（高分子化学与物理专业论文）蜂毒肽片段类似物的合成及其生物活性研究(1).pdf

摘要 本文采用固相多肽合成技术，以蜂毒肽( m e l i t t i n ) c 端1 5 肽片段m e l ( 1 2 2 6 ) 为模板，设计合成了一系列短缺肽段以及反序肽段。考察了这些多肽的溶血活性和抗 菌活性，讨论了多肽结构与生物活性的关系，应用荧光光谱技术研究了这些多肽和磷 脂膜的相互作用。 m e l i t t i n 是蜂毒中含2 6 个氨基酸残基的多肽，在m e l i t t i n 分子中有5 个碱性氨基 酸，其中4 个集中在肽段的c 端( k r k r ) 。m e l i t t i n 对革兰氏阳性菌和阴性菌均有很 强的抑制作用，是典型的阳离子抗菌肽。但m e l i t t i n 还有很强的溶血活性，在一定程 度上限制了它在临床上的应用。本文所合成的系列多肽的溶血活性大大降低，而基本 保留了抗菌活性。多肽抗菌和溶血的机理并不相同，有希望开发出高抗菌活性、低溶 血活性的m e l i t t i n 类似物制剂。去除了o i n 的反序肽以及更短的反序肽可以成为新的、 氨基酸残基更少的模型肽。 分别用k - d ( a v e r a g e ) 值和r t 值作为多肽疏水性的量度考察了多肽疏水性与生物活 性的关系，结果表明：m e l ( 1 2 - 2 6 ) 系列肽溶血和抗菌活性与肽段疏水性的规律性一 致，即肽段的疏水性是其发挥溶血和抗菌活性的主要影响因素。 用圆二色谱法研究了多肽在不同介质中的构象变化，当多肽在疏水性环境( 模 拟疏水性的细胞膜) 中时，将尽可能采取睁螺旋结构。应用荧光光谱方法研究了所合 成系列多肽与磷脂膜的作用，测得的磷脂，肽临界摩尔比与多肢生物活性之间有较强 的相关性，证实了多肽的抗菌和溶血活性主要源于多肽与不同的细胞膜的磷脂双层的 作用。 蜂毒肽 抗菌 阳离子抗菌肽 圆二色谱 溶血 荧光 a b s t r a c t u s i n gt h em e l i t t i n s c - t e r m i n a l1 5r e s i d u e s ，m e l ( 1 2 2 6 ) ，嬲t h em o d e l ，as e r i e so f a n a l o g u e sa n dr e t r o p e p t i d e sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e db yt h es o l i dp h a s ep e p t i d e s y n t h e s i s ( s p p s ) m e t h o d t h eh e m o l y t i c a c t i v i t i e sa n da n t i b i o t i ca c t i v i t i e so f t h e s e p e p t i d e s w e r ee x a m i n e d t h e i rs t r u c t u r e sa n di n t e r a c t i o n sw i t l l p h o s p h o l i p i d sm e m b r a n e sw e r e s t u d i e d m e l i t t i ni sat y p i c a lc a t i n m ca n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ，b u ti t sd e t r i m e n t a lp r o p e r t yo f k i l l i n ge u k a r y o t i cc e l l sl i m i t si t su s e t oac e r t a i ne x t e n t i nt h i sp a p e r , t h e p e p t i d ea n a l o g u e s w e r es y n t h e s i z e da n dt h e ye x h i b i t e dp o t e n ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e sa n dm u c hd e c r e a s e d h e m o l y t i c a c t i v i t i e s t h e i m p o r t a n tc l u e s w e r ei m p l i e dt o d e v e l o pt h eh i g h - e f f e c t i v e ， l o w t o x i cm e l i t t i na n a l o g u e s t h er e t r o p e p t i d ew i t h o u tt h et w oc - t e r m i n a lg i nr e s i d u e s c o u l db eu s e d 嬲an e wm o d e l p e p t i d e t h e h y d r o p h o b i c i t yo f t h ep e p t i d e s w a sc h a r a c t e r i z e d b y b o t hk _ d e 叩) a n dr e t e n t i o n t i m e ( r t ) o nc i sc o l u m n t h eh e m o l y t i ca n da n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e sc o r r e l a t e dw e l lw i 也t h e p a r a m e t e r s t h e s ec o r r e l a t i o n sa l s os u b s t a n t i a t e dt h ee s s e n t i a lr o l eo fh y e o p h o b i c i t i e si n t h eb i o a c t i v i t i e s t h ec o n f i g u r a t i o n so ft h ep e p t i d ea n a l o g u e si nd i f f e r e n ts o l v e n t sw e r es t u d i e db yc d s p e c t r aa n dt h e yw e r e f o u n dt oa d o p ta - h e l i xa th y d r o p h o b i cc o n d i t i o n s t h ei n t e r a c t i o no f m e l ( 1 2 - 2 6 ) a n a l o g u e sw i t l lp h o s p h o l i p i d sw e r ei n v e s t i g a t e db yf l u o r e s c e n c em e t h o d t h e s i n g l et r p r e s i d u ew a su s e da sr ni n t r i n s i cf l u o r e s c e n c ep r o b et of o l l o wi t sb i n d i n gt op g a n dp cv e s i c l e s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea f f i n i t yo f p e p t i d e sw i t h n e g a t i v ec h a r g e d p g l i p i d s i s s t r o n g e rt h a nt h a tw i t hn e u t r a lp cl i p i d s t h e c r i t i c a lm o l a rr a t i o so f l i p i d t o p e p t i d ew e r ef o u n dc l o s e l yr e l a t e dw i t ht h ep e p t i d eb i o a c t i v i t i e s ，w h i c hd e m o n s t r a t e d t h a t t h ea n t i b a c t e r i a la n dh e m 0 1 ) r t i ca c t i v i t i e so f p e p t i d e sm a i n l yc a m ef r o mt h e i ri n t e r a c t i o n s 、i t hp h o s p h o l i p i d sm e m b r a n e s k e y w o r d s m e l i r i n c a t i o n i ca n t i b a c t e r i a lp e p t i d e a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yc d s p e c t r a h e m o l y t i ca c t i v i t y f l u o r e s c e n c e 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 第一章前言 1 1 阳离子抗菌肽的结构和抗菌活性研究 抗菌素是一类应用最为广泛的药物。自从1 9 2 8 年弗来明发现青霉素以后，人们对 由病原微生物感染而引发的各类疾病不再束手无策，并由此发展了大量的d 内酰胺类抗 菌素。抗菌素的使用挽救了无数的生命，使人的预期寿命增加了十年以上，对保护人类 健康作出了巨大的贡献。但随着上述“传统抗菌素”的广泛使用，不断产生出诸多新问 题：如b 内酰胺类抗菌素的过敏反应以及长期使用导致细菌逐渐对其产生的耐药性。 2 0 0 0 年6 月1 2 日，世界卫生组织( w h 0 ) 官员指出：一些因细菌感染而引发的、目 前极易治愈的疾病，如喉咙疼痛和耳部发炎，在不久的未来很可能和疟疾以及肺结核一 样，对抗菌素产生免疫作用，从而成为一种难以治愈的疑难杂症。因此寻找新类型的、 细菌对其不易产生耐药性的抗菌素已迫在眉睫。 1 1 1 阳离子抗菌肚的结构特征 近年来的研究发现，许多生物体( 包括昆虫、两栖动物、哺乳动物和人类) 的防御 系统中存在抗菌多肽，当生物体受到外界微生物的刺激时，可大量迅速地合成。迄今为 止，已被测定肽链序列的抗菌肽多达数百种，它们的一级结构差别很大，但都为1 3 5 0 个氨基酸组成。分子量小于5 k d ，而且它们还具有两个共同特征：一是阳离子肽，即肽 链中富含精氨酸，赖氨酸等正电荷残基，等电点大于7 ：二是活性结构为两亲极性。它 们具有热稳定性强、强碱性和抗菌谱广的特点，可以抑制细菌、病毒和真菌等的生长【l 3 1 ， 部分抗菌肽尚具各抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。 1 1 2 阳寓子抗曹肽的抗菌机理 抗菌机理对设计具有高抗菌活性的类似物有重要的指导意义。虽然到目前为止阳离 子抗菌肽的抗菌机理还不是很清楚，但是近年的研究表明，阳离子抗菌肽与传统抗菌素 的抗菌机理是不同的。阳离子抗菌肽主要通过与细菌的细胞膜通过静电作用和疏水作用 结合，从而起到抑菌作用。事实上这只是经过国内外学者普遍认可的抗菌过程的第一步， 结合后如何抑菌还有不同的说法。 1 塑堑查堂堡圭! ! 塞生兰些! 堂垡2 丝兰 i ) 细胞膜电势依赖通道的形成 o k a d a 等1 4 】发现用麻蝇素i ( s a r c o t o x i ni ) 处理后的大肠杆菌对脯氨酸和四苯基磷 酸盐的吸收停止了，而这些物质的膜间运输需要膜间的电化学势，进一步的研究发现麻 蝇素i 扮演着离子泵的角色，它使得细胞内的钾离子快速地被析出，三磷酸腺苷含量急 速下降，继而导致细胞死亡。这些现象揭示抗菌肽的抗菌作用可能是其在细菌的细胞膜 上形成了离子通道造成细胞内物质泄漏导致电化学势的丧失。为了证实这一点，人们做 了一些抗菌肽与脂质体膜相互作用的研究。 c h r i s t c n s e n 等人5 i 通过脂质体膜经抗菌肽处理后的电势及电流变化，判断出抗菌肽 在膜上形成了孔道。他们还以脂双层为模型详细描述了抗菌肽作用于膜的过程。首先是 抗菌肽通过静电作用被吸引到膜表面，然后疏水尾巴插入细胞膜中的疏水区域，通过改 变膜的构象，多个抗菌肽聚合在膜上形成离子通道造成物质泄漏和细胞死亡。 c o c i a n c i c h 等【6 l 进一步发现，孔道的形成、开启和关闭都依赖于膜的电势。只有当 膜的电势高于1 0 0 m v 时，孔道才能形成或处于开启状态。因此这些孔道被称为电势依 赖性通道。 1 9 9 6 年，l o c k e y 等【7 1 利用电子显微镜和免疫胶体金技术观察到天蚕素( c e c r o p i n ) a 结合到大肠杆菌膜上，形成一个9 6 n m 的病灶，形成的孔洞直径4 2 n m ，孔洞导致细 胞内容物外泄，细菌死亡。这为电势依赖性通道的形成提供了直接的证据。 j u w a d i 【8 1 通过对天蚕素a 和蜂毒肽杂合体的抗菌作用研究，也提出了与上面相似 的抗菌机理。 值得注意的是大多数阳离子抗菌肽只对原核生物细胞( 如细菌) 产生特异的溶解作 用，而对真核细胞( 如血红细胞) 没有明显的作用。有人提出这种特性的原因在于原核 细胞与真核细胞的结构尤其是膜结构不同。真核细胞质膜具有膜蛋白和胆固醇，尤其是 后者的存在使细胞趋于稳定，而且哺乳动物细胞存在高度发达的细胞骨架系统，其中的 微丝、微管与质膜内层有许多结合位点，这些结构是细胞维持特殊形状和渗透压的首要 因素，它的存在抵抗了抗菌肽的溶胞作用。 2 ) “地毯式”( c a r p e t 1 i k e ) 模型 o r e n 等1 9 1 合成了一系列由不同比例的l e u 和l y s 组成的非对映异构体的模型肽， l e u 代表疏水性氨基酸，l y s 代表亲水性的、带电荷的氨基酸。肽的长度( 由1 2 个氨基 酸组成) 和d 氨基酸的位寅使得这些模型肽不能形成螺旋结构，c d 光谱也表明这些 2 塑墅丕兰璧主至! 塑生兰些l 兰垡2 堡兰 多肽在疏水性环境中没有任何可以检测到的二级结构。其中高度疏水性的模型肽既有抗 菌活性又能溶解血红细胞：而带很高正电荷的模型肽既不溶解血红细胞，其抗菌活性也 较低：处于高的疏水性和高的正电荷临界的模型肽既不溶血又有较高的抗菌活性。作者 认为两亲性的旺- 螺旋结构对溶血是很重要的，但对抗菌却不是必需的。具有合适的电荷 和一定的疏水性的多肽就会具有抗菌活性。既然这些模型肽不能形成a 螺旋结构，也就 难以跨膜形成离子通道，因此，作者提出了“地毯式”抗菌模型：多肽并没有插入膜的 另一侧，而是平行于膜的表面，并且象地毯一样形成了多肽的单分子层完全覆盖住膜的 表面，以类似于清洁剂的作用溶解了细菌的细胞膜。 s h a i 等合成了个别氨基酸被d 型取代的蜂毒肽类似物，由于分子中某些位置上 d - 氨基酸的存在，这些类似物都失去了原有的洳螺旋结构。实验表明：它们的溶血活性 消失了，然而抗菌活性被保留下来，并且通过电镜照片可以看到它们不仅完全溶解了革 兰氏阳性菌，也溶解了革兰氏阴性菌。作者认为上述结果支持“地毯式”抗菌模型。 a l v r i c z b r a v o 1 。】和k r i s h n a k u m a r i 1 2 l 等合成的短抗菌肽( 由1 2 或1 3 个氨基酸组成) 也都不能形成o l 螺旋结构，难以跨膜形成离子通道，似乎也符合“地毯式”抗菌模型。 3 ) 其它作用机制 1 9 9 7 年，s i l v e s t t o 1 3 1 研究发现天蚕素a 在低浓度时可以改变脂质体的膜电化学离 子梯度，同样浓度下也可改变革兰氏阴性菌的膜离子梯度，但在更高浓度下才会引起细 胞内容物的释放。作者提出天蚕素a 是通过改变膜离子梯度来杀死细菌的。 c a r l s s o n 等人研究发现，a t t a c i n 能够干扰大肠杆菌细胞外膜蛋白o m p c ，o m p f ， o m p a 以及l a m b 基因的转录，使这些蛋白质含量减少，从而导致细胞膜的通透性增加， 使细胞的生长受到抑制。 t h a n a t i n 在0 3 0 6 m o l l 时，就对大肠杆菌表现出强烈的杀菌作用。但当其浓度 提高到7 0 1 x m o l l 时，仍然检测不到细胞内钾离子的泄漏，这表明t h a n a t i n 不是通过改 变细胞膜通透性来杀菌的。当利用4 0 岬o l l 的t h a n a t i n 处理细菌时，l h 后，可监测到 细胞的呼吸作用变弱，6 l l 后呼吸作用完全停止。由此认为，t h a n a t i n 是通过抑制细胞的 呼吸作用来杀菌的l i ”。 1 1 3 阳离子抗菌肽的发展前景及存在问息 从上面的叙述可知，阳离子抗菌肽与传统抗菌素的抗菌机理是不同的。传统抗菌素 3 塑茎查兰堡主塑壅生望些! 兰篁2 丝壅 的抗菌机理为，抗菌素与细菌细胞壁上的某一特殊部位进行特异的结合，从而抑制细菌 的某些生理功能，起到抑菌作用。如果细菌在这一部位稍作变异，即可耐这种抗菌素。 如万古霉素与细菌细胞壁粘肽末端的一d - a i a d - a l a 结合丽抑菌，抗万古霉素的细菌则把 d a i a - d a l a 变异成d a i a - d l a c ，使万古霉素对其失去结合力而不起作用。细菌的耐 药机理还有：通过分泌p 内酰胺酶而破坏化学上很不稳定的p 内酰胺类抗菌素的p 内酰 胺环：分泌某种酶修饰抗菌素上的某些基团如乙酰化羟基等。阳离子抗菌肽的抗菌机理 为多肽的阳离子部分与细菌细胞膜( 阴离子性磷脂膜) 的磷酸基负离子通过静电作用力 相结合，多肽的疏水部分与细胞膜的碳氢链通过疏水作用力结合，且两种作用存在协同 作用从而起到抑菌作用。由于阳离子多肽与细菌细胞膜结合的特异性不高，细菌不易 通过简单的变异或修饰多肽产生耐药性。实验表明，阳离子抗菌肽对许多致病菌如致病 菌型大肠杆菌、伤寒杆菌、硝酸盐杆菌等有抗菌作用 1 6 1 。而且部分抗菌肽对一些临床 耐药致病菌也有良好的抗菌作用。此外，抗菌肽无致畸变作用，无积蓄毒性，是一类很 有希望的、细菌对其不易产生耐药性的抗菌素。十多年前，来自微生物的抗菌肽n i s i n 和m a g a n i n s ( 含有2 3 个残基) 被先后应用于医药、食品和农业等7 y i i ，n i s i n 已被美 国f d a 批准为血液防腐添加成分。m a g a i n i n 的类似物m s i 一7 8 和p r o t e g r i n 的类似物作 为抗菌素也已进入第三期临床试验。随着对分离纯化、抗菌特性、表达调控及毒力学性 质等问题的进一步研究，抗菌肽在不久的将来一定会大大造福于人类。 但是阳离子抗菌肽要成为药物，目前还存在一些问题：1 ) 与传统抗菌素相比，阳 离子抗菌肽的抗菌活性还不够高，因而用量较大；2 ) 由于阳离子抗菌肽的天然资源有 限，基因工程和化学合成便成为获取抗菌肽的主要手段。但是通过基因工程在微生物中 直接表达抗菌肽基因。可能造成宿主自杀而不能获得表达产物。以融合蛋白的形式表达 抗菌肽基因虽然可以克服这一缺点，但仍有表达产物少的问题。所以可以选择化学合成 的方法。阳离子抗菌肽的肽链较长，因而合成成本高，且免疫源性高；3 ) 某些肽( 如 本文所要研究的蜂毒肽) 有溶血副作用。解决上述这些闯题的有效途径是改造已有抗菌 肽和设计新抗菌肽分子，从而创造有更高抗菌活性，没有溶血活性且肽链较短的抗菌肽。 这就需要进一步研究阳离子抗菌肽结构与活性的关系和作用机理，为抗菌肷的分子改造 和设计提供足够的理论依据。 在众多的在阳离子抗菌多肽中，氨基酸残基数小于4 0 个且不含二硫键的线型多肽 最引入注目。其中蜂毒肽( m e l i t t i n ) 是1 9 6 5 年从蜜蜂毒液中分离出的第一个抗菌肽， 4 堕茎查兰婴主翌蒌兰兰些! 茎堡! 堡苎 是蜜蜂毒液的主要活性成分，约占干蜂毒的5 0 ( w w ) ，也是被研究最广泛的生物活性 肽之一。它对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很强的抑制作用。另外它还有抗真菌、抗肿瘤、 抗辐射、抗类风湿关节炎和溶血等活性，因此具有广泛的药理学开发价值。 1 2 蜂毒肽的结构和活性研究 1 2 1 蜂毒肽的结构 1 2 1 1 蜂毒肽的一级结构 最早蜂毒肽是由n e u m a n 等人于1 9 5 2 年用电泳分离得到的。当时它被命名为直接 溶血素f i ( d e r i e th e m o l y s i nf i ) ，以便与“非直接”溶血素磷脂酶a 相区分1 8 】。蜂毒肽最 初被认为是一个单一的肽，以后有报道它至少含有三羊中结构近似的组分，称作蜂毒肽i 、 蜂毒肽i i 和蜂毒肽f 。1 9 6 7 年，h a b e r m a n 等人测定报道了它们的氨基酸组成序列1 9 1 ， 后来又被l u b k e 等人用多肽合成技术所确认1 2 0 l 。 蜂毒肽i 由2 6 个氨基酸组成，分子量为2 8 4 0 ，其一级结构为： n h 2 - g l y - l l e - g l y - a i a - v a l l e u l y s _ v a i - l e u - t h r - t h r - g i y - l e u - p r o - a l a - l e u - i l e - s e r - t r p i l e ( 2 0 ) - l y s - a r g - l y s a r g - g l n - g l n ( 2 6 ) - c o n h z 蜂毒肽i i 由2 7 个氨基酸组成，其分子结构与蜂毒肽i 的区别主要在于2 1 位之后的 氨基酸组成两者稍有不同，它是在纯化过程中作为蜂毒肽i 的污染物而分离出来的。蜂 毒肽i i 的2 1 - 2 7 位氨基酸序列如下： s e r ( 2 1 ) - a r g - l y s - l y s - a r g ( 2 5 ) - g i n - g i n - c o n h 2 蜂毒肽f 是蜂毒肽i 的一个碎片，从n 末端开始比蜂毒肽i 少7 个氨基酸残基， 它可能来源于前蜂毒肽( p r o m e l i t t i n ) 上的一个较小的分裂物【1 9 , 2 1 。在蜂毒液中，蜂毒 肽i i 和蜂毒肽f 的含量很低，主要以蜂毒肽i 的形式存在。 来自不同亚种蜜蜂群的蜂毒肽，它们的一级结构略有区别。但无论何种情况，蜂毒 肽整条肽链都可以分为较长的n 端疏水部分( 1 - 2 0 ) 和碱性的c 一端亲水部分( 2 1 2 6 ) ， 并且，对于肽链构象具有关键性意义的脯氨酸残基总是出现在第1 4 位。 文献中研究最多的是取自西方蜂群的蜂毒肽i ，本文也以此蜂毒肽作为研究对象。 和其它的膜结合蛋白及膜蛋白类似，蜂毒肽的分子主要由疏水性氨基酸组成( 从n - 末 e 塑茎查兰堡主里! 塞生望些! 兰垡! 堡兰 端起前2 0 个氨基酸主要是疏水的) 阎。在蜂毒肽整条肽链中，没有任何酸性基团，只 有6 个碱性正电荷，其中4 个集中在c 端碱性4 肽序列r - k - r - k 另外两个分别是n 一 端胺基和l y s 7 的侧链胺基，从而使蜂毒肽成为强碱性肽。如果把蜂毒肽放到螺旋轮 上，能够看到多肽中极性和非极性氨基酸的不对称分布情况田1 ( f i 9 1 1 ) 。其中非极性 氨基酸聚集在螺旋轮的一侧，极性氨基酸则位于螺旋轮的另一侧。这种被称为“两亲性” 的特征是许多膜结合蛋白的肽链所共有的，这种两亲性的洳螺旋结构被假定为能够穿透 细胞膜1 2 4 - 2 6 。 p l c 1 0 4 c 1 顺序依次减弱。d r a k e ：等1 4 3 认为，这可 能是由于h p 0 4 2 更容易与精氮酸残基中的胍基结合的缘故。y u j i 等 3 s l 还给出了五种单 价阴离子对蜂毒肽聚集倾向的影响顺序：c c l 3 c o o c 1 0 4 c f 3 c o o c l f 。 ( 2 ) 蜂毒肽的晶体结构 在由高离子强度溶液中生长得到的晶体中，蜂毒肽以四聚体聚集态的形式存在畔。4 叼 ( f i 9 1 _ 2 ) 。分析此晶体的x - 射线衍射数据，可以推断溶液中蜂毒肽四聚体的二级结构。 用分辨率分别为2a 和2 5a 的晶体x 射线衍射数据，对晶体中蜂毒肽的构象进行分析 4 5 , 4 6 ，结果表明：晶体四聚体是由相同结构的单链组成，在晶体四聚体中，每条单链均 采取3 6 1 3 0 f 螺旋构象。( f i 9 1 3 ) 南开太学硕士研究生毕业( 学位) 论文 嘉望 芷燃 f i 9 1 2 t h ec o n f o r m a t i o no fm o n o m e r i cs u b u n i t s o fm e l l i t i nf r o mt h ec r y s t a u i n et e t r a m e r f i 9 1 3 i l l u s t r a t i o no f t h ea r r a n g e m e n to f m e l l i t i n 旺- h e l i c a lm o n o m e 瑙i nt h ec r y s t a l l i n et e t r a m e r p r 0 1 4 不含n h ，不能与其前的第四个氨基酸残基t h r l o 的c = o 氧原子形成氢键： n h ； l 一头一 8 堕茎丕兰堡主至塞兰兰些f 兰垒2 笙兰 由于p r o 的空间位阻作用使整条肽链的a 螺旋由此处断开，分成两段a 螺旋： g l y l l e u 9 和l e u l 3 - i l e 2 0 。t h r l 0 ，1 1 和g l y l 2 作为节点。p r o l 4 毗咯环的空间位阻作 用，使t h r l l - g l y l 2 问肽链方向，与正常的a ，螺旋结构中的肽键方向相比较，旋转了1 8 0 度，而l e u 1 3 p r o l 4 间肽键，为了维持i x 螺旋构象的需要，而采取反式构型，如此两 个僻螺旋轴相交成1 2 0 。角( 即两段螺旋的弯折角为6 0 。) ，整个主链的形状就像一根 弯折的圆柱( f i 9 1 3 ) 。氨基酸侧链围绕这根圆柱的分布在极性上是不对称的：十个大的 非极性氨基酸残基，全部隐蔽在弯折圆柱内侧的凹洼处；极性氨基酸侧链和带电荷的氨 基酸侧链，却分布在弯折圆柱外侧的凸面上；c 端的极性六肽序列k r k r q q ，像“尾 巴”一样，游荡在外侧极性部分。从而使整条肽链显示出两亲性( a m p h i p h i l i c ) 特征。 每两条洳螺旋构象的蜂毒肽链，通过非极性侧面的疏水作用，以反平行方式构成一 个亚基( a 链和b 链组成一个亚基，c 链和d 链组成个亚基) 。两亚基同理以垂直正 交形式构成四聚体聚集态 4 6 1 ( f i 9 1 2 ) 。非极性疏水氨基酸侧链包埋于四聚体内部( 作 为疏水性的t r p 残基也被包埋于四聚体内部) ，极性的和带正电荷的亲水侧基暴露于外 部水介质环境中。最近的电荷电荷位置是在a 链和c 链的l y s 2 3 之间，以及b 链和d 链的l y s 2 3 之间，大约为4 - 6 。非极性疏水侧链包埋在内部，可以避免它们与水接触， 而反平行排列则是由于c 端电荷静电排斥的结果。四个m e l i t t i n 分子的四条多肽链以完 整的2 2 2 对称性紧密堆砌在一起。 通过拉曼光谱检测到的蜂毒肽晶体四聚体的螺旋含量h 7 l 约为9 0 ，高于通过c d 光谱检测到的溶液中四聚体的相应值3 5 胡，约为5 0 - - 6 0 。这可能是因为晶体四聚体是 通过非常高的离子强度和多肽浓度得到的f 4 5 】。 ( 3 ) 蜂毒肽在甲醇中的结构 蜂毒肽在甲醇中有中等程度的溶解性( 当p h 值低于n 一端氨基基团的p k a 值时， 约2 0 毫克毫升) 。蜂毒肽在甲醇中以单链和i x 螺旋结构存在1 4 ，艚】。在h - n m r 谱图上， 构成肽链的酰胺键上质子的偶合常数h c h 。和n o e s 值表明了其典型的洳螺旋结构特 征。但t h r l 0 g l y l 2 之间缺乏仅螺旋结构所特有的n o e ( n u c l e a ro v e r h a u s e r e n h a n c e m e m ) 效应，而且t h r l 0 和t h r l l 酰胺质子的偶合常数3 j n h c h 。大于其它残基的 偶合常数3 j n h c h 。值。这些数据都支持了0 【一螺旋结构在p r o l 4 附近的松弛及l e u l 3 - p r 0 1 4 间肽键取反式构型。这与前文中描述的构成蜂毒肽晶体四聚体的单肽链的结构相一致。 在h - n m r 的n o e s y 谱图上1 4 ”，还缺乏较远残基间的n o e 效应，从而不能确定 9 塑茎查兰堡主型塑生兰些! 兰竺2 笙壅 两段螺旋的弯折情况。通过用n o e 距离限定数据，对分子进行分子动态模拟表明：在 分子动力学计算的最后3 0 p s 通过平均结构方法计算单肽链中两段螺旋的弯折角大约为 2 0 。，大大小于测得的晶体四聚体结构中的弯折角6 0 。也就是说，在蜂毒肽分子结 构中，p r o 基团附近并不需要一个大的弯折。 d e m p s e y , c e 【4 8 】通过酰胺置换的方法对蜂毒肽在甲醇中的单分子链作了全面的研 究，得到了分子间氢键的信息，其结论与前面通过h - n m r 方法得到的结果是相同的。 处于n 端序列( 氨基酸残基5 1 1 ) 和c 端序列( 氨基酸残基1 6 2 3 ) 的酰胺键上的h 对溶剂置换是稳定的，表明它们被一个稳定的螺旋结构上的氢键所保护；处于肽段中间 ( 氨基酸残基1 2 1 5 ) 的酰胺上的h 对置换反应有弱的稳定性，表明它们被不稳定的氢 键所保护( f i 9 1 4 ) 。也就是说，蜂毒肽分子n 端和c 端螺旋结构被中间一端柔性序 列所连接。c 端末尾几个氨基酸残基的酰胺键稳定性逐渐降低表明这几个残基由一个松 弛的c t 螺旋结构组成。 j 。二 f i 9 1 4 v a r i a t i o ni nt h es t a b i l i t yo f b a e k b o n ea m i d e so f m o n o m e r i em e l i t t i ni nm e t h a n o l t o e x c h a n g e w i t hs o l v e n td e u t e r o n s , d e m o n s t r a t i n gr a p i de x c h a n g ei nac e n t r a lt u r no f h e l i xa r o u n dt h e p r o - 1 4r e s i d u e l a r g en e g a t i v el o gk m i nv a l u e si n d i c a t es t a b l eh y d r o g e nb o n d s t h er e l a t i v e s t a b i l i t yo f h e l i c a lh y d r o g e n b o n d si s i l l u s t r a t e ds c h e m a t i c a l l ya b o v e ( 4 ) 蜂毒肽与膜结合后的二级结构 蜂毒肽与膜模型磷脂酰胆碱泡囊结合后，用h - n m r 方法对其结构作了研究4 9 。5 1 1 ， 结果与蜂毒肽在甲醇中的构象有基本相同的特征：都采取o t 一螺旋结构；都在螺旋中间部 位缺乏n o e 的连续性，表明了螺旋在残基i i 1 2 附近的松弛现象【4 9 1 。与蜂毒肽在甲醇 1 0 塑茎奎堂堡主堡塞生望些! 堂堡! 堡塞 中的构象相比，与泡囊结合的蜂毒肽其两亲性0 【螺旋疏水侧的酰胺显示了最大的化学位 移变化和最低的酰胺置换速率，表明了：蜂毒肽分子中0 【螺旋结构的非极性一侧面向泡 囊的内部，从而使这一侧的酰胺基团不容易与溶剂发生酰胺置换反应。 1 2 1 3 两亲性a 螺旋结构的重要性 在大量的研究工作的基础上，我们已经比较清楚地了解到蜂毒肽分子的一级结构和 高级结构。其中蜂毒肽分子高分辨率的晶体结构、在低偶电常数溶液( 甲醇) 中的结构 和与泡囊结合后的结构有一个共同点：就是都采取0 【螺旋结构。k a i s e r 和k e z d y t 2 s , s 2 l 认 为形成这种两亲性的二级结构对一些多肽发挥其生理功能是非常重要的。这类多肽有： a p o l i p o p r o t i na - i ，许多荷尔蒙如e n d o r p h i n ，生长荷尔蒙释放因予，e a l c i t o n i n 和蜂毒肽 等。 为了证明这一假设，他们合成了一组多肽，其氨基酸序列被设计成能够形成两亲性 的二级结构。从前人的工作中已知：当去掉蜂毒肽c 端6 个碱性氨基酸后得到的2 0 个 氨基酸片段虽然没有溶血活性但仍然能够与血红细胞结合【5 3 】，所以他们认为这6 个碱 性氨基酸一定有某种对活性位点的结合作用。因此他们就选定了一个模型肽：其从n 端开始的2 0 个氨基酸残基与蜂毒肽序列并无共同点，但是可以达到与蜂毒肽分子类似 的疏水亲水平衡和有强烈的形成螺旋结构的倾向；该模型肽以蜂毒肽的c 端6 肽结 尾。在这个模型肽中，l e u 表示疏水性基团，g i n 和s e r 表示极性基团，用s e r 取代了 原蜂毒肽中的l y s 7 ，以及p r o l 4 ，从而消除了a 螺旋结构的断裂松弛部分。这个模型肽 的仪螺旋轮显示了其两亲性的特征和比蜂毒肽分子更为延伸的疏水性侧面。沉积平衡分 离研究表明：这个模型肽可以在溶液中形成四聚体。c d 光谱研究表明：其四聚体中的 a 螺旋成分为6 9 ，单体中的螺旋成分为3 5 ，高于蜂毒肽分子的相应值：四聚体中 5 0 6 0 ，单体中1 8 。与蜂毒肽分子一样，合成的模型肽可以在空气水界面形成稳定 的单层。单层的破裂压力( 4 5 d y n e s e m ) 高于蜂毒肽的相应值( 2 2 d y n e “c m ) ，表明了 合成的模型肽形成了比蜂毒肽更稳定的两亲性结构。 该模型肽与蜂毒肽一样也是一个强的溶血试剂，并能激活磷脂酶a 2 ，而且其溶血 活性高于蜂毒肽。k a i s e r 和k e z d y 认为：更加延伸的螺旋结构导致了它更强的溶血活性。 如果这个模型肽与蜂毒肽功能上的相似性不是偶然的，那么可以认为：蜂毒肽分子中 2 0 个氨基酸序列只是提供了一个两亲性的结构模型，而并不是说只有这2 0 个氨基酸序 列才能发挥其生理功能。另外，由于p r o 而造成的c 【一螺旋结构的断裂松弛似乎也不是溶 1 l 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 血所必需的。 1 2 2 蜂毒肽的溶血活性和溶血机理 1 2 2 1 蜂毒肽的溶血活性 大量研究表明：蜂毒肽的溶血活性及其它的一些生物活性均起源于它对细胞膜的干 扰作用。在浓度高于1 1 j g m l ( 3 1 0 7 m ) 时，蜂毒肽能迅速与血红细胞结合并且引起 血红蛋白释放到细胞外介质中。研究表明，蜂毒肽是以单分子链的形式( 而不是四聚体 的形式) 与血红细胞结合然后才发生溶血过程的【5 4 1 。从构象研究来看，四聚体表面分 布着大量极性基团，使蜂毒肽分子保持良好的水溶性，因而限制了与膜的直接相互作用。 只有到达细胞膜时，这种四聚体解离成单体，使内埋的非极性的侧面外露，蜂毒肽分子 与膜的相互作用才能发生。在前文已经提到磷酸盐能够诱导蜂毒肽形成四聚体，所以它 在某种程度上抑制溶血过程，当h e 0 4 2 的浓度大于o 5 m 时，溶血作用可以完全被抑制。 用交联剂d i m e t h y l s u b e r i m i d a t e 交联蜂毒肽得到的线性聚合物能够抑制磷酸盐诱导的自 聚发生，保证它以单分子链的形式与血红细胞结合，因此该聚合物在高浓度的磷酸盐溶 液中保持了溶血活性【5 4 】。至于溶血过程的发生是否需要与膜结合的多肽单分子链在膜 上再次缔台。目前还是一个有争议的话题。 1 2 2 2 蜂毒肽的溶血机理 现在普遍认为溶血是通过蜂毒肽分子对双层膜脂织态结构的扰乱引起的。主要有两 种机理模型：1 ) 蜂毒肽分子跨膜形成离子通道，造成膜两侧离子的不平衡，然后发生 胶体渗出性溶血【5 5 】。2 ) 蜂毒肽分子以平行于膜的方式在膜上取向【蚓，疏水的内表面靠 近膜的非极性部分，而l y s 2 3 与g l n 2 6 侧链曲伸向外，避免进入脂相。在膜的织态被扰 动以后，或者由于多肽与膜的不稳定堆积几何导致脂孔穴的自发形成，从而使细胞内物 质泄漏【5 6 】；或者蜂毒肽分子使膜胶束化，在膜上留下了能泄漏细胞内物质的“洞” 5 7 o 1 2 2 3 合成蜂毒肽类似物研究溶血机理 p a d m a j a 和m e r d f i c l d 等【5 3 1 合成了l m e l i t t i n , 、d - m e l i t t i n 、 反向的m e l i t t i n 和乙酰 化的m e l i t t i n ，通过溶血活性检测、c d 光谱分析，导电性测量和能量最小化动力学计算 得出结论：蜂毒肽的溶血机理是形成离子通道。其过程为：1 ) 蜂毒肽单分子链在稀溶 液中以无规线团形式存在，2 ) 蜂毒肽分子通过静电力作用与脂双层表面带负电荷的磷 脂结合，3 ) 发生了重排作用，蜂毒肽分子的亲水侧面与脂双层的极性头组织接触， 1 2 亘墅奎堂堡主堡塞兰兰些! 兰垡! 堡壅 疏水性残基与膜内非极性碳氢链接触，4 ) 分子二聚体插入膜内形成离子通道，然后进 一步形成四聚体、五聚体等齐聚物。f i 9 1 5 更直观地说明上述溶血过程。 o r r a n d o mt m t “) ( - ) i o nc o n 2 0 0 0 2 3 0 0 l o 6 2 3 0 0 4 0 5 1 2 1 2 0 2 0 0 4 8 3 0 0 2 0 0 2 0 0 2 0 0 3 0 0 m ( 1 1 3 ) c a ( 1 1 3 ) 15 0 3518 0 。l e t h a lc o n c e n t r a t i o n sw e r ec a l c u l a t e df r o mi n h i b i t i o nz o n e so nt h i na g a r o s ep l a t e ss e e d e dw i t ht h e c e l l sl i s t e da b o v e bb s u b t i l i sw i t hm e d i u m e 。s r c = s h e e p r e dc e l l s 1 9 9 2 年，m e r r i f i e l d 掣叫又合成了一系列更短的( 由2 0 、1 8 、1 5 个氨基酸组成) 天蚕素a 与蜂毒肽的杂合肽，目的是筛选出结构最简单的多肽，可以更容易被合成， 从而提高其应用价值。其中c a ( 1 7 ) m ( 2 9 ) 、c a ( 1 - 7 ) m ( 4 1 1 ) 和c a ( 1 - 7 ) m ( 5 - 1 2 ) j 精 堕茎查堂堡主堕塞兰望兰兰! 堂堡! 笙苎 最小的尺寸和较高的抗菌活性。作者认为这些只有1 5 个氨基酸的、具有高度o l 螺旋结 构( 肤链的总长度是2 2 。5a ，小于细菌的细胞膜的厚度3 0a ) 的杂合肽，似乎难以采 取跨膜形成离子通道的抗菌机理。可能的解释有：1 ) 肽链不采取a 螺旋结构，而采取 3 ”螺旋结构，这样肽链的总长度就达到3 0a 。2 ) 两个或更多的肽链通过某种非共价 作用连接起来跨过细胞膜。 h o u g h t e n 等【叫合成了2 6 个单个氨基酸被去除的蜂毒肽类似物( 由2 5