（食品科学专业论文）不同成熟度烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究.pdf

郑州烟草研究院硕士毕业论文 摘要 本文对不同成熟度烤烟中的多种重要挥发性酸碱性香味成分进 行了分析研究。采用p h 为1 4 6 条件进行同时蒸馏萃取结合g c m s 法对酸性香味成分进行了分析；采用同时蒸馏萃取结合g c 法及 g c m s 法对碱性香味成分进行了分析。总共分析测定了1 4 种酸性香 味成分和1 3 种碱性香味成分。结果表明，大多数酸性香味物质随烟 叶成熟度提高，其含量增加；酸性香味成分的总含量则以成熟( 上部) 和过熟( 中部) 烟叶为最高。碱性香味物质中，无论上部烟叶还是中 部烟叶，在成熟过程中，毗嗪类成分含量都很低，且变化无明显规律， 上部叶总量略有降低，而中部叶总量呈锯齿形降低；毗啶类成分含量 较多，在烟叶成熟过程中，总量是逐渐增加的。碱性香味成分总量与 吡啶类物总量变化趋势相似。 不同成熟度烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究 a b s t r a c t i nt h i sa r t i c l e ，s o m ei m p o r t a n tv o l a t i l ea c i d i ca n db a s i cc o m p o n e n t s o fh e n a nf l u e c u r e dt o b a c c ol e a v e sw i t hd i f f e r e n tm a t u r i t i e sf r o mt h e m i d d l ea n du p p e rs t a l k p o s i t i o nw e r ea n a l y z e da n ds t u d i e d t h e a c i d f l a v o rc o m p o n e n t sw e r es e p a r a t e dw i t hs i m u l t a n e o u ss t e a md i s t i l l a t i o n a n do r g a n i cs o l v e n te x t r a c t i o nm e t h o du n d e rp h _ 1 4 6c o n d i t i o n ，a n dt h e n i d e n t i f i e da n dq u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n e db yc a p i l l a r yg c m s t h eb a s i c f l a v o rc o m p o n e n t sw e r es e p a r a t e dw i t hs i m u l t a n e o u ss t e a md i s t i l l a t i o n a n d o r g a n i c s o l v e n te x t r a c t i o n m e t h o d ，a n d t h e ni d e n t i f i e d a n d q u a n t i t a t i v e l y d e t e r m i n e db yc a p i l l a r yg ca n dc a p i l l a r yg c m s at o t a l o f14i m p o r t a n ta c i df l a v o rs u b s t a n c e sa n dat o t a lo f13i m p o r t a n tb a s i c f l a v o rs u b s t a n c e sw e r es t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ，w i t ht h el e a f m a t u r i t yp r o g r e s s i n g ，t h ec o n t e n t so f m o s ta c i df l a v o rs u b s t a n c e ss h o wa n i n c r e a s i n gt e n d e n c y a n dt h et o t a lc o n t e n to fa c i df l a v o rs u b s t a n c e si s h i 曲e s ti nt h er i p et o b a c c ol e a f ( u p p e rs t a l kp o s i t i o n ) a n di nt h eo v e r r i p e t o b a c c o l e a f ( m i d d l e s t a l k p o s i t i o n ) m e a n w h i l e ，p y r a z i n e s h a v el o w c o n t e n t sa n d u n c o n s p i c u o u sc h a n g e t e n d e n c y a st h el e a f m a t u r i t y p r o g r e s s i n g t h et o t a lc o n t e n t o f p y r a z i n e so f t h el e a v e sf r o m u p p e rs t a l k p o s i t i o ns h o w s as l i g h td e c r e a s et h o u g ht h eo n eo ft h el e a v e sf r o mm i d d l e s t a l k p o s i t i o n h a sah a c k l i n gt e n d e n c y ；p y r i d i n e sh a v em u c hh i g h e r c o n t e n t sa n ds h o wa n i n c r e a s i n g c o n t e n t s d u r i n g t h el e a f m a t u r i t y 4 郑州烟草研究院硕士毕业论文 p r o g r e s s i n g t h e t o t a lc o n t e n to fb a s i cf l a v o rc o m p o n e n t ss h o w sas i m i l a r t e n d e n c ya n d h a sa s i g n i f i c a n ti n c r e a s ei nt h eo v e r r i p el e a v e sa st h et o t a l c o n t e n to f p y r i d i n e s 5 不同成熟度烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究 1 引言 烤烟作为卷烟原料的一种叶用经济作物，掌握其成熟特征并适 时采收，对提高烟叶和卷烟品质有重要意义。目前，烟叶成熟度已成 为烟叶质量的中心内容，是烟叶优质生产的第一准则，国际烤烟标准 普遍将其作为第一质量要素。成熟度是烟叶质量的核心。 烟叶成熟度对烟叶外观和内在质量都有极其重要的影响，成熟 度不同，烟叶的形态结构、身份、油分、色泽等不同2 。6 】。掌握好烟 叶成熟度是烤好烟叶的先决条件。烟叶充分成熟是获得优良品质和香 味的最本质的要求l4 1 。成熟烟叶可产生醇和、舒适的香味，而不成熟 的烟叶青杂气味重。在品种和栽培条件相同情况下，成熟度好的烟叶， 香气和香味都较理想吲。烤烟生产实践证明，提高烟叶成熟度是提高 烟叶香气质、香气量的行之有效的措施嘲。从烟叶可用性的观点来说， 左天觉博士认为，在其总变数的作用中，烟叶适熟采收要占三分之 一，田间生产和管理以及调制各占三分之一，可见成熟度对烟叶可用 性的重要。朱尊权院士【弘9 峙旨出，就国际烤烟的可用性来讲人们越来 越重视其成熟度，可用性好的烟叶是成熟度好、烟碱中等、能保持香 味特性的烟叶。成熟完好的烟叶，细胞发育充分、孔隙较大、烟叶组 织结构疏松、填充性好、燃烧性得到改善、叶中含糖量降低而烟碱含 量略有增加，这些变化既有利于降低焦油量，又显著增强香味浓度， 使青杂气和刺激性相对减轻，这些都有利于提高烟叶的可用性。人们 对烟叶的成熟过程和不同成熟度烟叶的化学组成所作的大量检测和 分析研究工作，对认识烟叶成熟度极其化学特性，以及提高烟叶质量 郑州烟草研究院硕士毕业论文 和卷烟质量起着重要作用。 烟草中的化学成分，主要包括碳水化合物及其相关物质、含氮化 合物、有机酸及其衍生物，其它有机和无机成分等。由于不同成熟度 烟叶的化学组成不同，而烟叶化学成分又决定烟叶的内在质量，所以 分析研究烟叶成熟过程中这些成分组成的变化一直是烟草工作者感 兴趣的问题。烟叶成熟过程中主要常规化学成分如总糖、总氮、烟碱、 各种含氮化合物等的变化，人们已作了大量工作，有了基本认识，已 有许多论述。对烟叶成熟过程中香味物质组成变化的分析研究则不 多，近年才有一些比较深入的研究。 香味物质是烟叶品质的主要指标之一，它与成熟度之间的关系一 直是人们关心的问题。由于烟叶香味成分的组成极其复杂，且含量甚 微，尽管很早就有科学工作者对其进行了相关研究，但人们对它们的 认识仍较肤浅，直到2 0 世纪5 0 。6 0 年代以后，随着现代分离分析手 段的发展，人们对烟草香味物质的研究与认识才逐渐深入。而对不同 成熟度烟叶香味物质组成的分析研究，至今所作的工作不多，早期主 要关心的是含量较多的认为与香气有关的一些物质和香气前体物，如 石油醚提取物、酚类物质、色素类等1 1 0 】。石油醚提取物及酚类物质随 成熟度的提高有所增加，当烟叶成熟时含量最高。叶绿素和类胡萝卜 素含量在烟叶成熟过程中是逐渐降低的，且随着成熟度的提高，下降 速度加快】。1 9 9 1 年，王瑞新0 2 1 等研究了不同成熟度的n c 8 9 中部 烟叶香味成分的变化。结果显示，随着成熟度的提高，烟碱、棕榈酸、 2 ，7 ，1 2 西柏三烯一4 ，6 ，1 1 三醇等成分含量逐步增加。1 9 9 3 年， 不同成熟度烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究 刘百战和冼可法f 1 3 1 在对云南烤烟上部叶成熟度与某些重要中性香味 成分组成关系的研究中发现，定量分析的香味成分的总含量在成熟度 较好的烟叶要明显高些，表明成熟度好的烟叶香味成分的含量比成熟 度差的烟叶丰富。2 0 0 2 年，朱忠和冼可法【1 4 1 对中上部不同成熟度烤 烟烟叶常规化学成分和糠醛、乙酰呋喃、苯甲醛、苯乙醛、氧化异佛 尔酮、8 一大马酮、1 3 二氢大马酮、茄酮、巨豆三烯酮、新植二烯等 2 2 种重要香味成分作了分析研究。结果表明，大多数香味物质的含 量和所测成分中的醇类、醛类和酮类的总量，都随成熟度的增加而成 增加的趋势。 烟草中有机酸是对烟叶和卷烟的质量有重要影响与作用的一类 物质。它们种类繁多、含量差异大，因此烟草有机酸的分析研究很有 意义，长期以来一直受到烟草工作者的重视。 有机酸指含有羧基的有机化合物。由于与羧基相连的基团的不 同，有机酸分为脂肪酸、芳香酸及各种取代酸( 羟基酸、氨基酸等) i t s 。我们通常所说的烟草中的有机酸主要指氨基酸以外的有机酸。根 据有机酸分子中所含的羧基数目，又有一元酸、二元酸和多元酸之分。 烟叶中含有较多的有机酸，其总含量一般为1 2 1 6 ，大部分以与 碱金属或有机碱化合成盐的形式或以酯类的形式存在1 ，其中挥发性 有机酸含量很少，最多只有o 1 0 2 ，有的只有o 0 1 0 0 5 ，但其对 烟叶感官质量的影响却远远大于多元酸和高级脂肪酸。常温下，c i 2 以下的低级脂肪族酸和部分芳香族酸是液体，也就是平常所说的挥发 酸，这些酸在卷烟抽吸过程中直接进入烟气，故对香味有明显影响1 6 1 。 主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸、3 一甲基 戊酸、异己酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、十二酸以 及q 一呋喃甲酸、苯甲酸、苯乙酸等。其中，甲酸、乙酸和丙酸等有 较强的刺激性气味，而丁酸及己酸等有难闻的臭味【1 0 】。一些半挥发性 有机酸如十四酸、十五酸、十六酸、十七酸、十八酸、油酸、亚油酸、 亚麻酸等，由于其高含量及相对的挥发性亦能部分随水蒸气蒸出，在 通常的烟草分析中也将它们和挥发酸一起研究。在不同种类的烟叶 中，香料烟中挥发酸含量最高，烤烟次之，晾晒烟较低；而挥发性有 机酸又以甲酸、乙酸为主【1 7 1 。香料烟的挥发性有机酸组成有一特点： 3 一甲基戊酸、异戊酸的相对含量较高；而且c ，、c 。脂肪族酸中异正 构体的比率较高，这对香料烟宜人的感官性质有重要贡献。 一般质 量好、香气量大的烟叶，其挥发酸含量也比较高。因此，挥发酸的高 含量是优质烟叶的化学特征呷1 。 相对于挥发酸而言，研究较多的就是所谓的非挥发酸，主要包 括分子量较大的脂肪酸、脂环酸、芳香族酸、萜烯酸、二元酸、多元 酸等。这些酸虽然对烟气没有明显的直接作用，但有些可以调节烟草 的p h 值，使吸味醇和，还可增加烟气浓度，因而间接影响烟气的香 气，在烟气中起平衡作用1 0 】，也有些带蜡脂气味，对烟昧不利。在这 部分酸中含量较高的多为二元酸和三元酸；其中以苹果酸、柠檬酸、 和草酸的含量较高，次要的有琥珀酸、丙二酸、延胡索酸、戊二酸、 羟乙酸及丙酮酸等。 在烟草生长发育中，有机酸多是碳水化合物代谢的中间产物，同 不同成熟度烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究 时又是氨基酸等物质合成的前体物质，其代谢水平在烟草整体新陈代 谢中起着重要作用，它受到各方面因素的影响而处于不断的变化之 中。有机酸的代谢与碳水化合物代谢、光合作用、呼吸作用有着密切 的联系，大部分有机酸是上述代谢途径的中间产物，面与有机酸代谢 关系最密切的是柠檬酸循环( 又称三羧酸循环) 【4 1 。v i e k e r y 等1 8 】【1 9 】 对烟株内有机酸的代谢进行过深入的研究，试验结果表明，有机酸代 谢除了维持细胞内代谢的平衡，另外可能在烟株对外源因素变化的反 应中起着一定作用。在实验中，他们为烟株提供有机酸，烟叶的呼吸 作用则大大加强，并且提供的有机酸会迅速进入细胞内代谢反应且改 变了烟叶中有机酸的组成。个别有机酸，除了与其它有机酸之间存在 着联系如参与三羧酸循环外，还可能存在着自身特有的代谢途径与调 控机制。 烤烟在调制与陈化过程中，挥发性有机酸含量有显著的增加，这 对陈化和调制后的烟叶香味的改善与提高有重要的影响。 国外对有机酸在烟草中的存在及其与品质关系的研究开展较早， 1 9 5 5 年，f r a n ke r e s n i k 等2 川利用纸层析定性分析了晒烟中的有机 酸，测定了苹果酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸等1 2 种酸；利用柱色 谱分析了包括反丁二烯酸、琥珀酸、草酸、苹果酸、柠檬酸在内的五 种酸。1 9 5 7 年，d o n a l da b u y s k e 等【2 1 1 分析了烟气中的挥发性有机酸。 他们利用柱色谱技术分离并定量分析了烤烟、自肋烟、土耳其烟烟气 中的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、苯甲酸等 1 3 种酸，指出了烟草有机酸因烟草品种的变化而有显著变化。1 9 6 2 郑州烟草研究院硕士毕业论文 年，s w a i na r 和s t e d m a n r l 等【2 2 1 对晒烟中的高级脂肪酸作了分 析。实验中先用正己烷提取、后进行甲酯化，以气相色谱定量分析了 肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等六种酸。1 9 6 3 年，s c h m e l t zi 、m i l l e rr l 和s t e d m a nr l 2 3 1 运用新型的气相色谱 柱对两个等级的烤烟和香料烟中的挥发性有机酸进行了定性分析，测 定了从c l 到c 8 的1 4 种酸。s t e d m a nr l 等2 卅还对不同品种烟草中的 c i 到c 9 的1 7 种挥发酸进行了定性及定量分析。实验表明，土耳其烟 含有比烤烟高得多的3 甲基戊酸、戊酸、异戊酸而相对较低的甲酸、 乙酸。对比之下，白肋烟和马里兰烟在所有有机酸的含量上都较耳 其烟和烤烟为低。此后，j o n e st c 和s c h m e l t zi ( 1 9 6 8 ) 2 5 1 、d e m o l e e ( 1 9 7 2 ) 等【2 6 】、r o b e r r sd l 和r o h d ew a ( 1 9 7 2 ) 1 2 7 1 、k i m l a n db 等( 1 9 7 3 ) 2 8 1 、s c h u m a c h e rj n 和v e s t a ll 等( 1 9 7 4 ) 2 9 1 、l l o y dr a 等( 1 9 7 6 ) 【3 0 】、c h u m a nt ( 1 9 7 7 ) 等p 1 1 分别采用不同分离分析方 法对白肋烟、香料烟和烤烟的有机酸作了分析，鉴定了包括脂肪酸、 芳香酸、萜( 烯) 酸等近百种不同种类的酸性成分。1 9 7 7 年，i n g e r w a h l b e r g 等3 刁对烘烤和陈化过程对烤烟中酸性成分的影响进行了分 析研究。发现大部分挥发酸随烘烤及陈化过程而增加，一般在第六个 月已达到最大值。为了检测含量很微的一些酸性成分，许多研究采用 较大量的烟叶为分析样，例如k d m l a n db 等采用2 9 5 k g 原料得到5 5 9 挥发酸；c h u m a nt 等则采用4 0 k g 原料而得到1 2 3 5 9 酸性成分。1 9 8 9 年，w i l l i a m a 和j o h ngh e n d e l 等3 3 1 分析了烟草中非挥发酸，利用硫 酸一甲酵甲酯化、以气相色谱进行检测，分析了草酸、丙二酸、反丁 不同成熟度烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究 烯二酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸等六种有机酸。指出在烟草生长的 各个阶段，苹果酸是主要的有机酸。1 9 9 7 年，j e f f r e yt c l a r k 和j o h n e b u n c h 等3 4 1 分析烟草中的有机酸时，采用固相微萃取一重氮甲烷甲 酯化- g c 技术分析了包括乙酸、异戊酸、戊酸、3 甲基戊酸、苯甲酸、 苹果酸等在内的4 0 种有机酸。 国内烟草中酸性成分分析起步较晚，1 9 5 8 年张泳泉曾采用水蒸 气蒸馏和用碱滴定的方法对烤烟中总挥发酸进行了测定。李云【3 5 - 3 6 1 在1 9 8 5 年首次对国产烤烟和香料烟的低级脂肪酸进行了分析。先用 索氏提取器提取，再经碱洗、酸化，水蒸气蒸馏得到挥发酸，用h p l c 法检测，测定了c ，一c 。的低级脂肪酸。结果显示，甲酸、乙酸、辛酸、 壬酸回收率较低，癸酸则完全没有检出。原因是几个低分子量的酸水 溶性太强、挥发性太强，而癸酸则是挥发性太弱，有机溶剂很难进行 有效提取。同时与国外烤烟进行了对比，并结合评吸，认为一些低级 脂肪酸含量低是我国烟叶质量较差的一个原因。1 9 8 8 年，郭亚东p 7 对云南烤烟和晾晒烟中的有机酸进行了分析，甲酯化后用气相色谱技 术检测，共鉴定出5 1 种有机酸，其中包括2 6 种元脂肪酸。对分子 量大、难挥发的酸性成分分析效果较好，进行了定量分析，而对于分 子量小的挥发酸如乙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、3 甲基戊酸 等的分析则不理想，只进行了定性分析。1 9 8 9 年，李云等1 3 8 1 利用三 甲基硅烷化技术结合毛细管气相色谱法对1 1 种国产烤烟、香料烟和 白肋烟的1 2 种低级脂肪酸作了定性定量分析。实验发现：各种烟草 的低级脂肪酸组成在定性上相似，定量上有差别：烤烟中甲酸和乙酸 郊卅斓草研究院硕士毕业论文 的含量比香料烟和白肋烟高；香料烟的异丁酸、异戊酸和3 甲基戊酸 比烤烟和白肋烟多许多；质量好的烤烟和香料烟中总挥发酸比质量差 的烟叶高，尤其是它们的异正构酸比例比质量差的烟叶大。t 9 9 8 年， 李炎强和冼可法【3 9 1 采用直接进样法分析了烟草中挥发性和半挥发性 酸成分。他们使用同时蒸馏萃取法分离出酸性成分后，不经衍生化， 在l i p 一2 0 m 毛细管色谱柱直接进样做g c m s 鉴定，分析了1 9 种酸性 成分，并作了定量测试。方法的重复性和回收率试验显示，该方法适 宜于分析不少于6 个碳的挥发性、半挥发性酸成分。其中包括3 一甲基 戊酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等重要酸性香味成 分的测定。该方法与甲酯化法相比，明显简化了分析步骤，而且对于 c 。以上脂肪酸的分析，有较高的回收率。而对于c ，以下低级脂肪酸 的分析，回收率都很低。1 9 9 9 年，李炎强等1 4 0 使用同时蒸馏萃取 g c m s 方法对云南、河南烤烟中游离态和结合态的挥发性、半挥发 性脂肪酸成分作了比较分析，共定量测定了2 1 种成分。结果显示， 分子量较小、挥发性较强的脂肪酸，如异戊酸、戊酸、3 一甲基戊酸， 以结合态形式存在的较多；而分子量较大的半挥发性脂肪酸，游离态 形式多于结合态。从所测试的2 1 种酸性成分看，云南烤烟中游离态 酸以及游离态和结合态酸的总量都比河南烤烟高。1 9 9 9 年，刘百战 等1 4 1 1 对云南烤烟中高级脂肪酸和多元酸进行了分析，样品直接甲酯化 ( 甲酯化试剂为硫酸甲醇) 后用气相色谱检测。试验表明，中部烟 叶高级脂肪酸含量最丰富，下部烟略少，上部烟最少。不同颜色烟叶 的对比分析显示，桔黄色烟叶非挥发有机酸平均含量最高，其次依次 一i 同成糌崖烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究 为杂色、红棕，柠檬黄烟叶最低。2 0 0 0 年，陈章玉等i 删则采用了甲 酯化后以固相微萃取进行顶空吸附的方法对有机酸进行前处理，共鉴 定出了4 0 多种挥发及半挥发性有机酸。分析的灵敏度有所提高，中 间过程简单，主要做了定性分析，仅对3 一甲基丁酸、苯乙酸、辛酸、 十四酸、十六酸进行了定量分析。 总之，自廿世纪中叶以来，国内外对烟草中有机酸的分析研究如 对烟草其它香味物质成分分析研究一样取得很大进展。早期的烟草有 机酸的分析工作主要采用化学方法分析，由于分离、纯化、鉴定上的 困难，能分析鉴定的种类有限，对许多微量有机酸成分分析就更为困 难。自从1 9 5 2 年j a m e s 和m a r t i n 提出气相色谱方法以来，特别是1 9 5 5 年g o l a ym j e 提出毛细管气相色谱仪及以后出现g c m s 联用等技 术后，烟草分析工作步入了全新的时代。烟草中有机酸的分析一般是 先对烟草样品进行适当的前处理，将其与烟叶的中性、碱性和弱酸性 物( 酚类) 分开，再进行定性定量分析。前处理一般是经有机溶剂萃 取、碱洗再酸化而得到有机酸。分析挥发性酸还需进行水蒸气蒸馏， 使其与非挥发酸分开。所得到的有机酸则直接或经适当的衍生化处理 之后以g c 、h p l c 、g c m s 等方法进行定性定量分析。毛细管g c 直接进样的方法一般很难取得理想的效果，因为许多酸性物质沸点 高，仪器的响应值较低，色谱柱污染严重，并且对于分子量小的几种 脂肪族酸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸等回收率很低，重复性 差。近年，随着g c 技术与一些极性柱性能的改进与提高，对一些种 类脂肪酸的直接进样分析已取得良好效果 3 9 4 0 】。对于非挥发性酸和高 郑州烟草研究院硕士毕业论文 沸点酸如高级脂肪酸，衍生化处理后再进样分析，可获得较好的效果。 有机酸的衍生化处理主要包括甲酯化 3 3 - 3 4 l 【4 3 州】、氯甲基化、丁酯化 【4 6 1 、硅烷基化【4 7 1 、苄基化4 鄙等。这些方法有效降低了分析物的沸点、 减轻了柱子污染及提高了仪器响应值。然而，时至今日，对于烟草中 含量较高的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低分子量脂肪酸，由于它们水 溶性强、挥发性强，上述各种分离分析方法很难把它们与大多数有机 酸一起同时进行分离和定量分析。这是目前烟草有机酸分析中有待解 决的问题。近年来，烟草和烟气中有机酸分析的一些新方法和技术已 经出现如反相h p l c 4 9 - 5 0 1 、毛细管电泳5 1 1 、离子色谱 5 1 - 5 2 1 等分析鉴定 技术也已报道。如l a g o u t t ed ，l o m b a r dg ；等 4 9 1 应用反相h p l c 及毛 细管电泳对卷烟烟气中的有机酸进行了对比分析。他们主要对含量较 高的四种低分子酸甲酸、乙酸、乳酸、羟基乙酸等进行了分析。结果 发现：相对于老的检测技术，如g c 和离子交换h p l c ，反相i - i p l c 及毛细管电泳不需要对样品进行复杂的萃取及纯化，从而大大降低了 样品损失。而且毛细管电泳相对于反相h p l c 更具有以下一些优越 性：简便、快速、溶剂损耗少和不需接触有毒溶剂。 烟草中的挥发性、半挥发性碱性成分主要包括胺类化合物、含氮 化合物、含氮杂环化合物和生物碱类化合物。从挥发性、半挥发性碱 性成分来看，大多数属于以下两类：( 1 ) 蛋白质、氨基酸、烟碱的分 ! 解和转化产物；( 2 ) 糖和氨基酸的反应产物，如吡咯类、吡嗪类化合 物。挥发碱对烟草及烟草制品的感官特性有着重要的影响，是评价烟 草及烟草制品感官质量的重要指标。挥发碱中除了烟碱具有特殊生理 不同成熟度烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究 强度( 劲头) 作用外，对烟气感官质量影响大致有两方面：许多 挥发碱带有刺激性杂气味，如氨及其衍生物；某些具有香味的挥 发碱，如吡嗪类、吡啶类和吡咯类，它们含量都很低。分析研究烟草 中的挥发性、半挥发性碱性成分的组成，对提高卷烟加香技术，改进 卷烟感官质量具有重要的意义。早在1 9 6 6 年，n e u r a t h 等5 3 1 分析了白 肋烟中的1 7 种挥发性碱。1 9 7 7 年，w a h l b e r gi 等5 q 曾采用顶空技术 分析了陈化前后烤烟中的半挥性碱性成分。实验发现，烤烟经烘烤和 陈化后，烟碱及其转化产物的数量有所减少。而某些含量很低具有香 味特征的碱性化合物如吡嗪类、吡啶类化合物的浓度却有所增加。 t 9 9 9 年，吴鸣等m 1 采用水蒸气蒸馏、溶剂萃取分离的前处理方法， 以及配备氮一磷检测器的气相色谱和气相色谱一质谱联用分析鉴定技 术，对云南中二烤烟中的半挥性碱性成分进行了分析研究，共鉴定出 3 6 种半挥发性碱性成分。采用内标法定量测定了吡啶、2 一甲基吡嗪、 2 ，6 - 二甲基吡嗪、2 ，3 - 二甲基吡嗪、2 ，3 ，5 一三甲基吡嗪、2 一乙酰 吡啶、3 一乙酰吡啶、四甲基吡嗪、吲哚、2 ，3 一二联吡啶等1 0 种碱性 香味成分。研究结果表明，除2 ，3 ，5 三甲基毗嗪外，吡啶类化合物 在含量上明显高于吡嗪类化合物和其它含氮杂环化合物。2 0 0 2 年， 李鹏等m 1 对中国和巴西的白肋烟的挥发性碱性成分作了分析，共鉴定 出4 1 种成分，对其中1 7 种重要碱性香味成分作了定量测定。研究 结果表明，巴西白肋烟样品的碱性香味成分总量比中国四川和湖北白 肋烟样品要高。吴鸣、谢剑平、赵明月等 5 7 - 5 8 1 对白肋烟在生产、采收、 调制过程中重要香味成分的变化研究中关于碱性成分的变化时指出， 郑州烟草研究院硕士毕业论文 吡嗪、甲基吡嗪和吲哚在生产和采收过程中几乎不存在，直到调制阶 段含量才急剧增加。吡啶在整个过程中含量基本不变，而3 ，甲酰毗啶 在调制过程中含量是逐步增加的。他们还比较了我国湖北、重庆和巴 西、津巴布韦和马拉维白肋烟中的酸性、碱性和中性香味物质的组成， 指出，我国不同地区以及国外不同国家的白肋烟品质的优劣和它们的 酸、碱、中性各类香味物质含量的差别有关。 然而，烤烟烟叶成熟过程中，有机酸和碱性物质的变化，除了烟 碱和含量很高的柠檬酸、苹果酸、草酸等几种成分外，其它少有研究 和报道。 本文采用同时蒸馏萃取结合毛细管g c 法和g c m s 法对不同成 熟度的中上部烤烟烟叶的一些重要挥发性酸性和碱性香味物成分进 行了分析研究。 不同成熟度烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究 2 实验 2 1 实验样品、试剂、标样及仪器 ( 】) 实验样品 本实验样品为2 0 0 2 年采收的河南烤烟k 3 2 6 的不伺成熟度的上、 中部烟叶。各个烟样的外观特征列于表1 。 表1烟叶样品的外观特征 憾 成熟度颜色叶片结构 身份油分色度 稍密尚 l 欠熟深黄薄稍薄少淡 疏松 深黄正稍密尚 上 尚熟中等稍薄稍有少中弱 黄疏松 金黄正尚疏松 | 部 成熟中等稍薄稍有少中 其疏松 深黄正尚疏松稍有 过熟中等稍薄中弱 史疏松少 尚疏松 欠熟深黄含青稍薄薄少淡 疏松 中 尚熟 正黄微尚疏松 稍薄 稍有 中 部 浮青疏松少 金黄正尚疏松稍有 成熟稍薄中 臾疏松少 过熟土黄疏松稍薄薄少弱 ( 27 试剂 二氯甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇、无水硫酸钠、 磷酸、环己烷。以上试剂均为分析纯( 无水乙醇为色谱纯) 。 ( 3 ) 标样 苯乙酸甲酯( 内标) ，乙酸，丁酸，异戊酸，戊酸，3 一甲基戊酸 郑州烟草研究院硕士毕业论文 己酸，庚酸，辛酸，壬酸，癸酸，十二酸，十四酸，十五酸，十六酸； 三乙胺( 内标) ，四甲基吡嗪，2 ，3 - 二甲基吡嗪，2 ，5 - 二甲基吡嗪， 2 ，6 - 二甲基吡嗪，2 ，3 ，5 - 三甲基吡嗪，2 - 甲基吡嗪，2 - 甲氧基吡嗪， 2 - 乙基一3 一甲基吡嗪，2 - 乙酰吡啶，吡啶，噻唑，喹啉。以上试剂纯度 均大于9 7 ，3 乙酰吡啶纯度9 0 。 ( 4 ) 仪器 h p 6 8 9 0 气相色谱仪 h p 6 8 9 0 h p 5 9 7 3 气相色谱质谱联用仪 p h s 一3 c 数显型酸度计 同时蒸馏萃取仪( s d e ) 2 2 烟叶样品的前处理 分别取不同成熟度的实验样品烟叶，抽去烟梗，在烘箱中保持 4 0 。c 的温度下干燥2 小时。用粉碎机将其粉碎成烟末，过4 0 目筛， 置于密封袋中以备用。 用烘箱法5 9 1 测各烟叶样品的含水率，结果见表2 。 表2 作香味成分分析的烟样含水率 l 欠熟( )尚熟( )成熟( )过熟( ) 上部 6 2 25 0 96 2 34 6 8 中部 5 6 65 9 96 5 95 7 5 不同成熟度烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究 2 2 1 烟叶样品挥发性酸性香味成分分析的前处理 ( 1 ) 前处理方法的选择 在烟叶样品酸性香味成分的前处理过程中，选取三种基本实验 方法作为备选方法，即：a 、直接同时蒸馏萃取；b 、1 0 硫酸甲醇 甲酯化；c 、一定条件下同时蒸馏萃取。 a 、直接同时蒸馏萃取 采用常用的同时蒸馏萃取装置和方法，称取一定量的烟末，加 入一定体积蒸馏水( 同时加入沸石) 置于同时蒸馏萃取装置的左端， 一定体积的二氯甲烷置于右端进行同时蒸馏萃取2 小时。把二氯甲烷 萃取液以碱洗、再酸化得到挥发性、半挥发性有机酸，干燥浓缩后进 行g c 分析，从所得的气相色谱图来看，对于c 5 以前的低级脂肪酸， 由于其较强的水溶性与挥发性，该方法难以进行有效的提取，从而难 以进行定量分析。 b 、1 0 硫酸甲醇甲酯化 称取一定量的酸性香味成分标样，置于烧瓶中，加入一定体积的 1 0 硫酸甲醇在回流条件下进行甲酯化5 小时。干燥浓缩后进行g c 分析，从所得气相色谱图来看，对c ；以后的脂肪酸酯化效果较好， 而对于c ，以前的低级脂肪酸，由于其相对较低的沸点，与溶剂峰难 以进行有效的分离，在当前的实验条件下，无法进行有效的定性、定 量分析。 c 、一定条件下同时蒸馏萃取 取一定量的烟末，加入一定体积的蒸馏水，加入1 ：4 的磷酸调 2 0 郑州烟草研究院硕士毕业论文 节p h 值分别为1 、2 、3 、4 ，以二氯甲烷为萃取溶剂进行同时蒸馏萃 取。从定性结果来看，该方法对乙酸、丁酸、异戊酸、戊酸等低分子 量的脂肪酸能进行有效的提取，适于定量分析。在不同的p h 值条件 下，分别做回收率和重复性试验。实验发现，在p h 为l 的条件下， 酸性香味物质的回收率和实验的重复性较好，适合做定性及定量分 析。继而在p h = l 附近寻找更为合适的条件，发现p h 三1 4 6 的条件最 为适合分析。 ( 2 )烟叶样品挥发性酸性香味成分分析的前处理 称取备用的烟末样品2 5 0 9 ，置于1 0 0 0 m l 平底烧瓶中，加入3 5 0 m l 蒸馏水( 同时加入沸石) ，用l ：4 的磷酸调节烟末水溶液的p h 值为 1 4 6 ，置于同时蒸馏摹取装置的左端，1 0 0 m l 烧瓶加入4 0 m l 二氯甲烷 后置于右端，同时蒸馏萃取2 小时，装置如图1 所示。萃取液在6 0 的水浴中加热浓缩至l m l ，即为气相色谱分析的酸性物溶液。 图1 同时蒸馏萃取装置示意图 坷i 闻成熟度烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究 烟样挥发性酸性香味成分分析的前处理步骤如下图所示： 烟叶样品2 5 0 9 ) 加蒸馏水3 5 0 m l ，用1 ：4 磷酸调节p h i值为1 4 6 l ( 2 ) 以4 0 m l c h 2 c 1 2 同时蒸馏萃取2 小时 二氯甲烷萃取液 1 浓缩至l m t g c m s 酸性分析物 图2烟样挥发性酸性香味成分分析的前处理示意图 2 2 2 烟叶挥发性碱性香味成分分析的前处理 称取备用的烟末样品2 5 0 9 ，置于1 0 0 0 m l 平底烧瓶中，加入 3 5 0 m l 蒸馏水( 同时加入沸石) ，置于同时蒸馏萃取装置的左端，1 0 0 m l 烧瓶加入4 0 m l 二氯甲烷后置于右端，进行同时蒸馏萃取2 小时，装 置如图l 。将蒸馏萃取后所得的二氯甲烷萃取液转移至2 5 0 m 1 分液漏 斗中，先用2 0 m l 的5 盐酸洗涤三次，后以2 0 m t 二氯甲烷反萃取酸 洗所得的水溶液，再以适量2 0 的氢氧化钠调节水溶液的p h 值至 11 1 2 ，用2 0 m l 二氯甲烷萃取三次，合并有机层后以3 0 m l 饱和氯化 钠水溶液洗涤。洗涤后的有机层转入1 0 0 m l 烧瓶中，加入1 0 9 无水硫 酸钠干燥过夜。转移干燥后有机层至浓缩烧瓶中，在6 0 c 的水浴中 加热浓缩至o 5 m l ，即为气相色谱分析的碱性物溶液。 郑州烟草研究院硕士毕业论文 烟样挥发性碱性香味成分分析的前处理步骤如下图所示： 烟叶样品2 5 o g l 同时蒸馏萃取2 小时 i ( h z 0 3 5 0 m l ，c h 2 c 1 2 4 0 m 1 ) 二氯甲烷萃取液 l5 盐酸洗涤3 次( 2 0 m l 3 ) 1 水溶液用2 0 m l 的c h 2 c 1 2 反萃取 士 二氯甲烷溶液层 水溶液层 i ( 1 ) 2 0 的n a 0 h 调节p h 值为 i11 一 9 l( 2 ) c h ：c 1 ：萃取3 次 i( 2 0 m l 3 ) t 二氯甲烷溶液层 水溶液层 i3 0 m l 饱和n a c l 溶液 上洗涤 上i 饱和n a c l 溶液层 二氯甲烷溶液层( 碱性物) 1 ( 1 ) 1 0 9 无水硫酸钠干燥过夜 l ( 2 ) 浓缩至o 5 m l 士 g c 碱性分析物 图3烟样挥发性碱性香味成分分析的前处理示意图 2 3 烟叶样品挥发性酸性香味成分分析 2 3 1 烟叶样品挥发性酸性香味成分的定性分析 利用标准样品来确定各个酸性香味成分的g c 相对保留时间，并 不同成熟度烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究 结合g c m s 法对酸性香味成分进行定性。在g c m s 法基础上采用 选择特征碎片离子的方法对酸性g c 分析液进行分析鉴定。含有y 。h 的有机酸经电离后均具有m z = 6 0 的碎片离子，即m c l a f f e r t y 重排 r r a h 九l 为r r h 主功 + o h y o h m z = 6 0 于是选定计算机只给出具有m z = 6 0 碎片离子的质量色谱图。与此同 时，拿定量的标样混合物以完全相同的程序来确定各相应有机酸色 谱峰的保留时间。为防止选择特征碎片离子的过程中在所分析的有机 酸色谱峰中包含其它干扰成分峰，则把烟样中的有机酸除去以后，利 用选择特征碎片离子m z = 6 0 的方法进行分析，结果发现在所鉴定的 有机酸色谱峰处并无任何色谱峰出现，故可认为选择特征离子的方法 适合烟草中有机酸的分析。同时，按m z = 1 5 0 的特征碎片离子分析内 标物苯乙酸甲酯。 g c m s 条件：t - i p f f a p 毛细管柱：5 0 m o 2 2 m m x o 3 3um ，升 温程序6 0 。c ( 1 m i n ) 2 篁盟i 斗2 1 0 * c ( 4 0 m i n ) ，分流比：1 0 ：1 ，进样口温 度2 5 0 。c 电离方式e l ，电离电压7 0 。c ，传输线温度2 5 0 。c ，离子源 温度2 0 0 。c ，选择离子扫描方式( 有机酸：6 0 ；苯乙酸甲酯：1 5 0 ) ，载气 为氦气( 恒流模式：0 6 m l m i n ) ，。化合物鉴定由计算机在w i l e y 图谱库 中检索。 2 3 2 烟叶样品挥发性酸性香味成分的定量分析 本实验中对以标样保留时间和g c m s 鉴定的1 4 种酸性香味成分 进行了定量分析，采用内标法标准曲线进行定量。 4 郑州烟草研究院硕士毕业论文 ( 1 )内标法标准曲线的测定 取准确量的各标样混合物，在所分析的有机酸含量左右配制5 个不同浓度的环己烷溶液，各取1 0 hl 加入内标苯乙酸甲酯，以二氯 甲烷稀释至i m l 后在g c m s 联用仪上进行分析。根据各标样化合物和 内标物的质量及其在g c , m s 上相应的峰面积，按公式( i ) 计算内标 法标准曲线的a 和b 。 m i m s = ( a i a s ) a + b ( i ) 令y = m i m s ，x = a i a s ，则( i ) 变为： y ：a x + b ( i i ) 其中： m i i 物质的质量m s 一内标物的质量 a i i 物质的峰面积 a s 一内标物的峰面积 扩标准曲线的斜率 b 一标准曲线的截距 各酸性香味成分的内标法定量标准曲线的线性回归方程及其相关 系数可由计算机直接求得。结果见表3 。 不同成熟度烤烟中重要挥发性酸碱性香味成分的研究 表3 酸性香味物质内标法标准曲线的线性回归方程 化合物回归方程 相关系数 乙酸y = 6 10 7 8 x + o 010 9 9 9 8 丁酸y = 1 4 4 4 1 x + 0 0 0 4 70 9 9 9 7 异戊酸 y = 1 1 0 0 3 x 十o 0 0 4 70 9 9 9 4 戊酸y = i 1 2 5 6 x + o 0 0 9 10 9 9 9 2 3 甲基戊酸y = 1 16 8 8 x + o 0 0 50 9 9 9 4 己酸y = 1 2 4 7 1 x + 0 0 1 4 30 9 9 9 9 庚酸 y = 1 5 3 2 1 x + o ，0 0 6 70 9 9 9 8 辛酸 y = 】9 1 9 l x + 0 0 0 8 60 9 9 9 7 壬酸y = 2 4 0 1 3 x + 0 0 1 1 10 9 9 9 4 癸酸y = 0 3 4 6 8 x 0 0 0 3l0 9 9 9 3 十二酸 y = 2 9 4 6 2 x + o 0 2 1 10 9 9 9 2 十四酸y = 4 6 17 2 x + o 0 2 9 70 9 9 9 0 十五酸 y = 2 6 7 8 1 x + 0 0 31 40 9 9 9 1 十六酸 y = 8 1 8 2 7 x 0 0 1 5 80 9 9 9 4 由表3 可知，在所测范围内，各酸性化合物的内表法标准曲线相 关性较好，适合于定量分析。 ( 2 )前处理过程中酸性标样回收率的测定 取一定量各标样化合物加入到2 5 0 9 烟叶样品中，再将其与2 5 0 9 烟叶样品进行平行前处理和g c m s 分析。连续做五组烟叶样品，得 各有机酸的测定值，取平均值，计算出其回收率，结果见表4 。 郑州烟草研究院硕士毕业论文 表4 酸性香味物质前处理过程中标样回收率 编化合烟样测定标样加烟样+ 标样 差值 回收率 5 次烟样+ 标 样测定值变 号 物值( ug )入量( “g ) 测定值( “g ) ( ug ) ( ) 异系数( ) l乙酸3 7 4 1 24 0 3 6 4 4 3 2 2 15 8 0 8 1 4 3 96 5 8 2丁酸2 0 0 32 7 1 63 2 6 2 1 2 5 8 4 6 3 21 3 7 异戊 31 5 2 5 21 5 7 6 l2 3 6 0 6 8 3 5 5 5 3 0 l5 5 7 酸 4 戊酸 1 3 7 6 31 4 4 7 42 7 1 2 51 3 3 6 2 9 2 3 24 1 l 3 甲基 52 6 8 0 3 0 7 75 4 6 3 2 7 8 39 0 4 4 2 3 0 戊酸 6己酸1 6 3 5 21 6 5 2 93 3 9 5 01 7 5 9 91 0 6 4 7 2 1 5 7 庚酸 2 7 - 3 33 0 2 26 1 9 03 4 5 7 1 1 4 3 9o 6 0 8辛酸6 8 0 46 0 0 21 3 7 4 76 9 4 21 1 5 6 70 3 2 9壬酸5 l _ 2 63 6 1 08 7 5 13 6 2 41 0 0 _ 3 9 0 4 4 1 0 癸酸 1 4 8 94 8 7 13 4 8 41 9 9 54 0 9 66 7 2 + 二 2 0 7 44 9 3 22 1 2 01 0