（环境工程专业论文）红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究.pdf

浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 摘要 对实验室保藏的4 个红曲菌株分别进行液态和固态发酵筛选，分 别测定4 个菌株发酵液的抗氧化活性以及其中d i m e r u m i ca c i d 的含 量。通过实验发现，液态发酵时紫色红曲菌( m p u r p u r e u s ) s m 0 0 5 在d p p h 自由基清除方面略低，但其对a b t s 自由基的清除活性较其 它3 个菌株明显高出很多，且其发酵液中的d i m e r u m i ca c i d 含量也最 高，达到了0 4 7 3 m g m l ，因此确定紫色红曲菌( m p u r p u r e u s ) s m 0 0 5 作为液态发酵条件优化的出发菌株；在固态发酵时紫色红曲菌 ( m p u r p u r e u s ) s m 0 0 5 无论在a b t s 和d p p h 自由基清除方面，还 是在产d i m e r u m i ca c i d 方面均为最高，且与其他3 株红曲菌相差较大。 将筛选得到的红曲菌株m p u r p u r e u ss m 0 0 5 进行发酵培养基及发 酵条件优化，通过单因素试验以及正交试验确定使该菌株发酵液抗氧 化活性及d i m e r u m i ca c i d 含量最高的条件为：麦芽糖4 ( 4 0 9 l ) ， 蛋白胨7 ( 7 0 9 l ) ，初始p h 5 5 ，接种量8 ，培养时间5 d 。并对正 交结果进行方差分析得出所选的发酵条件因素对红曲发酵的影响均 为高度显著，且由验证实验得出优化后的发酵条件使得该菌株发酵后 d i m e r u m i ca c i d 的含量达到了5 8 1 2 4 - 0 6 0 9 m g m l ，比优化前提高了 1 2 倍。 紫苏叶水提取物中含有多种具有抗氧化活性的成分，将紫苏叶水 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 提取物与红曲菌共同发酵，实验发现通过超声破碎法提取紫苏叶中的 有效成分比热回流法具有一定优点，紫苏叶超声破碎后所得滤液使得 红曲发酵液中d i m e r u m i ca c i d 的含量显著提高，达到了 3 1 0 4 + 0 0 8 6 m g m l ，相比于对照提高了4 6 9 4 ，而热回流法仅为 2 7 3 7 + 0 0 7 3 m g m l ；且用紫苏叶超声破碎后所得滤液替代发酵培养基 中的去离子水，使得发酵液的a b t s 自由基和d p p h 自由基清除活性 分别达到了t e a c 值7 12 4 + 0 0 61m m o l l 和1 8 0 0 + 0 3 0 6 m m o l l ，相 比于对照分别提高了3 7 8 6 矛t l15 7 9 6 。 关键词：红曲，抗氧化，d i m e r u m i ca c i d ，紫苏叶，d p p h ，a b t s 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 s t u d yo ne f f e c to fa p p l y i n ge x t r a c to fp e r i l l at 0 a n t l 0 x i d n ta c t i v i t yo f ? i 抑? 、阴s c 【z sf e r m e n t a t i o n a b s t r a c t s c r e e n i n go fa n t i o x i d a n ta c t i o na n do u t p u to fd i m e r u m i ca c i do f f o u rm o n a s c u ss t r a i n sp r e s e r v e db yo u rl a bt h r o u g hl i q u i da n ds o l i ds t a t e f e r m e n t a t i o n t h er e s u l to fe x p e r i m e n ti n d i c a t et h a tm p u r p u r e u ss m 0 0 5 s h o w e ds l i g h t l yl o w e rd p p hs c a v e n g i n ga c t i o na n dm u c hh i g h e ra b t s s c a v e n g i n ga c t i o nt h a nt h eo t h e rt h r e es t r a i n s ，i na d d i t i o n ，i t sf e r m e n t a t i o n b r o t hh a st h eh i g h e s tc o n t e n to fd i m e r u m i ca c i d ，t h ey i e l dr e a c h e d 0 4 7 3 m g m l t h e r e f o r e ，t h em p u r p u r e u ss m 0 0 5w a sc h o s e df o ri n i t i a l s t r a i no fo p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s b yl i q u i d s t a t e f e r m e n t a t i o n m o r e o v e r , t h em p u r p u r e u ss m 0 0 5a l s os h o w e dt h eh i g h e s t o fa b t sa n dd p p hs c a v e n g i n ga c t i o na n dt h ey i e l do fd i m e r u m i ca c i d i ns o l i df e r m e n t a t i o n ，a n dh a st h el a r g ed i f f e r e n c ew i t ht h eo t h e rt h r e e m o n a s c u ss t r a i n s o p t i m i z et h em e d i u ma n dc o n d i t i o no f f e r m e n t a t i o no fm p u r p u r e u s s m 0 0 5 t h es i n g l ef a c t o rt e s ta n do r t h o g o n a le x p e r i m e n tw e r ea p p l i e dt o i i i 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 i n d e n t i f yt h eh i g h e s tl e v e l so ft h ea n t i o x i d a n ta c t i o na n dd i m e r u m i c a c i d c o n t e n t ，t h er e s u l tw a sm a l t o s e4 ( 4 0g l ) ，p e p t o n e7 ( 7 0g l ) ，i n i t i a l p h5 5 ，t h eq u a n t i t yo fi n o c u l u m8 ，f e r m e n t a t i o nt i m e5 d t h e nt h r o u g h t h ea n a l y s i so fv a r i a n c eo fo r t h o g o n a le x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tt h e f e r m e n t a t i o nf a c t o r sc h o s e d h a v et h eh i g h l ys i g n i f i c a n ta f f e c tt ot h e m p u r p u r e u ss m 0 0 5f e r m e n t a t i o n t h ey i e l do fd i m e r u m i ca c i dr e a c h e d 5 812 4 - 0 6 0 9 m g m lb yv e r i f i c a t i o ne x p e r i m e n tw i t ht h eo p t i m i z a t i o n c o n d i t i o n ，12 - f o l d so ft h ev a l u ew i t h o u to p t i m i z a t i o n p e r i l l al e a fe x t r a c tc o n t a i n sav a r i e t yo fi n g r e d i e n t sw i t ha n t i o x i d a n t a c t i v i t y t h ew a t e re x t r a c to fp e r i l l al e a ff e r m e n t a t i o nw i t hm o n a s c u s ，t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h ee x t r a c to fp e r i l l al e a fb yu l t r a s o n i c a t i o nw a sb e t t e r t h a nr e f l u x t h ey i e l do fd i m e r u m i ca c i dh a ss i g n i f i c a n t l yi m p r o v e db y a d d i t i o nt h ef i l t r a t eo ft h ee x t r a c to fp e r i l l al e a ft ot h ef e r m e n t a t i o n m e d i u mb yu l t r a s o n i c a t i o n , t h ec o n t e n to fd i m e r u m i ca c i dr e a c h e d 3 1 0 4 4 - 0 0 8 6 m g m l ，i n c r e a s e d4 6 9 4 c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l ，w h i l e o n l y2 7 3 7 4 - 0 0 7 3 m g m lb yr e f l u x a n du s et h ef i l t r a t eo ft h ee x t r a c to f p e r i l l a l e a fb yu l t r a s o n i c a t i o ni n s t e a do ft h ed e i o n i z e dw a t e ri n f e r m e n t a t i o nm e d i u m ，t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h et e a cv a l u eo fa b t s a n dd p p h s c a v e n g i n g a c t i o nr e a c h e d7 1 2 4 4 - 0 0 6 1 m m o l la n d 1 8 0 0 + 0 3 0 6 m m o l l ，i n c r e a s e d3 7 8 6 a n d15 7 9 6 c o m p a r e dt ot h e c o n t r o lr e s p e c t i v e l y i v 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 k e yw o r d s ：m o n a s c u s ，a n t i o x i d a n t ，d i m e r u m i ca c i d ，p e r i l l al e a f , d p p h ，a b t s v 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 第一章绪论 1 1 红曲概述 众所周知，红曲在我国有千年以上的历史，如汉末王粲七释就有“西旅 游深，御宿素粲，瓜州红曲，参糅相半，软滑膏润，入口疏散 的记述，又如北 宋太祖时期陶谷杂采隋、唐及五代典故撰写的清异录中有“以红曲煮肉 之 说。其后，元代吴瑞( 1 3 2 9 年) 著日用本草中记载“红曲酿酒破血行药势 。 明代两位科学家，李时珍( 1 5 1 8 1 5 9 3 年) 著本草纲目；宋应星( 1 5 8 7 1 6 6 6 年) 著天工开物；在该两部世界名著中对红曲培制与用途皆陈述详备川。 红曲的发现起源于中国，它色泽鲜艳，用途甚多。我国早在明朝就利用它培 制红曲。红曲可用于酿酒、制醋、做豆腐乳的着色剂，并可作食品染色剂和调味 剂，还可做中药。而2 0 世纪3 0 9 0 年代，我国红曲的发展则落后于日本。自 1 9 7 9 年日本学者远藤章( e n d oa ) 发现红曲菌产莫纳可林k ( m o n a c o l i nk ) 能 降血脂后，轰动中国及世界，又激起国人多方面的深入研究和应用。近年在理学 方面较突出的阐述的论文有孙佰申和周立平就“红曲菌次级代谢产物丫氨基丁酸 g a b a 支路及其他代谢途径的关系”的研究，以三羧酸循环途径来阐述g a b a 的形成；尤其是周礼红对“红曲菌聚酮酶p k s s 和限制性酶介导的整合r e m i 研 究既有理论原理又有实践的指导技术。 近年来，随着人们对人工合成食品添加剂和化学药物对人体毒副作用的认 识，世界各国掀起了食用绿色食品和使用天然药物的热潮，红曲作为药食两用的 天然制品，起了极大的关注。 1 2 红曲的分类 红曲霉( m o n a s c u s ) 是一种小型丝状腐生真菌，按真菌学的分类方法，红曲 霉属真菌门( e u m y c o p h y t a ) ，子囊菌纲( a s c o m y c e t e s ) ，真子囊菌亚纲 ( e u a s c o m y c e t e s ) ，红曲霉属( m o n a s c u s ) 【2 1 ，该属在国内报道的有1 7 种，日本 有4 0 多种【3 1 。有关红曲菌属的分类目前有多种不同的方法。上世纪3 0 年代，佐 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 藤喜吉【4 】在普通真菌学中认为红曲菌属于不整子囊菌纲( p l e c t o m y c e t e s ) 下的 红曲属( m o n a s c u sv a nt i e g h e m ) 。魏景趔5 】的真菌鉴定手册则将红曲菌属归 为子囊菌纲( a s c o m y c e t e s ) ，曲霉目( e u r o t i a l e s ) ，曲霉科( e u r o t i a c e a e ) ，红曲霉属 ( m o 刀a s c u sw e n t ) 。张纪忠6 1 和俞大绂【7 1 等采用的分类系统是将红曲菌属归于真菌 f - ( e u m y c o t a ) ，子囊菌亚f 1 ( a s c o m y c o t i n a ) ，不整子囊菌纲，散囊菌目，红曲科 ( m o n a s c a c e a e ) ，这也是目前多数真菌学者所采用的分类系统。 红曲菌属以下种的分类及命名也比较混乱。红曲菌属自建立后的一百多年 间，各种文献中关于该属的种的记载有2 7 种之多，但有些种实际上是同种异名。 最初红曲菌种的分类是根据其来源、菌落和显微特征、产生的色素及发酵特性等 加以命名的。如佐藤喜吉根据菌落颜色、菌丝和闭囊壳的颜色、菌丝中颗粒的颜 色、对牛奶及明胶的作用，将红曲菌分为6 个种；饭冢广和林庆福【8 】根据红曲菌 在p d a 和在加了乙醇、普氏液、n a c l 的曲汁中的生理特性将红曲菌分为1 4 个 种；h a w s k w o r t h 和p i t t 【9 】按照不同菌落形态、菌丝生长速度、闭囊壳壁的颜色、 是否出现渗出物和子囊饱子的形态大小等特征，将文献中记载的2 7 种只归纳 为了3 个种：丛毛红曲菌似p i l o s u ss a w ) 、红色红曲菌( mr u b e r v a r lt i e g h e m ) 和 紫色红曲菌( mp u r p u r e u sw e n t ) 。b r i g e 和h a w s h w o r t h 进一步用生化测验证明了 这种分类方法的正确性【l o 】。至今已分离到的主要红曲菌菌株都可以包括在这三 类中。 中国科学院微生物研究所的李钟庆等【1 1 】通过对模式菌种和可靠菌株的调查 研究，利用培养特征对红曲菌属进行分类后重新确认了8 个种，即发白红曲菌( 必 a l b i d u s ) ，红曲红曲菌( 肱a n k a ) ，橙色红曲菌( 膨a u r a n t i a c u s ) ，巴克红曲菌( m b a r k e r i ) ，烟色红曲菌( mf u l i g i n o s u s ) ，丛毛红曲菌( 膨p i l o s u s ) ，紫色红曲菌 ( mp u r p u r e u s ) 和红色红曲菌( 肱r u b e r ) 。1 9 8 7 年b a r n a r d 与c a n n o n 发表m f l o r i d a n u s 新种【1 2 】。1 9 9 5 年c a n n o n 等发表两种新种：mp a l l e n s 、必s a n g u i n e u s ， 并依有性世代之形态加以分类【1 3 】。 1 3 红曲菌的生态习性、形态学及生活史 红曲菌是腐生菌，嗜酸，特别喜乳酸，故常出现在乳酸自然发酵的基物中， 如大曲、制曲作坊、酿酒醪液、青贮饲料、泡菜、淀粉厂等都是它们适于繁殖的 2 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 场所【6 1 。红曲菌生长适应的温度范围很广，为1 5 - - 一4 2 。c ，生长最适为2 5 3 0 。c 。 最适p h 为3 5 5 0 ，能耐p h 2 5 ，耐乙醇达1 0 。红曲的成员大都是兼性嗜高 渗透压的生物，例如在含2 5 甘油的g 2 5 n 培养基上都能生长。它们都能利用淀 粉、糊精、棉籽糖、麦芽糖、蜜二糖、纤维二糖、蕈糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、 l 。阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、乙醇、甘油、乳酸、苹果酸、琥珀酸、延胡索酸、 柠檬酸为碳源；能同化硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵为氮源，然而有机氮源是它们最 好的氮源。红曲菌能产生多种酶类，如葡萄糖淀粉酶，能水解直链淀粉、支链淀 粉、麦芽糖、麦芽三糖；0 【葡萄糖苷酶或称麦芽糖酶、蛋白酶等。红曲菌能自己 合成生物素、泛酸、烟酸、对氨基苯甲酸、肌醇、吡哆醇、硫胺素、核黄素、麦 角固醇等【1 4 】，故其生活能力很强。 红曲菌属的形态学可分为个体形态和群体形态( 即菌落) 等的特征。个体形 态包括以下3 个方面。 菌丝( h y p h a ) ：红曲菌属是菌丝有横隔的多细胞构造，无色透亮或含深浅不 同的红色色素，或含深浅不同的褐色色素；细胞多核，细胞中大都具有黄色油滴， 细胞壁光滑，但往往附有结晶的疣状物；菌丝具不规则的分枝，菌丝直径3 一- 6 1 x m ： 菌丝之间常有网结联合现象。 无性世代( a s e x u a lg e n e r a t i o n ) ：红曲菌属的无性生殖产生分生孢子。分生孢 子着生于菌丝顶端或侧面小梗顶端，单生或以向基德方式形成链。分生孢子细胞 具有平截的基部，单细胞，多核，含油滴，呈倒梨形或球形，壁光滑，通常透亮 或含色素。 有性世代( s e x u a lg e n e r a t i o n ) ：有性生殖产生闭囊壳，其过程是首先形成1 个多核的雄器，随后又产生雌性器官产囊器的前身。这时雌性器官分成两个细胞， 为受精丝和产囊器。当受精丝顶端与雄器接触后，雄器内的细胞质与细胞核通过 受精丝进入产囊器内，只行质配而不结合，同时形成初期的闭囊壳。产囊器膨大 长出产囊丝，产囊丝形成双核细胞并核配产生子囊母细胞，经3 次分裂形成子囊 孢子。子囊母细胞变成子囊，含8 个子囊孢子，子囊壁在子囊孢子成熟过程中即 解体。初期闭囊壳内的子囊及其孢子不是同时形成和同时成熟的。成熟后的闭囊 壳壁较薄，只有一两层细胞，无孔口，内含有成堆的子囊孢子。当闭囊壳破裂后 散出子囊孢子，子囊孢子萌发后形成多核的菌丝。 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 在培养过程中，红曲菌属的无性生殖和有性生殖几乎同步发生，唯分生孢子 发育快而子囊孢子发育慢而己。红曲菌属的生活史如图1 1 所示【1 4 】。 图1 1 红曲菌属世代繁殖生活史 无形世代繁殖：1 、菌丝2 、分生孢子3 、子囊孢子4 、子囊孢子萌发 有性世代繁殖：l 、菌丝5 、雄器和产囊器6 、受精丝的形成7 、形成不育菌丝将雄 器产囊器包围8 、原始闭囊壳9 、原始闭囊壳剖面1 0 、成熟闭囊壳剖面l l 、 子囊孢子1 2 、子囊孢子萌发 1 4 红曲菌抗氧化活性物质 1 4 1 色素 红曲色素长期作为食品着色剂，它与合成色素相比具有性质稳定，耐热性强 ( 1 0 0 。c 的高温色调保持不变) ，耐光性和对蛋白质着色性极好等特点。而且，食 用红曲安全无毒，是值得大力推广的食用天然色素。 目前已确定结构式的红曲色素有6 种：红色色素( r u b r o p u n c t a m i n e 红斑胺素 或称红斑红曲胺、m o n a s c o r u b r a m i n e 红曲红胺素或称红曲玉红胺) 、橙色色素 ( r u b r o p u n c t a t i n 红斑素或称红斑红曲素、m o n a s c o r u b r i n 红曲红素或称红曲玉红 4 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 素) 和黄色色素( m o n a s c i n e 红曲素、a n k a f l a v i n e 红曲黄素或称安卡红曲黄素) ， 其结构式如图1 - 2 所示，这6 种色素的物理化学性质互不相刚1 6 】。 o o o 红斑素( 橙色) o o 红斑胺素( 赤色) m e m e o m e o o 红曲红素( 橙色) m e o 红曲红胺素( 赤色) o 红曲素( 黄色) 红曲黄素( 黄色) 图1 - 2 红曲色素的不同组分 m e m e 连喜军等人用化学发光法分析红曲色素中各成分对羟自由基的消除作用，证 明三类红曲色素中红色素的抗氧化活性最强，其次为黄色素，而橙色素抗氧化活 性最差，而且不同分子量的红色素的抗氧化活性也存在差别【1 7 1 。c h i 1 8 】等用不同 的有机试剂提取红曲色素，证明正己烷提取的红曲色素具有很强的清除d p p h 自 由基的能力。屈炯等人采用薄层层析得到不同的红曲色素组分，分别测定了这些 色素组分在o h 体系、0 2 一体系和d p p h 体系三种抗氧化模型中的抗氧化活性， 得出红色色素组分和橙色色素组分在这3 中氧化模型中均表现出较高的抗氧化 活性，且其中一种红色色素在4 0 9 9 m l 浓度下o h 和d p p h 的清除率分别达到 5 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 了3 2 和6 4 ，比相同浓度下的v c 高2 0 和4 l 【1 9 】。 1 4 2d i m e r u m i ca c i d 1 9 9 9 年日本学者a n i y a 从红曲红曲菌中发现了具有抗氧化活性的物质 d i m e r u m i ca c i d ，确定其结构为一种对称不饱和的二聚体，其结构式如图1 3 所 示。d i m e r u m i ca c i d 具有强烈的清除d p p h 自由基以及较强清除羟自由基和超氧 阴离子自由基能力，同时它还具有铁离子螯合能力。 o 洲n n 图1 - 3 d i m e r u m i ca c i d 的化学结构式 h a n i y a 等人通过研究红曲对小鼠肝中毒的影响发现红曲制剂能够保护肝脏免 受乙酰胺基酚引起的损伤，其原因是红曲发酵物能清楚体内的自由基和活性氧代 谢物，抑制了因乙酰胺基酚引起的自由基和活性氧代谢物对肝脏的损害。此外， g a i n 与细胞内的u d p 结合形成u d p g a i n ，这种物质可以改变r n a 和蛋白质 的合成而导致肝损伤。少量l p s 与g a i n 结合后会形成更多的活性氧化物，a n i y a 等研究人员给小鼠注射g a i n 或g a i n l p s 后发现血清中a s t 和g s hs 型转移酶 活性显著增加，而用红曲发酵液处理后则受到抑制。也就是说，g a i n 或l p s g a i n 处理导致氧化应激，而且因此产生的活性氧化物与肝微粒中g s hs 型转移酶活 性的增加以及肝损伤有关。因此他们认为可能是红曲制剂能够清除由g a i n 加 l p s g a i n 引起的活性氧化物，从而抑制肝损伤 2 0 2 1 1 。此外，经研究发现d i m e r u m i c a c i d 可以抑制过氧化氢引起的脂质过氧化，对食用了含有红曲发酵物的小鼠， d i m e r u m i ca c i d 除了可以保护小鼠的肝脏免受半乳糖及脂多糖( l p s ) 诱导的肝 损伤外，对乙酰氨基酚引起的肝中毒以及由c c l 4 引起的肝中毒也有显著改善作 用。d i m e r u m i ca c i d 对于生物体内产生的氧化应激反应可以起到有效地抑制作用， 保持生物体内的氧化还原状态的稳定。 t a i r a 等人研究了红曲发酵物中抗氧化物质d i m e r u m i ca c i d 对小鼠肝微粒脂 质过氧化的影响，发现d i m e r u m i ca c i d 可以在极低浓度下抑制由n a d p h 引起的 6 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 脂质过氧化，在2 和2 0 p m 浓度下的抑制率分别达到了6 6 9 和1 0 0 ，而相同 条件下抗坏血酸的抑制率在l m m 和5 m m 时分别为5 8 3 n1 0 0 。另外， d i m e r u m i ca c i d 在2 0 0 p m 时也能完全抑制由二价铁离子引起的脂质过氧化。t a k a 等人还确定了d i m e r u m i ca c i d 在生物体内的抗氧化机理，如图1 - 4 所采”1 。 。嚏1 d a n l 坞：f e n 了1 m 咕，。h d ( i m 2 e r u m i e c a c c i d _ 7 4 l r 0 2 j d i m e m m i c i d 0 o h 了k r o o z啪k-v誊t u 2 ，吼 0 、n 人 占h hd i m e r u m i ca c i d 图1 4 d i m e r u m i ca c i d 的抗氧化机制 o x i d a n t s n i t r o x i d er a d i c a l 2 0 0 7 年，j u n - i c h iy a m a s h i r o 用添加大蒜发酵后得到的红曲中的d i m e r u m i c a c i d 和老鼠肝脏做实验，发现l g m 的d i m e r u m i ca c i d 就可以抑制水杨酸引起的 脂质过氧化，ib m 的d i m e r u m i ca c i d 量就可以极大提高g s h g s s g 的比例。同 时，i o o g m 的d i m e r u m i ca c i d 就可以抑制乳酸脱氢酶的生成，以及t - b h p ( 叔丁 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 基过氧化氢) 引起的脂质过氧化也被抑制【2 4 1 。 2 0 1 0 年，k e n t a r oy a n o 等人研究了d i m e r u m i ca c i d 对小鼠体内由脂多糖 ( l p s ) 引起的多药抗性蛋白2 含量减少的影响。在小鼠( 1 2 m g k g ) 体内注射 d i m e r u m i c aa c i d 进行预处理，发现由l p s 引起的亚细胞分布被消除，小鼠胆管 的g s h 释放和胆汁流量都下降。在注射l p s1 2 h 后，多药抗性蛋白2 和m r n a 的表达分别明显降低了5 8 和7 。相反的，用d i m c r u m i ca c i d 预处理的小鼠则 没有表现出多药抗性蛋白2 表达的下降和胆管中g s h 的释放【2 5 1 。 1 4 3 酚类物质 红曲发酵代谢产物中含有多种酚类化合物。f e n g 等人以薏仁为底物，用紫 色红曲进行发酵，其发酵产物用甲醇来分离提取，得到最多的具有抗氧化活性的 物质就是酚类，其提取物的抗氧化能力非常出色，同时，清除d p p h 和同亚铁离 子的螯合的能力的对比为红曲发酵薏米 红曲发酵去壳薏米 薏米 去壳薏米【2 6 1 。 y a n g 等人以大米为底物，用紫色红曲进行发酵，其发酵产物用甲醇来分离提取， 同样得到酚类。清除d p p h 的能力对比为红曲发酵大米 红曲发酵去壳大米 大 米去壳大米；亚铁离子的螯合能力对比为红曲发酵大米红曲发酵去壳大米 大 米 去壳大米【2 7 1 。l e e 等人以大豆为原料发酵红曲，用水来分离提取，得到主要 的抗氧化物质也是酚类。提取物清除d p p h 能力的对比，热水提取效果比冷水好； 对于亚铁离子的螯合能力，两种提取效果相差不大【2 8 1 。 1 4 4 黄酮类物质 黄酮类化合物具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗突变、抗衰老、抗肿瘤、 抗菌等。其中最为重要的是黄酮类化合物的抗氧化活性，主要表现在减少自由基 的产生和清除自由基两个方面2 9 1 。林杰于2 0 0 7 年对红曲中的功效成分进行分离， 得到总黄酮的量为1 0 2 6 一- , 1 3 6 2 m g g 红曲米【3 0 1 。张茂良等人报道，红曲中黄酮 和黄酮醇含量约为0 4 5m g g t 3 1 1 。 1 4 5d i h y d r o m o n a c o l i n - m v m o h a na d h a l e 于2 0 0 6 从紫色红曲中分离得到的一种有效的抗氧化物质 8 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 d i h y d r o m o n a c o l i n - m v ，它是d i h y d r o m o n a c o l i n - k 的衍生物，其结构式如图1 - 5 所利3 2 1 。 h 3 c 图1 - 5d i h y d r o m o n a c o l i n - m v 的化学结构式 1 5 红曲抗氧化应用 当前医学研究领域前三位的肿瘤、冠心病和衰老均与自由基引起的膜脂质氧 化性损伤有关。研究发现某些自由基过氧化物是促癌剂，o b e r l e y 观察到癌症病 人血液中s o d 浓度明显比健康人低，甚至消失。而多数心血管疾病都起因于自 由基脂质过氧化作用，如低密度脂蛋白( l d l ) 的氧化被认为是导致冠心病的主 要原因。而在食品中广泛用于稳定脂肪防止氧化保持食物新鲜的合成抗氧化剂如 b h t 、b h a 和t b h q 等由于具有潜在毒性和致癌作用而受到人们的排斥。在日 本，b h a 只能用于棕榈油和棕榈仁油抗氧化作用；美国、欧共体等国己禁止使 用合成抗氧化剂。许多国家对其添加量已加以严格限制，f a 0 w h 0 食品标准 法典明确规定了合成抗氧化剂的添加量。为了满足食品以及饲料( 宠物食品) 生产的需要，研究开发广谱、高效、安全的天然抗氧化剂已经成为食品添加剂研 究领域中的热点。 而红曲作为一种天然的功能性食品添加剂，其在抗氧化的应用方面，尤其在 保护肝脏、抗疲劳、抗炎症方面都已有相关研究。在保肝方面，红曲可以减少天 冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶的量，抑制n a d p h 引起的脂质过氧化，抑制水杨 酸引起的脂质过氧化，表现出了很好的保肝效果。对于抗疲劳，红曲可以有效地 提高运动时间，增强耐力，延迟疲劳的出现；延缓血液中葡萄糖的降低及血液中 乳酸及尿素氮浓度的增加，减少运动造成的脂质过氧化。此外，红曲对于炎症也 9 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 有很好地消除作用。 1 5 1 抗疲劳 黄谚谚等人【3 3 1 ，以及许红峰等人【3 4 】用红曲的菌丝体及发酵液来研究红曲对老 鼠运动耐力的影响，发现无论菌丝体还是发酵液都可以使老鼠的运动能力提高， 耐力增强，疲劳的出现延迟；运动后血糖下降减少，耐缺氧能力增强。w a n g 等 人利用小鼠游泳耐力实验发现红曲组比对照组有较长的游泳时间及较高的血糖 浓度，较低的血乳糖、血尿素及血红蛋白水平，提示红曲可延长小鼠的游泳时间， 有效延缓血液中葡萄糖的降低及血液中乳酸及尿素氮浓度的增加，可以延缓运动 后所造成脂质过氧化的情形并对耐久性运动具有改善生理功能之作用【3 5 1 。 1 5 2 抗炎症 王火炎等人用特异性炎症老鼠老研究红曲对炎症的作用，发现红曲对巴豆油 致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致小鼠腹腔内芽肿均有显著的抑制作用，与洛伐汀的抗 炎作用相近。此外，对于角叉菜胶背部气囊滑膜炎的大鼠，红曲能够明显减少炎 症渗出液体量，减少渗出液中的白蛋白、c 反应蛋白、丙二醛的含量和血清中的 c 反应蛋白和丙二醛的含量。表明红曲具有显著的抗炎作用，且其抗炎机制与抑 制炎性因子的渗出，降低c 反应蛋白含量及消除自由基、抑制脂质过氧化有关 【3 6 3 7 1 。 1 5 3 抗癌 红曲次级代谢产物m o n a c o l i nk 有阻止各种信号蛋白质( 例如r a sr h o ) 添 加1 5 碳或2 0 碳脂肪链的作用，能抑制致癌基因r a s 蛋白质添加1 5 碳的作用， 故可用来治疗蛋白质所诱导的各类固型瘤病变。另外，闭环型m o n a c o l i nk 会提 高癌细胞内的c k l s 含量，也具有抑制癌细胞生长的功效【3 引。红曲菌还可以产 生多种天然抗氧化剂如黄酮酚及d i m e r u m i ca c i d ，除具有保护肝脏的作用外，也 是深具潜力的防癌、抗癌药物【2 2 1 。红曲橙色素具有活泼羰基，很容易与胺基起 作用，不但可以治疗胺血症，而且很可能是优良的防癌物质。 1 0 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 1 6 红曲其他功能性代谢产物及其应用 1 6 1 降血脂物质m o n a c o l i nk 1 9 7 9 年，日本学者远滕章教授发现红曲霉能产生强力抑制胆固醇合成的活性 物质，并将其命名为m o n o c o l i nk 【3 9 1 ，其结构式如图1 - 6 所示。它都能有效抑制 胆固醇生物合成中的关键酶h m g c o a ( 3 羟基3 甲基戊二酰基辅酶a 还原酶) 的活性，从而调节人体内异常血脂的作用。1 9 8 5 年，又相继分离到m o n o c o l i nl x j 、d i h y d r o e r i n o l i n 和d m y d r o m o n a l i nl 等类似物，它们都具有相同的基本结 构，同时又都具有很强的降低胆固醇作用【4 0 1 。到目前为止，各国研究者发现的 h m g c o a 还原酶抑制剂主要还是以m o n a c o l i n 类物质为主，约有十余种，并且 大部分由红曲菌产生。 h 闭环型开环型 图1 - 6m o n a c o l i nk 的闭环和开环化学结构式 1 6 2 降血压物质丫氨基丁酸( g a b a ) 1 9 8 6 年，t s u j i 等报道了长期服用mp i l o s u s 生产的红曲可减少s h r ( 自发 性高血压大鼠) 血压的提高。1 9 8 7 年，k o h a m a 掣4 2 】自红曲中分离出y 氨基丁酸 ( 丫a m i n o b u t a n o i ca c i d ，g a b a ) ，其结构式如图1 7 所示。研究认为是丫氨基丁 酸及氨基葡萄糖在降血压方面起到了主要作用【4 3 】。也有研究认为红曲中除了p 氨基丁酸外，还存在其他的降血压活性成分】。 h o n h 2 o 图l 一7 丫- 氨基丁酸( g a b a ) 化学结构式 1 1 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 1 6 3 麦角固醇 从红曲发酵液提取的麦角固醇，是脂溶性维生素d 2 的前体，经紫外线光化 学反应后生成维生素d 2 。维生素d 2 对生命代谢调节有重要作用，能有效防治 幼儿的佝偻病，对促进孕妇和老年人的钙磷吸收也有明显作用【4 5 】。不仅如此， 麦角固醇还能防止钙流失，对治疗骨质疏松效具有良好效果，且远胜于普通的补 钙。毛宁删等人的实验发现，红曲中许多菌株都能不同程度的产生麦角固醇， 并且其中某些菌株已接近目前生产用的酵母的发酵水平，具有工业开发、应用价 值。 1 6 4 其他抑菌物质 红曲的抑菌活性，在我国明朝时期宋应星编著的天工开物中就有记载。 许多研究均肯定了红曲菌在生长代谢过程中能产生某些杀菌抑菌的活性物质。早 期人们认为是桔霉素( c i t r i n i n ) 在发挥这种作用，但在使用不含桔霉素的紫色红 曲菌d s m l 3 7 发酵的提取物进行肉类的防腐效果观察的一项研究中表明，可能 这些提取物中含其它抑菌物质。日本于1 9 9 1 年【4 7 1 、捷克斯洛伐克于1 9 9 6 年分 别从红曲中分离到一种能抑制g + 、g 菌的化合物a n k a l a c t o n e ，宫慧梅【4 8 】等报道 了橙色素具有一定的抑菌性，可抑制革兰式阳性菌以及大肠杆菌，进一步证实了 这种可能性，其原理可能在于红曲色素与蛋白质结合，导致蛋白质变性而抑制微 生物生长。 1 7 红曲应用的安全性问题 红曲代谢物中的桔霉素( c i t r i n i n ) 最早是在1 9 3 0 年从p c i t r i n u m 中发现的一种 对肾脏有危害的真菌毒素。1 9 8 1 年，香港中文大学的w o n gh c 等1 4 9 】首次分离 出红曲中的一种抑菌因子，将其命名为m o n a s c i d i n a 。1 9 9 3 年，法国b l a n c 教授 【5 0 】用质谱、核磁共振、紫外及荧光分析等多种方法对m o n a s c i d i na 进行结构测 定、定性分析，发现m o n a s c i d i n a 就是桔霉素，其结构式如图1 8 所示。 1 2 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 h o o o h 图1 8桔霉素的化学结构式 h a s s a n 等【5 l 】用核磁共振( n m r ) 方法证实了曲霉中橘霉素的合成途径，发现 红曲菌中的合成途径不同于青霉属，后者中的合成途径是由1 个乙酰辅酶与4 个丙二酰辅酶缩合为戊酮，而后进一步合成桔霉素的，而前者是以丁酮为前体， 进而生成色素和桔霉素的。该研究也为不产桔霉素的红曲发酵研究提供了基础。 桔霉素的存在给红曲的安全性带来了严峻挑战，并引起世界各国研究人员的 高度关注。目前德国及欧美各国已制订针对我国红曲出口新标准，严格限制红曲 中桔霉素的含量，对我国的红曲出口产生了很大的限制。 1 8 紫苏提取物的抗氧化活性 紫苏叶系唇形科紫苏叶属一年生草本植物，是我国传统的药食植物。紫苏叶 中主要含有萜类化合物、黄酮及甙类物质、类胡萝卜素、脂肪酸，还有各种蛋白 质和氨基酸，主要具有抗氧化防衰老、降血脂、降血糖、抗过敏、抗微生物等作 用，此外还有抗癌、抗炎、解热、止血、镇静、镇咳、止吐等功能。紫苏叶中有 含量较为丰富的迷迭香酸，其具有超氧化物清除活性，且其抗氧化活性比维生素 c 高，此外紫苏叶中还含有的黄嘌呤氧化酶阻碍剂能减少超氧自由基的形成，能 有效起到抗氧化作用，延缓机体衰老 5 2 , 5 3 , 5 4 】。 1 9 本论文的研究内容、目的和意义 1 9 1 主要研究内容 抗氧化活性检测及d i m e r u m i ca c i d 定量检测方法的建立； 1 3 浙江工业大学硕士学位论文：红曲发酵应用紫苏提取物影响其抗氧化作用之研究 红曲液态深层发酵高抗氧化活性菌株筛选； 红曲固态发酵高抗氧化活性菌株筛选； 对高抗氧化活性红曲菌株液态深层发酵条件优化； 红曲菌发酵中添加紫苏叶提取物对其抗氧化活性的影响； 1 9 2 研究目的及意义 红曲作为一种天然食品添加剂，相比较于各种合成添加剂，具有无毒，无副 作用等优点。而红曲中含有的多种功能性活性物质，例如降血脂物质m o n a c o l i n k 、降血压物质丫氨基丁酸( g a b a ) 、抗氧化活性物质d i m e r u m i ca c i d 、麦角固 醇、天然色素、多种黄酮类物质和酚类物质、抑菌物质等，尤其是多种抗氧化活 性物质，它们在