（环境科学专业论文）高效降解多环芳烃白腐真菌菌种的筛选及降解特性.pdf

东北林业大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nr e c e n td e c a d e s ，w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to ft h ei n d u s t r y , t h em i n ea n du s eo ff o s s i l f u e la r ea l s or a p i d l yi n c r e a s i n g , s y n c h r o n o u s l ya c c o m p a n y i n gw i t ht h es e r i o u sp o l l u t i o no f p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) ，w h i c ht h r e a t e n e dh u m a nh e a l t ha n dt h ew h o l e e c o l o g i c a le n v i r o n m e n t a m o n gt h ec o n t r o lt e c h n o l o g i e s ，m i c r o b i a lb i o d e g r a d a t i o ni s af r i e n d l y a n de f f e c t i v em e a n st or e m o v ep a l - i sf r o mt h ee n v i r o n m e n t ，w h i c hh a sb e e ne x t e n s i v e l yu s e d w h i t e r o tf u n g i ，a sh i v i a l ye f f i c i e n td e g r a d i n gs t r a i n s ，a l s op l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h er e m o v a lo ft h e p a h s 14l o c a lw h i t e - r o tf u n g i ，w i d e s p r e a dg r o w ni nt h ef o r e s tn o r t h e a s tc h i n a , w e r es c r e e n e d f o rt h e i ra b i l i t yt oe f f i c i e n t l yd e g r a d ep a h s t h r o u g ht h er e s e a r c ho nd e g r a d i n ga n t h r a c e n ea n d e n z y m ep r o d u c t i o nb y14w h i t er o tf u n g i ，w ee v e n t u a l l yo b t a i n e dh i g h l ye f f i c i e n td e g r a d i n g f u n g u s - p o l y p o r e l l u sp i c i p e s t h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yo fa n t h r a c e n ea f t e r 16d a y so f i n o c u l a t i o nw a s7 0 0 0 t h em a j o re n z y m e ss e c r e t e db yt h ef u n g iw e r el i p ，m n pa n dl a c ，a n d l a cw a st h em a i nd e g r a d i n ge n z y m e u n d e rt h ed e g r a d a t i o nc o n d i t i o n s ，t h em a x i m u ml a e a c t i v i t yr e a c h e d19 9 5 0 5 9 u l t h er e s e a r c ho ne n z y m ep r o d u c t i o n f o u n dt h a ta d d i n g a n t h r a c e n ed e l a y e dt h ee m e r g e n c eo ft h ep e a ka n da l s os t i m u l a t e dl a cs e c r e t i o n i nt h e p r e s e n c eo fa n t h r a c e n e ，l a ea c t i v i t ya c h i e v e d3 0 4 3 0 8 u lw h i c hw a sh i g h e rt h a nt h en o n a n t h r a c e n e i nt h es t u d yw eo p t i m i z e dt h el a es e c r e t i o nc o n d i t i o n sb yo r t h o g o n a lt e s ta n ds i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t s a f t e ro p t i m i z i n gm e d i u m ，t h em a i nc o m p o n e n t sa r e3 5g lw h e a tb r a n ，4 g lp e p t o n e ，p h 4 0 ( m e d i u mo t h e rc o m p o n e n t s ：1g lk 2 h p 0 4 3 h 2 0 ，0 5g lk c l ，0 5g lm g s 0 4 7 h 2 0 ，0 0 1g lf e s 0 4 7 h 2 0 ) t h em a x i m u ma c t i v i t yw a s8 1 4 9 2 2 3u la n d t h ea c t i v i t yp e r i o dw a sm o r et h a n3 0d a y s t h ep e a kl a s t e dl o n g e r o p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n s w e r e ：t h ei n o e u l u m s3 910 m mb a c t e r i a l ，t h et e m p e r a t u r e2 8 ，r o t a t i o ns p e e d16 0 r m i n a n o t h e rs t u d yo nt h ei n d u c e rf o u n dt h a t ，o 2 5 4i t m o l lc u 2 十h a dp r o m o t e de n z y m e p r o d u c t i o n ，b u tw i t ht h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g , t h es t i m u l a t i v er o l ew a sg r a d u a l l yr e d u c e d t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o nw a s0 5 _ t m o l l ；l o wc o n c e n t r a t i o no ft w e e n8 0c o u l dp r o m o t e e n z y m ep r o d u c t i o n ，w h i l eh i 曲c o n c e n t r a t i o nw o u l di n h i b i te n z y m ep r o d u c t i o n t h eo p t i m a l c o n c e n t r a t i o nw a so 1 2 5g l t h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yo fs i n g l ea n dc o m p o u n dp a h sw e r em e a s u r e do nt h eil t h ， 2 2 n d ，a n d3 3 r dd a ya f t e rt h ei n o c u l a t i o nu n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s t h ed e g r a d a t i o n e f f i c i e n c i e so ft h es i n g l ea n t h r a c e n e ，p h e n a n t h r e n e ，p y r e n ea f t e r3 3 dc u l t u r ew e r e9 4 7 6 ， 9 6 5 6 a n d5 7 5 3 r e s p e c t i v e l y , s ot h ef u n g u sd e g r a d e dp h e n a n t h r e n em o s te f f e c t i v e l y , f o l l o w e db ya n t h r a c e n e ，f i n a l l yp y r e n e ；t ot h ea n t h r a c e n e + p h e n a n t h r e n e ，a n t h r a c e n e + p y r e n e u a b s t r a c t t w oc o m p l e xp a h s ，t h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c i e so fp h e n a n t h r e n ea n dp y r e n ea f t e r3 3 dc u l t u r e w e r e9 9 4 6 a n d61 0 9 t h ec a p a c i t yo fd e g r a d i n gs i n g l ep a h sr e l a t e dt ot h es t r a i n s s t r u c t u r ea n dt h e i ro w n p r o d u c i n ge n z y m e 。t h ed e g r a d a t i o n so fp a h si nd i f f e r e n tv a r i e t i e s w e r ed i f f e r e n td u et ot h es t r u c t u r eo fp a h s 。w h i c hr e s u l t i n gi nd i f f e r e n tu s ee x t e n t f o rt h e s a m ek i n d so fp a h s ，t h ep e a ko fe n z y m ep r o d u c t i o nw a ss y n c h r o n o u sw i t ht h eh i 曲e s t d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c y t h er e s e a r c ho nd e g r a d a t i o no fc o m p l e xp a h sf o u n dt h a ta d d i n ga s m a l la m o u n to fa n t h r a c e n ec o u l de n h a n c et h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yo fp h e n a n t h r e n ea n d p y r e n e t h e r e f o r e ，a d d i n gl m w p a h sm a ya c h i e v em o r ee f f i c i e n td e g r a d a t i o no fh m wp a h s k e y w o r d s w h i t er o tf u n g i ；p a h s ；s c r e e n i n g ；l a c c a s e ；d e g r a d a t i o n i i i 1 绪论 1 绪论 1 1 引言 近几十年，由于自然原因( 如火山爆发、森林火灾) 和人为原因( 如石油等燃料的 开采和使用量的剧增) 造成环境中多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a b o n s ，p a h s ) 含量急剧增加。p a h s 是一类持久性环境有毒有机污染物，由于p a h s 较易与土壤有机 质结合，在环境中性质稳定，使得p a h s 在土壤的表层和次表层有逐渐富集的趋势1 啦】。 p a h s 对人类具有潜在的“三致”作用，引起了环境科学家的广泛关注，故对其的治理已 成为环境科学界重要的科研方向之一【1 9 1 。对p a h s 环境污染的治理措施中生物修复被 认为是治理环境中p a h s 污染最有效的手段，而生物修复中采用微生物降解p a h s 的研 究较为普遍。白腐真菌作为一类庞大的微生物体系，对物质的降解有其独特的优点，与 其它微生物不同，对降解底物具有非专一性，降解酶系具有非水解性，降解反应发生的 场所具有细胞外性。与细菌相比，白腐真菌对异生物质的降解具有动力学优势【l o l 。细菌 对异生物质的低亲和力( 高k m 值) ，导致降解过程的不彻底性，只能将异生物质降解 至一定水平；而白腐真菌通过自由基过程实现对化合物的降解，降解反应一般遵循准一 级动力学，作用酶系无真正意义上的i o n 值，有利于对异生物质的最终降解，故白腐真 菌能继续降解低浓度污染物并将污染物降解至近于零的水平。对于白腐真菌的代表菌 种一黄孢原毛平革菌，不论是微生物学方面，或是应用方面，国内外均研究的比较深 入，并取得了许多成果。与国外相比，利用我国本土白腐真菌对环境污染物的治理方面 的研究甚少，这就要求我们更加关注本土菌种的研究，充分开发和利用本土白腐真菌资 源。 1 2 多环芳烃概况 1 2 1 多环芳烃的毒性 多环芳烃大都是些无色或淡黄色的结晶，个别具深色，熔点及沸点均较高，所以蒸 气压很小，高度不溶于水，化学性质稳定，当它们发生反应时，趋向于保留它们的共扼 环状体系，多通过亲电子取代反应形成衍生物。p a h s 可以引起机体免疫抑制反应，表 现为血清免疫学指标改变，并且多环芳烃化合物及其衍生物具有很强的致癌、致畸和致 突变作用，对人体有极大的危害。王丽华等】，采用未经处理的焦油、焦炭粉尘( 含有 p a h s ) 给小鼠肺内染毒，其肺腺癌发生率达8 7 7 ，其次为癌肉瘤、鳞状细胞癌、淋巴 癌等；用液化石油气( l p g ) 给小白鼠染毒，其精子畸变数增加。s z c z e k l i k 等【1 2 】，通过 描述波兰焦炉工接触p a h s 的反应，论述了p a h s 引起机体的免疫抑制现象，工人的血 清i g g 和i g a 明显降低( p 9 9 。e r g u l 等【7 2 j ，在对橄榄油废水的研究试验 中，调查了白腐真菌中的t r a m e t e sv e r s i c o l o rf p r l2 8 ai n i 对废水的预处理情况，结果 显示，在摇瓶培养的条件下，真菌对酚类去除率达到7 8 ，在静止培养的条件下，真 菌对酚类去除率达到3 9 ；在不断搅拌的反应器里，酚类去除率达到7 0 。f a r a c o 等 1 7 3 1 ，研究了白腐真菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 和p l e u r o t u so s t r e a t u s 对有色工业废 水的脱色作用，结果显示：p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 在一天之内的脱色率达到 4 5 ，一周的脱色率达到9 0 ，而p l e u r o t u so s l r e a t u s 在一天之内的脱色率达到4 0 ，一 周的脱色率达到6 0 。 i 绪论 1 3 4 2 降解p a h s 、治理土壤污染物的研究 近年来，各国土壤环境普遍受到污染物的威胁，土质日益恶化，造成这些变化的原 因有多种，包括工业废水的农田排放，农业药剂的不断增加，有毒有害物质的以外排放 等等，对于土壤污染的治理已经成为环境科学家们工作的重点内容。邹世春等【7 4 1 ，进行 了白腐真菌降解氯代农药的实验研究，结果显示，在适宜条件下，白腐真菌对氯代农药 的最大降解效率可达9 0 以上，并通过g c m s 分析降解产物，推测出了可能发生的降 解反应。对d d t s 的降解过程的分析得出结论，在1 。l 位上的c l 原子与苯环直接相连 的c l 原子相比更易脱除。在d d t 系列农药的降解过程中，苯环上的脱氯和苯环的开 环反应是整个反应速度的决定步骤。陈静等【_ 7 5 】，研究白腐真菌对p a h s 的降解，结果表 明，温度、培养基、氧气浓度、水土比对p a h s 的降解均有影响，并且得出了优化条件， 即温度为2 5 、营养液为查氏培养基、通气量为6 0l d _ 1 、水土比为5 ：1 。钟伟等【7 6 1 ， 从胜利油田含油废水中分离得到能以原油为唯一碳源的3 株细菌，并且将该细菌与白腐 真菌共同作用于p a h s 。实验结果表明，此3 株细菌能够辅助白腐真菌降解p a h s ，提高 白腐真菌的降解率。此实验证明了，自腐真菌可以在细菌的协助下更有效的降解 p a h s ，为我们更好的利用白腐真菌提供了方法和新思路。s a s e k 等【7 7 l ，研究了两种白腐 真菌却“l a c t e u s 和p l e u r o t u so s t r e a t u s 对土壤中p a h s 的降解情况，1 0 周以后，菲， 葸，荧葸和芘的浓度下降到6 6 。a n d e r s s o n 等【7 引，研究了5 种自腐真菌( t r a m e t e s v e r s i c o l o ，p r l5 7 2 ，t r a m e t e sv e r s i c o l o ，m u c l2 8 4 0 7 ，p l e u r o t u so s t r e a t u sm u c l 2 9 5 2 7 ，p l e u r o t u ss a j o r - c a j um u c l2 9 7 5 7 和p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u md s m15 5 6 ) 对土壤中葸，苯并【a 】葸和二苯并葸的降解能力，白腐真菌在不同种类土壤环境中显示出 不同的降解能力，t r a m e t e s 的降解能力很弱，p h a n e r o c h a e t e 和p l e u r o t u s 几乎能够将葸 全部降解。 虽然，对于一些白腐真菌的研究利用上取得了较大成绩，但是目前还有许多污染物 的降解机理以及菌体的降解路径、方法不为我们所获知。所以，要求我们在此方面要继 续坚持不懈的钻研下去，挖掘更多、更好、更为我所用的治理技术和菌体本身的作用途 径，为我们更有效的治理污染、保护环境提供新思路、新方法。 1 4 前景展望 白腐真菌菌种的开发及技术的发展，是一个漫长的过程。在这几十年的发展历程 中，菌种应用技术的研究取得了长足发展，特别是代表性菌种巾幽菌的微生物学特征 和具体应用等方面的国际领域的研究都比较成熟。但是，对于我国本士白腐真菌的科研 以及应用，在环境保护领域里的发展还存在着许多问题。与国外相比，本土菌种各方面 性能的研究深度和大规模应用都存在着很大差距。所以，要求我们在以下几个领域里加 强对自腐真菌的研究： 首先，在本土菌种的开发利用方面，我国环保领域与国外相比差距甚大，科研人员 应该更加重视本土菌种的研究。在本实验室的研究进展中可见，本土白腐真菌对环境污 东北林业大学硕十学位论文 染物同样具有降解能力，并且降解潜力巨大。研究探索出本土菌种的最适降解条件，对 于有效利用其进行环保治理工程有重要意义。 其次，在白腐真菌的微生物学方面，如菌体物质、分子生物学的基因技术以及作用 的机理分析等领域，均存在着许多尚未探究明了之处。对于此方面的继续深入研究，有 利于了解菌体特征、作用机制，在此基础上，更有利于从多方面提高菌体利用效率。 最后，对于白腐真菌的研究，最终要应用到大规模工程实际当中，实验室研究要更 多接近实际环境条件，掌握菌种的应用条件，将其控制在最佳状态，使其为环保工作做 出重要贡献是研究白腐菌的最终目的。 1 5 本文研究的目的意义和内容 1 5 1 本文研究目的意义 1 5 1 1 论文创新点 本试验的创新点在于，采用中国东北长白山林区的1 4 种特色白腐真菌菌种，首次 进行毒性强、难降解污染物多环芳烃的高效降解菌的筛选，并且对筛选出的高效降解菌 进行产酶方法的优化研究，得出针对该菌种独特的培养方法。 1 5 1 2 目的意义 p a h s 具有分布广、毒性大、难降解、生物富集率高的特点，它可以引起机体免疫抑 制反应，表现为血清免疫学指标改变，并且多环芳烃化合物及其衍生物还具有致畸、致 癌和致突变等作用，对人体健康和生态环境均具有极大的危害性，对其进行治理已显得 十分重要。 白腐真菌是国内外学者一致认可的多功能菌类，对环境中难降解有机污染物具有高 效、广谱的降解功能。近二十年来该菌在各行各业的发展中得到了广泛的应用，特别是 在环境治理方面，该菌显示出了对环境污染物强大的去除能力。鉴于白腐真菌具有特殊 的生理学特性，以及其他微生物所不具有的特殊降解机制，尤其适合用于环境污染物的 降解，所以本试验选择了中国东北长白山林区本土特色白腐真菌进行实验研究，筛选出 的p a i l s 高效降解菌将成为庞大的白腐菌系中对环境净化有重要作用的菌种，也为p a h s 的降解增添新的力量。对其产酶优化和p a h s 降解方面展开的研究，也必将对更好的了 解自腐真菌及利用它进行环境污染的治理起到促进作用，为环境治理做出重要贡献。 1 s 2 本文研究的内容 由于微生物降解具有低成本、无二次污染的特点，更适合利用其进行环境污染的治 理，故本研究主要通过p a h s 降解菌种的筛选，选拔出更高效去除环境中的难降解物质 p a h s 的优良菌种，主要从东北地区土著白腐真菌中筛选高效降解p a h s 的优良菌种， 通过产酶条件优化提高其降解效率，以及利用优化后的条件进行p a h s 的降解研究。 本文研究的主要内容如下： l 绪论 1 、p a h s 高效降解菌的筛选 ( 1 ) 通过1 4 种白腐真菌的p a h s 降解效果对比分析出高效降解菌。 ( 2 ) 对筛选出的菌种进行降解机制的初步推测探索，包括菌种长势、菌种产酶与 降解作用的关系，以及p a h s 对菌种产酶的影响。 2 、高效降解菌的产漆酶条件优化研究 ( 1 ) 通过正交试验确定最佳产酶培养基。 ( 2 ) 对培养条件进行优化，包括菌种接种量、培养温度和摇晃转速。 ( 3 ) 研究分析诱导物对菌种产酶的影响，确定吐温8 0 和金属铜离子的最适合浓 度。 3 、高效降解菌的p a h s 降解实验研究 ( 1 ) 研究不同单质p a h s 的降解效果，探索降解机制。 ( 2 ) 研究复合p a h s 的降解效果，分析降解机制 东北林业大学硕士学位论文 2 中国东北林区高效降解多环芳烃白腐真菌菌种的筛选 伴随社会的发展，煤和石油等石化燃料在工农业生产、交通运输以及社会生活中被 广泛应用，导致p a h s 大量排放。由于p a h s 具有高毒、难降解的特性，且在环境内残 留时间长，故成为世界性关注的有机污染物，其在环境中的累积已经越来越严重的影响 和威胁着人类的健康，对其的治理已成为环境工作者刻不容缓的任务，世界各国学者纷 纷展开对p a h s 的治理研究。j a c q u e s 等 7 9 j ，从p a h s 污染土壤中分离得到5 种细菌 ( m y c o b a c t e r i u m f o r t u i t u m ， b a c i l l u s c e f e u s ， m i c r o b a c t e r i u m s p ， g o r d o n i a p o l y i s o p r e n i v o r a n s ，m i c r o b a c t e r i a c e a eb a c t e r i u n l ) ，7 0d 该五种混合菌的不同浓度蒽、 菲、芘的平均降解率为9 9 、9 9 和9 6 ，而当五种菌单独作用时降解率则明显下降。 l i 等瞪，在长期受多环芳烃污染的土壤中分离出五种真菌和三种细菌，分别在灭菌，非 灭菌接种分离菌种，非灭菌不接菌的条件下对多环芳烃进行6 4d 的降解研究，降解率分 别为3 5 ，4 0 7 和4 1 3 。t s a i 等【8 ，采用硫酸盐还原细菌降解菲，研究降解过程中 的三种重要因素：菲，硫酸盐和生物量浓度对菲的降解影响，结果显示当菲，硫酸盐和 生物量浓度依次为2 0m g l - 1 ，1 9 2 0m g l - 1 ，2 8m g l - 1 时，菲的降解率最高为7 7 。 李全霞等【8 2 1 ，从土壤中分离得到一株p a h s 高效降解菌，鉴定为分枝杆菌属，该菌能以 芘、荧葸等多种p a h s 为唯一碳源生长，在芘含量为5 0 、1 0 0 、2 0 0m g l _ 1 的无机盐液 体培养基中，1 6d 降解率分别达到7 6 9 、9 1 8 和7 9 2 3 。 白腐真菌降解机理独特，降解酶系对底物的选择具有高度非特异性，使其作用物质 非常广泛，包括重金属离子、染料、各种工业废水、农药化肥、有机物等【8 3 8 9 】；降解 作用发生的细胞外性，决定了白腐真菌对包括p a h s 在内的许多高毒环境污染物能够有 效降解，而不被毒害f 9 0 q 3 1 。p o z d n y a k o v a 掣舛1 ，研究考察了平菇漆酶对于p a h s 的降解 能力，结果显示，该酶对多种p a h s 均具有降解效果，葸( 9 l ) 、菲( 7 2 ) 、芴 ( 5 3 5 ) 、芘( 6 5 5 ) 、荧葸( 6 9 7 ) 、和花( 7 3 ) 。c a j t h a m l 等【9 引，证实耙齿菌 能有效的作用于多种p a h s ，并得到葸对于芘等p a h s 的降解有促进作用的结论。 m o h a m m a d i 等f 】，采用白腐真菌代表种一黄孢原毛平革菌，进行降解葸的研究，研究结 果显示，该均能够有效地降解葸，降解率达到8 4 。 本研究选择中国东北林区普遍存在的1 4 种自腐真菌进行p a h s 降解菌种的筛选， 旨在开发中国本土白腐真菌优良菌种，进行有毒有机污染物一p a h s 的高效降解，修复 其造成的环境污染，为更有效利用本土特色白腐菌提供理论基础和技术支持。 2 中国东北林区高效降解多环芳烃白腐真菌菌种的筛选 2 - 1 材料与方法 2 1 1 实验材料 2 1 1 1 供试菌种 灵芝( g a n o d e r m al u c i d u m ) ，香菇( l e n t i n u se d o d e s ) ，猴头( h e r i c i u mc a p u t m e d u s a e ) ( 购于黑龙江应用微生物研究所) ； 毛革盖菌( c o r i o l u sh i r s u t u s ) ，树舌( e l f v i n g i aa p p l a n a t a ) ( 东北林区分离得到，保 藏于东北林业大学林学院森林病虫病理实验室) ； 青顶拟多孔菌( p d 咖o r e l l u sp i c i p e s ，5 4 9 ) ，贝叶多孔菌( p d 切o r e l l u sf r o n d o s u s ， 5 7 9 0 ) ，多毛栓菌( t r a m e t e sh i s p i d a ，5 6 0 ) ，裂褶菌( s c h i z o p h y l l u mc o m m u n e ，5 5 3 ) ， 烟色烟管菌( b j e r k a n d e r af u m o s a ，5 1 7 2 ) ，血红密孔菌( p y c n o p o r u ss a n g u i n e u s ， 5 8l5 ) ，彩绒革盖菌( c o r i o l u su e r s i c o l o r ，5 1 6 1 ) ，火木层孔菌( p h e l l i n u si g n h 2 r i u s ， 5 9 5 ) ，大孔多孔菌( p d 妇o r u sa l v e a l a r i s ，5 6 5 5 ) ( 购于中国科学院微生物研究所) 。 2 1 1 2 主要培养基 固体培养基：称取去皮马铃薯2 0 0g ，切成小块，加适量( 完全浸没马铃薯) 蒸馏 水，煮2 0 - 3 0m i n ，用9 层纱布过滤出马铃薯浸出液，加入葡萄糖2 0g ，k 2 h p 0 43 0 g ，m g s 0 4 7 h 2 01 5g ，琼脂2 0g ，蒸馏水定容至ll 。 马铃薯液体培养基：称取去皮马铃薯2 0 0g ，切成小块，加适量( 完全浸没马铃 薯) 蒸馏水，煮2 0 - 3 0r a i n ，用9 层纱布过滤出马铃薯浸出液，加入葡萄糖2 0g ， k 2 h p 0 4 3 0g ，m g s 0 4 7 h 2 01 5g ，蛋白胨5g ，蒸馏水定容至ll 。 2 1 1 3 主要仪器与药品 称取一定量蒽( 纯度 9 8 ) 溶于丙酮，配置成1 0 0m g l 标准溶液，工作液采用逐 级稀释法配置。 气相色谱仪；超声波水浴箱；旋转蒸发仪；7 2 1 型分光光度计；高速离心机：振荡 培养箱；生化培养箱。 2 1 2 试验方法 2 1 2 1 降解试验 向每个1 5 0m l 三角瓶中加入2 5 m l1 0 0m g l 葸丙酮溶液，放置通风橱中过夜，待 丙酮挥发完毕后取出，加入5 0 m l 马铃薯液体培养基，配制5 m g l 蒽溶液。灭菌后，接 种两片直径为1 0m m 的菌片，每个样品做三个平行，设置空白样品。在2 8 、1 2 0 r m i n 条件下培养，降解周期为1 6d ，测定降解率。 东北林业大学硕士学位论文 2 1 2 2 多环芳烃的提取 液相采用环已烷萃取，量取与待萃取的菌液等体积的环己烷放入分液漏斗中，剧烈 震荡，放置，待溶液分层后，将上层有机相倒入蒸馏瓶，下层水相倒入另分液漏斗 中，重复操作两次后，弃去水相；为了将p a h s 提取完全，对三角瓶里的菌片同时进行 提取，即向装有剩余菌片的三角瓶内加入2 0m l1 ：1 的环已烷和丙酮混合液，超声提取 2 0m i n ，重复操作两次后，弃去菌片。将每次液相与茵片萃取获得上层有机相合并入蒸 馏瓶，在4 5 下，旋转蒸发，浓缩至1 5m l 左右，收集于气相色谱小瓶，待测。 超声波提取法是美国e p a 推荐的p a h s 提取方法之一。该方法适合于p a h s 等结构 稳定的化合物的提取，并且能够破碎细胞，提取出菌体内的p a h s 。操作简单，速度 快，溶剂用量少，萃取效率高m 。 2 1 2 3 多环芳烃提取剂选择试验 含葸溶液及浓度的制备同2 1 2 1 ，溶液配制后，p a h s 的提取方法同2 1 2 2 ，待测 回收率。 2 1 2 4 多环芳烃的定性定量分析 采用气相色谱法【9 5 1 。 气相色谱条件：进样量l “l ，气化室温度2 6 0 ，分流比5 0 ：l ； 分离柱：a g i l e n t1 9 0 9 1 j - 4 1 3h p 一55 p h e n y lm e t h y ls i l o x a n e ( 3 0 0m 3 2 0 p m x 0 2 5i z m ，直径) ； 程序升温：初温2 0 0 ，中温2 6 0 ，升温速率5 m i n ，于2 6 0 ，保留3 r a i n ； 检测器：f i d 检测器，温度2 8 0 。 2 1 2 5 酶活测定方法 l 、粗酶液的制备：将菌种接入液体培养基，培养一定时间，移液枪移取lm l 培养 液于离心管中，9 0 0 0r m i n 离心1 0m i n ，上清液即为粗酶液。 2 、木质素过氧化物酶活力的测定f 叫：利用l i p 将藜芦醇氧化成藜芦醛，用可见。紫 外风光光度计测定3 1 0n m 处0 - - 2m i n 内吸光度值随时间的变化，从而得知酶反应速 率，进而推算酶活。定义每l m i n 氧化ll a m o l 黎芦醇为黎芦醛所需的酶量为1 个活力单 位。 ( 1 ) 酶活测定所需试剂：2m m o l l 黎芦醇；0 4m m o l lh 2 0 2 ；5 0m m o l l 酒石酸 酒石酸钠缓冲溶液( p h 2 5 ) 以及一定量的粗酶液。 ( 2 ) 酶活测定步骤： 空白样( 4m l ) ：0 4m l2m l5 0m m o l l 缓冲液一0 4m l0 4m m o l lh 2 0 2 - - 0 4 m l2m m o l l 黎芦醇一2 8m l 去离子水 2 中l 国东北林区高效降解多环芳烃白腐真菌西种的筛选 皇霉毫譬皇皇富= 葛= = = 詈鲁昌暑鲁暑葛富詈墨篁皇! ! 暑! 皇= 鼍! ! ! = ! 竺! 鼍! ! 皇暑皇= 詈! ! ! ! = = 暑= = = = ! 暑= = = = 暑= 皇詈皇詈暑暑昌宣号昌皇詈詈暑昌昌毒薯! 曩 样品( 4m l ) ：0 4m l 2m l5 0m m o l l 缓冲液一o 4m l0 4m m o l lh 2 0 2 - - 0 4m l2 m m o l l 黎芦醇一1 8m l 去离子水一lm l 酶液 用紫外分光光度计检测3 1 0n m 处吸收值变化，1 0s 间隔读数，记录2r a i n 内吸光度 值的变化。 酶活计算公式为：l i p 酶活( u m l ) = 等詈砖= 2 5 8 1 坠a t 砖( 2 - 1 ) 若测得酶活较小，则可采用u l 为单位。 即：酶活( u l ) = 百a a 尝专= 2 5 8 1 0 a t a 吉 t 曲vtv 式中：根据测得的吸光度值变化即可绘制吸收值时间关系曲线，等即为斜率； 坳为测定酶活的反应混合物的总体积，4m l ； s 为反应产物的吸光介质常数，9 3 0 0t o o l dc n l 一； b 为比色皿的厚度，1g i l l ； 1 ，为测定酶活的反应混合物中粗酶液的体积，单位为m l ； 2 5 8 l 为公式推导计算出来的系数。 3 、锰过氧化物酶活力的测定啪】：利用m n p 将m n 2 + 氧化成m n 3 + ，m n 3 + 与酒石酸结 合形成复合物，用可见紫外风光光度计测定2 3 8n m 处7 0 s 内吸光度值对时间的变化， 从而得知酶反应速率，进而推算酶活。定义每lm i n 氧化li 工m o l m n 2 + 为m n 3 + 所需的酶 量为1 个活力单位。 ( 1 ) 酶活测定所需试剂：1m m o l l h 2 0 2 ；1m o l l 酒石酸一酒石酸钠缓冲溶液 ( p h 5 o ) ：lm m o l lm n s 0 4 以及一定量的粗酶液。 ( 2 ) 酶活测定步骤： 空白样( 4m l ) ：0 4m llm o l l 缓冲液一o 4m l 1m m o l lm n s 0 4 - - 2 8m l 去离子 水一o 4m l1m m o l l h 2 0 2 样品( 4m e ) ：0 4m llm o l l 缓冲液一0 4m l lm m o l lm n s 0 4 一1 8m l 去离子水 - - 0 4m llm m o l l h 2 0 2 一lm l 酶液 用紫外分光光度计检测2 3 8n l n 处吸收值变化，1 0s 间隔读数，记录7 0s 内吸光度 值的变化。 酶活计算公式为：m n p 酶活( u m l ) = 箐尝砖= 3 6 9 2 竺a t 砖 ( 2 2 ) 若测得酶活较小，则可采用u l 为单位。 即：酶活( u l ) ：坐鱼三：3 6 9 2 0 竽土 t曲 va t v 式中：根据测得的吸收值变化即可绘制吸收值时间关系曲线，等即为斜率； 东北林业大学硕士学位论文 y o 为测定酶活的反应混合物的总体积，4m l ： 为反应产物的吸光介质常数，9 3 0 0m o | dc m ； b 为比色皿的厚度，1c m ； v 为测定酶活的反应混合物中粗酶液的体积，单位为m l ； 3 6 9 2 为公式推导计算出来的系数。 4 、漆酶活力的测定【1 0 1 】：利用l a c 氧化a b t s ，用可见紫外分光光度计测定4 2 0 l l l n 处0 - - 3m i n 内吸光度值对时间的变化，从而得知酶反应速率，进而推算酶活。定义 每1m i n 转化li - t m o l2 ，27 一连氮二( 3 乙基苯并噻唑6 磺酸) ( 简称a b t s ) 所需的酶量 为1 个活力单位。 ( 1 ) 酶活测定所需试剂：5m m o l la b t s ；0 2m o l l 醋酸一醋酸钠缓冲溶液 ( p h = 5 0 ) 以及一定量的粗酶液。 ( 2 ) 酶活测定步骤： 空白样( 4m l ) ：2m l 0 2m o l l 缓冲液一0 4m l a b t s - - 1 6m l 去离子水 样品( 4m l ) ：2m l0 2m o y l 缓冲液一o 4m la b t s o 6m l 去离子水一1m l 酶 液 用紫外分光光度计检测4 2 0n n l 处吸收值变化，3 0s 间隔读数，记录2 1 0s 内吸收值 变化。 酶活计算公式为：l a c 酶活( u m l ) ：竺华! ：6 6 6 7 坐! ( 2 3 ) a t曲va tv 若测得酶活较小，则可采用u l 为单位。 即：酶活( u l ) ：竺选! ：6 6 6 7a a 三 t 曲v a tv 式中：根据测得的吸收值变化即可绘制吸收值时间关系曲线，竺即为斜率； f v o 为测定酶活的反应混合物的总体积，4m l ： s 为反应产物的吸光介质常数，9 3 0 0m o l 。c m ； b 为比色皿的厚度，it i n ： 1 ，为测定酶活的反应混合物中粗酶液的体积，单位为m l ： 6 6 6 7 为公式推导计算出来的系数。 2 2 结果与分析 2 2 1 不同提取剂的多环芳烃回收率 该方法采用液一液萃取。目前，在p a h s 的分离提取中应用较多的提取剂是正己烷 2 6 , 7 5 , 1 0 2 1 。本研究针对正己烷和环己烷做提取剂的提取效果进行比较。从表2 一l 中可见， 对于p a h s 的溶解性和萃取效果环己烷明显优于正己烷，环己烷对蒽的回收效果明显高 2 【f l f q 东北林区- 效降解j - f 芳烃 1 腐真荫种的筛选 j ：正己烷【1 0 3 1 。 名称 丧2 1 葸的州【1 5 二私 同收率 正己烷 环己烷 6 2 4 3 士2 5 6 9 4 1 9 土2 8 9 2 2 21 4 种白腐真菌对蒽的降解效果 在2 8 、l2 0r r a i n 条件下，测定1 4 利- 白腐真菌1 6d 对葸的降解效果。图2 一l 为 1 4 种菌的1 6d 葸降解效果对比图。 1 4 种白腐真菌c t l 降解率在5 0 以上的菌种有4 种。其中，降解牢最高的为7 号， 青顶拟多孔菌，降解率为7 0 ；其次为l 号，灵芝，降解率为5 8 7 6 ；再次为彩绒革 盖蔺和血红密孔菌，降解率分别为5 5 1 9 和5 4 8 3 。 8 0 7 0 6 0 余5 0 萎4 0 澄3 0 2 0 1 0 0i 钔i 。置n l 2 ：j4 5 6 7b91 0l1l z1 3l q 菌种编 ， 图2 11 4 种白腐真菌1 6 d 蒽降解率 注释：菌种编号1 1 4 依次代表一灵芝、香菇、猴头、树舌、毛革盖、贝叶多孔菌、青顶拟多孔 菌、娴色烟管菌、裂褶菌、彩绒革盖苗、多毛栓菌、血红密孔菌、大孔多孔菌、火水层孑l 菌。 2 - 2 - 3 两种多环芳烃高效降解菌降解机制初探 2 2 3 1 两种高效降解菌的长势情况与蒽降解率的关系 在2 8 、1 2 0r m i n 条件下，观察青顶拟多孔菌和灵芝1 6d 的k 势情宁况。图2 2 和 图2 3 分别是灵芝和 顶拟多孔菌的生长照片。 f 于顶拟多- 孑d - 1 7 f 1 - l l x g 于灵芝而言，在具有较高降解率f 佝