（分析化学专业论文）基于碳纳米材料的非标记荧光核酸探针设计.pdf

产 d e s i g no fl a b e l f r e ef l u o r e s c e n tn u c l e i ca c i d sp r o b e su s i n g d n a c a r b o nn a n o m a t e r i a l sa s s e m b l i e s b y o u y a n g x i a n g y u a n b s ( h u n a nu n i v e r s i t y ) 2 0 0 9 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e a n a l y t i c a lc h e m i s t r y i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o ry a n gr o n g h u a j u n e ，2 0 1 1 j ， t 1 氨 湖南大学 学位论文原创性l 声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 欧严目湘袖 日期：劢f 1 年6 月z 同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 融 日潲灿 夕撕 日期：2 0 11 年6 月2 日 同期： 2 0 11 年6 月2 日 基于碳纳米材料的非标记荧光核酸探针设计 摘要 荧光探针主要包括分子识别单元和信号报告单元两个部分。当识别单元与目 标分子发生特异性分子识别时，信号报告单元将识别过程转化为可测量的荧光信 号，从而实现对目标分子的定性定量检测。核酸探针是指能与特定目标物质相互 作用，并含示踪物的功能核酸片段( d n a 或r n a ) 。通过设计和筛选，核酸分子可 以成为不同目标分子( 无机离子、有机小分子、生物小分子、核酸及蛋白质等) 的识别单元。对于常规的荧光探针，信号报告单元需要共价标记到分子识别单元 上，操作复杂、价格昂贵且会影响分子识别单元的识别功能。由于碳纳米材料特 殊的力学、电学、光学和超导性能及量子尺寸效应，它与核酸分子的结合可以提 高分子的识别效果并产生信号放大作用，所以它经常被应用于化学生物传感器设 计。 本论文以非标记，高灵敏度，高选择性，可应用于复杂生物体系的化学生物 荧光传感器设计为目标，将核酸分子和碳纳米材料( 包括碳纳米管、碳纳米颗粒) 有机结合，设计了核酸生物传感平台，实现了对蛋白质、核酸、生物酶活性的高 灵敏度高选择性荧光检测。主要研究内容包括如下： 1 基于单壁碳纳米管( s w n t s ) 核酸适体自组装时间分辨蛋白质分析。利 用s w n t s 作为猝灭剂，稀土配合物可以吸附在s w n t s 表面造成荧光猝灭。由于 核酸适体可以分散s w n t s ，但当它与相应蛋白质分子作用之后，分散能力减弱， 一定转速离心之后，碳纳米管沉淀在试管底部，取上层清液加入稀土配合物荧光 恢复。相比于传统的荧光检测方法，这个方法不需要标记、灵敏度提高而且可以 实现时间分辨在复杂体系中的检测。 2 基于碳纳米颗粒( c n p s ) 连接酶反应免标记荧光检测单碱基突变。此方 法结合了c n p s 的荧光猝灭作用，核酸连接反应和荧光核酸染料对单双链d n a 的 区分能力，实现了非标记、高分辨的单碱基突变荧光检测。 3 基于c n p s d n a 自组装非标记实时荧光甲基化检测。利用荧光嵌入染料 s y b r g r e e ni ( s g ) 可以嵌入双链d n a 中并且荧光显著增强和碳纳米颗粒可以降 低s o 的背景荧光实现对甲基化酶及其活性的非标记实时荧光检测。此方法可以 有望实现方便快捷高通量抗癌药物的筛选。 关键词：荧光传感；核酸；碳纳米管；碳纳米颗粒；非标记 ， 产 a b s t r a c t f l u o r e s c e n c ep r o b ei sm a i n l yc o n s i s t e do f t w of u n c t i o n a lp 盯t s ，t h er e c o g i l l t l o n m o i e t ya n ds i g n a lm o i e t y w h e nt h er e c o g n i t i o nm o i e t ys e l e c t i v e l y b i n d sw i t ht h e t a r g e tm o l e c u l e ，s i g n a lm o i e t yi sr e s p o n s i b l e f o ro u t p u t t i n gt h en u o r e s g e n c e s l g n a l s w i t hp r e d e s i g n e da n ds e l e c t e ds t r u c t u r e s ，f u n c t i o n a l n u c l e i ca c i d sc a ns e l e c t l v e l y b i n da n dr e c o g n i z ed i f f e r e n tk i n d so f a n a l y t e s ，i n c l u d i n gc a t i o n s ，s m a l lb l o m o l e c u l e s ， p r o t e i n s ，d n aa n de v e nc a n c e rc e l l s f o rm o s tn u c l e i c a c i d sp r o b e s ，s l g n a lm o i e t y 1 i n k e dw i t hr e c o g n i t i o nm o i e t yt h r o u g hc o v a l e n ti n t e r a c t i o n ，w h i c hm a k e s i tl a b o r l o u s t i m e c o n s u m i n ga n d c os t l y e v e nm o r em o d i f i c a t i o no fn u c l e i c a c i dm a ya l t e rl t s r e c og n i t i o na b i l i t y 0 nt h eo t h e rh a n d ，d u et o t h e i ru n i q u eo p t i c a l a n de l e c t r o n l c p r o p e r t i e s ，c a r b o nn a n o m a t e r i a l s ， s u c ha s c a r b o nn a n o t u b e sa n dg r a p h e n e s ， w h e n c o m b i n i n gw i t hn u c l e i ca c i d sc a n t h u se n h a n c et h em o l e c u l a rr e c o g n i t i o ni n t e r a c t l o n s a n da m p l i f yt h ed e t e c t i o ns i g n a l s t h e y h a v eb e e nw e l l - d e v e l o p e di nn 吼0 t e c h n o l o g y ， b i o s e n s i n ga n dd r u gd e l i v e r y i nt h i st h e s i s ，w i t ht h ep u r p o s eo fd e s i g n i n gl a b e l - f r e e n u c l e i ca c i df l u o r e s c e n t p r o b e sw i t h1 0 w e rb a c k g r o u n ds i g n a l ，h i g h e r s e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t y ，a n db e i n g c a p a b l eo fa p p l y i n g i nc o m p l e xe n v i r o m e n t s ，d n a i sc o m b i n e dw i t hv a 删sc a r b o n n a n o m a t e r i a l s ，i n c l u d i n gs i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( s w n t s ) a n d c a r b o n n a n o p a r t i c l e s ( c n p s ) ，t of a b r i c a t eh i g hp e r f o r m a n c e c h e m b i o s e n s i n gp l a t t o 锄s 1 n e c o n t e n t so ft h i st h e s i si n c l u d ea sf o l l o w i n g ： 。3 + 1 d e s i g no ft i m e r e s o l v e dl u m i n e s c e n c es e n s i n gp l a t f o r m o fp r o t e l n s u s l n g e u ，。 c o m 口l e xa n da p t a m e r - w r a p p e ds w n t s u s i n gs w n t s a su n i v e r s a lq u e n c n e r ，乜u c o m p l e xc o u l da b s o r bo nt h es u r f a c eo f sw n t sa n dt h ee u j + f l u o r e s c e n c e 1 sq u e n c h e d d u et ot h el o w e ra f f i n i t yo fa p t a m e r p r o t e i n t os w n t st h a n h a o fs i n g l es t r a n d e d d n aa n ds w n t sa r em o r es t a b l ei ns o l u t i o n s w i t hh i g hc o n c e n t a t i o no fn a ，t h l s p l a t f o r mi su s e dt os e n s el y s o z y m e c o m p a r e d w i t ht r a d i t i o n a lm e t h o d s , t h ep r o p o s e d s e n s o rp r e s e n t sl o w e rb a c k g r o u n ds i g n a li nc o m p l i c a t e d b i o l 0 9 1 c a ls a m p i e s 2 f l u o r e s c e n ts i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) a n a l y s l sb a s e d o n c a r b o nn a n o p a r t i c l e sa n dd n a l i g a s e an e w m e t h o df o rs n p sa n a l y s i sw a sd e v e l o p e d b a s e do nt h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n ge f f e c to f c a r b o nn a n o p a r t i c l e sa n dn u c l e i ca c l d s l i g a t i o nr e a c t i o n i nt h e l i n k e db yt h ep e r f e c t l y p r e s e n c e 。fd n a l i g a s e ，t h et w oh a l fp r i m e rd n a p r 。b e sa r e c o m p l e m e n t a r yd n a t a r g e tt of o r mad u p l e x ，b u tt h ed u p l e x c o u l dn o tf o r m e db yt h es i n g l e _ b a s em i s m a t c h e dd n a t h e f l u 。r e s c e n c eo fs y b r i l i l 基于碳纳米材料的非标记荧光核酸探针设计 g r e e ni ( s g ) 一s i n g l e s t r a n d e dd n a ( s s d n a ) i se f f i c i e n t l yq u e n c h e dw h e nt h e ya r e m i x e dw i t hc n p su n l e s st h e yh y b r i d i z ew i t ht h e i rp e r f e c t l ym a t c h e dd n a t a r g e t 3 f l u o r e s c e n ta s s a yo fd n aa d e n i n em e t h y l a t i o nm e t h y l t r a n s f e r a s e ( d a mm t a s e ) a c t i v i t y s gs h o w sd i f f e r e n tb i n d i n ga b i l i t i e st od o u b l e - s t r a n d e dd n a ( d s d n a ) o v e r s s d n a b yi n t e r c a l a t i n gw i t h i nt h ei n t e r n a l l ys t a c k e db a s e so fd s d n a ，w h i c hr e s u l ti n a ni n c r e a s eo ft h e i rf l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d s d a mm t a s ec o u l d m e t h y l a t et h e n 6 a d e n i n ei nt h es y m m e t r i ct e t r a n u c l e o t i d e5 - g a i - c 3 。i th a sa l s ob e e nf o u n d t h a td p nie n d o n u e l e a s ec a no n l yc u tt h es e q u e n c eo f5 g a m t - c 。3 w h e n t h e i n t e r n a la d e n i n ei sm e t h y l a t e d t h u s ，i nt h e p r e s e n c eo fd a mm t a s e ，t h ed s d n a c o n t a i n i n gt h es e q u e n c e so f5 gat - c - 3 7 c a nb em e t h y l a t e da n dt h e nb ec u ti n t o f o u rp i e c e so fs s d n a ，e m i t t i n gw e a kf l u o r e s c e n c e w h i l ei nt h ea b s e n c eo fd a m m t a s e ，o rt h ee n z y m ei si n a c t i v e ，t h ed s d n ai sr e m a i n e di nt h es o l u t i o n ，h a v i n g s t r o n gi n t e n s i t yo ff l u o r e s c e n c e c o u p l i n gs gw i t hc n p sn o to n l ys i g n i f i c a n t l y r e d u c e st h eb a c k g r o u n ds i g n a lw h e ns gb i n d st o s s d n a ，b u ta l s oi m p r o v e st h e s p e c i f i c i t y k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n c ep r o b e ；n u c l e i ca c i d ，c a r b o nn a n o t u b e s ；c a r b o n n a n o p a r t i c l e s ；l a b e l - f r e e i v 硕士学位论文 目录 学位论文原创性声明和版权使用授权书i 摘要。i i a b s t r a c t i i i 目录v 本文所用英文缩略词表v i i 第1 章绪论l 1 1 荧光核酸探针l 1 2 非标记核酸探针设计方法2 1 2 1 非标记紫外可见吸收探针设计2 1 2 2 基于核酸嵌入染料的非标记荧光探针设计5 1 2 3 其他非标记光学探针设计1 1 1 3 碳纳米材料在核酸传感中的应用1 3 1 3 1 碳纳米管在核酸传感中的应用1 3 1 3 2 石墨烯在核酸传感中的应用1 5 1 3 3 碳纳米颗粒在核酸传感中的应用1 5 1 4 本论文选题依据及研究思路1 6 第2 章基于碳纳米管核酸适体自组装时间分辨检测蛋白质18 2 1 引言1 8 2 2 实验部分1 9 2 2 1 主要试剂和仪器1 9 2 2 2 核酸适体s w n t s 复合物制备2 0 2 2 3x 射线光电子能谱实验2 0 2 2 4 缓冲溶液中l y s 检测2 0 2 2 5 细胞介质中l y s 检测2 0 2 2 6 实际样品检测2 0 2 3 结果与讨论2 0 2 - 3 1 设计机理2 0 2 3 2e u 3 + 络合物的形成和荧光猝灭2 3 2 3 3 缓冲溶液中l y s 检测2 5 2 3 4 细胞介质中l y s 检测2 8 2 3 5 尿样中l y s 检测2 9 v 基于碳纳米材料的非标记荧光核酸探针设计 2 4 小结3 0 第3 章基于碳纳米颗粒连接酶反应免标记荧光检测单碱基突变3 1 3 1 引言3l 3 2 实验部分3 2 3 2 1 试剂和仪器3 2 3 2 2s n p s 检测。3 3 3 2 3 熔链温度分析3 3 3 2 4 电泳分析3 3 3 3 结果与讨论3 4 3 3 1 机理设计3 4 3 3 2 碳纳米颗粒荧光猝灭和d n a 杂交分析3 5 3 2 3 单碱基突变检测3 7 3 2 4 单碱基突变检测的灵敏度和区分能力3 9 3 4d 、结4 0 第4 章基于碳纳米颗粒d n a 自组装非标记实时荧光甲基化检测4 1 4 1 引言4 1 4 2 实验部分4 2 4 2 1 主要试剂和仪器4 2 4 2 2 甲基化酶活性分析4 2 4 2 3 一些药物对甲基化酶活性影响4 2 4 3 结果与讨论4 3 4 3 1 碳纳米颗粒表征4 3 4 3 2 设计机理4 3 4 3 3 碳纳米颗粒降低背景信号4 4 4 3 4 甲基化酶活性分析4 5 4 3 5 甲基化酶抑制分析4 7 4 4 小结4 8 总结与展望4 9 参考文献51 附录攻读学位期间所完成的学术论文目录6 2 致谢6 3 v i 硕士学位论文 本文所用英文缩略词表 v l i 硕士学位论文 1 1 荧光核酸探针 第1 章绪论 分子探针，又叫传感器，一般由两大部分组成：对被分析物质进行选择性分子识别 部分，称为分子识别单元；而将分子识别事件转换为不同的检测信号的部分，称为信号 转换单元【1 】。对于某些传感器，分子识别单元与信号转换单元间，还需要连接基团。在 传感器对目标分子进行响应时，首先，分子识别单元与目标分子发生特异性的相互作用， 从而改变传感器的组成结构，结构上的改变使得信号转换单元发生物理信号的改变，从 而实现化学信号到物理信号的转换。 譬鲁 s i g n a lt r a n s d u c t i o n 图1 1 传感器的构成及工作原理示意 根据分子识别单元的不同，传感器可以分为免疫传感器和核酸探针【2 ，3 】。传统的免疫 传感器是基于抗原抗体强相互作用而设计的，它以抗体为识别元素来捕获抗原分子， 此种方法具有高度的选择性。然而，抗体的制备合成和纯化过程非常复杂，成本较高， 而且不同批次间存在较大的质量差异，此外，作为蛋白质，其使用和储藏方面的严格要 求，使其在应用上受到了一定限制。核酸探针是以脱氧核糖核酸或者核糖核酸为识别元 素从而检测核酸，蛋白质以及小分子。相对于抗体，核酸作为受体分子具有更好的通用 性和适用性。首先，核酸分子可以通过体外筛选大规模化学合成，制备成本较低，不同 批次间合成的核酸受体性能差异小；其次，可以保存较长时间，使用过程中不容易因重 金属离子等影响而失活；再次，理论上，小到金属离子、有机小分子，大到蛋白质、细 胞，都能通过指数富集配体系统进化技术( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no f l i g a n d sb ye x p o n e n f i a l e n r i c h m e n t ，s e l e x ) 筛选到合适的核酸受体；此外，核酸的标记和修饰也相对较为容易， 并已经完成商品化。 根据信号转换单元的不同可以分为电化学传感器、光学传感器、磁传感器和质量传 感器。而光学传感器又可以分为基于吸收光谱的光学传感器和基于荧光光谱的光学传感 器。基于分子荧光信号的改变而设计的传感器，由于荧光是发射光，其本身的背景光干 基于碳纳米材料的非标记荧光核酸探针设计 扰小，可以大幅度提升检测的灵敏度。荧光的产生首先依赖于光的吸收，当分子吸收光 子能量后，电子从低能级跃迁到高能级，此时分子进入激发态，当电子从高能级跃迁回 基态时，释放出光子，这便是荧光。当荧光分子周边存在与其电子能级比较接近的分子 轨道时，电子并不会从高能级直接跃迁回低能级并放出荧光，相反，电子通过光诱导电 子转移过程( p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ，p e t ) ，分子内电荷转移过程( i n t r a m o l e c u l a r c h a r g et r a n s f e r , i c t ) 或荧光共振能量转移过程( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ， f r e t ) 回到基态，从而造成荧光的猝灭。这一现象被广泛应用于荧光传感器的构建， 当传感器中识别单元与目标分子发生选择性作用时，由于共轭平面的扭曲、空间距离的 变化等，使得p e t 、i c t 或f r e t 的能量转移过程( e n e r g yt r a n s f e r ，e t ) 过程被强化或 削弱，从而造成荧光信号的变化。激基缔合物也是一类比较重要的荧光现象。激基缔合 物是两个同种分子或原子的聚集体，在激发态时，聚集体发出的荧光不同于其单体荧光。 多环芳烃( 如萘、葸和芘) 经常会产生这样的荧光现象，传感器中，识别单元与目标分 子作用前后，通常会使得这些荧光物质处于单体或双聚体两种不同的荧光型式，从而产 生荧光信号的差异。此外，还有一些基于化学反应( 通常也叫化学计量测定器) 、聚集 诱导荧光( a g g r e g a t i o ni n d u c e de m i s s i o n ，a l e ) 、激发态分子内质子转移( e x c i t e d s t a t e i n t r a m o l e c u l a rp r o t o nt r a n s f e r ，e s i p t ) 、光诱导质子转移( p h o t oi n d u c e dp r o t o nt r a n s f e r ， p i p t ) 等效应产生的荧光变化设计而成的荧光传感器，其荧光原理略有区别，但在设计 荧光传感器思路上是一致的。荧光传感器的设计和发展极大地丰富了传感器的种类和应 用，由于其背景信号低，检测灵敏度高，因此经常用于一些微量组分的检测。同时，我 们也看到目前荧光传感器的一些不足，主要是对大型仪器的依赖比较严重，由于荧光的 检测需要复杂的分光元件，因此，荧光传感器在小型化和集成化方面，仍面临着很多困 难。 1 2 非标记核酸探针设计方法 为设计同时具有化学识别与光学信号表达功能的探针分子，通常会在分子识别 单元或者目标物上标记一个信号单元来表达信号，不但操作麻烦，价格昂贵，且共价标 记可能会对探针分子的识别功能产生影响。因此，发展非标记核酸探针具有非常重要的 意义。目前非标记检测方法根据信号转换单元的不同可以分为光学传感器( 吸收光谱法， 荧光法，化学发光法，电化学发光法等) ，电化学传感器( 阻抗，伏安法等) ，光电化 学法，电导测量法，表面增强拉曼散射，表面等离子共振，质谱分析，核磁共振光谱法， 场效应晶体管，石英晶体微量天平，单电子晶体管，第二谐波带，干涉测量法，连贯反 斯托克拉曼光谱等。光学传感器依据光学原理进行测量，它有许多优点，如非 接触和非破坏性测量、几乎不受干扰、高速传输以及可遥测、遥控等。 2 硕士学位论文 1 2 1 非标记紫外可见吸收探针设计 免标记的紫外可见光谱法用到最多的是脱氧核酶。g 四链体和血晶素结合具 有氧化还原活性可以催化氧化。2 , 2 氨基- ( 3 乙基苯并噻唑啉磺酸6 ) 铵盐( 2 , 2 a m i n o d i ( 2 e t h y l - b e n z o t h i a z o l i n es u l p h o n i ea c i d - 6 ) a m m o n i u ms a l t ，a b t s ) 或者3 ， 3 ，5 ，5 四甲基联苯二胺( 3 ，3 ，5 ，5 - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e ，t m b ) 产生肉眼 可以观察的颜色变化。w a n g 等【4 1 设计了一条富含胸腺嘧啶的核酸链，当没有汞离 子时，在金属钾离子和血晶素存在下它会形成g 四链体并且具有很强的催化氧化 还原活性，当汞离子存在下，它会形成t h g t 结构，破坏了g 四链体的形成从 而没有了催化活性( 图1 2 ) 。y a o 等【5 1 利用此脱氧核酶检测甲基化酶的活性，他 把脱氧核酶的序列加到甲基化和酶切序列末端，当有甲基化酶存在下，甲基化酶 会甲基化相应位点并被核酸内切酶内切从而释放出脱氧核酶序列，此时加入血晶 素它具有了催化氧化活性，通过检测底物吸收的变化来定量甲基化酶浓度。 防躺 扒岁$ 普匪睁 。一 嘲瓣 一一。鼯妨告m 群氍一 图1 2 基于脱氧核酶比色检测汞离子【4 】 除了基于脱氧核酶g 四链体的催化氧化活性，还有基于金纳米颗粒聚集的非 标记比色方法。l u 等【6 】利用d n a 单链和双链对金纳米颗粒的吸附程度不同，d n a 单链可以缠绕在金纳米颗粒表面增加了表面负电荷，从而提高了它的抗盐浓度， 在金属离子存在下，脱氧核酶会被切成单链从而与d n a 作用，在高盐浓度下不 会产生聚集( 图1 3 ) 。 0 吉薯气- 一，氟一心 k 一2 一上f ：4 t t j d _ ： 器蒂掰 一v 弋r 薪m 嘭v 吖薪 l 掣l 訾 - ” 啐拿 ：罩三，： 图1 3a ，铀离子脱氧核酶序列；b ，基于金纳米颗粒比色检测铀离子【6 】 基于碳纳米材料的非标记荧光核酸探针设计 h u a n g 等【7 】也是利用了金纳米颗粒的聚集和分散来检测金属离子，不过他是 利用巯基碳链与金纳米颗粒的强烈作用而且会使金纳米颗粒聚集这一原理，当加 入另外一种金属汞，它与巯基链作用更强，此金属会和巯基碳链结合从而少量的 巯基链和金纳米颗粒作用，使得金纳米颗粒分散。而b 图是用了一条短的巯基链 它可以使金纳米颗粒分散，当加入一些金属离子，这些金属本身就可以吸附在金 纳米颗粒表面，因为都是带正电荷从而使得金纳米颗粒聚集。此外还有将金纳米 颗粒与聚合酶链锁反应相结合来检测特定序列d n a ( 图1 4 ) 。 恤 - e 翼、t ，* - 一 少幕 羔黧 。咿 j ，4 ! ：l i r 、 o ：妒 = = ” ：和喇怫峰“d 一，了、 1 8 少 、她 、 a o n p ：p p 口+ o r c 一 一_ ：2 m w a 叫“断d 辫赣 辫 一x 繁- j 擎一 i | j ：肇：j ： 图1 4 基于金纳米颗粒比色检测金属离子【7 】 除了上述利用g 四链体血晶素的催化氧化活性和金纳米颗粒的分散与团聚来 比色检测，还有利用碳纳米材料的催化氧化活性进行比色检测。q u 等【8 】利用了单 双链d n a 对碳纳米管的分散能力不同和碳纳米管能够催化氧化t m b 这一事实比 色检测单碱基错配。完全互补的d n a 双链分散碳纳米管能力弱，在高盐浓度下 它会产生聚集，离心后沉淀在试管底部，将沉淀物再分散，加入双氧水和t m b 颜色发生变化。如果有一个碱基错配，它分散碳纳米管的能力强，在高盐浓度下 不会团聚，离心之后仍旧在溶液中，及其少量的碳纳米管在底部，对t m b 的催 化能力弱( 图1 5 ) 。 肆i 未= 一善 娴一詈岫岬臻 娴蜘删晌 l 憎恤p 拉蹦。_ f 荸面警 图1 5 基于碳纳米管催化氧化活性比色检测核酸【8 l d o n g 等【9 1 他们将石墨烯与血晶素结合起来比色检测单碱基错配。碳纳米管有 催化氧化活性，同样的，当石墨烯和血晶素作用之后产生的复合物也具有催化氧 化活性。此文和上面机理相类似，只不过它取的上清物并选择了三种不同的氧化 4 硕士学位论文 底物检测分析( 图1 6 ) 。 a 囊 妻 攀豢 b b 霉唑制攀 t 鋈 图1 6 基于石墨烯，血晶素催化氧化活性比色检测单碱基错配f 9 】 此外还有利用有机小分子与金属离子结合之后颜色会发生变化而检测。罗丹 明b 与铜离子结合溶液会变成红色，0 c 氨基酸与铜离子可以产生更强烈的络合， 当。氨基酸存在下，铜离子会优先与仅氨基酸结合，而就不会与罗丹明b 结合， 罗丹明b 仍然显示无色【1 0 】( 图1 7 ) 。 8 孰 心锄 c a , 。二”e r r 瘳。 争 玲 图1 7 比色检测仅一氨基酸和胰岛裂1 0 1 1 2 2 基于核酸嵌入染料的非标记荧光探针设计 1 核酸嵌入染料 非标记荧光法用的最多的是核酸嵌入染料，包括吖啶橙、溴化乙啶( e t h i d i u m b r o m i d e ，e b ) 、t o t o y o y o 、s y b rg r e e n 荧光染料等。 吖啶橙是应用最早的核酸荧光探针，它们通过嵌入或静电吸引与d n a 分子 结合，使d n a 荧光大大增强，是序列非特异的小分子探针。吖啶的基本结构为 二苯并吡啶，在水溶液中呈弱碱性。1 9 4 0 年，发现当吖啶橙与酸性物质连接或存 在于酸性物质中时，其特征光谱会发生一定的变化，至此一直被用于生物体的染 警0；m邑 基于碳纳米材料的非标记荧光核酸探针设计 色。吖啶橙可与d n a 或r n a 作用，与双链脱氧核糖核酸( d o u b l e s t r a n d e dd n a ， d s d n a ) 结合后的荧光激发发射波长分别为5 0 2 5 3 8n m 。 b c 邺、n 驭n n ，c h 3 h 和 c h 3c h 3 图1 8 嵌入染料吖啶橙( a ) 、溴化乙啶( b ) 、s y b rg r e e ni ( c ) 的结构式 溴化乙啶是应用较广的菲啶类探针，溴化乙啶可结合单链脱氧核糖核酸 ( s i n g l e s t r a n d e dd n a ，s s d n a ) 、双链及多链d n a ，与核酸结合后，荧光增强 2 0 - - 一3 0 倍，激发波长红移3 0 一- - 4 0n m ，发射波长发生蓝移，斯托克斯位移较大。 双嵌入剂乙锭均二聚物( e t h i d i u mh o m o d i m e r ，e t h d ) 的嵌入部分使染料分子与d n a 之间形成十分牢固的亲和力，连接常数约1 0 1 1 ( 溴化乙啶仅为1 0 5 ) ，同时对三链 d n a 有高亲和作用，因而更利于应用到抗体、抗癌药物的基因水平的研究。 吖啶橙、溴化乙啶类染料虽然与核酸结合稳定，但未结合的染料自身的荧光 会造成高的荧光背景，干扰检测，同时溴化乙啶具有很大毒性。t o t o 和y o y o 是由g l a z e r 等开发的一类对d s d n a 具有高度亲和力的不对称菁染料。染料在溶 液中无荧光，降低了检测过程中的荧光背景干扰。与d s d n a 结合后发生强烈的 荧光，荧光增强约1 0 0 0 倍，染料分子与d n a 的碱基对最大比例可达1 4 ，在琼 脂糖凝胶和丙烯酰胺凝胶电泳中稳定。它们分别由单体噻唑橙t o 和嗯唑黄y o 通过一个多亚甲基胺柔性链连接成二聚体。 s y b rg r e e n 荧光染料包括s y b rg r e e ni 和s y b rg r e e ni i 。他们是荧光 素的衍生物，分别适用于d n a 和r n a 的琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺电泳。s y b ri 是对d n a 专一的染料，d n a s y b rg r e e ni 复合物的发射光谱性质与荧光素相似， 最大激发波长在2 5 4n m 附近，可用2 5 4n m 到3 6 0n m 光源激发。s y b rg r e e ni 的 d n a 亲和性极高，结合d n a 后荧光强度大大增加。s y b rg r e e ni d n a 复合物 的荧光量子产率( o 8 ) 比常用的溴化乙啶d n a 复合物( 0 1 5 ) 高很多，所以其 检测灵敏度很高。s y b rg r e e ni i 是已知最灵敏的检测电泳凝胶中r n a 的试剂， 以3 0 0n m 光激发，在琼脂糖胶和聚丙烯酰胺凝胶上均可检出5 0 0p g b a n d 的r n a 。 s y b rg r e e n i i 虽非r n a 专一染料，但它与r n a 结合时的荧光量子产率( 0 5 4 ) 比 d s d n a ( 0 3 6 ) 高得多( 这与其它一般核酸荧光染料相反) ，比溴化乙啶r n a ( 0 0 7 ) 则 高出7 倍之多。值得一提的是，r n a 浓度在2 1 0 0 0n g m l 范围内时，s y b r g r e e ni i r n a 复合物的荧光强度与r n a 浓度呈良好的线性关系，因此s y b r 6 硕士学位论文 g r e e ni i 很适于用来量溶液中的r n a ，其灵敏度较溴化乙啶高近两个数量级，比 分光光度法高近5 0 0 倍。另外，尿素、甲醛的存在不会令s y b rg r e e n i i r n a 复 合物的荧光猝灭，因此可用于观察r n a 在变性梯度胶中的迁移行为，效果很好。 2 非标记光学探针设计 荧光核酸探针经常被直接用来生物化学传感检测。w h i t t e n 等【l l 】利用了一种阳 离子亚苯基乙炔低聚物o p e 2 与单双链d n a 的作用方式不同从而导致荧光强度的 差异来检测特定序列d n a 。t e r a m a e 等【1 2 】利用当目标d n a 链上的腺嘌呤碱基对面 是a p 位点并且探针和目标链杂交成双链，a l l o x a z i n e 可以选择性地结合这个腺嘌呤 碱基同时a l l o x a z i n e 荧光被猝灭这个原理来检测单碱基错配。 嘲节曩嘣鬻喇嘲_ 蝈描庐伯脚n 啊a 嘲 图1 9 非标记荧光检测汞离子【1 3 1 c h a n g 等【1 3 】用t o t o 3 来检测金属离子汞。一条全是胸腺嘧啶碱基的核酸链 在汞离子存在下会形成t h g t 的双链结构，t o t o 会嵌入双链发生很强的荧 光信号