t e di ne a c hj i n h u ap i gp o s t m o r t e m s t o r a g eg r o u p s ，9s p o t ss h o w e das i g n i f i c a n tp o 0 5 ) d i f f e r e n c ed u r i n g7 2 h p o s t m o r t e ms t o r a g e b a s e do na v e r a g ev a l u ef o re a c hs p o t ，t w os p o t sa t ji n h u ap i g sg r o u pw e r e n td e t e c t e da to n e o rt w o p o i n t s ，i n c l u d i n go n ea to h g r o u p ，o n e a to h ，2 4 hg r o u p o n e s p o ts h o w e dt h eh i g h e s tp r o t e i n e x p r e s s i o na t4 8 hg r o u p 4s p o t sw e r ec o n s i s t e n t l yr e d u c e dd u r i n ga g e i n g ， w h i l e2s p o t sw e r ec o n s i s t e n t l yi n c r e a s e dd u r i n ga g e i n g 8p r o t e i n sw e r e s e p a r a t e df r o mj hm u s c l eo fd i f f e r e n tw e i g h t ，w h i c hs h o w e ds i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e 0 0 5 ) k e y w o r d s ：p i g s ；m e a tq u a l i t y ；m e c h a n i s m ；t w o d i m e n s i n a lg e l e l e c t r o p h o r e s i s ；p r o t e m i c s ；j i n h u ap i g ；d l yp i g v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本 人为获得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文 的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：j 辑 导师签名： 日期：彦州 浙江工商大学硕上学位论文 第l 章引言 1 1 生鲜猪肉品质及其评价 1 1 1 生鲜猪肉品质 一般来说，肉品品质是指与肉的外观、适口性和营养价值等有关的一些物理 特性和化学特性的综合体现【ij ，由感观品质、加工品质、营养价值和卫生质量或安 全质量组成【2 ，3 】，感观品质包括肉的表观、质地、风味等，它影响着消费者对肉品 的购买情况；加工品质决定肉品是否可用于进一步加工，这一性质主要取决于屠 宰后的处理；营养价值包括肉的化学组成和对人的营养功能；卫生质量或安全性 则要求不存在有害微生物或药物残留等污染。随着人们对动物保护和环境保护意 识的增强，有人赋予肉品品质另一个层次的内涵，即人文品质或动物福利1 4 1 ，对动 物的饲养方式( 粗放式散养、集约化囚禁式饲养) 和饲养环境( 有机畜牧、绿色 畜牧) 均提出更高的要求。对于生鲜猪肉，基于感观特性的生鲜品质是其食用品 质的集中反映。随着社会经济文化的进步和发展以及消费的日趋多样化和个性化， 人们对肉的可接受性往往基于肉的感观品质。肉品的感观品质与其本身的理化特 性及其生理生化机能密切相关，还与人的心理相关，受到地理和文化的影响。“苏 丹红”、“瘦肉精”等事件使人们对已有的一些感观要求指标产生误解。 肉品品质是一个复杂而多元的性状，受遗传、品种、性别、饲养模式( 饲养 营养、饲喂水平、饲养时间和饲养环境等) 、运输、宰前处理、屠宰方法、储藏条 件等诸多因素影响【5 l 。在肉品市场链中，从养殖生产者、肉品加工企业、销售部门、 零售商到消费者的巧i 同环节，根据各自不同的经济利益和要求产生了不同的肉质 内涵。养殖生产者希望有较高的瘦肉生产率，肉类加工企业希望有好的外观，在 冷藏过程中质量稳定，屠宰场和零售商希望有更长的货架寿命，而消费者则希望 在肉品安全的前提下，有较好的感官品质。然而，基于动物营养和饲料工业的现 代肉品生产，使传统的粗放管理、饲粮结构、饲喂方式、饲养密度等发生重大改 变，提高了肉类的数量，但是这也影响到肉用动物机体的生理学、行为学和生物 化学过程，导致了肉品品质的下降。同时为了促进生长，减少疾病，大量滥用化 浙江t 商大学硕：仁学位论文 学制剂、抗生素、瘦肉精等，加剧了肉品品质的恶化。此外，单纯追求提高产肉 性能，而忽视肉用动物的体质健康，外部形状与内在机能的协调，生理学的平衡 和整体适应性，从而导致现代肉用动物对周围环境条件的高度敏感性。最终导致 了肉品的食用质量如色泽、风味、嫩度等日益下降；p s e 肉的比例大幅度升高( 约 占整个肉类产量的8 1 5 ) ，系水力下降；肉中的残留现象极为突出【5 1 。所有这一 切使人们对现代畜产品品质的广泛质疑并导致对规模化养殖产品的消费信心不断 下降。以成分检测和含量水平为主的肉品品质评价方法已十分成熟，但对于生鲜 猪肉品质的形成机理、控制和评价研究则相对滞后，需进一步的深入研究。因此， 有效控制和提高生鲜猪肉品质建立客观有效的评价技术对现代肉类生产和消费的 健康发展具有十分重要的意义。 1 1 2 生鲜猪肉品质形成机理及评价方法研究进展 动物屠宰后不久，肌肉内的能源物质( 包括a t p ，磷酸肌酸和糖原) 被逐步 耗尽，肌肉活动产生的乳酸在肌肉中积累，肌肉酸化，p h 值不断下降，最后达到 一极限p h 值，肌肉出现最大僵直，这一过程称为尸僵。宰后2 4 小时p h 值与肌 肉的嫩度有相关性【6 】。尸僵发生后，肌纤维容易断裂，肌肉重新变软，p h 逐渐回 升，硬度下降，系水力提高，蛋白质和a t p 降解，肌纤维组织结构发生一定破坏， 从而达到最佳食用品质。这一过程称为肉的嫩化( t e n d e r i z a t i o n ) 或熟化 ( m a t u r a t i o n ) 。 肌肉的生长发育是一个长期的动态过程，因此猪肉品质的形成也是一个渐进 的过程，肉品的很多性状在动物生长发育过程中就已经被决定。m c p h e r r o ne t a l 7 】 ( 1 9 9 7 ) 在n a t u r e 上指出肌肉生长抑制素具有特异性表达并作用于骨骼肌细胞的 特点，在各物种间高度保守，并对肌肉的生长发育具有十分显著的抑制作用。 g r o b e r te la l 8 】( 1 9 9 7 ) 研究表明比利时蓝牛双肌表型的出现是由于在肌肉生长抑制 基因8 2 1 8 3 1 核苷酸处缺失1 l b p ，造成移码突变，使缺失突变后面的第1 4 位密码 子变为终止密码，合成无功能的肌肉生长抑制蛋白，并最终导致了比利时蓝牛的 过度生长。c a s a n l 9 】( 1 9 9 9 ) 研究了从比利时蓝牛m a r c i i i 、皮埃蒙特安格斯的 两个半同胞家系中分离出的肌肉生长抑制素钝化基因型，在每个家系以肌肉生长 抑制素座位的侧翼6 个微卫星标记，采用相差信息区分肌肉生长抑制基因的效应， 浙江工商大学硕士学位论文 对肌肉生长抑制素与整个基因组其它座位的互作效应进行了估测，发现肌肉生长 抑制素与4 号染色体对肌肉的剪切嫩度有互作效应。此外，肌肉生长抑制素还与 脂肪形成相关。l i ne ta l l l o 】( 2 0 0 2 ) 研究了肌肉生长抑制基因敲除的小鼠肌肉生成 和脂肪形成，发现敲除肌肉生长抑制基因的小鼠肌肉发育增加，相关联的是脂肪 形成能力降低，最终瘦蛋白分泌下降。r e b b a p r a g a d ae t a l 【l i 】( 2 0 0 3 ) 的研究也证实， 肌肉生长抑制素具有抑制b m p 7 诱导的脂肪形成的作用，这种抑制作用是通过细 胞内s m a d 2 s m a d 3 的磷酸化而实现的。 肉的成熟过程中蛋白质的降解和变性是肉嫩化的关键。肌肉经过最大僵直期 后，肌肉蛋白质会因钙蛋白酶酶解而导致蛋白质的降解和肌肉剪切力的上升，使 肌肉解僵得以嫩化。因此，钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白与肉的嫩化过程密切相 关。k o o l l l l l a r a i e 【1 2 】( 1 9 9 5 ) 指出钙激活蛋白与肌肉嫩化的作用机制有关，尸僵形 成以后，肌质网和线粒体膜不再吸收c a 2 + ，大量的c a 2 + 释放入肌浆中，激活钙激 活蛋白酶，促进肌肉蛋白质( 包括结缔组织蛋白) 水解，从而使肌纤维断裂。h o p k i n s 和t h o m p s o n t 】( 2 0 0 1 ) 采用原位法研究钙蛋白酶活性，研究表明钙蛋白酶会引起 蛋白质的降解，对肉的嫩化非常重要；而钙蛋白酶抑制蛋白可抑制肌肉内蛋白质 降解，参与肌肉生长过程中蛋白质的更新，还可抑制宰后体内钙蛋白酶的活性， 从而影响肉的嫩度。m o h a m m a de ta l 1 4 】( 2 0 0 2 ) 研究表明，肌肉的嫩化是由一系 列的蛋白质降解引起的，这些蛋白包括：肌原纤维内的连接蛋白，如肌联蛋白和 伴肌动蛋白；肌原纤维间的连接蛋白，如肌间线蛋白和纽蛋白；连接肌原纤维与 肌纤维膜的蛋白，如抗肌萎缩蛋白；连接肌纤维与基底膜的蛋白，这些蛋白的降 解引起肌原纤维的弱化，从而使肌肉嫩化。v e i s e t h ”】( 2 0 0 4 ) 等人通过实验证明， 以肌原纤维小片化指数( m f i ) 作为嫩度改变的标志，“钙蛋白酶活性在宰后9 h 内随着m f i 的增加而逐渐表现出来，1 2 h 内活性增加较为明显，2 4 h 后，钙蛋白酶 抑制蛋白活性的增加表现更为明显，之后的7 2 3 6 0 h 里，m f i 开始降低，说明钙蛋 白酶抑制蛋白活性的增加抑制了“钙蛋白酶的活性。k o o h m a r a i e 【1 6 】( 2 0 0 6 ) 研究表 明，在肉的成熟过程中，“钙蛋白酶的活性显著下降，是其发挥水解作用的体现， 因此u 钙蛋白酶是影响肉质嫩度的主要酶。 o 腩r i l 7 1 ( 1 9 9 1 ) 研究表明，加快冷却速度可以降低肌肉p h 值的下降速率， 对减少肌球蛋白变性和汁液流失非常有效。l a w r i e i l 8 l ( 1 9 8 8 ) 报道，高p h 值的肉 浙江工商大学硕+ 学位论文 解冻后比低p h 值的肉滴水损失少，冷冻、解冻的速度以及冷冻贮藏的温度都对肉 的保水性有明显影响。t o m b e r ge t a l t l 9 】( 2 0 0 0 ) 用不同电刺激获得不同p h 值下降 速率的肉，发现尸僵阶段p h 值快速下降组的肌肉细胞膜破裂，肌浆蛋白质释放到 胞外，该组肉的剪切力值在第1 天已明显低于其他组，并且在整个成熟期内剪切 力最高。研究表明由于大量蛋白质的快速降解，导致p h 值的快速下降，从而嫩化 肉。c h a n n o n 【2 0 1 ( 2 0 0 1 ) 报道，糖降解速率是影响猪肉嫩度的重要因素。l o n e r g a n 2 1 】 ( 2 0 0 2 ) 等研究表明，终p h 值与系水力、色泽和感官品质之间的相关性较好；糖 酵解的能量与肉的滴水损失呈显著正相关，而与色泽、p h 值呈显著负相关。r e e s 【2 2 1 ( 2 0 0 3 ) 等观察到宰后2 4 h 内p h 下降的速率与宰前击晕方式相关，宰后电刺激引 起的汁液流失更多，同时s d s p a g e 电泳显示蛋白的降解程度增加。但k r i s t e n s e n 【2 3 】 ( 2 0 0 1 ) 等认为，宰后骨架蛋白( 如肌间线蛋白) 不降解，在肌肉发生僵直时会 导致肌原纤维网格结构收缩形成汁液流失通道而增加汁液流失。 由于肉品品质形成机理与肉质特性密切相关，因此，从肉品品质形成机理方 面进行有效的肉品品质评价及控制对于现代肉品生产至关重要。总的来说，传统 的肉质评价方法包括感官品评、理化特性评价和组织学特性评价。然而这些方法 虽然一定程度上能反映肉的品质，但又不能较好和确切的反映消费者对肉品品质 的感受，也无法满足现代肉品生产和消费的要求。近年来，国内外在肉质评价新 技术的研究和应用方面虽有了较大的发展如电子鼻和电子舌技术、低频核磁共振 技术、计算机视觉技术、近红外技术等，但仍然不能和蛋白质组学在肉质形成机 理及评价研究中的作用相提并论，特别是利用蛋白质组学技术寻找、筛选并鉴定 和肉质有关的标记蛋白，全面而深入的洞察肉品质的形成机制与持水性、嫩度等 之间的相关性以及最终的肉质控制。现对传统肉质评价方法及肉品品质评价的新 方法作一介绍。 1 1 2 1 传统评价方法 对于肉品新鲜度的评价，主要从感官性状、腐败分解产物的特性与数量、细 菌污染程度三个方面来进行。传统肉品品质评价方法主要有：感官品评法( 依据 人们的主观感觉和经验，如肉的嫩度、多汁性、新鲜度、口感可适度等) 、物理化 学法( 如用剪切力表示嫩度、用系水力表示多汁性、用脂肪含量表示香味等) 和 组织学特性评价( 如肌纤维直径、肌纤维密度、肌节长度等) 。 4 浙江工商人学硕士学位论文 ( 1 ) 感官评价 感官评价是经专业训练的人员通过观察肉的表面和切面的状态、色泽、粘度、 弹性和气味来判定肉的新鲜度。感官评价肉质有两类方法：一是品尝专家小组主 观口感评定肉的风味，虽然是主观口感的评价，并有人文效应，但对特定的国家 和地区，却具权威性；再一类是对影响风味的主要指标，如肉色、p h 值、系水力、 嫩度、大理石花纹等进行分析，这虽是客观评价，但也只能算是对品尝评价的预 估和印证。感官评价是肉品卫生检查中国家认可的最基本、最快速的方法之一， 它具有快速、灵敏、简便、实用，不需要借助仪器，不用固定检验场所等优点， 但当前感官标准检测主要依赖于主观感觉和个人经验，判断结果与个人的年龄、 知识水平甚至是情绪等都有很大关系，测量结果常有较大波动，非经验丰富和训 练有素人员难以胜任。只有在极严格的实验条件下，实验结果才能获得满意地重 现性，另外与其它分析方法的结果也缺乏可比性。因此，在我国科研生产中不经 常采用，即使采用，所得结果也难以作为依据。 ( 2 ) 理化特性评价 1 ) 肉色 肌肉色素主要由肌红蛋白和血红蛋白构成，而对肉色起主要作用的是二价铁 与珠红蛋白的复合物，其色素环上铁原子的化学价对肉色的变化起决定作用。正 常猪肉由于被切开后肉和氧充分接触形成氧合肌红蛋白而呈现鲜红色，这便是消 费者所喜爱的颜色。但随着时间的延长，肌红蛋白中二价铁被氧化为三价铁而呈 现暗红色，为消费者所反感。 肉色的测定有多种方法，如经典的h o m s e y 法、氰化法、k r z y w i c k i 法、k a r l s s o n 法和t r o u t 法等，目前使用的肉色评分比色板、波长测定仪、色差仪、色度仪等。 肉色的评价分为主观评价和客观评价。主观评价是按5 级分制对肉色进行目测评 分【2 4 】。目前暂用美国的“肉色甲方图9 1 ：1 分= 灰白色( 异常肉色) ，2 分= 轻度灰 白色( 倾向异常肉色) ，3 分= 正常鲜红色，4 分= 稍深红肉色( 属正常肉色) 和5 分= 暗红色( 异常肉色) 。此法简单易行，能准确区分正常和异常肉色，但评分结 果容易受人为因素和环境光度的影响。肉色的客观评价即借助仪器来区分肉色。 例如使用色差计按l ( 亮度) ，a 值( 红色程度) 和b 值( 黄色程度) 以及b a 来评 价肉色，但在肉色评定中应根据我国实际，如我国地方猪种肉色的l 木值偏高，但 浙江工商人学硕士学位论文 一般不是p s e 肉【2 5 1 。亦可如h o m s e y l 2 6 1 提 h 的，利用分光光度计测定光密度值， 从而评价肉色。 2 ) 嫩度 嫩度是猪肉品质的首要物理指标，是猪肉质地和蛋白质特性的反映。肉嫩度 受多种因素制约，如品种、年龄、解剖学部位、肌纤维直径与密度、大理石纹程 度、肌肉化学成分( 各种脂肪、氨基酸含量) 等。其中测定前处理工艺是一个比 较重要的影响因素，特别是正确的电刺激熟化条件和胴体冷藏、酶制剂、酸处理 和高压处理都有益于改善嫩度。宰后胴体冷冻速度的控制可以有效地防止冷收缩 和解冻僵直，防止老化。此外，猪肉在烹饪时热处理的温度和时间对嫩度亦有重 大影响。肉的嫩度是所有肉质指标中最不稳定、最易受干扰的量化指标。 猪肉嫩度的评定分为主观评价和客观评价。主观评价是通过人们的咀嚼动作 所产生的肉嫩或老的感受，具体来说就是人们感受到的肉对牙齿的抵抗性、咬断 肌纤维的难易、对舌与颊的柔软性、磨碎肉的均匀性以及肉残渣剩余量多少的综 合刺激【2 7 - 2 9 1 。主观评价比较接近人们对肉适e l 性的综合评价，但它受个体心理和 生理因素的制约，且评价没用统一的标准，致使被鉴定的肉样可比性较低【3 0 , 3 i j 。 客观评价有两种基本类型：第一类，度量肉的咬力值，常用的仪器如v o l o d k e v i c h 咬力仪、物性测试仪( 即质构仪) ，以及穿刺类型的仪器如新西兰的m i r i n z 嫩度 计和法国嫩度计。第二类，度量肉的剪切力值，常用的仪器有沃一布剪切仪、万能 测试仪、物性测试仪、c l m 嫩度计等。 3 ) 肌肉系水力 系水力【3 2 1 ( w h c ) 是指在外力( 加压、加热、切碎、冷冻、贮存等) 作用下， 从肌肉蛋白质系统释放的液体量，是猪肉品质评定的重点。在现代肉品科学研究 中，系水力包括三个方面的内涵：系水潜能，表示肌肉携带水分的最大容量， 在正常肌肉p h 范围内，其取决于肌肉微观结构和表面张力参数【3 3 1 ；可榨出水， 表示外力条件下肌肉液体的流失量；贮存损失，表示不施加任何外力，只受重 力作用下，肌肉液体的流失量。肌肉水分中有5 左右与蛋白质结合形成稳定的结 合水，通常不易受到环境的作用而增减。其余9 5 的水分属于不易流动水或自由 水，这些水分易受外界环境影响。肌肉的最终p h 值及p h 值的下降速度、离子强 度、渗透压、蛋白质的变形程度和尸僵程度等均可影响肌肉的系水力，而系水力 6 浙江工商大学硕士学位论文 影响肉的风味、多汁性、嫩度、颜色、加工与贮藏性能。 系水力测定方法繁多，按样本处理手段可分为三类：第一类，利用外力改变 猪肉的保水结构，然后对改变了的结构和水分的得失进行度量，如压力称重法、 压力滤纸面积法、离心法、膨胀法、毛细管法等。第二类，不加任何外力度量猪 肉的液体流失，如滴水损失、滤纸法等。第三类，通过腌制或加温度量猪肉的失 水程度，如水浴损失、熟肉率、拿破率等。其中由毛细管法原理发展的k a u f f m a n 快速滤纸法【3 4 】和滴水法中的h o n i k e l 滴水损失法【3 5 】是较流行的两种方法。 4 ) p h 值 肌肉的p h 值是反映屠宰后猪胴体肌糖原酵解率的重要指标，宰后4 5 至6 0 分 钟度量的p h 值是公认的区分生理正常和异常肉质的重要指标。屠宰后有机体的自 动平衡机能终止，机体组织因供氧不足，无氧代谢( 糖酵解) 能力相对旺盛，最 终产生乳酸，乳酸的积累会导致肌肉p h 值降低。肌肉p h 值下降的速度和强度， 对一系列肉质性状产生决定性的影响。肌肉的p h 与肉色、系水力、嫩度等肉质性 状高度相关，屠宰后如果体温仍然很高( 如环境温度较高) ，p h 会迅速下降，可 使肌浆蛋白和肌原纤维蛋白发生部分降解，产生外观苍白、松软和液体渗出性猪 肉( p s e 肉) 的可能性就很大。p s e 肉的滴水损失明显，猪肉p h 值接近5 时，肌 肉的系水力很低，会对猪肉的风味产生影响，造成猪肉品质下降。 猪肉p h 值的测定可以使用比色法，即将肉浸液与一定p h 值的标准缓冲溶液 加同一指示剂进行颜色比较求出p h 值；或用普通酸度计在剥取背最长肌试样测 定；或用特制的酸度计在屠宰线上直接插入胭体肌肉中测定。宰后4 5 m i n 内测定 p h 值，记录为p h i ，2 4 h 测定的记录为p h 2 4 ，或p h o ( 最终p h 值) 。正常猪肉的 p h 值从活体时7 0 左右，宰杀后逐渐降低，至2 4 h 可降至5 3 5 7 左右。一般认为 p h i 6 0 ，又伴有暗黑色 和表面干燥可判定为d f d 肉【3 6 j 。p h 值易受到诸如品种、采样部位、家畜宰前状 况等因素影响，难以单独用这个指标反映出肉品新鲜度变化的真实情况。 ( 3 ) 组织学特性评价 用组织学特性评价肉品品质很早就受到重视，无论是进行感官评价，还是物 理特性评价，都是以肌肉的组织结构为基础。肌肉的组织学特性一般包括肌纤维 直径、肌纤维密度、肌纤维面积比例、脂肪面积比例、结缔组织面积比例和肌节 浙江工商大学硕十学位论文 长度等，这几种组织学特性与肌肉的嫩度、风味、多汁性有一定的对应关系，但 目前还没有形成一个定量的对应表达式，而且这几种组织学特性之间也不是独立 的，它们彼此间存在很多相关性。许多研究表明，肌纤维直径和密度是影响肌肉 嫩度和系水力的重要指标。肌纤维越细、密度越大的品种，其肌内脂肪的沉积量 要多于肌纤维粗而密度低的品种，且肉质和风味都较好。白肌纤维直径大于红肌 纤维和中间型纤维，白肌纤维比例越高，肉的风味越差，红肌纤维含量越高，肉 色越好，因含有类脂，红肌纤维含量越高则风味越好。川井田博【3 7 1 ( 1 9 8 3 ) 、谢菊 兰等【3 8 】( 1 9 9 8 ) 分别对猪的肌纤维直径与肉质之间的关系进行了研究，结果表明， 我国地方猪种肌纤维直径比引进猪种的肌纤维直径要细，相应的肉品嫩度较好。 王楚端等【3 9 】( 1 9 9 6 ) 研究结果发现，肌纤维直径粗大，白肌纤维增多而红肌纤维 减少是形成p s e 肉的组织化学基础。吴德等【4 0 】( 2 0 0 1 ) 研究结果表明，不同猪种 在肌纤维直径和横截面积上存在显著差异。朱砺等【4 l 】( 2 0 0 2 ) 研究结果表明肌纤 维面积与胴体性状间存在极显著的正相关，即肌纤维面积越大则胴体性状越好。 曾勇庆等【4 2 】( 1 9 9 8 ) 认为结缔组织在肌肉中会以较厚的中隔及较薄的肌束膜形式 在肌纤维间和肌束周围形成致密的膜鞘，这种膜鞘结构在一定程度上可防止肌肉 水分的蒸发和汁液的外渗损失，即肌肉组织结构中结缔组织含量越丰富，肌肉的 持水能力就越强。 1 1 2 2 生鲜猪肉品质评价的现代方法 ( 1 ) 电子鼻和电子舌技术( e l e c t r o n i cn o s ea n de l e c t r o n i ct o n g u e ) 电子鼻又称气味扫描仪，它以特定的传感器和模式识别系统快速提供被测样 品的整体信息，指示样品的隐含特征【4 3 1 。电子舌是一种使用类似于生物系统的材 料作传感器的敏感膜，当类脂薄膜的一侧与味觉物质接触时，膜电势发生变化， 从而产生响应，检测出各类物质之间的相互关系”4 1 。这种味觉传感器具有高灵敏 度、可靠性、重复性。它可以对样品进行量化，同时可以对一些成分含量进行测 量。基于电子舌与电子鼻各自的特点与检测中的优越性，电子鼻与电子舌在肉类 品质检测尤其是肉品新鲜度研究中已有了各种应用。这些电子产品虽然在一定条 件下对某些感官标准可以进行测定，但由于这些电子传感器容易受到复杂因素的 影响并且只能检测某些特定成分，单一用其来检测或者评定肉品新鲜度还不够完 善有待进一步研究。 8 浙江工商大学硕士学位论文 ( 2 ) 低频核磁共振技术( l f n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ，l f - n m r ) 核磁共振波谱是当代化学中一种重要的谱学研究手段，其应用范围广泛。n m r 是基于原子核磁性的一种核磁共振技术，2 0 世纪中期由荷兰物理学家g o v e t e r 最先 发现。由于n m r 可快速定量的检测样品且对样品不具破坏性，因此在食品科学中 的应用越来越多。n m r 基本原理：在静磁场中，具有磁性的原子核存在不同能级， 用一特定频率的电磁波照射样品，当电磁波能量等于能级差时，原子核吸收电磁 波发生能级跃迁，产生共振吸收信号( 自旋自旋弛豫时间t 2 和自旋晶格弛豫时间 t 1 ) 。有研究者认为，肉系水力的变化在于宰后肌肉肌原纤维的收缩和细胞外自 由水的变化【4 5 1 ，而这些变化与核磁共振一些检测参数的变化是对应的，由此提出 可用l f - n m r 测定不同处理过程中肉中水分迁移、系水力等的变化规律，该技术真 正从物质基础上解释了系水力影响肉品品质的原因。l f - n m r 在肉的系水力检测方 面具有优越性。 ( 3 ) 计算机视觉技术( c o m p u t e rv i s i o nt e c h n o l o g y ) 计算机视觉技术【4 6 】是利用一个图像传感器获取物体的图像，将图像转换成数 字图像，从中提取特征参数，并利用计算机模拟人的判别准则去理解图像和识别 图像，进而对产品进行分类或分级，不仅客观、高效且相当准确。近年来，随着 数字图像处理技术的快速发展，较大推动了计算机视觉技术在肉类新鲜度评价中 的应用研究，使肉品新鲜度评价的准确率高，而且可以省去繁琐的化学试验。计 算机视觉技术在胴体分级、肉中大理石花纹( 脂肪含量) 及肉色评定中也有广泛 的应用。计算机图像分析技术辅助颜色检测可以使肉外观颜色指标定量化、标准 化，不受人为心理因素影响，而且计算机视觉精度优于人眼的视觉精度，对颜色 变化反应灵敏。计算机视觉技术虽具有无损、快速、准确和安全等特点，但其易 受到某些复杂因素的影响，单一应用其来检测或者评定肉品品质还不够完善有待 进一步研究。 ( 4 ) 近红外技术( n e a r - i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y , n i r ) 近红外光谱是介于可见光谱区和中红外光谱区之间的电磁波，波长范围为 7 0 0 2 5 0 0 n r n 。当它照射到样品上时，光的散射和吸收取决于肉的结构组成( 如肌 节长度和胶原质含量) 和化学成分，从而对品质不同的肉可形成相应的特征吸收 光谱。近红外谱区的信息主要是分子内部原子间振动的倍频与合频的信息，几乎 9 浙江工商人学硕士学位论文 包括有机物中所有含氢基团的信息。近红外技术在肉品品质的检测中的应用相当 广泛，它可以用来测定肉类的水分、蛋白质、脂肪含量等指标，甚至可以在屠宰 分割过程中及时测定肉的理化指标及肉色。冷冻和解冻对肉的品质有较大的影响， 利用近红外技术可以将经过冷冻的肉鉴别分离出来，同时还可以测定肉的保水性 及渗透性，肉汁的损失率及干物质的含量【4 7 】。基于近红外的检测方法，不仅速度 快，可实现对多个项目同时检测；而且能提取样品的多组分信息并实现在线检测， 但是近红外技术建立预测模型需要耗费大量的人力物力，不能适用于样品数量少 的分析，并且检测的准确性要比化学法差。 1 2 蛋白质组学在肉品品质评价中的应用研究 1 2 1 蛋白质组学概述 1 2 1 1 蛋白质组学及差异蛋白质组学 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。 存这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学。目前功能基因组学所采 用的策略都是从细胞中m r n a 的角度来考虑的，但并刁 能全面代表蛋白表达水平。 实验也证明，组织中m r n a 丰度与蛋白丰度尤其是低丰度蛋白相关性差。更重要 的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质蛋白 质相互作用等则几乎无法从m r n a 水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的 执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命 在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后