（生物化学与分子生物学专业论文）龙葵耐重金属铜胁迫的生理生化机制研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名： 导师签名： ；摹苏 膨彩d 。 时间：o 切7 年多月，? e t 时间： 。7 年多月厂三日 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生魏士争每帆锄7 年多州日 导师签名：雪一乒 时间：护7 年6 月廖日 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 本文以杂草龙葵为材料，采用室内盆栽实验，应用生理生化研究方法和技术对龙葵 的重金属铜耐性的生理生化机制进行研究。重点探讨了c u 2 + 胁迫条件下龙葵体内可溶性 糖、可溶性蛋白等生化物质含量的变化和抗氧化酶系活性的变化规律，c u 2 + 胁迫对龙葵 光合作用、根系活力和细胞膜透性的影响以及根尖细胞的超微结构的变化和铜在龙葵体 内的分布和结合形态。从而了解杂草龙葵的耐铜能力并为进步阐明龙葵耐铜胁迫的生 理生化机制提供实验基础和理论依据。 研究结果表明，低浓度c u 2 + 胁迫( 1 0 m m o l k f l ) 对龙葵的毒害作用不明显，且对 其生长有一定的促进作用，随着处理浓度增加，龙葵长势受到抑制，叶片色素含量下降 即光合作用强度降低。龙葵在c u 2 + 胁迫下，导致活性氧( r o s ) 积累，损害了植物细胞 的膜系统，使得细胞膜透性增大；根系活力在短时间c u 2 + 胁迫下有所升高，发生应激反 应，表现出一定的适应性，但高浓度、长时间重金属毒害会破坏根细胞结构。龙葵对c u 2 + 胁迫具有一定的抵抗能力，具体表现为c u 2 + 处理使可溶性糖、可溶性蛋白含量升高；c u 2 + 胁迫使s o d 酶活性增加，在抵御c u 2 + 胁迫中起着主要作用，而p o d 活性随着胁迫浓度的 升高而增强，并且在处理前期的活性较高，同功酶也随之发生复杂的变化，c a t 在根中 的变化不大，茎和叶中的c a t 、s o d 和p o d 协同作用清除积累的活性氧。电镜观察结果 表明，在低浓度c u ：+ 胁迫( 2 5 m g l 1 ) 下，细胞核基本没有影响；当胁迫浓度增至5 0 m g l 4 时，各细胞器的结构出现受损，发生质壁分离，线粒体消失；1 0 0 m g - l 。胁迫浓度下的细 胞器受到严重破坏，核膜破裂，核仁解体、细胞核质凝集。c u 2 + 胁迫条件下，只有根中 的c u 含量明显增加，茎和叶片中的含量下降。龙葵根部细胞中可积累大量的c u ，并且 主要以h a c 提取态和h c i 提取态等难溶态为主。这些存在形态均有效地降低了c u 的活性， 增强了植物对c u 的抗性。这说明，c u 在根部的滞留作用是龙葵耐铜性的重要机制。 关键词：c u 2 + 胁迫；龙葵；生理生化特性；重金属耐性；化学形态；超微结构 a b s t r a c t a b s t r a c t s o l a r i u mr d g r u ml i sp l a n t e di nt h ep o ti ng r e e n h o u s e ，t h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l t o l e r a n c em e c h a n i s m st oh e a v ym e t a l sb ym e t h o d sa n dt e c h n i q u e so fp h y s i o l o g ya n d b i o c h e m i s t r ya r es t u d i e di n t h i st h e s i s t h ec h a n g eo fs o l u b l es u g e r 、s o l u b l ep r o t e i n 、 a n t i o x i d a n te n z y m e ss y s t e m sa n do t h e rb i o c h e m i c a lp h y s i c a lc o n t e n ta r ee m p h a t i cd i s c u s s e d t h ee f f e c to fp h o t o s y n t h e s i s 、r o o ta c t i v i t y 、c y t o m e m b r a n c ep e n e t r a t i o n ，t h ec h a n g eo f u l t r a s t r u c t u r a lo fr o o tt i pc e l l sa n dt h ed i s t r i b u t i n ga n dc o m b i n ef o r mo fc o p p e ri nc e l to f s o l a r i u mr d g r u ml a l ea l s oi m p o r t a n ti t e m si nt h es t u d y c o n s e q u e n t l y ，t h ec o m p e t e n c eo f c o p p e rt o l e r a n c ei s k n o w n t h ee x p e r i m e n tf o u n d a t i o na n dt h e o r ya u t h o r i t yw h i c ht h e p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt o l e r a n c em e c h a n i s m st oc o p p e ro fs o l a r i u mr d g r u ml a l e f u r t h e re l u c i d a t e d 1 1 1 er e s u l t si n d i c a t e ：u n d e rl o wc o n c e n t r a t i o no fc u 2 + ( 1 0i n m ol - k g - 1 ) ，s o l a r i u mr d g r u m l d o e s n tp u tu pe v i d e n tp o i s o n o u ss y m p t o m sb u ts h o w si t s e l f ag o o dg r o w t h , w h i l ee x p o s e s t oh i g hc o n c e n t r a t i o no fc u 2 + ，s o l a r i u mr d g r u ml t a k e so ns e r i o u sh a r m f u ls y m p t o m s ， r e s t r a i n s p i g m e n tc o n t e n to fl e a fa n dd e s t r o y s f u n c t i o no fc h l o r o f i h y l ls ot oa f f e c t p h o t o s y n t h e s i so f p l a n t al a r g en u m b e ro fr o s ( p r o d u c e sa n da c c u m u l a t e si np i a n od a m a g e s s e v e r e l yt h ec y t o m e m b r a n e ，c y t o a r c h i t e c t u r ea n df u n c t i o no fm a i no r g a n e l l e s t h er o o t a c t i v i t yi ss e a s o n e do ns h o tt i m es t r e s s i n g ，b u ti tc a l ld e s t r o yt h ef r a m e w o r ko fr o o tc e l lb y l o n gt i m es t r e s s i n gi nh i 曲c o n c e n t r a t i o n s o l a r i u mr d g r u ml p r e s e n t sm u c hs t r o n gt o l e r a n c e t oc u 2 + s t r e s s ，a sf o l l o w i n g ：i ti n c r e a s e st h ec o n t e n to fs o l u b l es u g e ra n ds o l u b l ep r o t e i n ；t h e a c t i v i t i e so fs o dm a k et h em a i nf u n c t i o ni nr e s i s t i n gc u 2 + t h ec a t i v i t i e so fp o di n c r e a s e w i t ht h er i s i n go fs t r e s sc o n c e n t r a t i o na n ds o z y m ec h a n g ec o m p l e x ；t h er o si sp u r g e db y c a ta n dp o dc o o p e r a t i n gw i t hs o d e f f e c t so fh e a v ym e t a l sc uo nu l t r a s t r u c t u r e so fr o o t t i p c e l l so fa r ed e t e r m i n e d u n d e rt h el o w e r t r e a t i n gc o n c e n t r a t i o n ( 2 5 m g l 。) ，t h e u l t r a s t r u c t u r e so ft h ec e l l sh a v en oo b v i o u sc h a n g e ；w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e st o 5 0 r a g + l - i , t h eu l t r a s t r u c t u r e so fp a r to r g a n d i e sb e g a nt oa p p e a rs o m ec h a n g e s ，s u c h a s p l a s m o l y s i sd i s a p p e a e i n go fm i t o c h o n d r i a d i s t o r t i o no fn u c l e u s ，m u c ho fh e a v yd e n s i t y e l e c t r o nd e p o s i t i n go nt h ec e l lw a l l u n d e ru n d e rt h eh i 曲t r e a t i n gc o n c e n t r a t i o n ( 1 0 0 m g l 1 ) ， t h eu l t r a s t m c t u r e so ft h eo e g a n e l l e sa r ea l m o s td e s t r o y e di nr o o tt i pc e l l s m a n yf u n c t i o n i n g 2 沈阳农业大学硕士学位论文 s t r u c t u r ei nr o o tt i pc e u s ，i n c l u d i n gm e m b r a n e ，n u c l e a rm e m b r a n e sa n dc l l r o m a t i n s ，b e c o m e f u z z ya n du n s t r u c t u r e d t h ec o n c e n t r a t i o no fc ui nr o o k si n c r e a s e s ，b u td e c l i n e si ns t e a m sa n d l e a v e s i tc a na c c u m u l a t eag r e a td e a lo fc ui nr o o tc e l lo fs o l a r i u mr d g r u ml t h er e s u l t s i n d i c a t et h a tr o o tr e t a r d a t i o ni si m p o r t a n tt o l e r a n c em e c h a n i s m st oh e a v ym e t a l so fs o l a r i u m r d g r u ml a sr e s p o n s eo fs o l a r i u mr d g r u ml o nc u 2 + s t r e s s ，t h eh a ce x t r a c t e d 、h c i e x t r a c t e da n ds oo na r em a i no c c u r t h ep r o c e s si ss e e m e dt ob eh e l p f u lf o rd e c r e a s i n g b i o a c t i v i t yo f c ua n dt h e nr e d u c i n gi t sp h y t o t o x i c i t i e s k e yw o r d s ：c u 2 + s t r e s s ，s o l a r i u mr d g r u ml ，p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a l i n d e x e s ，h e a v ym e t a lt o l e r a n c e ，c h e m i c a lf o r m ，u l t r a s t r u c t u r a l 3 第一章前言 第一章前言 1 1 重金属污染及研究现状 土壤是人类赖以生存的主要自然资源之一，也是人类生态环境的重要组成部分，是 人类社会的生存基础。随着农业生产的发展和农业现代化的推进，人们忽视了土壤的环 境承载能力，过量施用劣质化肥、农药，造成土壤中重金属污染日趋严重。目前，全世 界平均每年排放h g 约1 5 万t ，c u 3 4 0 万t ，p b 5 0 0 万t ，m n l 5 0 0 万t ，n i l 0 0 万t ( 周 泽义，1 9 9 9 ) 。据农业部的调查结果，目前我国污水灌区面积约1 4 0 万h m 2 ，遭受重金 属污染的土地面积占污灌总面积的6 4 8 。其中，轻度污染面积占4 6 7 ，中度污染面 积占9 7 ，严重污染面积占8 4 ，并且以汞和镉的污染面积最大，部分地区的重金属 污染已经相当严重( 陈志良和仇荣亮，2 0 0 2 ) 。 土壤中重金属积累到一定程度会对土壤一植物系统产生毒害，会造成重大的经济损 失。据初步估计，全国每年因重金属污染而造成的粮食减产损失高达10 0 0 多万t ，另外， 每年被重金属污染的粮食也多达1 2 0 0 万t ，合计经济损失至少2 0 0 亿元( 林强，2 0 0 4 ) 。 目前，已有一些地方生产的粮食、蔬菜、水果等食物中重金属含量超标或接近临界值， 这些农产品通过食物链富集到人体和动物体中，还会危及人类的生命和健康( 王向健和 郑玉峰，2 0 0 4 ) ，引发癌症和其他疾病等，并导致大气、地表水、地下水污染和生态系 统退化等其他次生生态问题。因此，土壤重金属污染已引起许多国家的高度重视。 早在2 0 世纪之初，西方就开始了关于重金属污染的研究。研究涉及生态学、环境 学、地理学等诸多领域。作为污染的最初受体和重金属进入食物链的端口，植物一直都 是重金属污染研究的重点对象，特别是随着生物科学的发展，作为一项重要的边缘科学， 植物重金属污染的研究已成为现代生物科学和环境科学的热点，以美国环保局公布的 p h y t o m m e d i a t i o nb i b i l i o g r a p h y 为例，1 9 7 7 年有关文献仅7 篇，到1 9 9 7 年已增长到每年 2 1 4 篇。美国，英国都设立了植物修复公司，专门从事土壤、水体重金属和放射性元素 的植物修复商业化工作。 在植物对重金属的耐性机制方面，相继提出螯合素、类金属硫蛋白和生物转化等作 用机制理论。目前耐性机制研究已由生物化学、生理学层次进入分子生物学层次，已克 隆出类金属硫蛋白( m t s ) 及植物螯合肤等与耐性机制相关的基因。k a m a s h i n a 已从小 麦中分离纯化出金属硫蛋白一e c 蛋白，并克隆了e c 基因；g r i l l 发现植络素合成的关键酶 4 沈阳农业大学硕士学位论文 的基因：m e a g h e r 博士领导小组向模式植物拟南芥转移有机汞裂解酶基因和汞还原酶基 因，获得抗汞的转基因植物。 我国在植物修复研究方面虽然已有许多人进行了初步探索和尝试，但系统性的研究 还处于起步阶段。2 0 0 2 年，我国学者陈同斌、杨肖娥等分别在湖南石门和浙江衢州发 现砷超积累植物蜈蚣草和锌超积累植物东南景天。随后，锰钻等超积累植物也相继发现。 洛永明、吴龙华在重金属污染土壤的植物修复，特别是利用螯合诱导技术进行强化修复 及风险诱导等方面开展了很多工作。束文胜等对铅锌尾矿酸化与重金属移动性的关系， 植被重建过程中耐性物种的选择，基质改良等生态学问题也作了系统研究。研究表明， 尾矿中重金属的毒性和营养元素的极端贫瘠是矿业废弃地重建过程中影响植物定居的 主要因子。这些都为以后植物修复工作的开展打下了基础。 1 2 重金属对植物的毒害作用 重金属污染导致的环境闯题及其对人体产生的毒害现已引起各界人士越来越多的 关注，有关重金属对各种生物的毒害作用及机理的研究也日趋增加。由于重金属数量多， 作用的生物更是无所不及，并且同一种重金属在不同的环境表现也会不同，因此研究重 金属毒害作用涉及的内容极其广泛。重金属对植物的毒害作用是由一系列因素决定的， 包括重金属的吸收位点、植物细胞中对重金属结合位点的竞争、重金属离子的特性、离 子的有效性以及各种化学作用等，而且对植物的作用不仅仅是对其单独某一方面的影 响，而是从分子到生理代谢、细胞结构，最终对植株的外部形态等各方面的综合影响。 1 2 1 环境中重金属的危害 尾矿、矿渣石材是矿区土壤重金属的主要来源之一。当这些矿山固体垃圾从地下搬 运到地表后，由于所处环境的改变，在自然条件下，极易发生风化作用，使大量有毒有 害的重金属元素释放出来进入到土壤和水体中，给采矿区及周边环境带来严重的污染。 在雨水等作用下，地下水和地表水都会受到不同程度的重金属污染。有毒气体的排 放无疑会直接污染大气。重金属在土壤中的聚集引起的危害更为严重，其进入土壤后， 一方面可在植物体中积累，并通过食物链最终转入人体内，危害人群健康，致畸致癌， 另一方面，还可能导致地下水污染，超过一定限度就会危害生态系统。同时，土壤中重 金属超标也会使农作物和其他生物受到危害。生物明显受生存的地质化学和生物化学环 境的制约，尤其是受矿泉水、土壤和岩石中高背景元素含量的制约。 1 2 2 重金属对植物生长的影响 5 第一章前言 无论是植物所需的微量元素还是非必需元素，在植物体内积累到一定程度，都会表 现出一些相似的毒害症状。重金属对农作物毒害效应的表观现象之一是生长受阻，通常 是出现生长迟缓、植株矮小、根系伸长受抑直至停止、叶片褪绿、出现褐斑、产量下降 等症状，即使是能完成生活史的耐性较强的品种，为了保持细胞正常功能，适应逆境， 必然要消耗植物生长过程中的有效能量，严重情况下会导致植物死亡。有研究表明，c u 处理后，水稻的有效穗数减少( 杨树华等，1 9 8 6 ) 。受p b 影响后，水稻的成熟期推迟， 空批率增加，从而使产量大幅度下降( 胡正义等，2 0 0 0 ) 。a s 能使四季豆的生殖生长 停止，不开花，不结实( 郑春荣和陈怀满，1 9 9 6 ) 。一定浓度的重金属铜、锌对黄瓜种 子发芽率、根的伸长、幼苗生长都有一定的抑制作用( 李淑艳和郭微，2 0 0 6 ) 。朱云集 等( 2 0 0 0 ) 研究表明，在水培和盆栽条件下，随砷浓度的提高，小麦胚根、次生根条数 减少，总根长度、胚芽长度缩短、根体积、干重也较对照减少。一些学者用不同浓度 的p b ”溶液浸泡大豆和绿豆种子并浇灌幼苗，结果表明，不同浓度的p b 2 + 对大豆种子的 萌发和幼苗的生长发育有不同程度的影响，f l p b 2 + 浓度越大，种子萌发和幼苗生长的危 害性越大( 苗明升等，2 0 0 3 ) 。周红卫等( 2 0 0 2 ) 对水生植物的研究发现重金属c r 的不 同价态对水花生均有毒害，而且随浓度的升高，叶片和根部的受害症状加重，当浓度增 至5 0m g l 1 时，叶及茎干枯，根腐烂，植株趋于死亡。d a s 等( 1 9 9 8 ) ，h a a g - k e r w e r 等( 1 9 9 9 ) 的研究也表明，用c d 处理的植物出现生长停滞，根部受破坏，叶片表现出黄 化现象，而且还影响蒸腾作用。 1 2 3 重金属对植物细胞膜的影响 在各种外界元素进入到植物细胞内之前，首先要经过细胞壁和细胞膜，因此，细胞 壁和细胞膜是植物细胞自身保护的第一道屏障。植物生长在重金属污染的环境中，由于 质膜是有机体与外界环境的界面，所以细胞质膜首先接触到重金属。研究表明，重金属 浓度越高，胁追时间越长，对细胞质膜的选择透性、组成、结构和生理生化等的伤害一 般也越大。利用不同浓度的c d 处理小麦、玉米幼苗，其叶片电导度和丙二醛( m d a ) 含量随c d 浓度的增大而增大( 檀建新等，1 9 9 4 ；孔样生等，1 9 9 9 ) ；张义贤和张丽萍 ( 2 0 0 6 ) 研究结果表明，不同浓度重金属c d 均可诱导大麦根细胞膜透性增大，根外渗 液的相对电导率和m d a 含量逐渐增大。证明在重金属胁迫下，叶片细胞质膜的组成和 完整性遭到破坏，细胞膜受到伤害后，细胞内的离子和有机物大量外渗，外界有毒物质 进入细胞，结果导致植物体内一系列生理生化过程失调。 6 沈阳农业大学硕士学位论文 1 2 4 重金属对植物光合作用的影响 不同重金属对植物叶绿素含量和光合作用有不同的影响，但总体规律均表现为随着 重金属处理浓度的升高，叶绿素的总含量降低。研究表明，过量c u 可极显著地降低苹果 叶片叶绿素含量( 刘春生等，2 0 0 0 ) ；c d 污染对水稻不同发育时期的光合作用影响非常 明显，并且其光合强度随着c d 浓度增高而降低( 王焕校，1 9 9 0 ) 。h g , 1 c d 处理对莼菜冬 芽茎和叶的叶绿素含量及叶绿素a b 值也产生了类似的影响( 陆长梅等，1 9 9 9 ) 。杨丹慧 ( 1 9 9 1 ) 的研究结果表明，c d 对光系统i 和光系统i i 均有影响，但对后者的影响更显著。 低浓度的重金属a 矿+ 处理引起菠菜p si i 颗粒的室温吸收光谱、室温荧光发射光谱和多肽 组分的改变( 谭晓宏等，2 0 0 3 ) 。n a g ( 1 9 8 1 ) 认为，c d 使叶绿素酶活性增加而导致叶 绿素分解加快，致使叶绿素含量减少。从己报道的资料看，重金属抑制植物光合作用的 机理是一个相当复杂的闯题，有报道认为c d 抑$ 0 p s h 活性，并进而导致基粒片层的消失， 类囊体酯脂降解，p s i i 光捕获叶绿素a b 蛋白复合体天线系统解体等现象( k r u p a & b a s z y n s k i ，1 9 8 5 ；k r u p a ，1 9 8 8 ：s k 6 r z y n s k a ，1 9 9 1 ) 。看来，重金属降低植物光合 作用的机理与叶绿素等光合系统许多方面的变化都有关。还有研究表明，高浓度的c u 会扰乱光化学合成和电子传递的初步反应，使根和茎的生长受到阻碍。因此，重金属对 光合作用的抑制是同时对光合器官结构的毒害和细胞内的有关叶绿素合成的酶系统的 影晌造成的。 1 2 5 重金属对植物抗氧化酶系统的影响 正常情况下，植物体内的活性氧代谢保持平衡。重金属对植物细胞膜的毒害，主要 是由于重金属胁迫下产生了过多的活性氧自由基而导致的氧化胁迫这种问接伤害造成 的。细胞内重金属离子的增加，可打破活性氧的产生与清除之间的平衡，增加活性氧的 生成量，加速0 2 。，h 2 0 2 向毒性更强的o h 转化，造成膜脂过氧化，增加膜透性，导致 细胞内含物外渗，代谢失调，对植物造成严重伤害，甚至导致植物死亡。植物体内超氧 化物歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 和过氧化氢酶( c a t ) 三种酶类组成了一个 有效的清除活性氧的酶系统( c h r i sc ta 1 ，1 9 9 2 ) 。s o d 在植物体内是清除o z - 的有效酶， 可将其转变为氧化作用相对较弱的h 2 0 2 ，f f i c a t 和p o d 是把h 2 0 2 转化为h 2 0 和0 2 的有效 酶体系，保护细胞免受活性氧的伤害，提高植物的抗逆能力。 重金属不仅通过产生氧胁迫导致对植物的毒害，重金属离子还通过替代酶蛋白反应 活性中心的金属离子或与酶蛋白中的s h 基结合，使酶蛋白变性失活；如果作用于清除 7 第一章前言 氧自由基有关的酶系统，并使其失活，将导致氧化胁迫的强化( s t a d t m a n & o l i v e r ，1 9 9 1 ； h a l l ，2 0 0 2 ) 。g a l l e g o 等( 1 9 9 6 ) 的研究结果表明重金属c u 和f e 对植物的影响是直接参 与反应产生了氧自由基，而c d 贝, l j 是通过间接的方式产生的，如果用自由基清除剂与这些 重金属离子一起作用于植物，则对各种酶活性以及氧化胁迫都会减轻，同时证明三者产 生氧自由基的能力是c u f e c d 。s c h f i t z e n d i i b e l 等( 2 0 0 2 ) 的实验表明，c d 对植物的 毒害可能是通过产生h 2 0 2 的方式而造成的，即在重金属的胁迫下植物体内积累h 2 0 2 ， h 2 0 2 的过量积累又会使植物体内的抗氧化酶系统和非酶系统发生紊乱，因此导致植物对 重金属的抗性机制不再起作用，从而使植物表现出毒害症状或死亡。 s o d 是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，主要以f e s o d 、m n s o d 和c u z n s o d 的形式存在于细胞质、叶绿体、线粒体和过氧化物酶体内，其功能是将o z 歧化为h 2 0 2 ，再由过氧化氢酶和过氧化物酶进一步分解成h 2 0 和0 2 。s o d 的抗氧化作用 需要p o d 或c a t 的参与和协同才能实现。0 可经h a b e r w e i s s 反应生成对机体毒性更大 的o h 自由基，s o d 在清除0 2 的同时还能阻止f e 弘重新受0 2 作用还原生成f e 2 + ( 0 2 - + f e 3 + - - , f e 2 + + 0 2 ) ，从而进一步阻止f e n t o n 反应( h e 0 2 + f e 2 + 一o h + f e ”+ 0 h 一) 产生更多的o h 。 因此，有人也将s o d 称作“一线抗氧化酶”( 方允中等，1 9 9 4 ) 。在重金属胁迫下，植 物体内所具有的活性氧清除酶系统和具抗性特征的生理活动被诱导而加快，s o d 在此诱 导下，其活性逐渐增加，用以清除重金属胁迫导致植物体内所产生过多的0 。研究表明， p b ，a s ，c u ，n i 等重金属都能引起s o d 活性的增加( m a s c h e re ta 1 ，2 0 0 2 ；k o r i c h e v ae t a l ，1 9 9 7 ) 。也有研究表明，当胁迫程度过于严重时，植物体中的o 。的增加超过了正常 的歧化能力极限并对组织细胞多种功能膜及酶系统产生破坏作用，导致s o d 活性的增加 受到抑制甚至急剧下降( 庞欣等，2 0 0 1 ) 。 p o d 广泛存在于植物体内不同组织中，作为活性较高的适应性酶，p o d 能够反映植 物生长发育的特点、体内代谢状况以及对外界环境的适应性。研究表明，重金属( c d ， c u ，z n ，n i 和p b ) 胁迫能诱导植物组织中p o d 总活性增加( v a n & c l i j s t e r s ，1 9 9 0 ；h e g e d u s e ta 1 ，2 0 0 1 ) ，这是植物对污染胁迫的响应。p o d 活性的增加可能是由于重金属的胁迫 产生了一些对植物体有害的过氧化物。p o d 可利用h 2 0 2 来催化这些对自身有害的过氧化 物的氧化和分解。 c a t 普遍存在于植物体内的所有组织中，它是生物氧化过程一系列抗氧化酶的终 端，c a t 通过对h 2 0 2 的清除而阻遏了h a b e r - w e i s s 反应( h 2 0 2 + 0 2 。+ r 一o h + h 2 0 + 0 2 ) g 沈阳农业大学硕士学位论文 产生o h ，从而保护膜结构。重金属在植物体内的生物学作用机制不同，植物体内的c a t 所产生的生态效应也不相同。p b t f j 紫背萍的c a t 活性有明显的抑制作用，而f e ，n i ，h g ， c r x 寸紫背萍的c a t 活性均有不同程度的刺激作用，并且c a t 对p b ，n i ，h g 的效应表现强 而迅速，对f e ，c r 的效应则表现为弱而迟缓( 董慧，1 9 9 9 ) 。植物体内的c a t 对重金属 的这种生态效应，是植物在逆环境因子的作用下，通过自身的酶机制，对植物作出的保 护性反应。 c d 2 + 胁迫对s o d 、p o d 存在低浓度下的激活效应和高浓度下的抑制效应，对c a t 则 表现为在所有浓度范围内的持续抑制效应( 张义贤和张丽萍，2 0 0 5 ) 。低浓度的c d 便对 水花生p o d 活性产生抑制作用，而s o d 和c a t 活性在低浓度c d 处理下升高，高浓度时又 下降( 周红卫等，2 0 0 3 ) 。王宏镔等( 2 0 0 2 ) 用c d 处理的不同小麦品种的结果表明，不 同品种间的s o d ，p o d 和c a t 活性差异显著，但同一品种的三种酶活性变化有所不同， c a t 活性基本可保持稳定，p o d 活性明显升高，相反s o d 活性一直下降。h g 对油菜这三 种酶活性的响应是一致的，低浓度下酶活性升高而高浓度下三种酶活性均下降( 马成仓， 1 9 9 8 ) 。c u 对三e l y l n am i n o r 的处理可导致其体内c a t ，g p o d 和p - p o d 的活性极大的增 加，而且随着c u 浓度的增加，三种酶的活性在2 4 h 均不断增加。但随着处理时间的延长， 一般在3 6 h 以后活性就会下降，而且在4 8 9 6 h 以内会降低到与对照相当的水平或者稍低 于对照( t e i s s e i r e & g u y , 2 0 0 0 ) 。罗立新等( 1 9 9 8 ) 测定了用c d 处理的小麦叶片中的 s o d 、p o d 和c a t 的活性，当处理时间延长时，c a t 活性变化不显著，s o d 活性逐渐降 低，而p o d 活性升高较快，这与王宏镔等( 2 0 0 2 ) 的结果相吻合。用h g 处理的小麦叶片 的s o d 和c a t 活性变化与c d 处理的又有不同，随着时间的延长，c a t 活性一直增加，而 s o d 活性前期有所提高，当时间延长时又下降。从以上所述重金属对植物细胞抗氧化酶 系统的影响可看出，重金属导致植物体内酶系统功能的紊乱，使植物不能有效清除活性 氧自由基，进而对质膜产生毒害作用。 1 2 6 重金属对植物细胞超微结构的影响 重金属对植物细胞中的细胞器等其它结构也产生明显的伤害，如破坏细胞的膜结 构，细胞出现严重的质壁分离和空泡化现象；使细胞核变形，核仁解体，核基质分布不 均匀，较严重情况下核中央出现大空泡；重金属对叶绿体、线粒体、细胞核等结构的不 可逆伤害，破坏了细胞正常生理活动所需的结构基础( o h o s h r o y & n a d a k a v u k a r e n ， 1 9 9 0 ) 。从而导致这些细胞器参与的各项生理生化功能被抑制甚至丧失。 9 第一章前言 国内外的许多相关研究涉及了从陆生植物到水生植物，低等植物真菌、藻类和苔藓 到高等维管植物。倪才英等( 2 0 0 3 ) 发现重金属导致紫云英细胞的超微结构损伤，主要 是叶绿体、线粒体和细胞核的结构遭到破坏。表现为叶绿体变形、球形化，类囊体模糊 不清、空泡化，被膜消失和腔内形成大脂类；线粒体变形和脊突膨胀或消失和外膜解体： 细胞核核仁膨胀消失，与染色质凝集在一起，核膜破裂。郝怀庆等( 2 0 0 1 ) 通过对水鳖 叶片超微结构的观察发现，在高浓度重金属胁迫下，细胞内的线粒体结构遭到严重破坏， 由于结构的破坏导致了细胞呼吸机能的障碍。李荣春( 2 0 0 0 ) 研究的烤烟在c d 2 + 和p b 2 + 的处理下也有相同的细胞器的变化，同时还发现细胞膜外有大量的p b 颗粒，推测细胞膜 可以阻止一部分p b 进入到细胞膜内，但这种作用还是比较有限的，因为细胞质内和叶绿 体里也有这些颗粒的存在。k u k k o l a 等( 2 0 0 0 ) 对松树针叶的重金属毒害研究发现，在 n i 2 + 为2 5m g k 分1 和c u 2 + 为5 0m g k g 1 的共同作用下，针叶的叶绿体内的基粒片层发生肿 胀，同时还发现在中央液泡内有一些颗粒状物质的沉淀，但由于相对测定限值数量太低 而无法测定是否是n i 或c u 的沉淀。d i a n n e l i d i s & d e l i v o p o u l o s ( 1 9 9 7 ) 用z n 2 + 、c u 2 + 和 c d 2 + 在不同浓度下处理的c e r a m i u mc i l i a t u m 出现了高浓度下叶绿体的基粒发生肿胀现 象，而且在2 8 m g l 。c u 2 十和1 0 m g l 。c d 2 + 时，细胞壁着色均很深，而且有电子致密颗粒， 在同样浓度的c d 2 + 时，叶绿体还会出现一些淀粉粒，同时在这些浓度时细胞有很多己死 亡，但还有一些细胞壁的残片和不可辩别的细胞内含物。以上研究均说明重金属能够破 坏细胞内各细胞器的结构，因此会导致这些细胞器参与的各项生理生化功能的损失和抑 制。 1 3 植物对重金属的耐性机理 重金属对植物是一种胁迫因素，会阻止植物生长、发育和繁殖，受重金属胁迫的植 物在一定范围内会产生一系列的生理生化反应以及核酸水平的变化，从而适应变化的环 境，因此形成了一定的耐性机制。然而迄今为止，人们对植物忍耐重金属的毒害机理仍 然不很清楚。一些研究者对植物的耐性概念仍不一致。重金属抗性( r e s i s t a n c e ) 机制的 形成是有种特异性的，通常分为两类，避性( a v o i d e n c e ) 和耐性( t o l e r e n e e ) ，前者是 指对有害元素的一种外在抗性机制，而后者是指形成了对有害元素的解毒生理机制 ( h a l l ，2 0 0 2 ) 。植物对重金属产生耐性一般包括以下几个过程，即固定、排斥、螯合 和区室化。 1 3 1 植物对重金属的抗性 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 虽然重金属污染能给大多数植物造成伤害，但在一定的浓度范围内，许多植物仍能 表现出对重金属具有一定的抗性，如重金属在根内与蛋白质、多糖类和核酸等结合，形 成稳定的化合物，沉积、固定下来，仅一部分移到地上部。其移动比例因金属元素而异， 如c u 、n i 、h g 、c d 等元素是在根中蓄积较多的元素，而z n 、m n 和f e 等则较易移动。 通常前者易与蛋白质等有机物结合形成稳定的螫合物，而后者则是稳定度较小的元素。 一般能与根中蛋白质稳定结合的元素，其向上部的移动较难。重金属被吸收到植物体后， 由于其存在部位及结合形态不同，毒性差异很大，也是不同植物种之间对重金属的耐性 产生差别的原因之一。 抗性是生物有机体暴露于逆境时能继续其各项基本生命活动的能力。包括避性和耐 性( b a k e r ，1 9 9 8 ) ，可能涉及多种机制，也是受多基因控制的特性。当逆境作为选择 压力使受胁迫种群的结构发生变化时，就导致了种群的分化，这也是生物对重金属毒性 的适应，可能是生物产生抗性方式之一。由于在避性时，植物不积累重金属，或者是采 取一种逃避的方式，因此人们把目光更多地注意到了耐性上。植物对重金属的耐性，代 表了植物对干扰和胁迫的一种反应或对环境变化的适应，近来成为一个研究的热点。人 们已从生态学、生理学、生物化学、分子生物学、进化等广泛领域深入地研究了它们之 间的关系( 段昌群，1 9 9 5 ) ，对其认识在迅速深化。 l - 3 2 植物对重金属的抗性机制 环境中过量的重金属会影响植物的正常生长和发育，尽管如此，不少植物仍能在高 浓度的重金属环境中生长、繁殖并完成生活史，这表明在长期进化过程中植物本身会发 生一系列生理生化以及分子生物学方面的变化，形成特定的抗性机制，以适应变化了的 环境，相应地产生了对重金属的抗性。植物的抗性表现在避性和耐性两个方面，相应地， 植物抗重金属也表现为两种基本对策即排斥和蓄积戴玲芬等，1 9 9 8 ) 。植物对重金属 的排斥有以下几种方式。分泌化合物降低重金属的有效性。这种机制在高等植物中并 不常见，但在蓝藻和细菌中却非常重要。回避摄入。环境中的重金属浓度很高但植物 几乎不吸收重金属。限制运输。植物将重金属滞留在根部限制其向地上部分转移。 排出体外。在高等植物中，通过对不同抗性的基因型进行的重金属离子吸收与代谢能量 关系的研究已证实，原生质膜溢泌有主动排出金属离子的作用( n i e s & s i l v e r ，1 9 8 9 ) 。 植物对重金属的蓄积是指植物吸收大量的重金属，但重金属在植物体内以不具生物活性 的解毒形式存在。植物的重金属蓄积又有几种不同的抗性机理。细胞壁和液泡扣留。 第一章前言 植物把吸收的重金属积累在体内一定的部位，避免其进入细胞质，从而减轻该重金属对 植物的直接毒害，细胞壁和液泡是植物积累重金属的主要场所。酶系统的作用。重金 属胁迫下，植物保护酶系统也会发生适应性变化，杨居荣等( 1 9 9 5 ) 发现c d 胁迫可引起 s o d 、p o d 、c a t 活性的改变。一些蔬菜幼苗在汞的胁迫下，会诱导产生新的p o d 同功 酶与外界不良的环境条作相适应。重金属结合蛋白的解毒作用。当植物细胞壁上能结 合的金属离子的结合点达到饱和时，重金属离子不可避免的进入细胞质中，此时关键性 的抗性机制则由存在于细胞质中的一些金属络合体承担。m t 是一种富含半胱氨酸( c y s ) 残基的低分子量金属结合蛋白，通过半胱氨酸残基的硫氢基和重金属结合形成无毒或低 毒的络合物，从而消除重金属的毒害作用。p c 是m t 的衍生物，它同样具有络合重金属 的功能。 1 3 3 螯合作用 植物对重金属离子的螯合作用是指植物体内的重金属离子配体( 蛋白) 对其具有高 度特异性的亲和作用以形成复合体，从而减少自由重金属离子在植物体内的浓度和降低 其毒性。植物金属鳌合剂有4 类( 王剑虹和麻密，2 0 0 0 ) ，它们分别是植物络合素 ( p h y t o c h e l a t i n ，p c s ) ，金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n ，m t s ) ，有机酸和氨基酸。c l e m e n s ( 2 0 0 1 ) 和张玉秀等( 1 9 9 9 ) 详细叙述了这4 种植物螯合剂在金属解毒过程中的作用。1 ) 植物络合素( p c s ) ：是一类由p c 合成酶以谷胱甘肽为底物催化合成的、由长度不同的 肽链构成的、富含c y s 的多肽，能以巯基与重金属发生络合作用而解毒，基本结构为 ( r g l u - c y s ) n g l y ( n = 2 1 1 ) 。目前在植物中分离到的p c s 多是镉离子结合物，很多 证据表明植物络合素在c d 解毒过程中具有重要作用( 全先庆等，2 0 0 6 ) 。络合素与金属 螯合后，可以降低细胞内游离金属离子的浓度，从而起到金属的解毒作用以及保护细胞 内对金重属敏感的酶( 张玉秀等，1 9 9 9 ) 。2 ) 金属硫蛋白( m t s ) ：是一类低分子量、 富含c y s 残基的金属结合蛋白，由于巯基含量高，对重金属的亲和力大，对c u 、z n 、p b 、 a g 、h g 、c d 等多种重金属都有络合作用，因此在解除重金属离子的毒害、维持组织中 金属离子的稳态以及调节金属离子向特定组织的运输等方面起重要作用( 全先庆