（发酵工程专业论文）鱼精蛋白工程化研究.pdf

鱼精蛋白工程化研究 摘要 鱼精蛋白是一类存在于各类雄性动物成熟精巢组织中的多聚阳离子肽。 鱼精蛋白用作新型的食品防腐剂和药物，证实具有耐热、抗菌、安全和多种 保健作用等优点。但同时在提高鱼精蛋白的耐酸性、增加抑制革兰氏阴性菌 能力和减少溶血方面需要继续研究。这些研究取得的进展，有助于发展鱼精 蛋白在乳品添d n - 齐u 中的应用，有助于研发新型抗菌素。 本文旨在通过改变天然鱼精蛋白的氨基酸序列，提高鱼精蛋白的耐酸 性、赋予和提高鱼精蛋白抑制革兰氏阴性菌能力以及在酸性条件下协助提高 酪蛋白的稳定性。为鱼精蛋白大规模生产应用提供更好的目的基因。 本论文人工设计合成了一种鱼精蛋白一一将天然鲑鱼精蛋白序列 p r r r r s s s r p v r r r r r p r v s r r r r r r g g r r r r 改变成p r r r r s s s r p v r r r r r p r v s s s r r r r g g r r r r 。由此降低了天然鱼精蛋白的两个正电荷，增 加了疏水性，新产生了一个与连续精氨酸残基相邻的丝氨酸簇，形成了相似 于酪蛋白中的两个局部序列( 精氨酸左右侧连续出现丝氨酸) 。 通过对革兰氏阳性菌，包括金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 、枯 草杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 和四联球菌( m i c r o c o c c u st e t r a g e n u s ) 以及革兰氏阴性 菌，包括大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 和圆褐固氮菌( a z o t o b a c t e rc h r o o c o c c u m ) 五种菌的抑制效果试验发现，新设计合成的鱼精蛋白对革兰氏阴性菌大肠杆 菌和圆褐固氮菌的最低抑菌浓度分别是2 5 0 “g m l 和5 0 01 a g m l ，较天然鱼精 蛋白硫酸盐对革兰氏阴性菌的抑制效果稍有提高。同时新设计合成的鱼精蛋 白对革兰氏阳性菌表现出了更好的抑制效果，尤其是对四联球菌的抑制效果 较之天然鱼精蛋白硫酸盐稍有提高，1 2 5 “g m l 的添加量对其仍有良好的抑 制效果。 本文首次研究了添加鱼精蛋白对牛奶体系稳定性的影响，并且取得了较 好的效果。将1 0 0 0l a g m l 、8 0 0 “g m l 、5 0 0 肛g m l 、2 5 0p g m l 、1 2 5 “g m l 五 种不同浓度梯度的新设计合成的鱼精蛋白和天然鲑鱼精蛋白硫酸盐溶液各 0 3m 1 分别添加到3 5m l 新鲜牛奶中，用8 柠檬酸在低于2 0 条件下调酸， 结果显示新设计合成的鱼精蛋白较天然鱼精蛋白硫酸盐对牛奶耐酸稳定性 有少许提高，如果能够降低鱼精蛋白的使用成本，适当的多添加一些会有更 好的效果。鱼精蛋白对牛奶稳定性影响的实验结果，与我们前面的理论分析 和设想正好吻合，正是我们前面对蛋白质结构与功能分析的直接的事实说 明。 将1 0 0 0g g m l 、8 0 0g g m l 、5 0 0g g m l 、2 5 0g g m l 、1 2 5g g m l 五种不同 浓度梯度的新设计合成的鱼精蛋白和天然鲑鱼精蛋白硫酸盐溶液各o 3m l 添加到3 5m l 新鲜牛奶中，把牛奶在室温下放置( 环境温度在1 2 2 0 之 间，时间为三月底到四月初) ，静置观察新鲜牛奶的存放天数，出现分层的 先后顺序。结果显示：未加鱼精蛋白的空白对照管6h 即可见分层，加入天 然鲑鱼精蛋白硫酸盐溶液的样品管可以放置1 2 1 5h ，加入新设计合成的鱼 精蛋白的样品管可以放置2 0 2 4h 。新设计合成的鱼精蛋白较天然鲑鱼精蛋 白硫酸盐对混合菌群的抑制效果好些，而两者相比不加任何鱼精蛋白的新鲜 牛奶都要好，说明鱼精蛋白对混合菌群确有抑制作用。 关键词：鱼精蛋白，氨基酸序列，人工设计，抗菌肽，抗菌特性，稳定性 e n g i n e e r i n gs t u d yo fp r o t a m i n e a b s t r a c t p r o t a m i n ei sak i n do fc a t i o n i ca n t i m i c r o b i a lp e p t i d ef o u n di nt h en u c l e a ro f s p e r mo f d i f f e r e n tm a l ea n i m a l s p r o t a m i n eu s e da san e wt y p eo f d r u g sa n df o o d p r e s e r v a t i v e ，i sp r o v e nt oh a v et h ea d v a n t a g e so fh e a tr e s i s t a n c e ，a n t i b a c t e r i a l p r o p e r t y , s a f e t ya n dh e a l t hc a r e ，a n ds oo n 。b u ta tt h es a m et i m e ，i ti sf o u n dt h a t i m p r o v i n g p r o t a m i n ea c i d - r e s i s t a n c e ，i n c r e a s i n gt h ec a p a c i t yo fi n h i b i t i n gg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i aa n dr e d u c i n gt h eh e m o l y t i cn e e dc o n t i n u a l l yt ob es t u d i e d r e s u l t so ft h e s es t u d i e sc o n t r i b u t et ot h ea p p l i c a t i o no fp r o t a m i n ea sd a i r y a d d i t i v e sa n dc o n t r i b u t et ot h ed e v e l o p m e n to fn e wa n t i b i o t i c s t h ep u r p o s eo f p a p e rb yc h a n g i n gt h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fp r o t a m i n ei s t oe n h a n c et h ea c i dr e s i s t a n c eo fp r o t a m i n e ，t oi m p r o v ec a p a c i t yo fp r o t a m i n e i n h i b i t i n gg r a m n e g a t i v eb a c t e r i aa n dt oh e l pi m p r o v et h es t a b i l i t yo fc a s e i n p r o t e i ni na c i d i cc o n d i t i o n s i ti st op r o v i d eb e a e rt a r g e tg e n e sf o rt h ea p p l i c a t i o n o fl a r g e - s c a l ep r o d u c t i o no f p r o t a m i n e i nt h ep a p e r , a na r t i f i c i a lp r o t a m i n eh a db e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d - c h a n g i n gt h es e q u e n c eo fp r o t a m i n ep r r r r s ss r p v r r r r r p r v s r r r r r r g g r r r ri n t op r r r r s s s r p v r r r r r p r v s s s r r r r g g r r r r a f t e rt h ee n g i - n e e r i n go fs e q u e n c e ，t h et w op o s i t i v ec h a r g e sw e r er e d u c e d ，t h eh y d r o p h o b i co f t h es e q u e n c ei n c r e a s e da n dt h es e r i n ec l u s t e rw a sa d d e d a sar e s u l t ，i ti ss i m i l a r t ot h ec a s e i np r o t e i na tt h et w op a r t i a ls e q u e n c e s ( a r g i n i n el e f t r i g h ts i d eo f s u c c e s s i v es e r i n e ) i nt h e p a p e r , g r a m p o s i t i v eb a c t e r i a ：s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，b a c i l l u s s u b t i l i sa n dm i c r o c o c c u st e t r a g e n u s ；g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a ：e s c h e r i c h i ac o l i a n da z o t o b a c t e rc h r o o c o c c u ma st h et r i a l s t r a i n s ，k e t a m y k i s s - 5 h a db e t t e r a n t i m i c r o b i a lp r o p e r t yt h a nt h ep r o t a m i n es u l f a t eo nt h eg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a t h em i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o no fe s c h e r i c h i ac o l ia n da z o t o b a c t e r c h r o o c o c c u ms e p a r a t e l yw a s2 5 0 t g m la n d5 0 0 “g m 1 a tt h es a m et i m e ， k e t a m y k i s s - 5 h a db e t t e ra n t i m i c r o b i a lp r o p e r t yo nt h eg r a m - p o s i t i v eb a c t e r i a , 12 5p g m lo f k e t a m y k i s s 一5s t il lh a dg o o de f f e c to nm i c r o c o c c u st e t r a g e n u s f o rt h ef i r s tt i m e ，t h ee f f e c to fp r o t a m i n eo nt h es t a b i l i t yo ft h em i l ks y s t e m i i i w a si n v e s t i g a t e d ，a n ds o m eg o o dr e s u l t sw e r eo b t a i n e d 0 3m ls o l u t i o no f k e t a m y k i s s - 5a n dp r o t a m i n es u l f a t ew i t hc o n c e n t r a t i o no f10 0 0 g m l ，8 0 0 “g m l ， 50 0p g m l ，2 50i t g m l ，12 5 “g m lr e s p e c t i v e l yw a sa d d e dt o35m lf r e s hm i l k ， t h e n8 c i t r i ca c i dw a sa d d e dt oa r e q u i r e dp ha t2 0 t h er e s u l t ss h o w e dt h a t k e t a m y k i s s - 5w a sb e r e rt h a np r o t a m i n es u l f a t ei nr e s p e c to ft h es t a b i l i t yo fm i l k i ft h ec o s to fp r o t a m i n ew a sr e d u c e d ，t h eb e r e rr e s u l t sw o u l db eo b t a i n e dw i t l l m o r ea d dv o l u m e e x p e r i m e n t a lr e s u l t so f p r o t a m i n ei nr e s p e c to ft h es t a b i l i t yo f m i l kw e r ec o i n c i d e dw i t ho u rp r e v i o u st h e o r e t i c a l a n a l y s i sa n d i d e a t h e p r e v i o u sa n a l y s i so fp r o t e i ns t r u c t u r ea n df u n c t i o nw a st r u t h o 3m ls o l u t i o no fk e t a m y k i s s 一5a n dp r o t a m i n es u l f a t ew i t hc o n c e n t r a t i o no f 10 0 0p g m l ，8 0 0v t g m l ，5 0 0i t g m l ，2 5 0 i _ t g m l ，12 5 t g m lr e s p e c t i v e l yw a s a d d e dt o35m lf r e s hm i l ka tr o o mt e m p e r a t u r e ( r o o mt e m p e r a t u r ew a sb e t w e e n 1 2 0 ca n d2 0 ，a tt h ee n do fm a r c ht oe a r l ya p r i l ) s t o r i n ga n do b s e r v i n gt h e m i l k ，r e c o r d i n gt h ed a y so ft h em i l kw i t ht h ea p p e a r a n c eo fp r e c i p i t a t i o n r e s u l t s s h o w e dt h a t ：b l a n kc o n t r o lt u b ew i t hn oa d d i t i o no fp r o t a m i n es t r a t i f i e da f t e r6 h o u r s ，s a m p l et u b ew i t ha d d i t i o no fs a l m o np r o t a m i n es u l f a t es o l u t i o nc a ns t a n d l2 15h o u r s w h i l es a m p l et u b e w i t ha d d i t i o no fd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d p r o t a m i n ec a ns t a n d2 0 2 4h o u r s d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e dp r o t a m i n eh a dt h e b e r e ra n t i m i c r o b i a lp r o p e r t yt h a ns a l m o np r o t a m i n es u l f a t eo nt h em i x e d b a c t e r i a ，b u tt h et w ow e r eb e r e rt h a ns a m p l e sw i t hn oa d d i t i o no fp r o t a m i n e t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tp r o t a m i n ei n d e e dh a da n t i m i c r o b i a l p r o p e r t yo nm i x e d b a c t e r i a k e y w o r d s ：p r o t a m i n e ，a m i n oa c i ds e q u e n c e ，a r t i f i c i a ld e s i g n ，a n t i b a c t e r i a l p e p t i d e s ，a n t i b a c t e r i a lp r o p e r t i e s ，s t a b i l i t y i v 陕哺科技人学硕十学位论文 原创性声明及关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出 重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：p 趋 日 期： 2 0 0 7 错月 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解陕西科技大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅乖借阅；本人授权陕西科技大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学 位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供 信息服务。 敞澄精絮鬈枷磊们0 0 7 蝴 论文作者签名：孓p 焘丑导师签名王彬钿期：2 0 07 年月 鱼精蛋白i ：程化研究 l 绪论 1 1 鱼精蛋白的研究进展 自弗莱明发现青霉素以来，抗生素一直是人类治疗因病原微生物感染引起的疾病的 有力武器，但是随着“传统抗生素”的大量使用，致病菌的耐药性逐渐增强，“抗生素时代” j 下逐渐走到尽头，目前最好的抗生素也逐渐失去效果，所以寻找新的抗菌药物已成为备 受关注的焦点f l 】。鱼精蛋白作为一类多聚阳离子肽，目前，已从多种鱼类( 如鲑鱼、虹 鳟鱼、鲱鱼等) 和哺乳动物( 如老鼠、人、野猪等) 的成熟精巢组织里提取得到，由于 其抗菌机制不同于传统抗生素，并且对哺乳动物等真核细胞无害，所以这类多肽逐渐成 为研究的热点，在食品和医药等相关领域有巨大的应用潜力。 1 1 1 鱼精蛋白的理化性质与分类 a 鱼精蛋白的理化性质 鱼精蛋f 3 ( p r o t a m i n e ) 又称精蛋白，是一类存在于各类雄性动物成熟精巢组织中的多 聚阳离子肽，主要存在鱼类( 如鲑鱼、虹鳟鱼、鲱鱼等) 成熟精子细胞核中，以核精蛋 白的形式存在，且与d n a 结合紧密。鱼精蛋白是一种小而简单的球形碱性蛋白，一般 由3 0 5 0 个氨基酸组成，其中以精氨酸为主。鱼精蛋白的等电点在1 0 1 2 之洲引，带正 电荷，能溶于水或稀酸中，但可被稀氨水沉淀。鱼精蛋白加热不易凝固且较为稳定。鱼 精蛋白在鱼类精巢中的含量极不稳定，随性腺的成熟度而变化很大。 鱼精蛋白的结构也因鱼种不同而有差异，但是它们存在许多相似的特征，如n 端均 为精氨酸或者丙氨酸，各种鱼精蛋白分子肽链中都含有4 个较长的和2 个较短的精氨酸 簇，并且分别被特征性的残基s e r 或t h r ，p r o i l e ，g l y g l y 或v a l - v a l 分隔开。 b 鱼精蛋白的分类 按照氨基酸组成的种类和数量，鱼精蛋白可以分为3 种：单鱼精蛋i 刍( m o n o p r o t a - m i n e ) ，碱性氨基酸只有精氨酸一种，如鲑鱼精蛋i 刍( s a l m i n e ) 、乌鱼精蛋i 兰t ( m u g i l l i n e ) 、 鲱鱼精蛋i 兰t ( c l u p e i n e ) 和虹鳟鱼精蛋i 刍( i r i d i n e ) ；双鱼精蛋i 圭t ( d i p r o t a m i n e ) ，碱性氨基酸 除了精氨酸外，还含有组氨酸或赖氨酸，如鲤鱼精蛋( j ( c y p r i n i n e ) ；三鱼精蛋白( t r i p r o t a m i n e ) ，碱性氨基酸含有精氨酸、组氨酸、赖氨酸三种，如鲟精蛋i 刍( s t u r i n e ) 。研究表 明，不同鱼种的鱼精蛋白在氨基酸的组成比例上有很大的差别( 见表1 1 ) 。另外，国内 外大多数学者认为鱼精蛋白并不是单一成分，而是由相互非常类似的数种成分组成的混 合物。国外一些学者在研究鱼精蛋白时，也发现鱼精蛋白是经过“组蛋白一中间蛋白_ 精 蛋白”这一过程转变而来，并且发现中间蛋白有两种结构异构体，这可能是鱼精蛋白分子 结构中含有两种或更多成分的原因。 ：i ：本论文中人工设计的鱼精蛋白序列已经申请发明专利保护 陕西科技人学硕十学位论文 匕，：表不不舍该种氨基酸 1 1 2 鱼精蛋白的生物学功能 鱼精蛋白具有广谱抑制活性，能抑制枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌等 的生长，对革兰氏阳性菌、酵母、霉菌也具有明显抑制效果【_ 瑚】。日本人研究了鲱精蛋白 和鲑精蛋白对1 7 种常见的食品腐败菌和致病菌的抑制作用( 见表1 2 ) ，革兰氏阳性菌 的发育受到了明显的抑制作用，而革兰氏阴性菌几乎不受影响。其原因可能与这两类细 菌表面的构造不同有关。 对革兰氏阳性细菌来说，因菌种与性状差异，鱼精蛋白的最小抑制浓度( m i c ) 也不 同，如表1 3 所示。由此可见，一般情况下，鱼精蛋白的最小抑制浓度( m i c ) 在1 0 0 0 “g m l 以下，表明鱼精蛋白对这些微生物的生长有很强的抑制作用，尤其是对巨大芽孢杆菌 ( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 和凝结芽胞杆菌( b a c i l l u sc o a g u l a n s ) 的抑制作用更强，其最小抑制浓 度( m i c ) 仅为7 5i _ t g m l 。此外在不同的食品及环境条件下，鱼精蛋白的最小抑制浓度( m i c ) 2 鱼精蛋白：l j 稃化研究 也会有所不同。另外，鱼精蛋白能抑制好气性细菌孢子发芽后的发育，若与加热灭菌法 并用，则效果更好；而且能有效地抑制肉毒梭状芽孢杆菌中的a 型、b 型及e 型菌的发 占f o 表1 - 2 鱼精蛋白对细菌发育的抑制作用 t a b i 一2i n h i b i t o r ye f f e c t so fp r o t a m i n eo nb a c t e r i a 注：对发育无抑制；4 - ：对发育稍有抑制；+ ：对发育有抑制；+ + ：能显著地抑制发百。 研究还发现鱼精蛋白的抗菌活性受其它多种因素的影响，如金属离子、酸碱度、温 度、有机成分和菌种等。p h6 0 以上时有明显的效果，且随着p h 值的增加活性增强， 但p h 值为5 0 以下时其抗菌效果微弱【9 1 。一般说鱼精蛋白热稳定性好，在常、温 1 2 l 范 围内加热对鱼精蛋白的抑菌活性无显著影响。m 孑+ 、c a 2 + 、f e ”等高价金属离子对鱼精 蛋白的抑菌活性有一定的影响【l o l ，但一价金属离子以及食品营养成分对其抗菌活性影响 较小。加入的离子浓度越大影响越大，e d t a 的加入可以螯合溶液中的离子，因而可以 增强鱼精蛋白的抗菌活性。1 引。 3 陕两科技入学硕十学位论文 表卜3 鱼精蛋白抑制细菌发育的最低浓度( m i c ) t a b 1 - 3m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n so fp r o t a m i n eo nb a c t e r i a 菌种 鱼精蛋i 1 ( i t g m l 培养基) 鲱精蛋白 鲑精蛋白 1 1 3 鱼精蛋白的作用机理 从国内外学者对鱼精蛋白抑菌作用的报告中，可以看出鱼精蛋白是通过作用于细胞 的以下3 个部位来起作用的：一是作用于细胞壁和细胞膜系统；二是作用于遗传物质或 遗传微粒结构；三是作用于细菌细胞内的酶系统或功能蛋白”6 1 。鱼精蛋白既可以作用 于细菌细胞壁，又可以作用于细胞质膜：攻击细胞壁时，可能是鱼精蛋白以分子中多聚 精氨酸或多聚精氨酸与其他少数几个氨基酸以某种结构或形式与细菌细胞壁结合，破坏 细胞壁中的肽聚糖的合成，从而达到抑菌的效果；攻击细胞质膜时，可能是与磷脂头部 的负电荷( 即阴离子结合位点) 通过静电引力相互作用，定位于膜的表面，一方面影响 膜质子动力，另一方面与膜中一些涉及营养运输和生物合成系统的蛋白质作用，影响它 们的功能。与上述机理相反的观点是：这种机理认为鱼精蛋白不会导致细胞的破裂，细 胞能保持某种意义上的完整性。所以一般认为，鱼精蛋白至少是通过作用于细菌细胞的 2 个部位( 细胞壁和细胞质膜) 来实现其抑菌的目的，而不仅仅是作用于某个部位，其 最终抗菌效果是由作用于这2 个部位产生的效果的叠加。关于鱼精蛋白会不会导致细菌 细胞的裂解还需研究证明。 除此之外，鱼精蛋白还有其它的作用部位，如有研究人员发现鱼精蛋白在半致死浓 度时对基因转录的抑制【l 。另外，它可以不引起细胞溶解或改变细胞渗透性而发挥抑菌 作用，如使细胞丧失积累亮氨酸的能力，因而不能进行蛋白质合成，破坏能量转导和营 养摄取功能；降低a t p 的浓度，并抑制氨基酸的运输，表明损害了细胞产生质子动势的 能力【l 引。鱼精蛋白的抑菌机理究竟是怎样的，目前还是各持己见，没有形成定论，有待 4 鱼精蛋白t 程化研究 于进一步研究和探索。 1 1 4 影响鱼精蛋白抑菌效果的因素 a 温度的影响 由于大部分关于鱼精蛋白的研究工作都是在细菌最适生长温度( 3 0 c 3 7 c ) 下进行 的，因此温度对其抑菌作用的影响在很长一段时间并不被人们所认识。目前，研究表明 细菌的不同属、不同种甚至同一个种的不同菌株对鱼精蛋白的敏感性受温度的影响是不 同的。1 9 9 7 年，j o h a n s e n 等在研究中发现温度影响鱼精蛋白的抑菌活性。当培养温度从5 升到2 5 时，单核细胞增生李斯特氏菌( l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ) 对鱼精蛋白的抗性增加， 而腐败希瓦氏菌( s h e w a n e l l a p u t r e f a c i e n s ) 对鱼精蛋白更加敏感【1 9 1 。t r u e l s t r u ph a n s e n 等【2 0 l 发现，温度对蜡状芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) ，热杀索丝菌( b r o c h o t h r i xt h e r m o s p h a c t a ) 和清 酒乳杆菌( l a c t o b a c i l l u ss a k e ) 的敏感性没有影响。李斯特菌属( l i s t e r i a ) d ? 的两个种无害李 斯特氏菌( l i s t e r i ai n n o c u a ) 和单核细胞增生李斯特氏菌，以及腐败希瓦氏菌a 2 菌株和摩氏 摩根菌( m o r g a n e l l am o r g a n i i ) 随着温度降低抗性增强，而金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ) 在1 0 ( 2l 1 - , 1 8 更敏感。单核细胞增生李斯特氏菌1 9 11 5 菌株在低温抗性增强，而 0 3 2 菌株在低温时更敏感。 bp h 的影响 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，甚至霉菌对鱼精蛋白的敏感性均受p h 影响【2 1 1 。而且 鱼精蛋白的抑菌作用受培养基的p h 影响较大，在中性到碱性p h 范围内具有较低的最小抑 菌浓度( m i c ) 和最小杀菌浓度( m b c ) 。 鱼精蛋白在高p h 下抑菌活性增强，可能是因为高p h 致使细菌外膜负电基团增加，从 而促进鱼精蛋白( p i 1 0 ) 与细菌外膜的静电作用。t r u e l s t r u ph a n s e n 和g i l l 也认为p h 影响鱼 精蛋白对细菌表面的亲合性，从而影响其抑菌效率。鱼精蛋白在中性或碱性p h 范围内对 细菌表面有最大的静电亲合性，因而具有更高的抑菌效率l 2 2 】。 c 阳离子和e d t a 的影响 p h 和离子强度影响细胞膜表面电荷，鱼精蛋白在中性到碱性p h 条件和低离子强度的 条件下抑菌效果最好口3 1 。科研人员发现c a 2 + 能够减弱鱼精蛋白的抑菌效果，认为高浓度 的c a 2 + 能够对细胞壁的肽聚糖层造成轻微的损坏 2 4 1 。鱼精蛋白能够抑制单核细胞增生李 斯特氏菌，大肠杆菌和腐败希瓦氏菌的氧气消耗，添力l c a 2 + 印- - 和m 9 2 + 能够解除该抑制，再 添加e d t a 又可使该抑制恢复。t r u e l s t r u ph a n s e n 等也发现，在鱼精蛋白抑菌实验的培养 基中加入e d t a ，对鱼精蛋白的抑菌作用有促进功能。 二价阳离子可以保护细胞质膜和肽聚糖上的负电荷的磷脂，稳定细菌表层的整体结 构，因此能解除鱼精蛋白的抑菌作用。而e d t a 能够通过螯合c a 2 + 和m 矿+ 来摧毁细菌细 胞被膜，i 劭c a 2 + f 1 1 m 9 2 + 通常能够稳定革兰氏阴性菌的脂多糖层和革兰氏阳性菌的肽聚 陕两科技人学硕+ 学位论文 糖层。这样就使得阳离子抗菌肽能够更容易的渗透进入细胞质膜。e d t a 也能够释放内 源性的磷脂酶来进一步降解细胞质膜。 除了以上几个影响鱼精蛋白抑菌效果的主要因素外，还有其它一些因素，例如细胞 膜的渗透性、蛋白水解酶类、竞争相同结合位点的化合物或者通过非特异结合能够除掉 鱼精蛋白的化合物，以及实验中培养细胞的数目、鱼精蛋白的浓度和培养基的内部参数 等等。 1 2 鱼精蛋白分子设计研究进展 天然的鱼精蛋白并非完美无缺，大部分天然鱼精蛋白存在抗菌活性不强、抗菌谱相 对较窄、合成成本较高、在具有对病原微生物高杀灭活性的同时往往伴随着对真核生物 的毒副作用和对蛋白酶敏感等不足。因此如何提高鱼精蛋白抗菌活性、扩大抗菌谱、降 低合成成本和最大程度降低鱼精蛋白毒性成为其分子设计的目的，也是目前多肽药物开 发的难点和希望所在。到目前为止，国内外的学者在鱼精蛋白设计方面做出了大量的工 作，同时也取得了很多可喜的成果。 1 2 1 鱼精蛋白分子设计原理 蛋白质工程是指人们在深入了解蛋白质空间结构以及结构与功能关系，并且在掌握 基因操作技术的基础上，设计和改造蛋白质，借以改善蛋白质的物理和化学性质，如提 高蛋白质的热稳定性、酶的专一性等，使之更好地为人类所用。 蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案。蛋白质的分子设 计按改造部位的多寡分为3 类：第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现；第 二类为“中改”，对来源于不同蛋白的结构进行拼接组装；第三类为“大改”，也就是完全 从头设计全新的蛋白质( d en o v op r o t e i nd e s i 弘) 。 小改是指已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换，这是目前蛋白质工程中最广 泛使用的方法。这种方法通过定点突变技术或盒式替换技术有目的改变几个氨基酸残基， 借以研究和改善蛋白质的性质和功能。 蛋白质的分子设计可以分为两个层次：一种是在已知立体结构基础上所进行的工作， 直接将立体结构信息与蛋白质的功能相关联的高层次的设计；另一种是借助于一级结构 的序列信息及生物化学性质，在未知立体结构的情形下所进行的分子设计工作。第一种 类型的分子设计工作实际上在利用二级结构信息的同时也运用了一级结构序列及有关生 化信息，即第一类的分子设计工作实际上已经包含了第二类工作。 蛋白质分子设计的过程简单说来就是，首先建立所研究对象的结构模型，在此基础 上进行结构与功能关系研究，然后提出设计方案；通过实验验证后进一步修正设计。往 往需要几次循环才能达到目的。一般的分子设计工作可以按以下5 个步骤进行： ( 1 ) 建立所研究蛋白质的结构模型，可以通过x 射线晶体衍射、二维核磁共振等测定 6 鱼精蛋白- g li 化研究 结构，也可以根据类似物的结构或其它结构预测方法建立起结构模型。 ( 2 ) 找出对所要求的性质有重要影响的位置。同一家族中的蛋白质的序列比对和分析 往往是一种有效的途径。需要认真考虑此种性质受哪些因素的影响，然后逐一对各因素 进行分析，找出重要位点，这是分子设计工作的关键。 ( 3 ) 选择一系列在( 2 ) 中所选出位点上改变残基所得到的突变体，一方面使蛋白质可能 具有所要求的性质，另一方面又尽量维持原有结构，使其不做大的变动。尽量在同源结 构中此位点已有的氨基酸残基表中进行选择，同时考虑残基的体积、疏水性等性质的变 化所带来的影响。 ( 4 ) 预测突变体的结构。 ( 5 ) 定性或定量计算优化所得到的突变体结构是否具有所要求的性质。 所谓中改也即分子剪裁，是指在蛋白质中替换1 个肽段或者1 个结构域。蛋白质的立 体结构可以看作由结构元件组装而成。因此可以在不同的蛋白质之间成段地替换结构元 件，期望能够转移相应的功能。 大改，即从头设计( d en o v o ) 蛋白质分子，是指从氨基酸残基出发，即从一级序列出 发，设计制造自然界中不存在的全新蛋白质，使之具有特定的空间结构和预期的功能。 一般地讲，只有当完全掌握了一级结构的规律，掌握了高级结构与生物功能相关性，才 有可能真正地从头设计。显然目前还做不到这一点。但是鉴于已经有成千上百个蛋白质 分子结构获得测定，并且从中已经总结得到许多规律性的经验，因此进行从头设计的尝 试是可行的。 蛋白质分子设计工作的大部分是在计算机终端上完成的。要设计具有一定功能的蛋 白质，首先要设计正确折叠的蛋白质。设计的第一步是选择目标，确定所要建造的三级 结构。就目前的水平而言，所选择的目标均是一些残基不多( 6 0 8 0 个残基) 、结构简单并 且具有对称性的多肽结构，这类结构在自然界中广泛存在，例如四螺旋束、上下p 筒结构、 希腊b 筒结构等，而且人们对此类结构研究得较多，因而有许多经验规则可循。 选定目标之后就要进行序列设计，选择的序列应尽可能地不同于天然结构的序列。 设计时要充分考虑氨基酸形成特定二级结构的倾向性。例如设计仅螺旋时，应选择像l e u 、 g l u 等易于形成q 螺旋的残基，设计全d 结构时，应选择v a l 、i l e 等易于形成p 折叠中的残基； 而在设计转角时常选择p r o a s n 残基对。选择和排布残基时，还要考虑到疏水相互作用、 螺旋的偶极稳定作用、静电相互作用以及残基侧链的空间堆积，尽可能地使序列有利于 形成预期的二级结构。当选择好氨基酸残基后，需通过理论预测方法预测出所设计的多 肽的二级结构和三级结构，初步检验设计的成功与否，并在此基础上加以调整和更正， 使得目标模型达到预期的目标。目前二级结构预测主要有c h o u - f a s m a n 方法、g a m i e r 方 法和c o h e n 方法等，所依据的基本思想是信息论和概率统计规律；三级结构预测方法和 7 陕两科技人学硕十学位论文 构象搜索方式很多，例如系统搜索方法、分子动力学、蒙特卡洛方法等，所依据的基本 原则是能量最低原理( 来鲁华等，1 9 9 3 ) 。 对蛋白质分子进行理论设计之后，还需要在实验室中通过合成工作将其付诸实现， 检验设计的成功与否。多肽化学合成方法，特别是固相合成技术，为设计思想的实现提 供了途径。与此同时，基因工程技术的发展为人工合成蛋白质开辟了广阔的前景。 1 2 2 鱼精蛋白分子设计方法 阳离子抗菌肽分子设计是指基于结构与功能关系，通过一系列生物信息学方法，实 现对天然阳离子抗菌肽的定向改造或全新设计，获得更加符合需要的非天然序列，并阐 明其活性机制，供进一步开发利用。在阳离子抗菌肽设计的过程中，生物信息学起到了 极其重要的作用。众多的生物软件和网络在线工具给科研工作者提供了极大的方便。利 用n c b i 的c l u s t a lx 程序和网络在线工具h t t p ：b i o i n f o g e n o t o u l f r m u l t a l i n m u l t a l i n h t m l ，以 f a s t a 格式输入多个抗菌肽分子序列，序列比对得到抗菌肽分子的一级保守序列；利用生 物软件d n a s t a r 、v e c t o rn t ia d v a n c e 、a n t h e p r o t 和网络工具h t t p ：a l e x a n d e r c o m p b i o u c s f e d u - n o m i n n p r e d i c t h t m l 进行序列的二级结构分析；利用a n t h e p r o t 软件的h y d r o - p h o b i c i t y 计算出该肽段亲水和疏水位点，用h e l i c a lw h e e l 获得三维螺旋轮结构，并分析螺 旋两侧和整体的亲水和疏水状态；r a s m o l 和v e c t o r n t ia d v a n c e 等软件能够绘出多肽的三 维结构供研究者参考。 到目前为止，国内外学者使用不同的设计方法对阳离子抗菌肽进行序列的改造，总 结起来可以分为四种：基于抗菌肽结构与功能的设计方法、基于抗菌肽抗菌机理的设计 方法、抗菌肽氨基酸残基侧链的化学修饰和其他设计方法。 a 基于抗菌肽结构与功能的设计方法 抗菌肽种类繁多，结构上以三种类型为主：( 1 ) 形成q 螺旋的抗菌肽；( 2 ) 含c y s 形成 二硫键的抗菌肽；( 3 ) 富含1 2 种氨基酸的抗菌肽，例如富含p r o 和h i s 【2 5 j 。抗菌肽的结构 功能研究以及分子设计，目前大部分集中于两亲a 螺旋抗茵肽，原因在于：仅- 螺旋抗菌 肽分布最广，数量最多，并具有广谱抗性。该类抗菌肽长度短( “o 个残基) ，易于化学 合成。线性结构简单，易于通过圆二色谱分析和多维核磁共振进行结构测定【2 们。基于以 上特点，两亲a 螺旋抗菌肽已成为分子设计的首选对象。因此，在众多的抗菌肽分子设 计方法中，以天然序列为模板，维持抗菌肽两亲( 3 t 螺旋结构不变，取得了很大的成就。 1 ) 残基替换 残基替换就是替换天然序列中的一个或多个氨基酸残基。s o n gy u bs h i n 2 7 1 等人将天 然的0 【螺旋抗菌肽k l 6 w k w k k l l k k l l k l l - n h 2 ) 的l e u 6 替换茂p r o ( k w k k l p k k l l k l l - n h 2 ) ，残基替换后的k 6 l 6 w 表现出的抗菌活性可以和蜂毒肽相媲美，然而其溶血活 性远低于蜂毒肽。同时证明了p r o 出现在两亲a 螺旋抗菌肽中，对抗菌肽的选择性毒性起 8 鱼精蛋白一i i 程化研究 到了完美的效果。s a w a i l 2 8 】等在保留两亲q 螺旋结构的前提下进行单残基突变，用g l y 取 代抗菌肽o v i s p i r i n 1 ( k n l r r i i r k i i h i i k k y g ) 第1 0 位的i l e ，结果克服了对红细胞的溶血 活性，并提高了抗菌活性。y a n g a 2 9 1 等研究了富含a r g 和p r o 的抗菌肽瞄t 印t i c i l l ，他们将 抗菌肽序y d p a r g 替换为l y s ，发现虽然两者的构象没有显著的差别，但替换后的抗菌肽 活性提高了2 倍而且溶血活性大大降低。原始的抗菌肽具有极强的结合两性离子和阴离子 的能力，而l y s 替换后与两性离子的结合能力降低，仅与阴离子有极强的结合能力。 国内的葛晓东【3 0 1 等人将l l 3 7 1 拘g l u l 6 、a s p 2 7 年1 g l u 3 6 m g l n 、a s n 、g i n 所替换，在不 改变l l 3 7 两亲0 【螺旋结构的前提下，增加了序列的净电荷，实验证明，替换后序列的抗 菌活性有所增加，同时降低了l l 一3 7 的溶血活性。 2 ) 截取天然抗菌肽的部分序列 众所周知，人源性的l l 3 7 及g k e 两个抗菌肽就是