（生物物理学专业论文）钝顶螺旋藻中荧光藻蓝蛋白的分离纯化.pdf

膨夕? z 妒 硕士学位论文 摘要 藻蓝蛋白( p h y c o c y a n i n ，p c ) 是一种普遍存在于蓝藻( b l u e g r e e na l g a e ， 又称c y a n o b a c t e r i a ) 中，含开链四吡咯结构的天然蓝色素。在活细胞中，藻蓝 蛋白既可以作为蛋白存储单位，也可以作为抗氧化剂，使细胞在一定限度内免受 光损伤。动物实验表明，藻蓝蛋白有抗肿瘤作用，能有效预防大肠炎等疾病。藻 蓝蛋白的这些属性，使它广泛应用于食品、化妆品、医药等领域，具有广阔的应 用前景。 本论文采用d e a e s e p h a r o s ef a s tf 1 0 w 结合羟基磷灰石( h y d r o x y l a p a t i t e ， h a ) 柱层析法，分离纯化人工养殖钝顶螺旋藻( 鲫l 如ap 妇t 即“0 中的藻蓝 蛋白，经脱盐、冷冻干燥后得到了具有经济价值的藻蓝蛋白纯品。 紫外可见吸收光谱显示所得样品最大特征吸收波长为6 2 0n l ，蛋白浓度 3 0 时，0 d 6 2 0 o d 2 8 0 5 0 ，0 d 6 2 0 0 d 6 5 0 2 0 。s d s p a g e 结果表明，纯化的藻蓝 蛋白样品由两种亚基( 即q 、8 亚基) 组成，分子量分别为1 6 5 k d a 、1 7 6 k d a ； 结合非变性凝胶电泳检测结果，推测实验条件下藻蓝蛋白样品主要以( a 卧a 型杂 聚体形式存在。 本文所述分离纯化藻蓝蛋白的方法，具有蛋白活力高，成本低，重复性好等 优点，为大规模生产提供可靠依据。本方法已申请专利，专利申请号为： 0 2 】5 0 9 1 9 o 。 关键词：钝顶螺旋藻：藻蓝蛋白；分离；纯化 胁夕i z 鲈 硕士学位论文 a b s t r a c t m y c o c y a n i ni s an a t u r a lb l u ep i g m e n tp r e s e n ti na 1 1 b l u g r e e na l 群l e i nt h e n v i n ga l g a ec e n ，p h y c o c y a l l i l lc a j ls e r v ea sap r o t e i ns t o r a g el l l l i ta n da sa l la 1 1 t i o x i d a n t ， p r o t e c t i n gt l l ec e l l 肋mc e m i nw a v e l e n 鲥1 sl i 曲td 蜘a g e m o r e o v c r ，p h y c o c y a n i n h a sb e e ns h o mt oh a v es i g 面f i c a n ta i l t i t u m o rp r o p e 谢e sa n d i ti ss h o w ht op r e v e n t c 0 1 j 矗sj na na n i m a lm o d e l p b y c o c y 撕n1 1 a sb e 8 nw i d e l yu s e di ns u c ha r e a sa s 勋d s ， c o s m e t i c 姐dm e d i c i n e ，a 1 1 di t s o fn o d o u b t 1 a p h y c o c y a n mh a s a s p i c n d i d p e r s p e c t i v e 工nt l i s 州j c i e ，i s o l a t i o na n d p u r f f i c a t i o no f p h y c o c y a i l i l l 劬mc u i d v a t e d 印驴“胁 p 蛔g 珊时w e r ea c c o m p l i s h e db yd e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w c h r o m t o 鲫h y t o g e 山e rw i t hc h r o m a t o g r a p h yo nh y d r o x y i a p a t i t e a n dt l e na f c e rd e s a l t i f i c a t i o na n d 舶e z e d r y i n g ，ac o 锄翦e r c 越p r o d u c to f p h y c o c y a n 洒w a sg a i n e d ， t h ea b s 。南a n c e 功懿i m 诹lo fp h y c o c y a n bo b i a i n e dw a s6 2 0 n mo b s e r v e db y u v ，si p c c 仃o m e t e la tac o n c e n 昀t i o na b o v e3 0p e 州m t ，。d 6 2 0 内d 2 8 0h i 曲盯 m a n5 oa 1 1 d0 d 6 2 0 ，o d 6 5 0 h i g h e rl h a n 2 0w e r e d e t e c t c d a n 面y s i sb ys d s - p a g e m c o m b i 衄d o n 谢协n o n d 饥a t i l r e df a g es h o w e dt h a tp h y c o c y 觚i nw a sc o m p o s e do f t w ok i n d so f s u b l l l l i t s ( q a n d b ) 、i mm o l e c u l a rw e i g h t1 6 5 k d a 肌d1 7 6 k d a ， r e s p e c t i v e l 弘卸dt l l e ym i g h t f o r 工na ( 口b ) 3h e t e r o p o l y m e rmt h e o p e r a d o n c o n d i t i o 嗌 o u fm e 也o d sd e s 喇b c dh e p r o v e da p p j j c a b l ei na d 呦t a g e so f h j 曲a c t i v i t yo f p r o t e i np r o d u c t ，i o wc o s ta n d9 0 0 dr e p e a t a b i l i 坝n e 鞲s u l t sw e r eo f 缸1 d 锄瓤f a l i m p o n a n c ef o rm ec 伽i n gr e s 髓r c h t 1 1 i sm e t h o di sa p p l y i n gf o r ap a t e n tw i t h 也e n u m b e r0 2 1 5 0 9 1 0 k e y 竹o r d s ：印j ，u l j 册印a 芒p n s j s ， p h y c o c y a n i n ，i s 0 1 a t i o n ，p u r i f i c a t i o n 2 加夕，z 掌 硕士学位论文 第一章文献综述 日【舌 原始光合作用生物出现在距今约3 6 亿年前。蓝藻是细菌和绿色植物之间的 进化桥梁，它包含生命进化所需的全部物质，具有重要的进化意义。 蓝藻很少用来作为人类的食物，而螺旋藻( s p i n l l i l l a ) 则是其中一个特例。 螺旋藻是一种丝状多细胞螺旋形蓝藻，有特殊的螺旋结构，细腿丝状物直径约1 0 微米，长度可达1 0 0 0 微米。早在远古时代，人类就已经开始利用螺旋藻。西班牙 人发现阿芝台克人( a z t e c s ) 利用螺旋藻作为食物；非洲乍得湖边的土著居民至 今还吃着被他们称为d i h e 的螺旋藻。在西方，螺旋藻的太批量生产始于墨西哥。 自从2 0 世纪s o 年代首次作为商品出售，螺旋藻作为健康食品越来越普及。全球已 有七十多个国家把螺旋藻作为食物，而且这个数目还在不断增加。1 人们对螺旋藻的认识是从它的可食用性开始的，螺旋藻富含氨基酸，维生素， 矿物质和其它营养成分，是一种优质食物来源。近年来的研究发现，螺旋藻还有 多方面的药理学属性。体外和体内实验表明，螺旋藻对过敏症、贫血症、癌症、 肝毒性、心血管疾病、高血糖症、高血脂以及免疫缺陷等有抑制作用。对螺旋藻 组分功能分析表明，螺旋藻的主要药理学属性与它的组分，包括脂肪酸q - 3 或 q 6 、6 一胡萝卜素( b e 协c a r o o e n e ) 、旺- 生育酚( a i p h a - t o c o p h e r 0 1 ) 、藻蓝蛋白 ( p h y c o c y a r l i n ) 、苯酚h e n 0 1 ) 复合物和c a - s p i n l l 锄( c a i s p ) 等有关。 2 】有关螺旋藻 的化学、药理学、毒理学方面的研究还在不断深入，而探索螺旋藻在人类身上的 应用价值成为当前研究的一个热点。 螺旋藻是一种光能自养型生物，它是通过一种被称为藻胆蛋白体 ( p h y c o b i i i s o m e s ，p b s ) 的结构来捕获光能，并高效的( 9 0 ) 将光能传递到 光反应中心，进行光合作用。藻胆蛋白体的主要成分为藻胆蛋白 ( p h y c o b i l i p r o t e i ，p b p ) ，它是藻胆蛋白体中一类捕光色素复合蛋白的总称 胁夕? z 掌 硕士学位论文 包括藻红蛋白( p h y c o e r y t l l r i n ，p e ) ，藻蓝蛋白( p h y c o c y a n i n ，p c ) ，藻红蓝蛋白 ( p h y c o e r y t h m c y a n i n ，p e c ) 和别藻蓝蛋白( a 1 1 0 p h y c o c y a l l i n ，a p c ) 等。光能依次经 过藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白的传递，到达光反应系统，这个过程是高效 有序的。 每种藻胆蛋白由等摩尔量的a 和b 亚基构成，有些藻胆蛋白还含有y 亚基。 藻胆蛋白的a 和p 亚基通过分子间的各种相互作用力( 疏水键、氢键、和离子键 等) 先形成单体( ob ) ：单体之间借助连接多肽( 1 i n k e rp 0 1 y p e p t i d e s ) 的作用再 聚合成三聚体( ab ) ，。通过y 亚基的铆定作用，某些藻胆蛋白能形成更稳定的 聚合态。 藻蓝蛋白作为螺旋藻中一种主要的光捕获天线，组成藻胆蛋白体的“棒”( r o d ) 亚结构。两种亚基d 和b ，分别由1 6 2 个和1 7 2 个氨基酸组成。在天然条件下，两 种亚基形成( a ”：，或者( ab ) 。等杂聚体形式。根据来源不同，藻蓝蛋白大致可 以分为两种类型：r p c 和c p c 。不同类型的藻蓝蛋白，在氨基酸结构、光学性质 等方面不尽相同。 藻蓝蛋白不仅是藻类重要捕光色素蛋白，而且具有其他更重要的开发利用价 值。它可作为天然色素添加剂应用于食品和化妆品中；也可作为蛋白质营养强化 剂添加到食品和饲料中；还可作为具有医疗保健作用的药物，应用于医药领域。 1 1 螺旋藻的研究概况 螺旋藻主要分布在南北纬3 5 度的亚洲、非洲和南北美洲的碱性水体中，是一 类低等植物，在分类学上属于蓝藻门、蓝藻纲、段殖体目、颤藻科。 1 3 目前研究最多的有三个种：钝项螺旋藻( s 用a 泓拈) 、极大螺旋藻 ( 置施工咖) 和盐泽螺旋藻( s 黝船) 。螺旋藻外观青绿色，藻体为单一的藻 丝，往往多数藻丝聚集形成薄片状，藻丝弯曲，多数伴有有规律的螺旋状绕转。 螺旋藻作为古蓝藻的后代兼具微生物和植物的特点：螺旋藻细胞内没有真正的细 胞核( 称原核) ，遗传背景简单，便于基因分析和外源d n a 检测；细胞壁组成特殊， 4 胁歹? 破掌 硕士学位论文 容易消化；营光合自养生长，而且培养条件简单。r 4 螺旋藻的这些特点广泛应用 于光合作用、固氮作用、叶绿体起源以及植物进化等重大生物学问题的研究。 此外，螺旋藻营养丰富，而且兼具多种重要的药理学功能，我们有理由相信 螺旋藻产业有着良好的发展前景。 1 1 1 成分及营养学分析 螺旋藻含有多种营养成分。它的突出特点是具有高氨基酸含量( 6 2 ) 和 高类胡萝p 索含量( 4 m g g ) 。螺旋藻蛋白质由1 8 种氨基酸组成，含有人体和动 物所必需的8 种氨基酸。螺旋藻的深蓝绿色来自附加在类胡萝h 素上的混合色 素。叶绿素占1 ，而藻蓝蛋白含量高达1 4 。除此之外，螺旋藻还包含类胡萝h 素，多种维生素和矿物质。其中维生素b 1 2 含量比较高，比动物肝脏高3 5 倍， 是现在已知所有生物体中维生素b 1 2 含量最高的一种。螺旋藻中含有7 的脂类， 其中2 0 是v 一亚麻酸( g a 姗a - l i n o l e n i ca c i d ，g l a ) 。g l a 可能有炎症调节功 能，并且它本身是一种常用的食补品，具有降血脂、软化血管的功能。【l j 人类食用螺旋藻的历史，以及世界各国科学家的科学实验结果都证明，人们 长期食用螺旋藻是十分安全的。联舍国粮食和农业组织( t h eu n f a 0 ) 认定螺旋 藻是第三世界抵抗营养不良的潜在武器。 1 1 2 药理学功能 近2 0 年来，有关螺旋藻的药理学作用研究涉及鱼类至哺乳类动物甚至人类 的众多生理过程。螺旋藻的原核型细胞壁是由多糖和胞壁肽组成的。在胞壁中螺 旋藻多糖连到肽链上，既有抗氧化属性，又有刺激免疫系统的功能，能增强细胞 核酶活性和d n a 修复合成。而胞壁上的肽类物质则有助于维持免疫系统最佳的就 绪状态，可通过增强短波睡眠刺激代谢影响中枢神经系统，而且它们还可以影响 机体发育。【4 ，5 ，6 】 加夕? z 掌 硕士学位论文 螺旋藻是免疫系统的强力促进剂。少量的螺旋藻抽提物就可以刺激免疫系统 功能，尤其是那些由巨噬细胞介导的反应。注射或口服1 5 0 3 0 0m g k g 剂量的钝 顶螺旋藻中的多糖，能增加小鼠外周血巨噬细胞的百分含量、t 一淋巴细胞的百分 含量和溶血素含量。这些结果表明，多糖能改善非特异性细胞免疫和特异性体液 免疫。众多的喂食实验表明，螺旋藻能增强非特异性细胞免疫反应如趋药性 ( c h e j i 】o t a x i s ) 和噬菌作用。用绵羊血红细胞( s r b c ) 处理喂食钝顶螺旋藻的 老鼠发现与初级免疫反应相关的脾脏抗体产生细胞的数目增加，而对与二级免疫 反应相关的i g g 产物几乎没有影响。这表明螺旋藻通过激活巨噬细胞功能、噬 菌作用和i l 一1 产物增强免疫反应，尤其是初级免疫反应。 螺旋藻可以作为降血脂、抗疲劳以及提高i g g ，i g a 和i g m 水平的药物。螺 旋藻还有抗辐射潜力，有助于肝脏和肾脏的解毒作用。动物实验显示，螺旋藻能 显著降低高剂量二氧芑、庆大霉素和有机汞等对机体的影响。 7 1 1 3 基因工程研究 螺旋藻基因工程的研究起步较晚，主要集中在基因克隆、测序、转移和表达 方面，并取得了显著进展。 近年来，人们通过p c r 及d n a 探针杂交等方法从螺旋藻分子中克隆了许多 有用的基因，如核酮糖一l ，5 二磷酸羧化酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、2 l k d a 类 囊体膜蛋白和c p c 基因等，并对大多数基因进行了测序。川 目前在螺旋藻转化中主要以抗生素作为标记。有研究表明螺旋藻对氯霉素和 一种除草剂敏感，并且氯霉素可作为转基因螺旋藻的抗性筛选压力，液体培养时 o 1 扯g m l 氯霉素可抑制螺旋藻的生长，固体平板致死浓度为1 o ”g m l ，因此氯霉 素是比较理想的转基因螺旋藻抗性选择试剂。 目前向螺旋藻中导入外源基因的方法有两种：遗传转化和接合转移。遗传转 化包括天然转化、诱导转化和电击穿孔。天然转化是指一些单细胞能够有效地吸 纳外源d n a 分子：诱导转化是指通过人工感受态引入外源d n a ：而电转化法则 对中期的螺旋藻比较适宜。接合转移是向丝状蓝藻引入外源d n a 的有效方法， 需首先构建含有目的基因、e c 0 1 i 质粒复制起点及转移起点和选择标记的杂交质 6 加芦= z 鲈 硕士学位论文 粒，转化含有辅助质粒的e c o l i 菌株，再通过接合引入一个i n c p 接合质粒，使3 个质粒位于同一宿主，然后与受体藻株混合，通过抗生素筛选获得抗性藻落。辅 助质粒和接合质粒由于无法复制和整合而逐渐丢失，杂交质粒若含有蓝藻质粒复 制起点，能够以复制子形式独立存在，还可与蓝藻内源质粒发生同源重组和染色 体同源重组而稳定存在。 通过重组d n a 技术构建螺旋藻新品种以及实现螺旋藻天然产物的基因工程 生产是目前螺旋藻基因工程研究的重点。 1 2 藻胆蛋白 藻胆蛋白主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数一些甲藻中，其主要功能是作 为光合作用的捕光色素复合体：在一些藻类中它也可以作为储藏蛋白，在氮源缺 乏时分解，提供氮源。 1 2 1 藻胆蛋白的种类 己知的藻胆蛋白主要可以分为4 大类，即藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白 和别藻蓝蛋白。根据来源的不同，每大类又可以分为若干个小类，每一小类前面 分别冠以b 、c 和r ，这些字母是用来表示藻胆蛋白的来源。【9 ，1 0 一“】几种藻胆蛋 白的吸收谱如下： 1 2 r 1 8 】 v 山哪_ i h - i r p h y c o c y a n i n il占k，ja-置 一形；z 掌 硕士学位论文 r - p b y c o e 叮h r i n弘p h y c o e 叮t h r i n y j p h y c o e r y m r m p h y c o e r y t h r i 玎5 6 6 印j r t a 1 1 yp u r i 6 e d ) p h y c o e r y t h r o 。y 曲 a p c 0 。f t i a l i yp t i 6 e d ) 图1主要藻胆蛋白的吸收光谱 8 2-日08t 胁芦? z 掌 硕士学位论文 1 2 2 藻胆蛋白的组成 藻胆蛋白是一类寡聚体蛋白，基本构建单位是a 和b 亚基，亚基分子量在 1 7 k d a 至2 2 k d a 之间。在b 一和r 一藻红蛋白中还存在少量的y 亚基，它的分子量 较大，约为3 0 k d a 。每种亚基是由脱辅基蛋白( a p o p r o t e i n ) 和开链四吡咯结构的 色基组成，色基通过硫醚键与脱辅基蛋白的半胱氨酸残基交联。目前已经测定了 许多种藻胆蛋白d 和b 亚基的氨基酸全序列。【1 3 】 一般来说，藻胆蛋白的。亚基与b 亚基形成稳定的单体( ab ) ，再由单体聚 合为多聚体( ab ) 。从蓝藻和红藻中分离的藻胆蛋白是三聚体( ab ) 。或六聚体 ( ab ) e ，有时也以二聚体形式存在。藻胆蛋白在溶液中的状态往往与藻胆蛋白 的种类、浓度、溶液的p h 和离子强度等因素有关。例如c 一藻蓝蛋白在接近其等 电点( p i = 5 5 5 ) 时，以六聚体( a 且) 。为主要的存在形式，而在p h6 8 时，则 以三聚体( ab ) 。为主；在p h 为5 4 ，离子强度为0 2 ，蛋白质浓度为o 6 m g m 1 时，存在六聚体与单体间的平衡( ab ) 。_ 6 ( ab ) ；在p h 为6 8 ，蛋白浓度较低 时，则存在着三聚体与单体间平衡；而当蛋白质浓度很高时，即使是p h6 8 ， 仍以六聚体与单体间的平衡占优势。而对于r 一藻红藻白和b 一藻红蛋白来说，在 一个很宽的p h 范围内均是以很稳定的六聚体( a 。y 形式存在，其原因可能是 y 亚基将两个三聚体“盘”铆在一起。一般来说，大部分的别藻蓝蛋白是以三聚 体的形式存在。【1 4 。1 7 】 1 2 3 藻胆蛋白的色基藻胆素 1 9 2 8 年l e m b e r g 首次证明藻胆蛋白是由脱辅基蛋白和四吡咯结构的色基组 成。在藻胆蛋白中总共发现4 种色基，分别为藻蓝胆素( p h y c o c y a n o b i l i n ，p c b ) 、 藻红胆素( p h y c o e r y t h r 。b i l i n ，p 髓) 、藻尿胆素( p h y c o u r o b i l i n ，p u b ) 和 p h y c o b 儿i v i 0 1 i n ( p x b ) 。这4 种色素是同分异构体，它们的差异表现在双键位 置的不同。藻胆色素分子结构如图2 5 所示： 1 9 ，2 0 】 9 洳；矢 硕士学位论文 图2p c b 的分子结构 图3p e b 的分子结构 0 声所歹，z 鲈 硕士学位论文 图4p u b 二聚体结构 图5p x b 的分子结构 藻胆蛋白分子共价结合的色基数目较多。而且一个分子可以结合种类不同的 印歹，z 学 硕士学位论文 色基，例如r 一藻红蛋白共价结合2 5 个藻红胆素、9 个藻尿胆素；三聚体的藻红 蓝蛋白可以共价结合3 个p x b 和6 个藻蓝胆素。 一个藻胆蛋白的所有色基在功能上可以分为两种类型。一种是能吸收能量并 相应地产生荧光的“荧光型”色基( f ) ，另一种称为“敏化型”色基( s ) ，它能 吸收能量并将吸收的能量快速高效地传递给“荧光型”色基，自身不能产生荧光。 1 4 ，2 1 1 2 4 藻胆蛋白的结构与功能 一级结构分析发现藻胆蛋自在某些位点处的氨基酸残基相当保守 1 3 ，这些 位点在保证色基的构象以及蛋白质分子稳定性方面具有重要的意义。藻胆蛋白分 子b 亚基的7 2 位均为经过修饰的y n 甲酰天冬酰胺残基，这是经蛋白质的转译 后修饰而产生的，而且不论是原核藻类还是真核藻类的藻胆蛋白，均有这种现象 的存在。这种甲基化作用的功能主要为：( 1 ) 为藻胆蛋白提供一种保护机制，即 在容易接触极性基团的位置上防止氨基酸残基的去酰胺化。( 2 ) 与且8 4 位上的色 基相互作用，使其吸收光谱红移。( 3 ) 有利于藻胆体内定向能量传递。 目前对藻胆蛋白高级结构的认识主要来源于x 射线衍射法结果。【3 6 高分辨 率的藻胆蛋白晶体结构解析表明，所有的藻胆蛋白的晶体结构均十分相似，即d 亚基和b 亚基靠静电相互作用形成有部分重叠的“弯月”形单体( d ) ，3 个单体( 邮) 围绕中心轴形成一个具中央空洞的圆盘形三聚体( c 啦) 3 。如果藻胆蛋白是六聚体形 式( a b ) 6 ，则由两个圆盘形的三聚体( a b ) 3 垛叠在一起形成。每个三聚体盘厚约为 3 5 a ，圆盘的外径为1 1 0 a ，中央空洞的直径为3 5 a 。 a 亚基和b 亚基虽然含有不同数量的氨基酸残基，而且一级结构不同，但它 们的二、三级结构却十分相似，均含有9 个a 螺旋，每两个a 螺旋之间有不规 则转角相连，亚基的三级结构与球蛋白十分相似。 c 藻蓝蛋白的每个单体( a b ) 含有3 个藻蓝胆素，分别位于n - 8 4 、b - 8 4 和b 一1 5 5 。这3 个色基的化学结构相同，均为p c b ，但由于蛋白环境的不同，因而有 不同的吸收光谱。吸收峰分别位于5 9 8 n m ( b 1 5 5 ) 、6 1 8 m ( a - 8 4 ) 和6 2 4 脚( b 一8 4 ) 。别藻蓝蛋白的单体( 口口) 只含有两个色基，分别d 一8 4 和0 8 4 。尽管这些色 膨夕，z 鲈 硕士学位论文 基与c 一藻蓝蛋白的色基相同，均为藻蓝胆素，但相对于c 藻蓝蛋白来说，别藻 蓝蛋白色基吸收峰红移4 0 n m 。这些结果表明相同的色基结合在不同的藻胆蛋白、 同一藻胆蛋白的不同亚基或者同一亚基的不同位点，其光谱的待征不同。究其原 因是色基所处的蛋白质环境不同所致。如上所述，脱辅基蛋白的特点决定着色基 的构象，反过来，色基的结构也影响脱辅基蛋白的结构，进而影响和控制着整个 藻胆蛋白分子的聚集态，例如色基的还原和光致漂白作用可以使藻胆蛋白不能形 成高于二聚体的聚集态，还原的色基再氧化可以使藻胆蛋白重新聚合成起始状 态。这说明藻胆蛋白是自定义的，而且是色基蛋白质系统的最佳状态。现已广泛 认为完整的色基结构是决定藻胆蛋白四级结构的重要因素。【2 2 ，2 3 ，2 4 2 5 ，2 6 】 一般认为天然态藻胆蛋白分子中，蛋白质组分的功能主要有：( 1 ) 保持色基 特定的构象并防止色基的大幅度运动；( 2 ) 它们具有特定的氨基酸残基使色基保 持质子化状态，色基的质子化状态可以抑制色基激发态时无辐射驰豫散失能量； ( 3 ) 藻胆蛋白聚集态的形成有利于色基间以及色基与脱辅基蛋白间的相互作用， 这两种作用影响着色基的光谱特征。 藻胆蛋白除了作为光合作用捕光色素蛋白外，还可以作为藻细胞内蛋白的储 藏库，即在环境条件合适时大量合成藻胆蛋白，而当环境条件缺乏台成蛋白质所 需的氮和硫元素时则分解藻胆蛋白，提供氨基酸以合成其他细胞生存所必需的蛋 白质。 2 7 ，2 8 r 2 9 】 1 2 5 藻胆蛋白与光合作用 藻胆蛋白是蓝藻的主要的光捕获元件。光能在藻胆蛋白体中的传递途径为： p e 一 p c 一 a p c 一 a p c b ，最后到达叶绿素a 。其中藻红蛋白和藻蓝蛋白组成藻胆蛋 白的棒结构，而别藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白b 则形成核结构，如图6 所示一。藻 胆体捕获的光能高效而优先地传递给光合膜中的p s i i 反应中心，说明藻胆体与 p s i i 反应中心之间存在结构和功能上的某种联系。这一观点已得到冰冻撕裂和 冰冻蚀刻电镜观察的证明，即藻胆体与光合膜外质撕裂面( e s ) 的p s i i 颗粒呈对 应或近乎对应分布。藻胆体的发色基( 3 0 0 8 0 0 个) 被严格包装在每个胆蛋白盘 中，这些盘按其吸收或发射峰顺次排列，加上联结蛋白的调节作用，结果能量在 跏? z 掌 硕士学位论文 藻胆体的盘一盘之间只能按一个方向传递。 1 4 r 1 8 ，3 1 ，3 2 ，3 3 3 4 】 藻胆体的全程能量传递效率高达9 0 以上，全程传递时间不到2 0 0 p s ，其中 能量从p e 到最近的p c 的传递时间约2 8 p s 。d a l e 和t e a l e 认为，在胆蛋白盘中， 发色基以敏化( s ) 和荧光( f ) 两种形式存在，且s 一发色基吸收的能量高效率传给 f 一发色基。对r p b 和a p 进行的脉冲动力学实验表明，s 一 f 传递时间的上限为 8 p s 。可见藻胆体中盘一盘传递是全程能量传递的限速步骤。 3 5 ，3 6 图6蓝藻藻胆蛋白棒核结构模型 左图表示的是组成棒结构的藻蓝蛋白六聚物；右图表示的是由藻红蛋白和藻蓝蛋白组成 的棒状结构以及由a p c 和a p c - b 形成的核状结构。 1 3 藻蓝蛋白 藻蓝蛋白普遍存在于蓝藻中，在钝项螺旋藻藻粉中含量高达2 0 。它富含 人体八种必需氨基酸，是自然界中具有重大开发价值的食用和饵料蛋白资源。它 具有明显的抗氧化作用、抗炎症作用，能清除辐射以及选择性的抑制加氧酶一2 的活性，具有一定的医疗保健作用。【3 8 4 3 1 3 1 藻蓝蛋白的组成和结构 目前已知的藻蓝蛋白有：红藻中的r p c 、蓝藻中c p c 、隐藻中的p c 一1 和 4 柳，z 学 硕士学位论文 p c 一2 以及蓝裸甲藻中的p c 一6 4 5 、p c 一6 2 9 等。 己经对来源于螺旋藻等多个物种的藻蓝蛋白进行了氨基酸序列分析，结果显 示，藻蓝蛋白是由两个亚基。一亚基和b 一亚基构成。来源于钝顶螺旋藻的c p c 的氨基酸序列分析显示，c p c 的a 一亚基和b 一亚基分别由1 6 2 个和1 7 2 个氨基 酸残基组成，如下所示：【1 3 】 c p cqc h a i nf r o m 勋川l 加p 厶f 舢“s ： 1 m k t p l t e a v si a d s q g r f l ss t e i q v a f g rf r q a k a g l e aa k a l t s k a d sl is g a a q a v yn k f p y t t q m q g p n y a a d q r gk d k c a r d i g yy h v t y c l ia g g t g p m d e yl i a g i d e i n rt f e l s p s w y ie a l k y i k a n h g l s g d a a t e an s y l d y a i n al s1 6 2 ： c p cqc h a t ni r s p i r u ii n ap j 8 t e n s i s ： 1m f d a f t k v v sq a d t r g e m l s t a q i d a l s q mv a e s n k r l d av n r i t s n a s ti v s n a a r s h la e q p q l i a p g g n a y t s r r m a a c l r d j 口e i i l r y v t y a v f a gd a s v l e d r c ln g l r e t y l a lg t p g s s v a v gv g k m k e a a l a i v n d p a g i t pg d c s a l a s e ia s y f d r a c a av s1 7 2 ； x 一射线衍射等结构分析显示，a 链在4 1 4 ，2 卜4 6 4 8 6 2 ，6 4 6 7 ，7 8 一1 0 1 ，1 0 5 一儿0 ， 1 1 5 一1 2 1 ，1 2 6 1 3 9 ，1 4 4 一1 6 0 等位置为螺旋区域，总共为9 个螺旋结构；d8 4 位置为p c b 结合位点。而b 链在4 1 4 ，2 l - 4 6 ，4 8 6 2 ，6 4 6 6 ，7 6 9 9 ，1 0 3 一1 0 8 ，1 1 3 1 2 0 ，1 2 4 1 4 3 ， 1 5 4 一1 7 2 等位置为螺旋区域：b8 4 和b1 5 3 为p c b 结合位点；b7 2 为甲基化位点。 不同藻蓝蛋白n 和b 亚基结合发色团的位置、种类和数量不一样。一般每个 亚基结合卜4 个开链四环吡咯构成的发色团。藻蓝蛋白结合的发色团包括p c b 、 p e b 和p u b 等。如来源于螺旋藻的c p c 在8 4 、b8 4 和b1 5 5 三个位置都是结 合一个p c b 。而来源于红藻的r p c 则可以结合p c b 、p e b 和p u b 等三种藻胆素， 但是在已发现的r p c 中，p e b 和p u b 并不同时存在，每个r p c 分子至少结合一 个p c b ，另外一种色素分子为p 髓或p u b 。 4 4 。4 9 藻蓝蛋白的亚基在体内以多聚体形式存在，主要有三聚体、六聚体，以及还 有二聚体和比六聚体聚集度更高的聚集体。藻蓝蛋白以何种聚集态存在受多种因 素影响，p h 值、蛋白质浓度、离子强度、辐射以及光照强度和光照时间等都能 胁歹? z 掌 硕士学位论文 使藻蓝蛋白聚集度发生改变。例如在p h 5 5 时，a h a l o p h y t i c a 的藻蓝蛋白以 六聚体形式存在，p h 7 4 时以二聚体存在，p h 7 5 时，s y n e c h o c c u s6 3 0 l 藻蓝蛋 白以三聚体形式存在。 1 3 2 藻蓝蛋白的性质及影响 藻蓝蛋白分子由于结合发色团的位置、类型以及数量上的不同，其光学性质 也不一样。两种主要的藻蓝蛋白的光学特征如下：c p c 在6 1 5 6 2 0 n m 处有最大 特征吸收峰，最大荧光发射峰在。6 3 5 6 4 7 n m 之间。r p c 在6 1 5 6 2 0 n m 处有最大 吸收峰，与c p c 不同的是它在5 5 6 n j i 】左右有一个稍小的吸收峰，最大荧光发射 峰在6 3 5 6 4 0 n m 之间。藻蓝蛋白的等电点稳定，有报道的p i 值一般在4 6 4 6 5 之间。【4 4 l 藻蓝蛋白及其色素的稳定性受多种因素如温度、p h 值、金属离子等影响。 当加热温度达至6 0 时，色素降解速度较快，而超过7 0 时，在3 0 加i n 内蓝色 素尽变为绿色：在p h 5 6 时，藻蓝色素稳定性较好，离开这个范围越远，其稳定 性越差。在有锌和铁离子存在时，色素会慢慢出现沉淀，随着锌和铁离子强度的 增大，色素颜色由蓝色变绿后转黄色。而钙和钾离子对色素没有影响。蔗糖的存 在基本上不对色素产生影响，而葡萄糖的存在则加快了藻蓝色素的降解，产生大 量绿色沉淀。另外，食品添加剂中的抗氧剂h 舡、酸味剂柠檬酸、抗坏血酸、防 腐剂山梨酸、尼泊金酯也会影响色素，使色素产生褪色。所以，如何保持藻蓝色 素的稳定性是一个很重要的问题。 1 3 3 藻蓝蛋白的功能及应用 抗辐射能力：蓝藻的一个重要生物学属性是它能够有效抵抗紫外线和其它电 离射线辐射。藻蓝蛋白，蓝藻中的活性成分之一，能显著抑制血细胞的减少。造 血干细胞的损伤或修复在造血功能型辐射疾病中至关重要。【4 1 ，5 0 】而藻蓝蛋白能降 低造血干细胞的光敏感性，防止于细胞减少，促使细胞进入增殖状态，有助于造 血功能的恢复。腹腔注射藻蓝蛋白能缓和辐射引起的鼠外周血核骨髓细胞损伤， 加速鼠外周血白细胞、骨髓核细胞和多功能造血干细胞的修复。在”c ot - 射线照 膨，彳z 鲈 硕士学位论文 射实验中也能观察到c 一藻蓝蛋白核多糖参与的白细胞和骨髓成核细胞的损伤修 复。藻蓝蛋白能降低6 0 c oy 射线照射和腹膜盐酸苯肼注射联合处理小鼠的贫血 水平。 抗炎症抗氧化作用：藻蓝蛋白能抑制葡萄糖氧化酶诱导的炎症，对急慢性组 织器官炎症都有显著抑制作用。它的抗氧化和氧自由基属性可能与它的抗炎症活 性有关。炎症代谢产物如氧自由基等，能诱导白细胞浸润到组织或者黏附到血管 上皮细胞，而这些地方恰恰是炎症反应的中心。在各种体外和体内实验模型中， 藻蓝蛋白通过清除羟基、烷氧基和过氧化物等活性氧物质来实现抗炎症活性。进 一步研究表明，抗炎症活性并不依赖于皮质甾类物质的释放。藻蓝蛋白能抑制 f e ”一抗坏血酸维生素c 诱导的过氧化反应。口服藻蓝蛋白提取物( 5 0 一3 0 0 m g k g ) 导致显著的抑制活性。【4 0 ，5 1 ，5 2 其它作用：藻蓝蛋白能抑制溶血作用，作用方式与维生素衍生物和抗坏血酸 维生素c 相似，不同的是藻蓝蛋白的抗氧化能力要强得多( 1 7 倍2 0 倍) 。这种 保护作用可能是由清除水相中相关基团引起的。利用c f u e ( c o l o n yf o r i n i i l g u 1 1 “e r y t h r o i d ) 技术体外培养小鼠胚胎肝脏细胞，相继的研究证实c 藻蓝蛋自和 多糖能影响特定的造血祖母细胞的分化和增殖。具体的机制还不清楚，可能是通 过调节造血细胞分化增殖所需因子的产物来实现的。藻蓝蛋白喂食患有肺癌的小 鼠，结果发现处理组( 喂食藻蓝蛋白) 的存活率显著高于对照组( 未喂食藻蓝蛋 白) 。6 周后处理组的存活率为9 0 ，对照组仅存活2 5 ：8 周后，处理组还有 2 5 存活，而对照组全部死亡。在另一实验中，两周后处理组的白细胞活力高于 或等于没患癌症的普通组。这说明藻蓝有一定的抗肿瘤效应。【1 ，3 9 ，4 2 藻蓝蛋自作为藻类重要的捕光色素成分，已经广泛应用于光合作用体外模拟 等重要研究中； 由于它是一种天然无毒色素，可以作为添加剂应用于食品和化妆品中； m i y a e a w ak a z u k i 和k a ta i l l i n o t a k a s h i 等就成功的提取了藻蓝蛋白作为食品和化 妆品色素添加剂。 作为一种蛋白，它还可以添加到食品和饲料中充当营养强化剂：大日本油墨 公司开发出商品名为l i n ab l u ea 的钝项螺旋藻藻蓝蛋白产品作为蛋白质营养强 却歹亨z 掌 硕士学位论文 化剂应用于食品和饲料中。 同时它的荧光属性使它可以作为生物化学示踪物，用于免疫检测、荧光显微 技术和流式细胞仪技术等方面； 另外，藻蓝蛋白的还有重要的药用价值。i i j i m a 等认为藻蓝蛋白能促进免疫 系统，以抵抗各种疾病；哈佛医学院s c h w a r t z 和s h k i a r 等也发现螺旋藻藻蓝蛋 白对一些癌细胞有抑制作用：浙江医科大学曾苏等把从螺旋藻中抽提取出藻蓝蛋 白作为一种新型治疗癌症的新药物。 展望 螺旋藻是迄今研究最多的藻类之一。成分分析显示螺旋藻营养丰富，组成合 理；而且安全性检测证实螺旋藻是少数无毒副作用的蓝藻之一：另外，螺旋藻对 生长环境的要求简单，大范围养殖方便。螺旋藻的这些特点使它成为一种优质的 食物来源。合理的开发利用螺旋藻将有助于解决第三世界国家的粮食问题。 螺旋藻功能研究的蓬勃开展，向我们展示了螺旋藻作为药物的广阔前景。动 物实验的结果显示螺旋藻在防病抗病方面具有重要作用。然而，对于这些作用的 分子机制的了解尚浅。而且，早期的研究数据缺乏同一性，螺旋藻要作为有针对 性药物在人类身上广泛使用还有待进一步研究。 光合作用是地球上生物赖于生存的重要保障，其重要性不言而喻。螺旋藻是 地球上最早的光合作用生物的后代，兼具微生物和高等植物的某些特征。螺旋藻 细胞结构简单，对其光合系统组成和功能的研究比较方便。目前，对螺旋藻中主 要的光捕获蛋白的组成以及作用机制的研究已经取得了一些成果。而这些数据的 获得有助于我们探讨并合理开发高等植物的光合作用功能，具有重要的意义。 综上所述，我们认为螺旋藻具有重要的研究价值。这也是我们选取钝顶螺旋 藻为分离纯化对象的一个重要原因。 洳； 矢嘧 硕士学位论文 r e f e r e n c e ： 1 n p ：，、v w w s p i r u l i n 簦o u r c ec o m ， 2 4 5 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 c h a m o r r ogs a l a z a rm ，a r a u j ok gd o ss a n t o scp c e b a o sga n dc a s t i olf 2 0 0 2 u p d a t eo n t h ep h a n n a c o l o g yo f 印讹d 加d 口r 砌唧打印，a nu n c o n v e n t i o n a if o o d ，月枷 三口f 抽口册“肛，5 2 ( 3 ) ：2 3 2 - 2 4 0 s u d as ，w a 诅n a b em m ，o t s u k as ，m a h a i ( a h a n ta ，y o n g m a n i t c h a iw n o p a m a r a p o mn ， l i uya n dd a yj g2 0 0 2 1 幻n o m cr e v i s i o no fw a t e r - b l o o m - f o n t l i n gs p e c i e so f o s c 川a _ t o r i o i dc y a n o b a c t e r h 加tz 跏fe v 。上 缸憎6 如 ，5 2 ( p i5 ) ：i5 7 7 - 15 9 5 h t t p ：，w w w l s o n i c n 鲋一s p i r u i i n ，s p l n e w s 9 6 h 姐i p i n e r oe e ，b e 九n e j ob p 舳dv i l l a r 如，f a m ，2 0 0 1 a n t j o x i d a n ta c t i v _ t yo fd i f f e r t f r a c t i o n so f s p 盯u l i n ap l a l e n s i sp r o t e a ne x t r a c t 而m 口c d ，5 6 ( 5 7 ) ：4 9 7 _ 5 0 0 b h a tv ba n dm a d y a s t h ak m ，2 0 0 1 s c a v e n g i n go fp e r o x y n i 们t eb yp h y c o 叫a n i n 卸d p h y c o c y a n o b i i i nf 如ms p j r u l i n ap l a t e n s i s ：p r o t e c 廿0 na g a i m t o x j d a t i v ed a m a g et od n a - 占妣 b 卸 肛胁c o m m m ，2 8 5 ( 2 ) ：2 6 2 - 2 6 6 h t t p ：，w w 、h g r e e n f o o d s b i a r 丁i c l e s a p i r u i i n a 山t m i y u 只c e np l ，“j ra n dc h e ns m ，2 0 0 2 t h er e s e a r c hp m 蓼e s so fs p o r u l i n ag e n e t i c e n g i n e e 一哼曰“f 胁抽d ，招订。b 口柑乃c 蛔d 魄1 8 ( 6 ) ：4 5 1 - 4 5 6 p e n gw m ，s h a n gs t 乙i ug q a n df uy l ，1 9 9 8 a “a n c eo fs t u d i e so np h y c o b i l i p r o t e i no f