（生物物理学专业论文）mg2对p53绑定dna稳定性的分子动力学研究.pdf

南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校同网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 y i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 型蕴出 2 0 1 0 年6 月4 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 m 9 2 + 对p 5 3 绑定d n a 稳定性的分子动力学研究 姓名赵蕴山学号 2 1 2 0 0 7 0 1 2 8答辩日期2 0 1 0 年5 月2 4 日 论文类别博士口学历硕士硕士专业学位口 高校教师口同等学力硕士口 院系所 物理学院专业生物物理学 联系电话 0 2 2 2 3 5 0 8 2 6 0e m a i l d o u l 9 8 4 1 6 3 c o m 通信地址( 邮编) ：南开大学分子生物研究所4 1 9 ( 3 0 0 0 7 1 ) 备注：是否批准为非公开论文 否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校 图书馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：赵蕴出 二： 2 0 1 0 年6 月4 日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 口限制( 2 年)口秘密( 4 1 0 年)口机密( 2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月日 审批表编号批准日期 2 0 年月日 限制2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密1 0 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密2 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) 摘要 摘要 p 5 3 蛋白是多细胞生物体中重要的癌症抑制器，它能够和d n a 绑定并修复 损伤d n a ，研究p 5 3 蛋白结构、功能以及和d n a 绑定能力可以揭示癌症发生 的机理。本文通过对m 9 2 + 和z n 2 + 结合p 5 3 蛋白能力的比较，力图找到m 9 2 + 对 p 5 3 蛋白的结构、功能造成得影响，以及m 9 2 + 结合p 5 3 蛋白对d n a 绑定稳定性 的影响。 本文主要使用了分子动力学模拟的方法，应用等温等压系综分别对p 5 3 蛋白 单链体系、c l 。和p 5 3 蛋白体系、z n 2 十和p 5 3 蛋白体系、m 孑+ 和p 5 3 蛋白体系、 m 孑+ 结合p 5 3 蛋白绑定d n a 五个体系进行了1 0 纳秒的模拟。并对它们结合的 稳定性、结合自由能、p 5 3 蛋白二级结构的改变等进行研究，在对模拟后数据的 分析和比较中发现如下结果： 1 m 9 2 + 结合p 5 3 蛋白的r m s d 曲线分析稳定性较z n 2 + 差，且m 9 2 + 与p 5 3 结合位点与z n 2 + 有差异，m 孑+ 主要与p 5 3 蛋白d b d 区域h i s l 7 8 结合， 并且影响p 5 3 蛋白的d b d 区域残基序列g l u 2 0 4 、t y r 2 0 5 、l e u 2 0 6 、a s p 2 0 7 所形成的1 3 平行完全消失。 2 m 9 2 + 结合p 5 3 蛋白绑定d n a 的稳定性也较差，其r m s d 曲线图波动很 大，模拟前后d n a 分子骨架r m s d 相差3 8a ，d n a 双螺旋结构变化。 结果表明m 9 2 + 结合p 5 3 蛋白导致d b d 区域( d n a b i n d i n gd o m a i n ) 绑定d n a 的稳定性下降，这种不稳定性可能是癌症发生的诱因，可以通实验进一步验证。 关键字：p 5 3 蛋白，m 9 2 + ，分子动力学模拟，d n a a b s t r a c t a b s t r a c t p 5 3 ，a l s ok n o w na sp r o t e i n5 3o rt u m o rp r o t e i n5 3i si m p o r t a n ti nm u l t i c e l l u l a r o r g a n i s m sw h e r ei tr e g u l a t e st h ec e l lc y c l ea n df u n c t i o n sa sa t u m o rs u p p r e s s o rt h a ti s i n v o l v e di np r e v e n t i n gc a n c e r t h em e c h a n i s mo fh o wc a n c e r o c c u r sc a nb ef o u n do u t t h r o u g ht h es t u d yo fi t ss t r u c t u r e ，f u n c t i o n ，a n da b i l i t yo fb e i n gc o m b i n e dw i t hd n a t h ep a p e rd i s c u s s e st h ed i f f e r e n c e sb e t w e e nm 9 2 + a n dz n 2 + c o m b i n e dw i t ht h ep 5 3 d n a - b i n d i n gd o m a i n ( d b d ) t of i g u r eo u th o wm 9 2 + i n f l u e n c e st h es t r u c t u r e ， f u n c t i o n ，a n ds t a b i l i t yo ft h ep 5 3d b d i nt h i sp a p e r , m o l e c u l a rd y n a m i c si su s e di ni s o t h e r m a l - i s o b a r i ce n s e m b l ef o r 10 一n a n o s e c o n dt os i m u l a t et h ef i v es y s t e m s - - d b ds y s t e m ，d b dw i t hc i - s y s t e m ， d b dw i t hz n 2 + s y s t e m ，d b d 埘t hm 醇+ s y s t e m ，a n dd b d - d n ac o m p l e x 晰t h m 9 2 + s y s t e m t h er e s u l t so fm m p b s a ( g b s a ) c a l c u l a t i o n ，r m s da n a l y s i so f s t a b i l i t yo ft h ed b d ，b i n d i n gf r e ee n e r g yo fc o m p l e xa n ds e c o n ds t r u c t u r eo fp 5 3a r e a sf o l l o w e d ： 1 m 薛+ c a nb eb o u n dt op 5 3d b d b u tt h er m s di sn o ta ss t a b l ea sz n 2 + m o s ti m p o r t a n t l y , ab e t as h e e td e c l i n e si np 5 3d b da m i n oa c i ds e q u e n c e g l u 2 0 4 ，t y r 2 0 5 ，l e u 2 0 6 ，a s p 2 0 7 2 t h es t a b i l i t yo ft h ed b d - d n ac o m p l e x 谢t hm 醇+ i sp o o rw i t hm a j o r f l u c t u a t i o ni nr m s dg r a p h t h er m s do ft h ed n ap h o s p h a t eb a c k b o n e b e f o r ea n da f t e rs i m u l a t i o ni s3 8a d o u b l e h e l i c a ls t r u c t u r eo fd n a c h a n g e sa f t e rs i m u l a t i o n i nc o n c l u s i o n ，t h ec o m b i n a t i o no fm 酡+ a n dp 5 3l e a d st ot h e i n c r e a s i n g i n s t a b i l i t yo fd b d t h i si m p l i e st h a tt h ei n s t a b i l i t yo fd n am a yb et h ec a u s eo f c a n c e r s ，w h i c hc a nb ef u r t h e rt e s t e di ne x p e r i m e n t a ls t u d y k e y w o r d s ：p 5 3 ，m g + ，m o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n ，d n a i i 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 目录1 i i 1 j 一 日i j 舌。1 第一章癌症抑制蛋白质p 5 3 蛋白2 第一节癌症抑制蛋白质p 5 3 蛋白的结构3 第二节p 5 3 蛋白激活途径4 第三节p 5 3 蛋白的变异导致癌症的发生6 第四节z n 2 + 在p 5 3 蛋白绑定d n a 中起重要作用7 第五节m 9 2 + 在p 5 3 蛋白绑定d n a 中的研究8 第二章分子动力学模拟方案设计1 0 第一节分子动力学模拟1 0 2 1 1 分子动力学量子力学基础1 0 2 1 2 分子动力学力场1 1 2 1 3 能量优化1 3 2 1 4 自由能计算1 3 第二节模拟方法及方案1 4 2 2 1p 5 3 蛋白结构和d n a 结构获取1 4 2 2 2 分子动力学模拟体系的建立1 5 2 2 3 分子动力学模拟计算1 6 2 2 4 分子模拟r m s d 曲线图分析1 6 目录 2 2 5 m m p b s a ( g b s a ) 分析1 7 第三章模拟结果和分析1 8 第一节a p o d b d 区域模拟体系1 8 3 1 1 a p o d b d 模拟体系的热力学信息图1 8 3 1 2a p o d b d 体系r m s d 图分析2 0 3 1 3 a p o d b d 体系二级结构的分析2 l 第二节c i - d b d 模拟体系2 2 3 2 1c i d b d 模拟体系r m s d 曲线图分析2 2 3 2 2c i - d b d 模拟体系二级结构的分析2 2 第三节z n 2 * - d b d 模拟体系2 3 3 3 1z n 2 + 一d b d 模拟体系r m s d 曲线分析2 3 3 3 2z n 2 + - d b d 模拟体系分子二级结构的分析2 3 3 3 3z n “d b d 模拟体系m m p b s a ( g b s a ) 结合自由能分析。2 4 第四节m 9 2 * _ d b d 模拟体系2 6 3 4 1 m 9 2 * - d b d 模拟体系r m s d 曲线图2 6 3 4 2 m 9 2 * d b d 模拟体系二级结构的分析2 7 3 4 3 m 9 2 * _ d b d 模拟体系m m p b s a ( g b s a ) 结合自由能分析2 7 第五节m 9 2 * _ d b d & d n a 模拟体系2 9 3 5 1m 9 2 * _ d b d & d n a 模拟体系r m s d 瞌线图分析2 9 3 5 2m 9 2 * _ d b d & d n a 模拟体系二级结构分析3 0 3 5 3 m 9 2 * - d b d & d n a 模拟体系m m p b s a ( g b s a ) 结合自由能分析。3 0 3 5 4d n a 稳定性分析3 2 第四章结论和讨论3 4 第一节 4 1 1 4 1 2 4 1 3 m 9 2 + 影响p 5 3 蛋白d b d 区域稳定性及结构变化3 4 模拟体系稳定性比较3 4 m 9 2 + 能较好的和d b d 区域结合3 4 m 9 2 + 影响d b d 区域二二级结构变化3 4 i v 目录 第二节 4 2 1 4 2 2 第三节 第四节 m 9 2 + 结合p s 3 蛋白d b d 区域对d n a 绑定的影响3 5 m 9 2 + 结合d b d 区域绑定d n a 致使d n a 稳定性变差3 5 m 9 2 + 结合d b d 区域绑定d n a 致使d n a 结构变化3 5 小结与结论3 5 不足与改进3 5 参考文献3 7 致谢。4 1 个人简历4 2 v 刖舌 前言 p 5 3 蛋白在多细胞生物中起到了非常重要的作用，它能调节细胞周期并且抑 制癌症。经研究发现，人体细胞中p 5 3 蛋白的缺失会导致癌症的发生，一半以 上的癌症患者的细胞中p 5 3 蛋白发生了变异或者功能丧失【1 1 。所以研究p 5 3 蛋白 的结构、特点和性质，有助于我们了解癌症发生的机理，并可以启发我们找到 如何去治疗癌症的方法。 研究发现p 5 3 蛋白绑定d n a 可以起到促使d n a 稳定的作用。在人体细胞 中，当有d n a 损伤或受到其它刺激时，p 5 3 蛋白可通过多种途径被激活，被激 活p 5 3 蛋白的d b d 区域( d n ab i n d i n gd o m a i n ) 可以绑定损伤d n a 并且使其 修复，或者被激活的p 5 3 蛋白直接调控细胞死亡。通过这样的方式，p 5 3 蛋白保 证了d n a 的稳定性，因此它被称为基因组的“护身符”和“保护者”【2 j 。 许多晶体结构图像中发现z n 2 + 存在于p 5 3 蛋白和d n a 绑定区域中，也有许 多报道证明z n 2 + 对p 5 3 蛋白的d b d 区域绑定d n a 起到重要的作用，z n 2 + 的缺 失会导致p 5 3 蛋白和d n a 绑定稳定性下降。模拟研究p 5 3 蛋白的d b d 区域 c y s l 7 6 残基、c y s 2 3 8 残基、c y s 2 4 2 残基和z n 2 + 结合力最强，z n 2 + 会增强p 5 3 蛋白绑定d n a 的能力。 人体中镁含量非常丰富，是人体必需的矿物质，它参与蛋白质的合成和肌肉 的收缩作用，也是人体内一系列复杂的生物化学反应酶的激活剂。m 矿+ 和z n 2 + 同属2 价阳离子，m d + 和p 5 3 蛋白作用相关的研究却很少，且m 9 2 + 是否会诱发 癌症还没有定论：有研究称食用镁可降低癌症的发生率【3 】；也有研究称人体摄入 过多的镁会导致癌症的发生 4 1 。因此本文为寻求m 9 2 + 是否会成为诱发癌症的一 种成因，利用分子动力学模拟研究m 9 2 + 结合p 5 3 蛋白与d n a 之间的相互作用， 应用a m b e r 9 软件对其结合过程做长时间模拟，以及使用软件m m p b s a 对其 结合自由能进行分析，使用生物视图软件v m d 、c h i m e r a 等对其二级结构进行 研究，从理论上分析m 9 2 + 对p 5 3 绑定d n a 稳定性的影响，为进一步实验提供 理论依据。 第一章癌症抑制蛋白质p 5 3 蛋白 第一章癌症抑制蛋白质p 5 3 蛋白 p 5 3 蛋白( p r o t e i n5 3 ，t u m o rp r o t e i n5 3 ) 是由l i o n e lc r a w f o r d ，d a v i dp l a n e 等人于1 9 7 9 年发现，当时它被认为是一种导致癌症发生的s v 4 0 病毒的靶点。 老鼠的t p 5 3 蛋白基因于1 9 8 2 年第一次被俄罗斯科学家克型5 1 ，人类t p 5 3 蛋白 基因第一次是1 9 8 4 年被克隆【6 j 。起初人们认为它是一种致癌基因，直到1 9 8 9 年 它的抑制癌症的作用才被约翰霍普金斯学院确定下来。1 9 9 4 年s c i e n c e 就有报道 p 5 3 蛋白单链和d n a 绑定的结构图m ，基本确定p 5 3 蛋白和d n a 绑定区域以及 p 5 3 蛋白一些变异位点，如图1 1 所示左侧浅色为p 5 3 蛋白核心d b d 区域，右 侧深色双螺旋为d n a ，中间为一个z n 2 + 和d b d 区域变异点，大多数发现导致 癌症的p 5 3 蛋白变异点都在d b d 区域e 。 图1 1p 5 3 蛋白单链和d n a 绑定的结构图 p 5 3 蛋白的名称来自s d s p a g e 电泳里显示的分子量( 五万三千道尔顿) ， 在人类基因组里由t p 5 3 蛋白基因编码。它还有许多名字：肿瘤细胞抗原p 5 3 蛋 白、抗原n y - c o 1 3 、磷蛋白质p 5 3 蛋白、癌症抑制器p 5 3 蛋白。在许多生物体 内( 包括人、啮齿类、青蛙、鱼类) 都含有p 5 3 蛋白，它起到调节细胞周期并 且抑制癌症的作用。只得到t p 5 3 蛋白一个功能片段遗传的人大部分会在幼年时 就发生癌症。细胞中t p 5 3 蛋白会被一些变异剂损伤，比如化学药剂、辐射、病 毒，这很有可能导致细胞分裂失控。超过5 0 的人类癌症细胞中t p 5 3 蛋白发生 了变异或者消失。 2 第一章癌症抑制蛋白质p 5 3 蛋白 第一节癌症抑制蛋白质p 5 3 蛋白的结构 根据氨基酸残基计算的结果，p 5 3 蛋白的实际分子量应该是四万三千七百道 尔顿，与它在s d s p a g e 电泳里显示的分子量有所区别( 五万三千道尔顿) 1 7 - 9 1 。 这一差别是因为p 5 3 蛋白含有的大量脯氨酸残基，脯氨酸残基减缓了它在 s d s p a g e 电泳的迁移速度【1 0 l 。p 5 3 蛋白是由人1 7 号染色体短臂上t p 5 3 蛋白基 因编码( 1 7 p 1 3 1 ) 7 - 9 l ，而许多已得到完整基因数据哺乳动物的t p 5 3 蛋白的同 源体也已经被识别。 p 5 3 蛋白有3 9 3 个氨基酸组成，并且分为7 个区域【1 1 l ： 1 n 端转录激活区域( t a d ) ，也被成为激活区域1 ( a d l ) ，起止于氨基酸残 基l 到4 2 ，此区域是用来激活转录因子的； 2 激活区域2 ( a d 2 ) ，起止于氨基酸残基4 3 到6 3 ，此区域在细胞凋亡活动起 重要作用； 3 富含脯氨酸区域，此区域对细胞凋亡起重要作用，起止于6 4 到9 2 ； 4 d n a 绑定核心区域( d b d ) ，起止于氨基酸残基1 0 0 到3 0 0 ，包含一个z n 2 + 和许多精氨酸； 5 原子定位信号区域，起止于氨基酸残基3 1 6 到3 2 5 ，这个片段有助于金属离 子的定位； 6 同源寡聚区域( h o m o o l i g o m e d s a t i o nd o m a i n , o d ) ，起止于氨基酸残基3 0 7 到3 5 5 ，是引起p 5 3 蛋白在生命体内四聚化活动自发发生的区域； 7 c 端是与d n a 绑定向下调节有关的区域，起止于氨基酸残基3 5 6 到3 9 3 。 p 5 3 蛋白的d b d 区域为核心区域，它是绑定d n a 的关键区域，d b d 区域 的变异会引起癌症的发生。 人体中两种最常见d n a 多态性发生7 2 号密码子上，一般是由一个脯氨酸替 代一个精氨酸，导致这个结果主要是由于d n a 编码7 2 号密码子胞嘧啶替代鸟 嘌呤的s n p ( s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ) 变异所产生1 1 2 。1 3 】。 3 第一章癌症抑制蛋白质p 5 3 蛋白 第二节p 5 3 蛋白激活途径 当人类细胞受到u v 光照射、电离辐射、毒性化合物及其它环境损伤就有可 能发生d n a 断裂。如果d n a 损伤得不到修复，d n a 断裂片段就会在细胞分裂 时发生失控并最终导致癌症的发生i a * 1 8 1 。 正常情况下，p 5 3 蛋白的蛋白质水平( 含量) 是很少的，这主要是受到了 m d m 2 的持续降解。细胞中m d r n 2 可以绑定p 5 3 蛋白以形成一种复合物，它抑制 p 5 3 蛋白的行为并阻滞p 5 3 蛋白从细胞核运送至细胞浆质的这个过程。m d m 2 也 起到一种泛素蛋白酶的作用，并以共价键形式将泛素连接到p 5 3 蛋白，通过这 种方式标记并引导蛋白酶降解p 5 3 蛋白。然而p 5 3 蛋白的泛素化是可逆的，泛 素特异性酶u s p 7 可将p 5 3 蛋白从泛素m d m 2 和p 5 3 蛋白形成的复合物上剥离， 使其不被蛋白酶降解。这个过程保证了p 5 3 蛋白在细胞中能够稳定的对癌症细 胞出现进行反应。 如果细胞d n a 受到损伤，p 3 8 、a t m 、a t r 等会释放细胞信号，并将m d m 2 磷酸化，磷酸化的m d m 2 将会与p 5 3 蛋白分离，同时这些细胞信号也会抑制m d m 2 对p 5 3 蛋白的降解过程，使细胞中的p 5 3 蛋白水平上升。这时p 5 3 蛋白与细胞 的基因组中的调节位点结合以活化其它终止细胞分裂的蛋白的制造，如果这种 d n a 损伤还能修复，p 5 3 蛋白可以将细胞周期控制在g 1 s 调节点从而使细胞停 止生长，并激活d n a 修复蛋白修复d n a ，如果停滞的时间够长就可以容许d n a 修复蛋白有修复d n a ，并且重新启动细胞周期。如果这种d n a 损伤很严重以 至于无法修复时，肿瘤抑制蛋白p 5 3 蛋白将会起始细胞死亡程序或凋亡过程， 将这个细胞剔除并使受损的d n a 永久地从生物体内消除掉【l 引。 如图1 2 所示，在正常细胞中p 5 3 蛋白被其抑制调节蛋白m d m 2 所抑制。当 d n a 损伤或受到其它压力时，多种途径将导师p 5 3 蛋白m d m 2 复合物降解。一 旦p 5 3 蛋白被激活，它就可以引导细胞周期停滞，并容许细胞自救和修复；或 者引导细胞凋亡，以去除损伤细胞。 4 第一章癌症抑制蛋白质p 5 3 蛋白 醐a 由毗蚋 c 硼q 吲尊a b n o r m a l l t 舢 h 焖i | c e l l q 哼轴翻删 嘲 埔纠哪 i c 辑聃n 轴娃 三回 _ 八 p 呷鼬 o t 破ha 耐啊射n 捌 o 辨研 锄毒霪dc e l l s c 戤il 嗣 ra 潮g i 嘲e t i cs t 稿l u t 丫 图1 2p 5 3 蛋白抑制肿瘤途径n 们 激活的p 5 3 蛋白绑定d n a ，并且能激活一些基因的表达( 包括w a f f l c ：i p l 编码的p 2 1 ) 。p 2 1 绑定于一种细胞周期g 1 s 转换期重要的分子g 1 s c d k ( c d k 2 ) 和s c d k 复合体【1 9 1 。 p 5 3 蛋白还可以与许多化学物质相互作用，比如：h i p k l 、复制蛋白a 1 、 e r c c 6 、t s g l o l 、蛋白激酶r 、c f l a r 、x p b 、c r e b 绑定蛋白、c r e b l 、有 丝分裂原激活蛋白激酶、抗增殖蛋白、r p l l l 、d n a p k 催化亚基，a t f 3 、h i p 勉、 h i f l a 、m e d l 、z i f 2 6 8 、g p s 2 、e f e m p 2 、原髓细胞白血病蛋白、p l k 3 、t p 5 3 蛋白i n p l 、a u r o r a a 激酶、b r e 、p t t g l 、c h e k l 、c c n g l 、细胞周期蛋白h 、 t o p1 、p i a s l 、c d c l 4 b 、b r c a 2 、b r c a l 、r c h y l 、c d c l 4 a 、e 4 f 1 、p a r p l 、 z n f l 4 8 、h m g b l 、p r k r a 、t p 5 3 蛋白b p l 、c d k l 等等等等【2 0 3 4 1 。 p 5 3 蛋白可以通过多个途径激活，但大多都是通过a t m 、a t r 、c h k l 、c h k 2 等作用于m d m 2 p 5 3 蛋白复合物，使得m d n l 2 磷酸化并释放p 5 3 蛋白，以增加 p 5 3 蛋白在细胞中的浓度。p 5 3 蛋白再被一些激酶磷酸化激活，以修复受损d n a 或调控细胞凋亡。 5 第一章癌症抑制蛋白质p 5 3 蛋白 第三节p 5 3 蛋白的变异导致癌症的发生 癌症细胞中失活的p 5 3 蛋白变异位点一般都发生在d b d 区域，大多数这些 变异都损坏p 5 3 蛋白绑定目标d n a 序列的能力，因此影响了这些基因正常的转 录激活作用。这些变异属于隐性的功能丧失变异。j m c h e n 和r r o s a l 等研究 表明p 5 3 蛋白d b d 区域h i s1 7 5 ，a s p2 4 5 ，t r p2 4 8 ，m e t2 4 9 ，s e r2 7 8 ，a n dl y s2 8 6 如果发生变异将会导致p 5 3 蛋白结构变化并诱发癌症【2 4 】。b r a n d t r a u f e t 等人研究 发现h i s l 7 9 变异l e u 、a r 9 2 4 9 变异t r p 、i l e 2 5 5 变异p h e 后p 5 3 蛋白的结构将 会发生严重改变1 3 5 。 p 5 3 蛋白o d 区域变异的蛋白质分子被称为野生型p 5 3 蛋白( w i l d t y p ep 5 3 蛋白，w i p l ) 3 6 1 ，它是人体中最早被发现可引起癌症的分子，它影响p 5 3 蛋白 正常的激活转录作用。如图1 3 所示，当d n a 分子受到损伤，w i p l 会阻止p 5 3 蛋白激酶p 3 8 、c h k l ，2 ，使m d m 2 与p 5 3 蛋白无法分离，如果p 5 3 蛋白已经被激 活的p 5 3 蛋白，w i p l 会使p 5 3 蛋白去磷酸化，并抑制a r f 使m d m 2 更容易降 解p 5 3 蛋白。w i p 也可能抑制p 5 3 蛋白转录和细胞周期停滞。因此o d 区域的 变异属于显性的功能丧失变异。野生型p 5 3 蛋白是一种不稳定的蛋白，以一种 协同方式构成折叠和无结构区域。 豳圜鬈阑 图1 3 野生型p 5 3 蛋白( w i p l ) 诱发癌症过程图 6 第一 章癌症抑制蛋白质p 5 3 蛋白 第四节z n 2 + 在p 5 3 蛋白绑定i ) n a 中起重要作用 在大多数p 5 3 和d n a 绑定结合的晶体结构图像都发现了存在z n 2 + ，许多报 道证明z n 2 + 对p 5 3 蛋白的d b d 区域绑定d n a 起到重要的作用，z n 2 + 的缺失会 导致p 5 3 蛋白和d n a 绑定稳定性下降，继而导致p 5 3 蛋白无法完全发挥其修复 d n a 损伤的功能【3 h 。 如图1 4 所示，h 1 、h 2 为两个q 螺旋区域，s 1 s 1 0 为b 平行区域，l 1 、l 2 、 l 3 为环状结构区域，p 5 3 蛋白的晶体结构中呈现是一个大的b 平行支架，z n 2 + 被c y s l 7 6 、c y s 2 3 8 、c y s 2 4 2 限制在h l 、l 3 ，h i s l 7 9 连接l 2 和l 3 环，移除z n 2 + 降低p 5 3 蛋白绑定d n a 的特异性。没有z n 2 + 的d b d 区域( z n 2 + - f r e ed b d ，也 叫a p o d b d ) 结构会发生变化，并易于聚集。 a b 3 l132 s 2 s 3s 4i 2h l 2s ss 6s7s 8 l 3s 9s 1 0h 2 叫卜一1 卜卜卜卜一卜卜酬一卜一 5 1 1 2 碉1 3 5 ； 犯i | 1 8 1 ，赫南72 1 9 2 l 2 5 81 枞2 盼 1 1 0 1 2 41 就1 , 1 11 驺1 7 7 1 镐2 2 1 4 2 3 0 筠擞2 7 1 1 图1 4 ：a 图为含有z n 2 + 的p 5 3 蛋白与d n a 绑定的结构图 b 图为氨基酸序列对应的区段名称 b u t l e r 和l o h 通过n m r 的研究发现，a p o d b d 的l 2 、l 3 发生的结构性变异 很大，与d n a 较小沟连接的l 3 在d n a 特异性绑定上起到了至关重要的作用4 列。 j i a n x i n d u a n 和l e n n a r tn i l s s o n 在研究中发现当z n 2 + 存在的时候，p 5 3 蛋白连接 7 第一章癌症抑制蛋白质p 5 3 蛋白 在d n a 磷酸化的骨架上，并使l 3 环上a r 9 2 4 8 特异性插入d n a 较小沟，插入 较小沟的a r 9 2 4 8 引起较小沟变窄，这与a p o d b d 与d n a 绑定时有所不同。在 结构上，z n 2 + 协同p 5 3 蛋白上的原子使得特异性绑定最优化，而z n 2 + 对p 5 3 蛋 白主要的影响在l 2 环上。研究表明l 3 环对p 5 3 蛋白和d n a 绑定起到至关重要 的作用，而z n 2 + 对p 5 3 蛋白的影响主要在l 2 环上【4 3 1 。 表1 1 用单字母氨基酸显示p 5 3 蛋白d b d 区域的晶体结构氨基酸序列，起止 于9 4 - - 2 8 9 号氨基酸，为了方便识别，使用了下划线表示形成1 3 平行结构的序列， 以波浪线表示形成q 螺旋结构的序列。本文中如不做特殊说明，1 3 平行结构均 用下划线表示，a 螺旋结构均用波浪线表示。 表1 1p 5 3 蛋白d b d 区域晶体结构氨基酸序列 9 4 1 3 3 s s s v p s q k t yq g s y g f 型坦f l h s g t a k s v t 凸签p a l 恻 1 3 4 1 7 3 f c q l a k 砸三盟垡逊攀d s t p p p g t r v r a m a i y k q 墅疆m t e v v 1 7 4 2 1 3r r c 班照蜓r c s d s d g l a p p q hl 里坠堡g n l r v旦瞧旦d r n t f r 2 1 4 2 3 3 h 墨y y y y e p pe v g s d c 幽型m c n s s c mg g m n r r p 避 2 5 4 2 8 9i i t l e d s s g nl l g r n s f e v rk a c p g r d r ri e 基l 烈l 第五节 m 9 2 + 在p 5 3 蛋白绑定d n a 中的研究 m 孑+ 与癌症相关的报道有很多，但现在还没形成定论。有报道称埃及的癌症 发生率只有美国和欧洲的1 0 ，其主要原因就是埃及人每天摄入3 m g 的镁。但 也有报道称过多摄入镁会导致癌症的发生，并影响人体激素水平，以及诱导d n a 变为致癌基因，比如在饮用水中如果含有了过多镁、钙、硝酸盐会引起胃癌【4 j 。 在一些更深入的研究中称，一些特定的无脊椎动物血液淋巴或网状细胞中， m 9 2 + 的缺失会引起癌变，但在固态肿瘤中m 9 2 + 的缺失往往能阻碍癌变。而在另 一些报道中称，镁元素在细胞和亚细胞分配中的调解在癌症研究中非常重要m j ， 并且癌病变和镁元素有密切关系：如果在组织蛋白中镁元素水平正常( 尤其在 h l 和鸟嘌呤n 7 位点) 可以起到预防癌症的作用【4 6 j ；与此同时，如果镁元素超 出正常水平，就会引起核酸变为可引发癌症的左手型z 型d n a ；相反，癌病变 会引起m d + 分布混乱，使得m 孑+ 从红细胞中移动出来，并使得非癌组织细胞的 8 第一 章癌症抑制蛋白质p 5 3 蛋白 m 9 2 + 损耗【4 7 1 。也有报道称，m 9 2 + 的致癌作用也有可能在于影响含硫氨基酸的新 陈代谢、生长以及免疫系统。然而m 9 2 + 可以对一些特定的致癌金属原子起到影 响，竞争性抑制这些原子的致癌作用【4 7 】。 现有研究中对m 9 2 + 和p 5 3 蛋白作用的报道很少，m 9 2 + 是否会影响p 5 3 蛋白 结构从而影响p 5 3 蛋白和d n a 绑定的能力无从知晓。有实验研究证明在通过对 p 5 3 蛋白晶体提纯，并使用荧光及圆二色性法测定p 5 3 蛋白和m 矿+ 的相互作用 时发现：m 9 2 + 影响p 5 3 蛋白晶体发生结构变化，光谱中一个1 3 平行消失1 4 。但 它并不能从结构上研究出p 5 3 蛋白b 平行消失的具体位置，这使得我们非常有 必要对m 孑+ 与p 5 3 蛋白结合以及对d n a 绑定的影响做研究。本文希望通过 a m b e r 9 进行分子动力学模拟方法对m 9 2 + 与p 5 3 蛋白结合及d n a 绑定进行模 拟，通过对z n 2 + 和m 9 2 + 结合p 5 3 模拟的比较，以及对d n a 稳定性的研究，也 许能从理论上揭示m 9 2 + 是否会是诱发癌症的一个因素。 9 第二章分子动力学模拟方案设计 第二章分子动力学模拟方案设计 第一节分子动力学模拟 分子动力学( m o l e c u l a rd y n a m i c s ，m d ) 是模拟粒子相互作用及运动的研究 领域，其应用范围非常广，包括模拟简单水分子相变、蛋白质与蛋白质、蛋白 质与金属原子、受体和配体相互作用等等。根据已知相互作用势函数以及力学 参数，分子动力学可以应用于复杂生物分子的多体相互作用模拟，甚至简单星 系模拟。研究粒子的运动为分析生物现象的功能提供线索，比如蛋白质对接点、 相互动力学及热力学特性。 2 1 1分子动力学量子力学基础 按照量子力学理论，一个分子体系的动力学特征可以用时间依赖的薛定谔 方程表示： 台则 沪一f 丢詈( 啪) ( 2 1 ) 其中是哈密顿算子，它由每个粒子的动能项和粒子间的势能项组成；是 体系的波函数，其参数r 代表原子核坐标，r 表示电子坐标，t 为时间；壳是普 朗克常数。利用计算机数值求解( 2 1 ) 式来模拟分子体系的动力学行为称为量 子分子动力学。在实际的计算中，为减少计算量，通常把大分子体系看作是质 点在经验的有效势场中的运动，如此就可以采用经典的牛顿力学来描述简化的 体系。一般的做法是采用经典牛顿力学简化公式( 2 1 ) 进行计算，常用的算法 有：蒙特卡罗方法( m o n t ec a r l o ，m c ) ，能量极小化( e n e r g ym i n i m i z a t i o n ，e m ) ， 简模法( n o r m a l m o d ea p p r o a c h ，n m ) ，分子动力学( m o l e c u l a rd y n a m i c s ，m d ) 以及 由分子动力学衍生出来的随机动力学( s t o c h a s t i cd y n a m i c s ，s d ) 等 4 7 , 4 8 1 。 分子动力学模拟方法是把分子体系看作在势能面中质点的运动。由于每个 分子体系的势能面是高度复杂的，难于精确描述，为了使用，往往选用某些于 原子坐标相关的函数对势能面进行拟和，得到势能面的近似解析表示。这种势 能面的表示方法称为力场，而这组于坐标相关的函数称为位能函数。如果位能 1 0 第二章分子动力学模拟方案设计 函数确定，质点的整个运动方程就可以求解了。 2 1 2 分子动力学力场 位能函数也称为力场，近十年来已经发展了多种力场，它们的表示的基本形 式相似，只是在能量函数各项的选取、参数量化、以及分子间量子力学的处理 有些区别，其中最著名的且被广泛使用的有：a m b e r 、c h a r m m 、g r o m o s 和c v f f 等力场【4 。 在模拟计算过程中，对于积分时间步长t 的选取非常重要，主要是为了限 制是体系的高频运动。选取较大的时间步长虽然可以加快计算速度，但同时会 引起积分过程失稳和积分值的不准确；t 过小又会加重计算负担。一般的做法 是：把一个振动周期分成若干个时间步长来完成，如c h 键伸缩的周期约为 1 0 1 4 s ，若分为1 0 步来计算，则积分的时间步长应为1 0 1 5 s ，即飞秒( f s ) 数量 级；或者冻结不感兴趣的分子内部的高频运动( 如键的伸缩、键角的张合等) ， 这样在进行分子动力学模拟时就可以选择较大的时间步长【4 引。 为了使分子体系构象空间的时间遍历能够代表其完整的空间遍历，需要保证 足够的计算时间，但是基于大分子体系模拟时的巨大计算量，必须在精确性和 计算量之间进行权衡，因此一般动力学过程时间的数量级在纳秒( n s ) 级。 为了简化对于能量的计算，分子动力学模拟方法把分子体系看作是质点在 势能面中的运动。由于分子体系势能面的高度复杂性，想要精确描述是难以做 到的，实际的模拟