（化学工艺专业论文）毛细管电泳电化学发光检测技术的应用研究.pdf

中文摘要 毛细管电泳电化学发光技术，是当今国际分析化学前沿领域中一种极具潜力 的微分离检测技术，它集成了电泳分离的高效、电化学发光检测的灵敏等特点， 主要优势在于：费用低廉、简便快捷、样品用量少、污染小。 本研究的目的在于发展完善毛细管电泳电化学发光检测技术，探索其分析应 用体系，研究新技术和新方法，建立应用于代谢体液中残留药物、中草药活性成 分的检测技术。主要包括以下几方面的内容： 1 采用毛细管电泳与吡啶钌电化学发光( c e e c l ) 检测技术测定药物雷尼 替丁，电化学发光试剂一吡啶钌采用柱后加入的方式。根据标准加入法定量待测 成分，应用于代谢尿液中雷尼替丁的分析，取得了令人满意的结果。 2 发展c e e c l 同时测定中草药洋金花中的两种活性组分的新技术。经验证， 系统检测灵敏度高，样品分离度好。阿托品和东莨菪碱的检测限分别为5 x1 0 8 m 和lxl 旷m ，低于已报道的紫外方法检测限。可以预见，中药提取物特征性的 电泳谱图在中药指纹识别分析方面将具有一定的应用潜力。 3 建立用于中药罂粟中四种成分的c e e c l 分离检测体系。高电导率的离子 液体卜乙烷基一3 一甲基咪唑四氟硼酸盐( e m i m b f 4 ) 作为添加剂加入电泳分离缓 冲液中，用于改善检测灵敏度的研究。采用电迁移进样技术，导致样品区带和运 行缓冲溶液区带问电场强度的明显差异，实现场放大进样效应，提高检测灵敏度。 离子液体c e e c l 技术的应用有望在中药分析领域开拓新的发展空间。 关键词：毛细管电泳、电化学发光、中药、离子液体 a b s t r a c t a c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) w i t he l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n ( e c l ) h a sp o t e n t i a la p p l i c a t i o ni na n a l y t i c a lc h e m i s t r yd u et ob o t ht h eh i g he f f i c i e n c yo f s e p a r a t i o no fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n dt h eh i g hs e n s i t i v i t yo fe c ld e t e c t i o n 1 1 1 e n u m e r o u sa d v a n t a g e so fc e - e c lt e c h n i q u ei n c l u d ef a s ts e p a r a t i o n ，l e s sp o l l u t i o n ， d e c r e a s e dc o s ta n dw a s t ep r o d u c t i o n t h et h e s i si sc o n c e n t r a t e do nt h ed e v e l o p m e n ta n di m p r o v e m e n to fc e e c l s e p a r a t i o n a n dd e t e c t i o n t e c h n i q u e ，e x p l o r i n g i t se x t e n s i v e a p p l i c a t i o n i n p h a r m a c e u t i c a l sa n dh i o c h e m i c a l sa n de s t a b l i s h i n gn o v e ls y s t e m so fc e - e c lf o rt h e d e t e r m i n a t i o no fd r u gf r o mm e t a b o l i z e du r i n ea n dd i f f e r e n ta c t i v ei n g r e d i e n t si n c h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e ，a sd e s c r i b e db e l o w ： 】a n o r i g i n a l m e t h o db a s e do n c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s - e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o nw a su s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fr a n “i d i n e e c le n d c o l u m nd e t e c t i o no fa n a l y t ew a sp e r f o r m e di n5 m mr u ( b p y ) 3 “d e t e c t i o n o f r a n i t i d i n ew a sc o n f i r m e db ys t a n d a r da d d i t i o nm e t h o d ，w h e r et h ei n c r e a s eo f p e a k h e i g h ta tc e r t a i nm i g r a t i o nt i m ew a sd i r e c t l yp r o p o r t i o n a lt ot h em n o u n ts p i k e dw i t h d r u g t h ep r o p o s e dm e t h o dw a sa p p l i e ds a t i s f a c t o r i l yt o t h ed e t e r m i n a t i o no f r a n i t i d i n ei nu r i n e 2 1 1 1 ec o u p l i n go f r u ( b p y ) 3 2 + b a s e de c ld e t e c t i o nw i t hc ew a sd e v e l o p e df o r t h e s i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no ft h et w om a j o ra c t i v e i n g r e d i e n t s i nf l o sd a t u r a v a l i d a t e dm e t h o ds h o w sh i g hs e n s i t i v i t ya n dr e s o l u t i o nf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f a n a l y t ew i t hd e t e c t i o nl i m i t so f5 1 0 一sm o l lf o ra t r o p i n ea n dl x l o 6m o l lf o r s c o p o l a m i n e ，r e s p e c t i v e l y c o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a lc em e t h o d ，t h ep r e s e n tm e t h o d d i s p l a y e dg o o dp e r f o r m a n c ei nt e r m so fs e n s i t i v i t y t h u s , as p e c i a la t t e n t i o ni s f o c u s e do nt h ee l e c t r o p h e r o g r a m s ，w h i c hc a na l s ob e u s e df o r e x p r e s s i n g a c h a r a c t e r i s t i cf i n g e r p r i n tf o rc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n ei nt h ef u t u r e 3 c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，r u ( b p y ) 3 2 + e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c e e c l ) w a se s t a b l i s h e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no ff o u rb i o a e t i v ec o n s t i t u e n t si nc h i n e s e t r a d i t i o n a lm e d i c i n eo p i u mp o p p y a ni o n i cl i q u i d ( i l ) 1 e m y l - 3 - m e t h y l i m i d a z o i u m t e t r a f l u o r o b o r a t c ( e m i m b f 4 ) a sa d d i t i v ew i t hh i g hc o n d u c t i v i t yw a sa d d e di n t o r u n n i n gb u f f e ri no r d e rt oi m p r o v ed e t e c t i o ns e n s i t i v 时o fc e - e c ls y s t e m i lm a d e t h er e s i s t a n c eo fs a m p l es o l u t i o nm u c hh i g h e rt h a nt h eb u f f e ra n dr e s u l t e di na n e n h a n c e df i e l da m p l i f i e de f f e c to fe l e c t r o k i n e t i c i n j e c t i o n ，i m p r o v e dd e t e c t i o n s e n s i t i v i t y i ti se x p e c t e dt h a tc e e c lw i l le x p l o i tan e wa p p l i c a t i o ni nh e r b a l m e d i c i n a la n a l y s i s k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ；c h i n e s et r a d i t i o n a l m e d i c i n e ；i o n i cl i q u i d 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤生盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 陡 签字日期： 谚g 年萝月哆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫鲞盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 按 签字日期：p 拍年g 月j 日 导师签名 羽荔灰 签字日期：少年矿月乃日 第一章文献综述 1 1 引言 第一章文献综述 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 。c e ) 是近二十多年发展起来的一种新 的液相分离技术。与传统电泳相比，毛细管电泳技术的重要进展在于采用了高散 热效率细内径的毛细管，使得高分离电场的引入成为可能，全面改善了分离的质 量，从而推动分析科学从微升水平进入纳升水平。毛细管电泳是经典电泳和现代 微柱分离技术相结合的产物，是继高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 之后，分析科学领域的又一次开拓性贡献。 自1 9 6 7 年n j e n c n 率先提出毛细管区带电泳【l 】以来，这种高效的微分离技术就 吸引着分析领域众多学者的广泛关注1 9 8 1 年j o r g e n s o n 和l u k a c s 采用7 5 1 i m 内径 毛细管柱，获得理论柱效超过4 x 1 0 5 n m ，从而奠定了现代毛细管电泳技术的基 础1 2 4 1 。1 9 8 3 年，h j e r t e n 研究的毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦法陋相继问世， 在大幅度提高分离效率的同时，实现定量操作的自动化。1 9 8 4 年，t e r a b e 6 】突破 传统电泳仅适用于带电粒子分离模式的束缚，用s d s 胶束为准固定相成功地分 离了待测样品中的中性组分，从而建立了胶束电动毛细管色谱( m e c c ) 。1 9 8 8 年， 随着商品化毛细管电泳分析仪器的推出，毛细管电泳分离科学的发展进入了一个 崭新的阶段。 近年来，毛细管电泳与各种检测技术连用，显示了强大的分析能力。分析对 象从无机离子、有机离子、药物，到生命科学的d n a ，蛋白质，多肽，核苷酸， 氨基酸等生物分子。毛细管电泳技术符合以生物工程为代表的生命科学各领域中 的分离分析要求，尤其让人瞩目的是毛细管电泳在人类基因测序工程中的贡献。 勿庸质疑，毛细管电泳技术已经成为2 1 世纪分析化学、生物分析化学中重要的分 离分析技术1 7 j 。 1 _ 2 毛细管电泳分离理论 1 2 _ 1 双电层和z e t a 电势 由界面化学可知，固体与液体接触时，由于固体表面分子离解或表面吸附溶 液中的离子，使得浸没在液体中的所有表面都会形成双电层。 c e 通常采用的是石英毛细管柱，在碱性和微酸性( p h 2 5 ) 溶液中，熔硅表面 的硅羟基( s i o | i ) 电离成s i o - ，使内表面带负电荷，此负电荷称为定域电荷。它吸 引溶液中的正离子形成双电层。双电层溶液一侧由两层组成，第一层为吸附层， 称为s t e m 层或紧密层( c o m p a c tl a y e r ) ，在s t e m 层中与固体表面接触的特性吸 第一章文献综述 附离子是部分脱水的；第二层为扩散层( d i f f u s el a y e r ) ，s t e r n 面外的剩余对 离子构成，其电荷密度随着远离固体表面而逐渐与体相溶液接近。在s t e m 层和双 电层的游离部分起点的边界层之间的电势为管壁f 鬟 z c l a 电势，记作( 约在 o - l o o m v 之间) 。 f i g u r e1 - ! e l e c t r i c d o u b l e l a y e r o f i n n e r w a l l i n c a p i l l a r y 图1 - 1 毛细管内壁双电层示意图删 毛细管内壁熔硅表面上的z e t a 电势正比于它表面上的电荷数与对离子层厚 度的乘积，而电荷数与对离子层厚度又受到对离子的性质、缓冲液p h 值、缓冲 液中阳离子和熔硅表面间平衡等因素的影响。处于扩散层中的阳离子，在外加电 场作用下，朝向阴极与s t e r n 层作相对运动。由于这些阳离子是溶剂化的，当它 们向阴极运动时，携带着周围的溶剂一齐迁移由此而形成电渗流( e o f ) 。管壁电 荷密度和双电层厚度的关系可用公式表示如下： a e o = d 国佬( 1 一1 ) 式中：为溶液的介电常数，如d 管壁电动势，d 为双电层厚度( 一般为1 - l o n m ) ，0 为 管壁定域电荷面密度。 毛细管壁上的z e t a 电势是c e 的一个重要参数，对控制电渗流，优化c e 分 离条件有实际指导意义。 1 2 2 电泳和电渗 毛缅管电泳指以高压电场为驱动力，以毛缅管为分离通道，依据样品中各 组分之间淌度和分配行为上的差异而实现的一类液相分离技术。 毛细管中荷电粒子的迁移行为取决于电泳( e l e c t r o p h o r e s i s ) 和电渗 第一章文献综述 ( e l e c t r o o s m o s i s ) 两个因素。在电解质溶液中，带电粒子在外电场作用下，向其 所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳；电渗是指体相溶液在外加电场作用下整体 向着同一个方向运动的现象。在不考虑相互作用的前提下，粒子在毛细管中的实 际流速矿是泳流速度 0 和渗流速度p k 的矢量和。即： 矿= + ( 1 - 2 ) 其中哟粒子的有效速率，为电泳速度，为电渗速度。 电渗流的速度通常是电泳流速度的5 - 7 倍。因此，毛细管中核电粒子的迁移 速度主要受由电渗控制，然而实现多种样品分离却是基于各个待钡4 成分在毛细管 中泳流速度的差异。 图1 2 施加高压后毛细管通道内的电泳与电渗 f i g u r ei - 2e l e c 仃o p h o r e s i sa n de l e c t r o o s m o s i si nc a p i l l a r ya tt h es e p a r a t i o nv o l t a g e 分离毛细管中，正离子的运动方向和e o f 一致，最先流出；中性粒子的泳流 速度为“零”，随e o f 而行：负离子运动方向和e o f 相反，当e o f 速度大于电泳 速度时，它在中性粒子之后流出，反之则无法流出。带同种电荷具有不同荷质比 的混合物，若所带电荷为正，则荷质比大者最先分离：若所带电荷均为负值，则 荷质比大者展后泳出。 ( 1 ) 电泳 对于给定的离子在分离介质和操作温度条件固定时，电泳淌度是一常数。电 泳淌度的差异，构成了电泳分离的基础。在电场作用下荷电粒子的电泳迁移速度 匕由下式决定： k 2 p e p e ( 1 3 ) 第一章文献综述 其中e 为电场强度：为表示溶质的淌度，即溶质在给定缓冲液中单位时间 间隔和单位电场强度下移动的距离。在充满自由溶液的开口管中粒子的淌度可近 似地表示为【9 1 ： p 0 8 磊7 4 月i 卜4 ) 式中f 为流体的介电常数： “是粒子的z e t a 电势( 这里特指粒子外“固定”离子切平面和离得最近的游离离子边界 层之间的电势) ： 目是介质的粘度。 因为z e t a 电势的大小和粒子表面的电荷密度有关，所以不同离子可能按照它 们表面电荷密度的差别以不同的速率在电介质中移动，最终达到分离。 ( 2 ) 电渗 石英毛细管柱内，由于硅羟基发生电离而使其内表面带负电，和溶液接触 时形成了一双电层。在高电压作用下。双电层中的水合阳离子驱动流体整体地朝 负极方向移动，形成电渗流。 与电泳淌度类似，e o f i 黝嫒# 。可表示为： a 一t ”j 7 ( 卜5 ) 电渗流是毛细管电泳中的基本操作要素，由于受电场强度、毛细管材料、缓 冲液p h 值、缓冲液成分与浓度、添加剂和温度等因素的影响，因此可以利用不 同方法对e o f 的大小和方向进行控制，以改善c e 的分离效率，提高选择性和分 离度，优化分离条伊。 理论上，凡能影响电渗的因素都有可能用于电渗的控制，理想的电渗控制方 法不仅能稳定电渗，而且能调节电渗的大小和方向，目前控制电渗流最基本的方 法有： ( 1 ) 调节电场强度。增加分离场强可以提高电渗速度，提高样品的分离效 率。 ( 2 ) 改变缓冲液p h 、离子强度或缓冲液浓度。 缓冲溶液的p h 是通过改变毛细管壁集团的解离度来影响电渗的，它的影响 只体现在电渗大小的变化上，并不能改变电渗的方向。离子强度或缓冲液浓度一 般通过影响双电层来影响电渗，基本原理为：离子浓度升高导致双电层变薄，电 渗下降。与p h 对屯渗的影响相比，离子强度对电渗的影响相对较小，基本趋势 是过高或过低的离子强度都不利于提高样品的分离效率。 ( 3 ) 选择柱温度，改变粘度。 增加柱温会导致缓冲溶液的粘度下降，管壁硅羟基的解离能力增强，从而提 第一章文献综述 高电渗。通常大多数样品要求在常温下电泳分离，只有某些糖类需要满足高温柱 内分离。然而过高柱温会影响样品分离效率，限制高压的使用。 ( 4 ) 添加有机溶剂、表面活性剂。 有机溶剂作为一种改性剂，可以改变分离毛细管内壁和运行缓冲液的性能。 毛细管电泳最常用的有机添加剂是甲醇和已腈，有机溶剂的加入不仅会使柱内双 电层变薄导致电渗降低1 1 1 i ，而且还可以对疏水溶质起到增溶的作用。 表面活性剂可分为离子型和非离子型两类。电泳分离常用阳离子表面活性剂 做电渗的改性剂，如季铵盐【1 2 。1 4 l 和氟化阳离子表面活性剂等6 l 。溶液中的阳离 子表面活性剂是通过与管壁电荷的静电作用来抑制电渗的，随着阳离子表面活性 剂浓度的增大、表面活性剂链长的增加，电渗逐渐减少直至反向。 ( 5 ) 管壁涂层改性毛细管内壁。 添加剂涂层技术通常分为物理涂层技术和化学涂层技术两类。两类涂层均可 以实现电渗的改变。物理方法必须使用高粘合力的高分子化合物才能形成稳定的 涂层，如环氧树脂等。而化学涂层技术的研究目前已有了新的进展，化学键合的 目的不再是单纯的为了控制电渗，克服某些生物大分子的吸附已经成为涂层技术 的一种衍生技术。 以电场力驱动产生的e o f ，与h p l c 中靠外部泵压产生的液流不同。e o f 的 流型属扁平流型( f l a tf l o w ) ，而h p l c 的流型则是抛物线状的层流( 1 a m i n a rf l o w ) 。 扁平流型不会引起样品区带的增宽，这是c e 获得高分离度的重要原因之一”】。 图1 3 电渗流柱塞状平流型( a ) ( 电泳) 泵推动的抛物线形层流( b ) ( 色谱) f i g u r e l - 3f l a tf l o wo f e l e c t r o o s m o s i si ne l e c u o p h o r e s i s ( a ) a n dl a m i n a rf l o wf o r c e db yp u m pi n h p l c ( b ) 1 2 3 分离效率与分离度 毛细管电泳分离的基础是溶质电迁移速度的差异，毛细管电泳沿用色谱的理 第一章文献综述 论塔板数 1 0 7 ) 。凝胶是毛细管电泳的理想介质，由于凝胶粘度大，故能减少溶质的 扩散，具有抗对流、阻挡毛细管壁对溶质的吸附等作用，而且还可减少甚至忽略 电渗流的影响。采用c g e 分离样品，所得峰形尖锐，可以达到c e 中最高的柱效。 c g e 的缺点在于凝胶柱制备困难。 1 9 8 3 年，h j e r t e n 首先将传统的聚丙烯酰胺凝胶用于c e f 2 舶，成功地分离了多 种蛋白质1 2 3 , 2 。 。c g e 与激光诱导荧光检测技术的结合，在d n a 序列分析中显示 了速度和效率方面的优越性【2 5 】。 某些高分子聚合物的水溶液代替凝胶的技术就是无胶筛分，相对凝胶分离技 术而言，无胶筛分的分离效率略低。 1 3 4 毛细管等速电泳( c i t p ) 毛细管等速电泳( c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i sc 1 1 n 是基于试样中各组分在二种 电解质中电泳迁移率的差异而进行分离的一种电泳技术【2 6 1 。其中一种电解质是迁 移率较高的前导离子电解质溶液；另一种是迁移率较低的尾随离子电解质溶液， 样品离子的淌度介于两者之间。当加上电场后，由于各种离子迁移率不同，电解 第一章文献综述 质溶液将形成由负极到正极增加的离子浓度梯度而电位梯度与电导率呈反比， 故低浓度离子区即低电导区有较高的电位梯度。由于离子的迁移速度与电场强度 呈正比，随着电泳的进行，离子进入等速状态，此时形成紧紧相邻而又彼此完全 分离的单组分区带。 c i t p 不能对阴离子和阳离子进行同时分离，但可通过控制p h 值。改变任意 两种离子间的分辨率，可观察到指纹区物质的微小变化。 1 3 5 毛细管等电聚焦电泳( cl e f ) 毛细管等电聚焦电泳( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c l e f ) 是基于两性电介 质在分离介质中的迁移形成p h 梯度，使具有不同等电点的物质聚集在不同的位 置上，在毛细管中等电点聚焦，形成明显的区带。c l e f 常用于蛋白的分离，由 于有极高的分辨率，通常可以分离等电点差异小于0 0 1 p h 单位的两种蛋白。 1 3 6 毛细管电色谱( c e c ) 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l c c t r o c h r o m a t o g r a p h y , c e c ) 是毛细管电溶与h p l c 技术结合的产物。它通过在毛细管中填充或在毛细管中涂布、键合色谱固定相， 依靠电渗流推动流动相，使中性和带电荷的样品分子根据他们在色谱固定相和流 动相间的吸附、分配平衡常数的差别及电泳速率的不同而达到分离的一种分析模 式【2 7 】。 毛细管电色谱不仅具有高效毛细管电泳的高柱效，同时还具备h p l c 的选择 性。既克服了c z e 选择性差和分离中性化合物困难的弱点，又克服了m e c c 胶 束选择有限的缺点。 毛细管电色谱柱的制备是毛细管电色谱分离分析中一个极为重要的环节，因 为包括柱的重复性、柱寿命、柱效在内的几项柱性能指标是实际应用最关键的指 标，也是毛细管电色谱分离分析的基本指标。 毛细管枉的类型分为：填充柱毛细管电色谱；开管柱毛细管电色谱。毛细管 电色谱的分离柱效比高效液相色谱法高的根本原因在于，电渗泵导致塞子式流形 的产生。 1 3 _ 7 亲和毛细管电泳( a c e ) 亲和毛细管电泳( a f f i n i t yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a c e ) 是基于配体和受体 之间相互作用的差异，研究生物分子间特异性相互作用，提高毛细管电泳分离选 择性的一种新型分离技术。a c e 分离的对象主要为生物大分子，其原理是依据蛋 白、核酸等生物大分子能够与配体通过静电疏水、氢键等非键作用结合在一起， 第一章文献综述 形成不同荷质比的配合物。特异性高，可逆性强是这种特异性作用的突出特点。 亲和毛细管电泳的应用研究主要集中在两个方面： 一是研究受体与配体之间的特异性相互作用，获得热力学与动力学等参数； 二是利用这种特异性相互作用提高毛细管电泳分离的选择性。 1 4 毛细管区带电泳的几个操作参数 在众多的电泳分离模式中，毛细管区带电泳是最简单的，也是运用最为广泛 的一种分离模式。分离毛细管两端与管中缓冲液成分保持一致，缓冲液组分简单， 操作相对便捷。c z e 的分离对象是包括无机，有机物在内的众多荷电物质，各种 物质因具有不同迁移速率而实现分离。 毛细管区带电泳的分离需要控制几个电泳参数，主要包括操作电压、缓冲液 种类及其p h 值和浓度、添加剂等。样品分离条件的选择需要通过对上述电泳参 数实施优化，电泳参数的选取的具体操作归纳如下： 1 4 1 分离电压 c e 技术优于传统电泳技术的主要方面在于细内径毛细管的应用成为可能， 具有大面积体积比的毛细管可以有效的散热，因而能使用更高的外加电压，提 高了样品的分离效率，缩短了分析时间。 分离体系最佳外加电压值的选取主要受三个因素的制约： ( 1 ) 缓冲溶液浓度( 离子强度) ； ( 2 ) 分离毛细管内径大小； ( 3 ) 分离毛细管的长度。 实验中，我们通常在固定毛细管内径、柱长之后来选择最佳电压。 随着操作电压的增加，电渗流和电泳流速度的绝对值都相应增加，样品迁移 时间缩短，尽管电泳流速度的增加视粒子所带电荷而异，但由于电渗流速度一般 远大于泳流速度，因此表现为粒子的总迁移速度加快。在升高电压的同肘，毛细 管柱内的焦耳热增加，缓冲液的粘度减小，而粘度和温度之间呈指数型变化，因 此操作电压和迁移时间为非线性关系，表现为电压高时速度增加更快一些。在一 定范围内柱效随电压的增加而增大，过了临界值后，随着电压的升高，焦耳热的 影响加剧，柱效反而下降，而l 临界值的具体位置视系统和组分而异。 1 4 2 缓冲溶液 缓冲溶液作为毛细管中直接作用于待分析物质的介质，在c z e 的分离中担当 着相当重要的角色。缓冲溶液类型、浓度和p h 不仅影响毛细管内的e o f ，亦影响 第一章文献综述 待测样品的电迁移行为，决定着c z e 分离效率、选择性、分离度的好坏以及分 析时间的长短，在c z e 分离条件优化中具有重要意义。目前，背景电解质的选 择尚无严格规则可循，但通常应满足如下几个条件 2 s l 。 ( 1 ) 为保证分离的稳定和数据的重现，要求缓冲溶液有一定的p h 调节范围， 并在该p h 范围内有足够的缓冲容量。 ( 2 ) 浓度高而产生电流小的缓冲溶液是c z e 分离的首选。因为浓度高可以提 高分离度，电流小可允许使用较高的外加电压。 ( 3 ) 缓冲溶液的表观淌度尽量接近样品溶质的淌度，否则会引起样品区带发 散。 ( 4 ) 某些情况下对缓冲溶液应有特殊要求。例如，在多元醇和糖类化合物的 分离过程中，可以采用硼酸盐缓冲溶液与样品发生络合反应，使中性的分子形成 阴离子从而得到分离。 缓冲溶液p h 值影响着熔硅毛细管壁的表面特性。在高p h 值下，s i - o h 基电 离趋于饱和，e o f 达到最大且变化平缓，而在低p h 值，电离受到抑制，e o f 接 近零。因此，缓冲溶液p h 成为影响泳出时间重现性的关键参数。 离子的电泳淌度正比于它的有效电荷。离子的有效电荷受操作缓冲溶液p h 的影响，因此，缓冲溶液p h 的调节与控制也是优化分离的重要对策。如：缓冲 液对生物大分子分离的影响是通过控制其解离程度及带电性质来实现的，溶液p h 值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳速度也就越快，尤其对于蛋 白质等两性分子，缓冲液p h 还会影响到其电泳方向，当缓冲液p h 大于蛋白质分子 的等电点，蛋白质分子带负电蘅，其电泳的方肉指肉正极。为了保持电泳过程中 待分离生物大分子的电荷以及缓冲液p h 值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离 子强度。 对于含有几种成分共存体系的分离，分离度的优劣是毛细管电泳分离成败的 关键。若它们带有同种电荷且电泳淌度相近，则需要通过调整缓冲溶液的p h ， 在它们的p k a 值附近搜寻可以产生最佳分离度的条件。 一些常的毛细管电泳分离缓冲溶液, 及p k a 值见表1 - 2 。 第一章文献综述 表卜2 常用缓冲液及其p k a 值1 2 l l t a b l e1 - 2c o m m o n l yu s e db u f f e rw i t hp z a 缓冲溶液b u f f e r p k a 磷酸盐p h o s p h a t e 2 1 2 柠檬酸盐c i t r a t e 3 0 6 甲酸盐f o r m a t e 3 7 5 琥珀酸盐s u c c i n a t e 4 1 9 柠檬酸盐c i t r a t e 4 7 4 醋酸盐a c e t a t e 4 7 5 柠檬酸盐c i t r a t e 5 4 0 琥珀酸盐s u c c i n a t e 5 5 7 2 - ( l 吗啡啉) 乙磺酸m e s6 ，1 5 a d a6 6 0 咪唑i m i d a z o l e7 o o 磷酸盐p h o s p h a t e 7 2 l 批( 2 羟乙基) 哌嗪：( 乙磺酸) h e p e s 7 5 5 - 三( 羟甲基) 甲基甘氨酸t r i c i n e 8 1 5 三羟甲基氨基甲烷t r i s 8 3 0 吗啉m o r p h o l l n e 8 4 9 磷酸盐p h o s p h a t e 7 2 l - ( 2 羟乙基) 哌嗪- 乙磺酸) h e p e s 7 5 5 三( 羟甲基) 甲基甘氨酸t r i c i n e 8 1 5 三羟甲基氨基甲烷弼s8 t 3 0 吗啉m o r p h o l i n e 8 4 9 硼酸盐b o r a t e9 2 4 c h a p s o9 6 0 磷酸盐p h o s p h a t e 1 2 3 2 与p h 的影响相比，缓冲溶液浓度对样品分离的影响比较复杂。但是基本的 趋势是：在恒定p h 下，e o f 速度随浓度增大而减小，不管电泳淌度如何变化， 电渗流总是大于电泳流，因此在其它分离条件固定不变时，溶质的泳出时间都随 缓冲溶液浓度增加而延长长，分离因子得到改善。 选择缓冲液时还应当考虑是否会对检测构成干扰，如t r i s 和硼酸盐，因它们 第一章文献综述 自身分子较大，可以在高浓度时使用而不会产生大的电流，常用作生物缓冲液， 但它们有强的紫外吸收，因此不能用于紫外检测体系。 1 4 3 缓冲溶液的添加剂 在c z e 分离中，除了背景电解质外。常常还在缓冲溶液中添加某种成分， 通过它与管壁或与样品溶质之间的相互作用，改变管壁或溶液物理化学特性，提 高分离选择性和分离度，进一步优化分离条件。常用添加剂有如下几类： ( 1 ) 表面活性剂，如季铵盐等； ( 2 ) 有机溶剂，如甲醇、乙腈等； ( 3 ) 两性离子，如三甲铵基内盐； ( 4 ) 金属盐，如k 2 s o + ，l i c i 等； ( 5 ) 手性试剂，如环糊精、冠醚等： ( 6 ) 其它试剂，如尿素、线性聚丙烯酰胺等。 毛细管缓冲液中添加剂的作用依据其种类、特性及所应用的分离体系可分为 如下几种： ( 1 ) 抑制电渗流的大小，控制其方向，从而增强样品的分离选择性，提高多 种样品共存体系的分离度。 ( 2 ) 动态修饰管壁，以达到抑制管壁的吸附，防止区带展宽，提高分离效率 和重现性的作用。这对于荷电的生物大分子的分离尤为重要。 ( 3 ) 稳定溶质的结构，增加疏水溶质的溶解度 ( 4 ) 扩大分离范围， 如添加手性试剂对手性物质迸行分离，加入络合剂分 离中性成分 1 5 毛细管电泳的检测方法 c e 仪器的功能与应用范围，在很大程度上依赖于c e 检测器的性能，因此c e 检测方法的研究和检测器的开发一直是分析领域的热点。毛细管电泳技术发展初 期，j o r g e n s o n 就曾指出，c e 技术的广泛应用与深入发展所面临的主要挑战是 高灵敏度和多模式检测器的发展。由于毛细管内径极小进样量有限，因此具有高 分离效率的毛细管电泳微分离体系为与之相匹配的检测技术提出了更高的要求。 为了适用c e 微体积在柱检测的要求，人们作了大量卓有成效的研究，发展了许 多类型的检测器。 1 5 1 紫外吸收法 基于朗伯比尔定律的u v - 可见吸收法是c e 分离中一种常用的检测方法。 第一章文献综述 由于通用性好，结构简单，加上商品吸收检测器已达到较高性能，因此，u v - 可见吸收检测器是目前应用最广泛的一种c e 检测器。现在商品化紫外可见吸 收检测仪器的技术已相当成熟。 f i g u r e1 - 4d e t e c t i o nc h a r to f o n c o l u m nd e t e c t i o nw i t hc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 图卜4 毛细管电泳柱上紫外检测图示 2 l l 紫外吸收法常采用柱上检测( o n c o l u m nd e t e c t i o n ) 方式( 如图l - 4 ) ，在毛 细管出口端适当位置除去聚酰亚胺涂层，使透明部位对准光路即可实现对待测样 品区带的柱上检测。该检测模式虽然简便易行，但是毛细管的短光程却严重限制 了分析检测的灵敏度，无法满足低浓度含量样品的分析需求。为此，人们做了大 量的研究工作以改善检测的灵敏度 2 9 , 3 0 i ，用高能量的氙灯或激光做光源、引进光 纤、光电二极管阵列、聚焦、快速扫描等技术以及使用矩形池、泡型池和z 型池 或多次反射的方法来增加光程，提高灵敏度，降低样品检测限。 1 。5 。2 激光诱导荧光检测法 激光诱导荧光( l a s e ri n d u c e df l o u r e s c e n c e ，l i f ) 技术是一种在气体、液体和 固体测量中有着广泛应用的光学技术，是目前最灵敏的检测方法之一。大多数情 况下，l i f 的检测限为1 0 4 0 1 0 0 2 m o l l ，比常规的u v _ 可见吸收法低5 6 4 数量 级。高灵敏度的检测方法意味着可以与更小内径的毛细管相匹配，容许施加更高 的分离电压，获取更高的分离效率。也预示着该检测技术可以成为极低浓度或极 微量样品乃至单细胞生物样品分离检测的强有力工具。 自g a s s m a n 首次将l i f 弓 入毛细管电泳检测后【3 l 】，l i f 检测器就成为毛细管电 泳检测器中灵敏度最高的一种模式。激光光源的优点是光可聚焦到接近衍生极 限，通过光纤或合理的光学设计可以非常便利的将激光聚集在毛细管中心，有效 提高了光的激发效率，减少了不必要的光散射。 第一章文献综述 与米氏散射、瑞利散射和拉曼散射不同。激光诱导荧光过程不是一个散射过 程，而是一个波长的吸收和转化过程。照射光激发分子发出更长波长的光，不同 分子发光光谱是不一样的，应用这一原理就可以根据分子的特征谱线来探测和鉴 别不同分子。由于只有在照射光波长与被测分子的吸收能级匹配的时候，才能产 生荧光信号，所以根据不同应用，需要选择不同的激光器或使用可调谐激光器或 者针对特定激光选择合适的示踪材料。 由于许多化合物荧光量子产率很低，且多数本身不具有荧光，特别是氨基酸、 多肽和蛋白质等生物分子的检测常需要借助衍生技术( d e r i v a t i z a t i o n ) 或标记技 术( 1 a b e l i n g ) ，因此衍生技术在荧光检测中就显得极为重要。常用的衍生技术按 照衍生过程分为柱前( p r e c o l u m n ) 、柱后( p o s t c o l u m n ) 和在柱衍生( o n - c o l u m n d e r i v a t i z a t i o n ) 模式。 l i f 检测器的局限性在于：自身体积较大，结构复杂，部件要求较高，成本 较高。且因受到激发波长及荧光试剂的限制，通用性也较差。 1 5 3 折射指数检测法 溶液的折射指数( r e f r a c t i v ei n d e x r j ) 通常与溶液组成，浓度及温度有关，l u 检测可基于光热效应诱导温度变化、待测溶液组成的差别和溶质的浓度变化来进 行。与其它类型检测器相比，l u 检测器结构简单、造价低廉、适于微体积和微 柱检测，具有非破坏性和通用性强等优点。由于检测器的灵敏度较低，易漂移， 因此研究的重点在于发展高灵敏度应用于微体积的l u 检测法。 1 5 4 质谱检测法 质谱法( m a s ss p e c t r o m e t r y ，m s ) 是一种灵敏度高、专属性强、可提供样 品结构信息非常理想的检测手段。m s 的高鉴定能力与c e 的高效分离相结合， 可用n i 级样品进行元素含量测定、结构分析和分子量的准确测定，是微量样品 分离分析的强有力工具。在地质样品年代考证、药品监测、药物开发、化学及药 物产业的过程监控等方面，质谱分析发挥了重要的作用。 c e 和m s 已有成熟的商品仪器，c e - m s 分离检测仪的关键部件在于二者联用 的接口。如何保持c e 的分离效率，满足m s 分析进样要求，达到m s 仪器的质量 分辨率和检测灵敏度，则取决于接口性能的完善。 近年来，关于毛细管电泳分离与质谱联用接口设计被大量报道，较成熟的接 口有点喷射接口、连续流一快原子轰击接口( c o n t i n u o u sf l o w - f a s ta t o m b o m b a r d m e n t ，c f f a b ) 和离子喷射接i ：1 ( i o n s p r a y 。i s ) 等。c e m s 联用技术在微量 生物高聚物的结构解释方面发挥了重要的作用。可以预见，随着接口技术的日臻 ” 第一章文献综述 成熟，m s 将会成为c e 的理想检测器。 1 5 。5 电化学检测法 与其它检测方法相比，电化学检测技术特有的优势在于：质量检测限低，线 性范围宽，选择性好，而且设备简单，价格低廉，便于推广使用。根据检测原理 的不同，电化学检测可分为电导检测，电位检测和安培检测三种模式。 电位检测的基础是电极电势的能斯特公式。当待测电泳组分区带流经电极表 面时，引起电势的变化，记录其随时间变化的曲线即得到电泳谱图。电位检测法 的特点是简单快捷、线性范围宽，可以同时测定无机和有机离子。但是，由于灵 敏度低、重现性较差使得该技术在c e 中的应用受到一定限制。 电导检测器一般采用两个相对的指示电极检测水溶液中离子型溶质的电导， 记录电导随时间的变化即得到电泳的分离谱图。由于电导检测器使非选择性检测 器，信号来自载体电解质离子和溶质离子的电导之差