（食品科学专业论文）花生粕抗氧化肽的研究.pdf

j ，i ，： ：“， 摘要 花生粕是花生仁经压榨提炼油料后的副产品，目前主要应用在饲料中，有时甚至作为 废料扔掉。抗氧化肽作为一种天然抗氧化剂，具有较好的抗氧化性和安全性，吸引了越来 越多的关注。因此，充分利用花生粕制备抗氧化肽是重要的研究课题，具有较高的应用价 值。 本文以花生粕为原料，利用筛选得到的枯草芽孢杆菌2 0 0 2 9 对花生粕进行发酵处理， 得到了花生粕发酵液，通过响应面分析优化得到了制备抗氧化肽的最佳条件：p h 值8 、温 度3 0 、发酵时间4 9 5 h ，在此条件下，发酵液的d p p h 自由基( d p p h ) 清除率为6 3 2 8 。 并对不同发酵时间的d p p h 清除率与多肽含量的相关性进行了研究，发现d p p h 清除率与 多肽含量的相关性较好，p 值为0 0 0 1 0 。 利用超滤对花生粕发酵液进行了粗分离，分离效果较好，超滤后，发酵液的抗氧化性 变化不大。 。 采用d a 2 0 1 c 大孔吸附树脂对多肽进行了精制处理，发现吸附过程属于快速平衡吸 附，动态吸附过程中，上样浓度、流速均对吸附的穿透点产生影响，热动力学研究发现， 树脂对多肽的吸附符合l a n g m u i r 方程式，拟合相关系数均在o 9 8 以上，利用2 5 - 一1 0 0 的乙醇对吸附后的树脂进行了洗脱，发现不同洗脱组分的氨基酸组成、分子量有较大差异， 对不同组分的抗氧化活性进行了测定，发现7 5 7 , 醇洗脱组分( p m f h 7 5 ) 的活性最强。 利用凝胶过滤、半制备r p h p l c 对p m f h 7 5 进行了分离纯化，p m f h 7 5 经凝胶过 滤分为4 个组分，其中f 3 的d p p h 清除率显著高于其他三个组分，并利用l c m s 对f 3 中的抗氧化多肽的组成和结构进行了分析。 最后对发酵后的残渣的成分进行了分析，在氨基酸组成方面，同花生粕原料进行了比 较，发现残渣中的a r g 的含量降低，m e t 的含量增加，蛋白质的营养价值得到一定程度上 的提高。 关键词：花生粕；抗氧化肽；超滤：脱盐；凝胶过滤色谱；反向高效液相色谱 a b s t r a c t a b s t r a c t p e a n u tm e a l w h i c hi sm a i n l ya p p l i e di nf e e d ，s o m e t i m e se v e nd i s c a r d e da sw a s t e ，i sa b y - p r o d u c tw h e np e a n u to i l i s e x t r a c t e d s i m u l t a n e o u s l y a s n a t u r a la n t i o x i d a n t s ，a n t i o x i d a n t p e p t i d e sh a v ea t t r a c t e di n c r e a s i n g i n t e r e s t sb e c a u s eo ft h e i rs a f e t ya n dg o o da n t i o x i d a t i v e p r o p e r t i e si nr e c e n ty e a r s t h e r e f o r e ，m a k i n gf u l l u s eo fp e a n u tm e a lt op r e p a r ea n t i o x i d a n t p e p t i d ei sa ni m p o r t a n tr e s e a r c ht o p i c i tr e p r e s e n t sas i g n i f i c a n t v a l u e i nt h i sp a p e r , t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rp r o d u c i n gt h ea n t i o x i d a t i v ep e p t i d eo fp e a n u t m e a l ，u s i n gl i q u i d s t a t ef e r m e n t i o nb yb a c i l l u ss u b t i l i s 2 0 0 2 9s c r e e n e d ，w e r ed e t e r m i n e db y r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y a sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r e 3 0 。c ，p hv a l u e8 , t h ep e r i o do ff e r m e n t a t i o n 4 9 5 h u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n ，t l l ed p p hr a d i c a l s c a v e n g i n ga c t i v i t yo ff e r m e n t a t i v ep r o d u c t r e a c h e d6 3 2 8 u n d e rt h ed i f f e r e n tf e r m e n t m i o nt i m e ，t h ec o r r e l a t i o no fd p p hr a d i c a l ( d p p h ) s c a v e n g i n ga c t i v i t ya n dt h ec o n t e n to fp e p t i d ew a ss t u d i e d ，t h e r ew e r es t r o n gr e l a t i v i t i e sa b o u t d p p hr a d i c a l ( d p p h ) s c a v e n g i n ga c t i v i t ya n dt h ec o n t e n to fp e p t i d e ，p = o 0 010 u s i n gu l t r a f i l t r a t i o nt op e a n u tm e a l ，t h er e s u l ts h o w e di tw a sag o o dm e t h o do fs e p a r a t i o n a f t e ru l t r a f i l t r a t i o n ，t h e r ew a sn oc o n s i d e r a b l ec h a n g eo f t h ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo ff i l t r a t e p e p t i d ew a sd e s a l t e db yd a 2 01 - c ( m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n ) t 1 1 er e s u l t si n d i c a t e d t h a t t h ea d s o r p t i o no fp e p t i d eb e l o n g e dt or a p i de q u i l i b r i u ma d s o r p t i o n 1 1 l eb r e a k t h r o u g hp o i n tw a s a f f e c t e db yt h ef l o wr a t e c o n c e n t r a t i o n 1 1 l er e s u l to ft h er e s e a r c ho ft h e r m a ld y n a m i c ss h o w e d t h a tt h ea d s o r p t i o no fp e p t i d e sw a si na c c o r d a n c ew i t hl a n g m u i re q u a t i o n ，t h ec o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n tw e r ea l lm o r et h a n0 9 8 t h ep r i m a r yp u r i f i c a t i o nw a sc a r d e do u tb ye t h a n o lw i t h d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n ( 2 5 - - 10 0 ) a c c o r d i n gt ot h e i rh y d r o p h o b i cp r o p e r t y , t h ef r a c t i o n e l u t e db ye t h a n o lw i t h7 5 c o n c e n t r a t i o ns h o w e dt h eb e s ta n t i o x i d a n ta c t i v i t y t h ea m i n oa c i d c o m p o s i t i o na n d m o l e c u l a rw e i g h to f e a c hf r a c t i o nw e r ed i f f e r e n tw i t he a c ho t h e r p m f h 7 5w a ss e p a r a t e db yg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h ya n dr p - h p l c ，p m f h 一7 5w a s s e p a r a t e di n t of o u rc o m p o n e n t sb yg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y , t h ed p p hr a d i c a l ( d p p h 。) s c a v e n g i n ga c t i v i t yo ft h e f 3w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h eo t h e rt h r e ec o m p o n e n t s m e a n w h i l e t h ec o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r eo ff 3w e r ea n a l y z e d f i n a l l y , t h ei n g r e d i e n t so fr e s i d u e a f t e rf e r m e n t a t i o nw e r ea n a l y z e d i nr e s p e c to ft h e c o m p o s i t i o no fa m i n oa c i d s ，c o m p a r i n gt or a wm a t e r i a l s ，m er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n t e n to f m e ti n c r e a s e d ，a r gd e c r e a s e d , b u tt h en u t r i t i v ev a l u eo fp r o t e i nw a si m p r o v e d k e y w o r d s ：p e a n u tm e a l ；a n t i o x i d a t i v ep e p t i d e ；u l t r a f i l t r a t i o n ；d e s a l i n a t i o n ；g e l c h r o m a t o g r a p h y ；r p - h p l c i l 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 1 弓i 言1 1 1 多肽的介绍：jl 1 2 多肽的抗氧化作用l 1 3 抗氧化肽的制备一2 1 4 花生粕的介绍2 1 5 花生粕的研究及利用现状。3 1 6 本课题研究的意义和主要内容3 2 实验材料及方法5 2 1 实验材料和仪器一5 2 1 1 实验材料：5 2 1 2 仪器与设备。5 2 2 实验方法一5 2 2 1 菌株的活化5 2 2 2 摇瓶筛选发酵菌株。6 2 2 3 酶活及水解度( d h ) 的测定6 2 2 4 双缩脲测定酸溶性多肽含量。6 2 2 5 抗氧化活性的测定。6 2 2 6 发酵实验的优化6 2 2 7 不同发酵时间的d p p h 清除率与多肽含量的相关性分析6 2 2 8 花生粕发酵液的超滤处理。6 2 2 9 大孔树脂的静态吸附和解吸实验一7 2 2 1 0 大孔树脂的动态吸附实验7 2 2 1 l 大孔树脂对花生粕静态吸附的热动力学8 2 2 1 2 氨基酸分析8 2 2 1 3 多肽分子量分布的测定8 2 2 1 4 蛋白质或多肽疏水值的计算8 2 2 1 5 抗氧化肽的分离纯化9 2 2 1 6 成分分析1 0 3 实验结果及讨论。1 1 3 1 花生粕的成分分析1 1 3 2 菌株的筛选1 1 目录 3 2 1 水解度( d h ) 的测定1 1 3 2 2 双缩脲测定酸溶性多肽含量1 2 3 2 3 酶活的测定1 2 3 2 46 株枯草芽孢杆菌发酵液抗氧化活性的测定1 3 3 3 发酵制备抗氧化肽的优化实验1 3 3 3 1 时间单因素实验1 3 3 3 2 接种量单因素实验1 4 3 3 3p h 值单因素实验1 4 3 3 4 温度单因素实验1 5 3 3 5 响应面优化设计1 5 3 3 6 不同发酵时间的d p p h 清除率与多肽含量的相关性分析1 7 3 4 发酵液的超滤及分级产物抗氧化活性分析l8 3 4 1 超滤前后多肽的分子量1 8 3 4 2 超滤对发酵液抗氧化活性的影响2 0 3 5 大孔树脂的脱盐和分级洗脱2 1 3 5 1 大孔树脂的静态吸附与解吸实验2 1 3 5 2 大孔树脂对花生粕多肽静态吸附的热动力学2 3 3 5 3 大孔树脂的动态吸附和解吸实验2 4 3 5 4 乙醇分级洗脱物的脱盐效果2 6 3 5 5 多肽分级组分的抗氧化活性2 7 3 5 6 多肽分级组分分子量的测定2 9 3 5 7 多肽分级组分的氨基酸分析3 0 3 6 花生粕抗氧化肽的分离纯化与结构分析：3 1 3 6 1 凝胶色谱s e p h a d e x g 1 5 分离p m f h 7 5 3 1 3 6 2r p h p l c 分析组分f 3 3 2 3 6 3l c m s 对花生粕抗氧化肽f 3 的分析3 2 3 7 发酵后残渣的成分分析3 4 结论与展望3 6 致谢3 7 参考文献。3 8 附蜀专4 3 l i 1 引言 1 1 多肽的介绍 1 引言 人们一直认为蛋白质是通过人体各种消化酶作用后以游离氨基酸的形式吸收的，但是 目前越来越多的研究成果正在冲击这个传统的观点u 】。现代营养学研究发现，人类摄入的 蛋白质经消化酶作用后，大多是以寡肽的形式消化吸收的，以游离氨基酸的形式吸收的比 例很小。肽作为分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，是蛋白质的结构与功能 性片段，使蛋白质具有多种多样的结构与功能，这些功能性多肽在大分子蛋白中是表现为 没有活性的，但是在以下三种情况下它们能从蛋白序列中释放出来：( 1 ) 消化酶的水解；( 2 ) 能水解蛋白的微生物的作用：( 3 ) 来源于植物或微生物的蛋白酶的水解作用例。很多生物活 性肽具有特定的生理学功能，能对心血管系统、消化系统、免疫和神经系统作用，这是由 氨基酸序列决定的，近些年来对于多肽的研究越来越引起了科学家的兴趣，对多肽的抗菌 作用、抗氧化、抗血栓、降血糖、免疫活性目前逐渐成为了多肽研究的热点。 1 2 多肽的抗氧化作用 脂质过氧化作用以及自由基链式反应、生物大分子的氧化反应会导致多种生理破坏作 用【3 训，近年来，生物物质的抗氧化活力，尤其是天然抗氧化肽，正引起越来越多的关注， 在食品工业中被添加到脂肪含量较高的肉制品中，目的是用来取代人工抗氧化剂如丁基羟 基茴香醚( b h a ) 、2 , 6 二叔丁基4 甲基苯酚( b h t ) 并能提高产品的货架期【5 】。 肽的抗氧化活性与其氨基酸序列、组成有着密切的关系【6 】。有研究报道些氨基酸和 它的衍生物如c y s 、h i s 、t r p 、l y s 、a r g 、l e u 、v a l 、t r p 都具有抗氧化活性1 7 j 。另外，包 含h i s 、t r p 、t y r 的低分子多肽也显示出显著的抗氧化活性【8 】。肽的一级结构是构成其具有 抗氧化作用的必要因素，有研究者发现蛋白水解物的功能性质与分子量以及所含的氨基酸 相关，n i r a n j a 利用离子交换树脂、凝胶过滤层析和高效液相色谱从贻贝发酵物中分离出一 种抗氧化肽，这个7 肽分子量为9 6 2 d a ，氨基酸组成为h f g b p f h 9 。 根据来源的不同，抗氧化性的肽又分为动物性肽，植物性肽和其它肽类。 关于动物性肽的研究较多，肌肽( c a m o s i n e ) 是广泛存在于动物的肌肉中的二肽，俄国 于1 9 0 0 年首次发现肌肽，它是一种水溶性二肽，由p 丙氨酸和l 组氨酸结合形成的 p a l a h i s 形式，肌肽在骨骼肌中的含量高于其他组织，占肌肉重量的的0 2 - - 0 5 。肌 肽广泛存在于动物的骨骼肌中( 猪肌肉含量为2 8 0 0 m g k g ) ，在大脑、心肌、肾脏、胃也有少 量分布。实验室通常从肌肉组织中提取肌肽，但成本高，无法批量生产。目前国外正在研 究从屠宰下脚料中提取，从而获得大量而廉价的肌肽【lo 】。谷胱甘肽是一种含巯基的三肽， 广泛分布于动植物、谷物、油料种子中，谷胱甘肽在及体内的生化防御中起着重要的作用， 具有多方面的生理功能，在体内的抗氧化活性主要表现在：( 1 ) 谷胱甘肽是体内的自由基清 江南大学硕士学位论文 除剂；( 2 ) 保护红细胞防止外源性和内源性氧化剂损害；( 3 ) 清除脂质过氧化物。 关于植物性抗氧化肽的研究，张君慧研究了中性蛋白酶酶解大米蛋白产物的抗氧化特 性】，采用8 种不同的抗氧化模型进一步测定了大米蛋白酶解物的抗氧化活性，并通过分 离纯化鉴定出二个多肽，分子量分别为9 5 9 5 和1 0 0 2 5 ，序列分别为f r d e h k k 和 k h n r g d e f 。李艳红研究了碱性蛋白酶a l c a l a s e 酶解鹰嘴豆蛋白，全面研究了不同水解度 ( d h = 5 2 5 ) 鹰嘴豆蛋白酶解物的抗氧化能力，结果表明水解度( d h ) 为1 5 鹰嘴豆蛋白酶 解物具有最高体外抗氧化活性，并分离出一种抗氧化肽，抗氧化肽的氨基酸活性为 n r y h e ( a s n a r g t y r - h i s g l u ) 1 2 】。谢正军研究了碱性蛋白酶a l c a l a s ef g2 4 l 制备苜蓿叶蛋 白抗氧化肽，结果发现酶解物中分子量小于1 k 的组分所占比例最高，达到6 7 8 6 ；酶解 物的d h 值与d p p h 清除率之间不存在线性关系【1 3 1 。 除了以上两种肽，吴金鸿从丝绸工业的废水中回收丝胶蛋白( s h ) ，通过酶解来制备具 有生物活性的肽，经过分离纯化发现三个肽段，它们的氨基酸序列结构分别为： i i l l l a a k f g 、k v i i k p l i 和q p v i a h m 。这些肽段的氨基酸序列结构上具备抗氧化肽的特 征【1 4 1 。s h e l l y 利用三种微生物酶对牛奶蛋白质进行作用，发现水解物作用后具有一定的抗 氧化活性l l 引。 1 3 抗氧化肽的制备 目前，抗氧化肽的制备主要有三种方法：( 1 ) 抗氧化肽的提取：曾有研究者以提取的 方法制备了肌肽、谷胱甘肽。但是，提取制备得到生物活性肽在商业生产上仍然存在瓶颈， 目前仍缺少相应的大规模生产技术；( 2 ) 蛋白酶酶解制备抗氧化肽：蛋白质经酸水解、酶解 等方法处理后均可得到抗氧化肽，由于酶促反应条件温和易于控制，专一性较强、副产物 少等优点，因此酶解法利用的最多。目前已有报道中制备抗氧化肽大部分都采用蛋白酶水 解的方式，选用的酶主要有植物蛋白酶( 木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等) ；动物蛋白酶( 胰蛋白 酶、胃蛋白酶等) ：以及微生物产生的蛋白酶( 枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌等) 。采用商业 蛋白酶水解蛋白具有操作简单、条件温和等优点，但也存在得率较低、成本高等技术缺陷； ( 3 ) 发酵法制备抗氧化肽：发酵方法同酶解法相比，能够将微生物产酶和酶水解等工序连接 起来，降低了生产成本；而且微生物产生的端肽酶对小肽末端有修饰作用，制得的多肽不 但没有苦味，还具有发酵的天然芳香味，适口性很好。 1 4 花生粕的介绍 花生是世界五大油料作物之一，其种植范围遍及世界各大洲。我国的花生产量很大， 目前占据世界第一位1 6 】，花生粕是花生仁经压榨炼油后的副产品，含有丰富的植物蛋白， 适合在饲料中应用。花生粕主要由碎果仁组成，同时还有一些种皮和外壳存在，主要颜色 呈淡褐色或深褐色，有淡花生香味，形状为小块或粉状【1 7 】。梅娜对花生粕的化学成分进行 预试和分析测定表明，花生粕含有丰富的化学成分黄酮类、氨基酸、蛋白质、鞣质、糖类、 2 l 引言 三萜或甾体类化合物等成分。其中，蛋白质含量达4 8 6 8 ，多糖含量为3 2 5 0 ，灰分5 6 1 ， 维生素e0 8 7 1 m g l o o g t l 引。 1 5 花生粕的研究及利用现状 花生粕的营养价值较高，花生粕的花生蛋i 兰t ( a r a c h i n ) 几乎包含了人体必需的八种氨基 酸，谷氨酸、天冬氨酸较高，与动物蛋白相近，且不含胆固醇，可消化性好，具有丰富的 营养价值。由于花生粕还含有多种营养物质，因此可以应用在多个方面，如食品营养强化 的花生粕制品、花生粕发酵食品、营养性花生寡肽【1 9 l 。任初杰从花生粕中提取花生粕多糖， 提取率为9 3 9 ，为花生粕中活性多糖的深入研究打下了基础【2 州。花生粕中含有一定量的 膳食纤维，膳食纤维为一种功能性食品添加剂，洪瑶利用了花生粕膳食纤维提取并进行了 优化，在最优条件下提取率为8 7 0 。结果证明用化学分离法提取花生粕中膳食纤维是可 行的，且可提高花生附加值睇。邢福国对花生粕提取总黄酮进行了研究，取率的影响。研 究结果表明：在浸提温度为9 0 、料液比为l ：5 0 ( g m l ) ，乙醇浓度为5 0 浸提3 h 的条件下 浸提效果最好，花生粕中总黄酮提取率为1 6 0 m g g t 2 2 】。张伟利用花生粕提取蛋白质进行了 研究，在优化条件下，对提取的花生蛋白进行了含量的测定，提取率为8 8 0 6 ，蛋白纯度 为9 0 4 3 t 2 3 1 。吴肖研究了利用美拉德反应制备肉味香味料，根据美拉德热反应香气成分检 测表明，在这个系统中体现鸡肉香型的化合物主要是烤香、肉香和脂香化合物，证明了利 用花生粕制造香味料具有一定的可行性【2 4 】。叶元土把花生粕应用到添加到鱼饲料中，并研 究了对草鱼生长生理机能的影响 2 5 j 。 1 6 本课题研究的意义和主要内容 花生是世界五大油料作物之一，其种植范围遍及世界各大洲。我国花生生产分布范围 非常广泛，主要集中在山东、河南、河北、安徽等省份，占全国花生产量的6 0 以上。每 年，我国花生产量为1 0 0 0 万吨左右，位居世界第1 位，约占全球花生总产量的3 8 。花 生粕是花生仁榨油后的副产品，含有丰富的植物蛋白，可以应用于禽畜水产饲料中，但有 时仅仅作为废料丢弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境1 2 6 】。 花生粕含有丰富的氨基酸，但是与豆粕比，花生粕中蛋白质的氨基酸构成不太平衡， 其中精氨酸含量较高，蛋氨酸、赖氨酸和色氨酸的含量不足。把花生粕用作饲料，需要注 意的是精氨酸偏高、赖氨酸太低和易受黄曲霉毒素污染的问题，这也在一定程度上限制了 花生粕的利用【2 7 j 。因此目前如何提高花生粕的附加值也倍受人们关注，研究发现寡肽比游 离氨基酸具有更好的生理活性，而且更容易被吸收，但是酶法制备多肽目前存在两个方面 的问题：( 1 ) 蛋白酶分离纯化较为困难，价格成本较为昂贵；( 2 ) 蛋白酶一般为内切酶，酶解 的过程中由于疏水性氨基酸的暴露，蛋白水解液的苦味较重，影响了多肽产品在食品中的 应用【2 引。 本课题就是以脱脂的花生粕作为原料，利用发酵法对脱脂后的花生粕进行降解，来制 3 江南大学硕士学位论文 得具有抗氧化性质的肽类物质。发酵法因为将产酶和酶解连接起来，大大节约了成本，同 样发酵后的产品可以作为一种活性成分添加到产品中，提高花生粕的附加值，所以本课题 不仅有着较高的经济价值，更重要的是适应了现代人对营养保健产品的需要，对于缓解我 国十分紧缺的蛋白和油脂资源需求，增加和丰富我国营养、保健与医疗食品的种类，提高 我国人民的膳食营养与健康水平有着十分重要的意义。 本论文研究的主要内容包括： 1 利用微生物降解花生粕。在料液比一定的条件下，通过改变其他条件对微生物降解 过程进行优化处理，以提高发酵产物中活性肽的含量，提高溶液抗氧化性。然后对发酵后 的产物进行微滤处理，得到多肽。 2 对所得溶液进行精制，主要利用大孔吸附树脂对发酵物进行脱盐，使得酶解液中的 抗氧化肽得到浓缩，富集，并研究了大孔吸附树脂对花生粕多肽的吸附性质。 3 进一步利用凝胶过滤对抗氧化肽进行分离纯化，同时对发酵后的残渣进行分析。 4 2 实验材料与方法 2 1 实验材料和仪器 2 实验材料及方法 2 1 1 实验材料 枯草芽孢杆菌2 0 0 2 9 、2 0 0 3 3 、2 3 2 6 1 、2 0 0 0 4 ：国家菌种保藏中心； 枯草芽孢杆菌2 0 0 0 1 、2 0 0 0 2 ：本实验室保存； 花生粕：山东鲁花集团有限公司，使用前粉碎过5 0 目筛； d a 2 0 1 c 大孔吸附树脂：江阴市苏青清水处理有限公司： d p p h ( 1 ，1 d i p h e n y l - 2 一p i c r y l h y d r a z y l ) ：美国s i g m a 公司： 斜面培养基：牛肉膏3 9 l ，蛋白胨1 0 9 l ，n a c l5 9 l ，琼脂2 9 l ，p h 7 4 7 6 ，1 2 1 ， 灭菌2 0 m m ； 液体培养基：牛肉膏3 9 l ，蛋白胨1 0 9 l ，n a c i5 9 l ，p h 7 4 7 6 ，1 2 1 ，灭菌2 0 m i r a 发酵培养基：花生粕5 0 9 l ，n a c l5 9 l ，1 2 1 ，灭菌2 0 m i n 。 2 1 2 仪器与设备 超净工作台 气浴恒温振荡培养箱 高压灭菌锅 v i s 7 2 2 型分光光度计 f o r m a 7 0 2 超低温冰箱 r e 5 2 3 旋转蒸发仪 w a t e r s 6 0 0 高效液相色谱 b s z 1 0 0 自动部分收集器 p e l l i c o n - 2 超滤装置 h l 1 b 恒流泵 玻璃层析柱1 6 9 0 c m l g j 1 0 冷冻干燥机 2 2 实验方法 苏净集团安泰公司 金坛市荣华仪器制造有限公司 上海博讯实业有限公司 上海精密科学仪器有限公司 t h e r m ol i f es c i e n c e s 上海亚荣生化仪器厂 美国w a t e r s 公司 上海青浦沪西仪器厂 p a l l 公司 上海沪西分析仪器厂 上海华美实验仪器厂 北京四环科学仪器厂 2 2 1 茵株的活化 用接种环取一环保藏的菌种接入斜面培养基中，在3 7 c 下活化培养2 4 h ，待用。 江南大学硕士学位论文 2 2 2 摇瓶筛选发酵菌株 用接种环取1 _ 2 环在斜面培养基中生长旺盛的菌落，接入装有1 0 0 m l 发酵培养基的 2 5 0 m l 三角瓶中，3 0 下、1 2 0 r p m 摇床培养3 6 h 。发酵结束后沸水浴处理1 0 m i n ，然后 5 0 0 0 r p m 离心2 0 m i n ，上清液保留待用。 2 2 3 酶活及水解度( d h ) 的测定 采用余勃的方法【2 9 , 3 0 】，发酵液不经过沸水灭酶直接离心取上清液，即为粗酶液。酶活 定义：l m l 粗酶液每m i n 水解酪蛋白产生l t t g 酪氨酸为一个酶活力单位。 2 2 4 双缩脲测定酸溶性多肽含量 5 m l 花生粕发酵液中加入5 m l l 0 的t c a ( - - 氯乙酸) ，混匀室温放置1 0 m i n 后， 5 0 0 0 r p m 离心2 0 m i n ，上清液取出利用双缩脲法测定酸溶性多肽含量c e ( m g m l ) 3 1 】，设原 来花生粕发酵液的多肽浓度c o ( m g m l ) ，即有c o = 2 c , , 。 2 2 5 抗氧化活性的测定 d p p h 清除率实验采用k l o m p o n g ，v 的方法【3 2 1 。 螯合铁离子能力的测定采用z h u ，k x 的方法【3 3 1 。 还原能力的测定采用h w a n g ，j y 的方法f 3 4 】。 清除羟基自由基能力采用王瑛瑶的方法【3 5 1 。 2 2 6 发酵实验的优化 用接种环取1 2 环在斜面培养基中生长旺盛的菌落( 2 0 0 2 9 ) ，接入装有1 0 0 m l 液体培 养基的2 5 0 m l 三角瓶中，先对菌株进行扩大培养2 4 h 后，移取一定量的菌液加入到发酵培 养基中，在一定温度、p h 值下进行发酵，发酵结束后沸水浴处理1 0 m i n ，然后5 0 0 0 r p m 离 心2 0 m i n ，上清液保留待用，优化后得到的残渣进行成分分析。 发酵优化实验考虑因素时间、温度、接种量、p h 值进行单因素实验，在单因素实验的 基础上，以时间、温度、p h 值( 中性p h 值附近，适合菌体生长) 为因素，设计三因素三水 平响应面实验，用中心组合的方法进行数据回归分析以及显著性检验，以d p p h 清除率为 指标，以确定发酵的最优实验条件。 2 2 7 不同发酵时间的d p p h 清除率与多肽含量的相关性分析 最优条件下，发酵培养基灭菌、接种后，分别培养0 - 6 0 h ( 每次间隔1 2 h 取样) ，测定 花生粕发酵液中的酸溶性多肽含量、糖含量、d p p h 清除率，并对它们的相关性进行分析。 2 2 8 花生粕发酵液的超滤处理 在室温条件下，采用p e l l i c o n 2 超滤设备，首先利用去离子水清洗3 0 m i n ，至滤出液p h 值至中性，开始阶段利用0 4 5 t t r n 微滤膜对花生粕发酵液进行微滤处理，再利用截留分子量 6 2 实验材料与方法 为1 0 k d a 的超滤膜对最优发酵条件下得到的花生粕发酵液进行超滤，超滤结束后先用 0 0 2 m o l l 的n a o h 清洗3 0 m i n ，然后利用去离子水洗至中性，超滤条件为：进口压，0 8 m p a ； 出口压，0 2 m p a 。以水为测定样品时，1 0 k d a 超滤膜的膜通量为1 3 0 m l m i n 。 2 2 9 大孔树脂的静态吸附和解吸实验 2 2 9 1 大孔树脂的预处理 无水乙醇浸泡2 4 h 后，继续用无水乙醇洗至a 2 2 0 n m 无吸收峰，再用去离子水洗净备用。 2 2 9 2 大孔树脂的静态吸附过程条件的确定 在1 5 0 m l 锥形瓶中加入6 9 经过预处理的湿树脂，加入2 5 m l 超滤液，在3 0 。c 恒温水 浴振荡器中振荡，每隔3 0 m i n ，取样测定其肽的吸光度值( a 2 2 0 n m ) ，最终吸附1 2 h 。 在1 5 0 m l 锥形瓶中加入6 9 经过预处理的湿树脂，加入2 5 m l 超滤液( p h 值为3 8 ) ， 在3 0 。c 恒温振荡器中振荡，吸附1 2 h 后测定多肽含量，计算吸附率与吸附量【3 6 】。 pf 、 吸附率= 二乇1 0 0 c ， 吸附量：! 竺! 二竺2 兰兰 朋 g ：原液浓度( m g m l ) ； c f ： 吸附液浓度( m g m l ) ； 阢 溶液体积( m l ) ； m - 树脂质量( g ) 。 2 2 9 3 大孔树脂的静态解吸实验 取6 9 湿树脂置于1 5 0 m l 锥形瓶，加入2 5 m l 超滤液，3 0 。c 恒温水浴振荡器中吸附1 2 h ， 用去离子水洗干净，加入2 5 m l 不同浓度的乙醇( 浓度分别为0 ，2 5 ，5 0 ，7 5 和1 0 0 ) ， 静态解吸3 h ，得到解吸液最适浓度。 用1 0 0 7 , 醇洗脱静态吸附实验中的树脂，每3 0 m i n 测定吸光度值( a 2 2 0 i l m ) 即j 。 2 2 1 0 大孔树脂的动态吸附实验 2 2 1 0 1 大孔树脂的动态吸附实验 不同样品浓度对d a 2 0 1 c 大孔吸附树脂吸附性能的影响：用d a 2 0 1 c 大孔吸附树脂 装满2 6 c m 3 0 c m 层析柱，室温条件下，将浓度为3 、6 、1 2 m g m l 的花生粕抗氧化肽以 1 m l m i n 的流速流经层析柱，收集样品，检测流出液的a 2 2 0 舢，以a e 2 0 n m = 0 0 5 为穿透点， 比较不同浓度时花生粕抗氧化肽的穿透体积和穿透动态变化过程。 不同流速对d a 2 0 1 c 大孔吸附树脂吸附性能的影响：室温条件下，将浓度为6 m g m l 的抗氧化肽以0 5 、1 、2 m l m i n 的流速流经层析柱，收集样品，检测流出液的a e 2 0 m ，以 a 2 2 0 砌= 0 0 5 为穿透点，比较不同流速时花生粕抗氧化肽的穿透体积和穿透动态变化过程。 将处理过的大孔吸附树脂d a 2 0 1 c 用去离子水洗涤干净，然后装入2 6 c m 3 0 c m 层 析柱中，在室温下通入超滤液，浓度为6 m g m l ，上样速度为1 0 m l m i n ，测定a 2 2 0 啪处的 江雨大学硕士学位论文 吸光度。当a 2 2 0 n m 达到0 0 5 时，停止上样。这时可认为大孔吸附树脂对多肽的吸附已饱和， 换用去离子水洗。洗脱速度为2 m l m i n ，直到电导率不再变化。最后换用2 5 、5 0 、7 5 、 1 0 0 的乙醇进行动态洗脱，洗脱流速为2 m l m i n ，最终当a 2 2 0 n m 不再变化，停止收集。 2 2 1 0 2 大孔树脂分级洗脱花生粕抗氧化肽 上样条件为：上样流速为l m l m i n ，样品浓度为6 m g m l ，水和各浓度的乙醇洗脱的 条件为：洗脱流速为2 m l m i n ，收集各洗脱峰，重复上样，多次收集，真空浓缩蒸去乙醇， 冷冻干燥得到脱盐的不同疏水性的花生粕多肽。 2 2 1 1 大孔树脂对花生粕静态吸附的热动力学 平衡吸附实验在3 个不同的温度( 3 0 ，4 0 * ( 2 ，5 0 c ) 下进行。1 1 9 预先处理过的大孔 树脂，放入1 5 0 m l 具塞锥形瓶中，加入1 5 m l 不同浓度( c d ) 的花生粕多肽溶液，使多肽浓 度从5 2 5 m g m l ( 间隔5 m g m l ) 。将锥形瓶置于设定好温度的摇床上，振荡结束后，过滤， 从上层清液中取l m l 稀释到适当倍数，利用f o l i n 酚法测定蛋白含量【3 8 1 。 2 2 1 2 氨基酸分析 采用高效液相色谱法：将1 5 0 m g 样品置于水解管中，加入6 m o l l 的h c l 溶液，在酒 精喷灯下真空封口，1 1 0 水解2 4 h ，冷却后定容、过滤、脱气，上样前先过0 4 5 9 m 微滤 膜，采用a g i l e n t l1 0 0 液相色谱仪测定氨基酸的含量 3 9 】。 2 2 1 3 多肽分子量分布的测定 高效液相色谱：w a t e r s 6 0 0 高效液相色谱仪( 配2 4 8 7 紫外检测器和e m p o w e r 工作站) ； 色谱柱：t s k g e l 2 0 0 0 s w x l3 0 0 m m x 7 8 m m ； 流动相： 乙腈水三氟乙酸：4 5 5 5 0 1 ( v v ) ； 检测波长：u v 2 2 0 r 蚰； 流速：0 5 m l m i n ； 柱温：3 0 v e 4 们。 2 2 1 4 蛋白质或多肽疏水值的计算 d = 丝! ! 丝a f t i。 以i m i q = a q i 式中： a a i ： 1 0 0 9 蛋白质中每种氨基酸的含量( g ) ； m i 各种氨基酸的摩尔质量( g m 0 1 ) ； a a i , m i ： 1 0 0 9 蛋白质中氨基酸的总摩尔数( m 0 1 ) ； z s f i i 氨基酸侧链疏水性值( k j m 0 1 ) ； 厶q ： 蛋白质疏水性值【4 。 8 2 实验材料与方法 2 2 1 5 抗氧化肽的分离纯化 2 2 1 5 1 凝胶色谱s e p h a d e x g 1 5 分离p m f h 7 5 将处理好的s e p h a d e x g 1 5 装入1 1 x 1 0 0 c m 的玻璃层析柱，用去离子水将大孔树脂处 理得到的p m f h 一7 5 配置成1 0 m g m l 的溶液，上样量为l m l ，用去离子水以1 2 m l h 的流 速洗脱