（细胞生物学专业论文）刺松藻多糖生物活性的初步研究.pdf

， ，1 0 学位论文独创性声明 4 i 1 llrull lui i lll l iii y 18 9 0 7 8 6 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和 致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的 启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名盈碰盘 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名： 五毖亟 指导教师签名： 签名日期： ，f年月方日 l - 1 j q 1 ， 、c r i 辽宁师范大学硕士学位论文 刺松藻多糖生物活性的初步研究 摘要 本文采用热水浸提一乙醇沉淀法提取刺松藻多糖，并对刺松藻多糖抑制肿瘤细胞生 长、诱导凋亡、抑制肿瘤细胞迁移的生物活性进行研究，并对其抗凝血作用进行初步探 讨。采用m 丌比色法检测刺松藻多糖对人肺腺癌a 5 4 9 细胞增殖的影响；h o e c h s t 3 3 2 5 8 染色，观察被刺松藻多糖处理后的a 5 4 9 细胞是否发生凋亡的形态学改变。采用免疫细 胞化学、w e s t e r nb l o t 法检测刺松藻多糖对a 5 4 9 细胞凋亡相关蛋白b c l - 2 的表达水平。 利用b o y d c nc h a m b e r 模型实验观察刺松藻多糖作用a 5 4 9 细胞以后，细胞的迁移能力发 生的变化。 通过心脏抽取新西兰白兔血液制得血浆，分别与生理盐水、浓度为1 2 5 、2 5 0 、5 0 0 、 1 0 0 0 9 9 m l 刺松藻多糖溶液等体积混合，利用血液凝聚仪测定兔血的活化部分凝血酶时 间( a z r r ) ，凝血酶原时间( p d 和凝血酶时间( t t ) ，检测刺松藻多糖对抗凝血作用的影 响。采用颈动脉插管法抽取新西兰白兔血，制备富血小板血浆( p i 冲) 、贫血小板血浆 ( p p p ) ，分别与生理盐水、浓度为2 5 0 、5 0 0 、1 0 0 0 p g m l 刺松藻多糖溶液混合，a d p 为诱导剂，检测最大聚集率。 实验结果显示刺松藻多糖对肺腺癌系a 5 4 9 细胞的增殖有明显的抑制作用，且与多 糖浓度及其作用时间有密切的依赖关系，而且经刺松藻多糖处理过的a 5 4 9 细胞发生明 显的形态学改变，细胞中b c l - 2 蛋白水平下降，表明刺松藻多糖具有诱导a 5 4 9 细胞凋亡 的作用；b o y d 饥c h a m b e r 模型结果显示刺松藻多糖能显著抑制a 5 4 9 细胞的迁移能力。 刺松藻多糖在体外能明显延长家兔a p t t 、p t 、t t ，差异有显著性；能抑制血小板聚集 率，随多糖浓度增加，血小板聚集率呈明显下降趋势。 本实验证明了刺松藻多糖能够抑制肿瘤细胞的增殖及迁移能力，诱导细胞凋亡，具 有抗凝血、抗血栓等作用，为进一步研究刺松藻多糖的生物活性具有一定的意义。 关键词：刺松藻多糖；肺腺癌；细胞凋亡：抗凝血 l 气 刺松藻多糖生物活性的初步研究 t h e p r e l i m i n a r yr e s e a r c ho fp o l y s a c c h a r i d eo f c o d i u m f r a g i l eo nb i o a c t i v i t y a b s t r a c t p o l y s a c c h a r i d e so fc o d i u mf r a g i l ew e r ee x t r a c t e db ym e a n so fh o tw a t e re x t r a c t i o na n d e t h a n o lp r e c i p i t a t i o n ，t os t u d yt h em e c h a n i s mo fp r o m o t i n gt b m o ra p o p t o s i s ，t u m o ri n h i b i t i n g a n dt u m o rm i g r a t i o na sw e l la si n h i b i t i n ge f f e c t so fp o l y s a c c h a r i d eo fc o d i u m f r a g i l e ( c f p s ) o nb l o o dc o a g u l a t i o no f p o l y s a c c h a r i d eo fc o d i u m f r a g i l ew e r ep r e l i m i n a r yr e s e a r c h e d m t t e o l o r i m e t r yw a sa p p l i e dt oq u a n t i f yc e l lv i t a l i t yo ft h ec e l ll i n e sa 5 4 9a f t e rb e i n g t r e a t e dw i mp o l y s a c c h a r i d eo fc o d i u m f r a g i l e h o e c h s t 3 3 2 5 8d y e i n ga 5 4 9c e l l st r e a t e dw i t h p o l y s a c c h a r i d eo fc o c 矗u mf r a g i l eh a v eb e e nu s e dt oo b s e r v et h em o r p h o l o g i c a lc h a n g e so f a p o p t o s i sa f t e r t h ea 5 4 9c e l l st r e a t e db yd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o np o l y s a c c h a r i d e t h e e x p r e s s i o no fa p o p t o s i sr e l a t e dp r o t e i n sb c l - 2o fa 5 4 9c e l l st r e a t e db yp o l y s a c c h a r i d eo f c o d i u mf r a g i l ew i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n2 4 ha r ed e t e r m i n e db yw e s t e r nb l o ta n d i m m u n o c yt oc h e m i s t r y t h em i g r a t i o na b i l i t yo fa 5 4 9c e l l st r e a t e db yp o l y s a c c h a r i d eo f c o d i u m f r a g i l ew a s o b s e r v e db ym e a n so f b o y d e nc h a m b e rm o d e l t h eb l o o dp l a s m ai sm a d eo f b l o o d ，w h i c hi se x t r a c t e df r o mn e wz e a l a n dw h i t er a b b i t s h e a r t w em a d et h eb l o o dp l a s m am i x e dw i t ht h ep h y s i o l o g i c a ls a l i n ea n dt h ep o l y s a c c h a r i d e o fc d 妣加阚跆s o l u t i o nw h i c hd e n s i t ya r e1 2 5 、2 5 0 、5 0 0a n d1 0 0 0i - t e g r r d ；r a b b i tb l o o d a c t i v a t i o nt h r o m b i nt i m e ( a z r t ) ，p r o t h r o m b i nt i m e ( p da n dt h r o m b i nt i m e ( 田w a s d e t e r m i n a t e db ym i x e db l o o dc o n d e n s i n ga p p a r a t u st ok n o wt h ei n f l u e n c eo fp o l y s a c c h a r i d e o fc o c 矗u mf r a g i l eo na n t i c l o t t i n ge f f e c t c a r o t i da r t e r yi n t u b a t i o ne x t r a c t i o nw a sa p p l i e dt o g e tn e wz e a l a n dw h i t er a b b i tb l o o dt h e ng e tr i c hp l a t e l e tp l a s m af i r e ) a n dl e a np l a t e l e t p l a s m ap p p ) ；w em i n e 丑e dt h e mi n t op h y s i o l o g i c a ls a l i n ea n dt h ep o l y s a c c h a r i d eo fc o d i u m f r a g i t es o l u t i o nw h i c hd e n s i t ya r e1 2 5 、2 5 0 、5 0 0a n d1 0 0 0i t g m l ，a n dt a k e na d pa s e x u t o r y , t h o u g ht h i sm e t h o dw ec a no b s e r v e dt h em a x i m u mg a t h e r e dr a t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta 5 4 9c e l l sw e r ei n h i b i t e do b v i o u s l yb yc f p sw h i c hd e p e n do n t h ed r u gd o s a g ea n dt r e a t - t i m ec l o s e l y ；i tc o m et oac o n c l u s i o nt h a tt h et u m o u rc e l l sc o u l db e i n h i b i t e db yc f p sw h i c hw a sp o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t ht r e a t t i m eo ft h ec f p s ；t h ee x p r e s s i o n o fb c l - 2i nt u m o u rc e l l st r e a t e db yc f p sd e c r e a s e da n dl e a d e dt ot u m o u re e l i sa p o p t o s i s ；t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t so fb o y d e nc h a m b e rm o d e ls h o w e dt h a tp o l y s a c c h a r i d eo fc o d i u m f r a g i l e c a ni n h i b i ta 5 4 9c e l lm i g r a t i n ga n dr e d u c e dt u m o u rc e l l sp e r m e a t i n gt op e r i p h e r a lt i s s u e 2 辽宁师范大学硕士学位论文 a p t t ，p ta n dt tw e r ep r o l o n g e ds i g n i f i c a n t l yb yp o l y s a c c h a r i d e sa n dt h e a g g r e g a t i o nw a si n h i b i t e dp r o m i n e n t l y t h ee x p e r i m e n t a lp r o v e dt h a tp o l y s a e c h a r i d eo fc o d i u mf r a g i l ec a l li n h i b i tt u r n p r o l i f e r a t i o n ，m i g r a t i o na n di n h i b i tb l o o dc o a g u l a t i o na n dt h r o m b o s i s t h ep o s i t i v e t h i se x p e r i m e n tw i l lh e l p f u lf o ri n v e s t i g a t i n gt h eb i o l o g i c a la c t i v i t i e so fc o d i u m f r a g i l e k e y w o r d s ：p o l y s a c c h a r i d e o fc o d i u m f r a g i l e ；l u n ga d e n o c a r c i n o m a ；a p o p t o s i s ；a n t i c o a g u l a n t j 刺松藻多糖生物活性的初步研究 目录 刺松藻多糖生物活性的初步研究i 摘要i a b s t r a c t i i 1 弓i 言1 1 1 海洋生物药物的研究1 1 2 海藻多糖的活性物质研究。2 1 2 1 海藻多糖的活性物质的研究概况2 1 2 2 海藻多糖抗凝血抗血栓的研究概况3 1 2 3 海藻多糖抗肿瘤活性的研究概况4 1 2 4 海藻多糖抗病毒5 1 2 5 海藻多糖的抗衰老作用6 1 2 6 海藻多糖的免疫作用7 1 2 7 抗辐射和对机体细胞的保护作用。9 1 2 8 抑制新生血管的形成9 1 2 9 降血脂及降低血粘度1o 1 3 刺松藻的生物活性物质的研究1 0 1 3 1 刺松藻多糖活性物质的研究概况1 0 1 3 2 刺松藻的研究现状l l 2 刺松藻多糖的提取、分离、纯化1 3 2 1 材料与方法l3 2 1 1 材料一13 2 1 2 仪器。1 3 2 1 3 方法13 2 2 结果16 2 3 讨论18 3 刺松藻多糖对肺腺癌a 5 4 9 细胞凋亡的影响2 0 3 1 材料与方法- - 2 0 3 1 1 材料2 0 3 1 2 实验仪器2 0 3 1 3 实验方法2 1 3 2 结果2 6 辽宁师范大学硕士学位论文 3 2 1m t t 法检测c f p s 对人肺腺癌a 5 4 9 细胞生长的影响2 6 3 2 2h o e c h s t3 3 2 5 8 检测a 5 4 9 细胞是否发生形态学变化2 7 3 2 3 免疫细胞化学检测a 5 4 9 细胞b c l 2 的表达2 9 3 2 4w e s t e r nb l o t 检测a 5 4 9 细胞b c l 2 的表达量的变化3 0 3 2 5 刺松藻多糖对a 5 4 9 细胞的迁移的影响。3 l 3 3 讨论3 3 4 刺松藻多糖抗凝血抗血栓的研究3 5 4 1 材料与方法3 5 4 1 1 材料3 5 4 1 2 仪器3 5 4 1 3 方法3 5 4 1 4 统计学分析。3 7 4 2 结果3 7 4 2 1 刺松藻多糖抗凝血作用：3 7 4 2 2 刺松藻多糖对家兔血小板聚集的影响3 9 4 2 3 刺松藻多糖对胶原蛋白肾上腺素诱导小鼠血栓形成的影响3 9 4 3 讨论4 0 5 结论4 l 参考文献j 。4 3 硕士期间发表论文。4 7 致谢i 4 8 一v 一 辽宁师范大学硕士研究生学位论文 刺松藻多糖生物活性的初步研究 研究生 指导教师 学科专业 研究方向 汪艳秋 侯林教授 细胞生物学 海洋细胞生物学 1 引言 1 1 海洋生物药物的研究 广阔的海洋潜力巨大，是一个丰富的生物资源库，据估计，海洋中生活着的各种生 物，种数约占地球生物总数的8 0 ，生物多样性远超陆地。辽阔的海洋不但可向人类提 供各种优质食品资源，还是个种类繁多、结构独特、活性特异的海洋天然产物和生物活 性物质的超级宝库。由于处在长期稳定的低温、高盐、高压的特殊生理环境，海洋生物 之间便有着特殊的生态关系，代谢出各种各样的，具有独特生理活性的新奇物质。近年 的研究表明，海洋生物体内蕴含着许多功能独特的天然活性物质，美国、日本、澳大利 亚等发达国家先后把海洋生物技术研究确定为2 1 世纪优先发展领域。目前海洋生物活 性物质的研究进展很快，是天然海洋药物开发的重要方向。在开发天然海洋资源的总体 设想下，正极力开辟从海洋生物中寻找天然海洋药物这个新领域。到目前为止，人们已 经从海洋生物中发现了3 0 0 0 多种新结构的天然海洋生物，其中2 0 0 多种均具有各种生 物活性物质，为未来的海洋药物开发奠定了一定的前期基础【l 】。 中国，是世界上利用天然海洋生物最早的国家之一，对海洋生物的研究一直是我国 研发新药的一个重要方向。早在中华本草中就已经描述了6 0 0 多种海洋药物。而这 些从古到今的，积累了几千年的药理药性是我国中医药学不可分割的一部分，近3 0 年 来我国海洋药物发展迅速，其中涉及海洋中药、保健品等多个领域。其中主要有抗菌抗 病毒类药物，消炎镇痛药物，作用于心脑血管系统的药物，抗肿瘤药物，消化系统、泌 尿系统的药物，而且还有消除和抑制脂肪生成的减肥作用。现阶段，癌症与心血管疾病 己成为医学界的两大难题，是对人类威胁最大的疾病。癌症的治疗方法，主要是以外科 手术、放射治疗和化学治疗，及其这三种方法的综合应用。但是由于外科手术仅能切除 可见的肿瘤，对于分散的、不可见的癌细胞却无法消除，因此，不适宜于晚期和年老体 弱的患者；而放射疗法不但不能根除病因，反而容易产生局部复发与远处转移，且不可 l 刺松藻多糖生物活性的初步研究 避免地会对机体的正常组织产生毒副作用；而对心血管疾病进行治疗的药物，在临床上 主要是以化学药的应用为主，但往往会引起胃肠道出血等不同程度的副作用，近几年来 人们从海洋天然产物中筛选出3 0 0 0 种具有抗肿瘤活性的新化合物并对多种海洋抗肿瘤 活性物质进行了临床前或临床试验矧。所以，从天然海洋生物中开发抗肿瘤及心血管疾 病的药物已成为各国研究天然海洋药物的热点。 1 2 海藻多糖的活性物质研究 1 2 1 海藻多糖的活性物质的研究概况 海藻是单株的简单植物，由基础细胞构成。全世界藻类约有3 0 0 0 0 余种，迄今被人 类广泛利用的海藻，主要是生活在海底或某种固体结构上的，在大量出现时分不出茎或 叶的水生植物。一般来说，最常见的海藻是海草，如：红藻、绿藻和褐藻。由于海藻受 生活环境的影响，导致其化学组成与陆生植物差异比较大，大多含有丰富的营养物质， 除含有多糖外，还含有维生素、蛋白质、微量元素及硫、氮、卤素化合物、菇类与酚类 化合物等1 。早在1 0 0 多年前，被誉为“糖化学之父 的德国著名科学家e f i s c h e r 就开 始了糖类研究。目前，随着研究方法的不断改良及现代分离技术的广泛应用，海藻不仅 被大量应用在制作食品工业原料、肥料和饲料上，而且其药用价值也越来越引起人们的 关注。随着对海藻的生物活性物质的研究日趋深入，海藻多糖在预防和治疗常见病及疑 难疾病，特别是病毒性疾病、癌症、心脑血管病、艾滋病及辅助治疗中的作用越来越受 到重视，从而引起了医学界的广泛关注，许多科研工作者探讨了多糖的抑瘤作用及其作 用机制。从而使这一学科成为目前生命科学中研究最活跃的领域之一口1 。 海藻多糖( s e a w e e dp o l y s a c c h a r i d e ) 是海藻的主要活性成分，是指海藻中所包含的各 种高分子碳水化合物，其中包括由2 0 个以上单糖通过糖苷键连接而成的含醛基或酮基 的多羟基聚合物及其衍生物，是多组分的多糖混合物，一般多为水溶性，富含硫酸基， 有较高粘度或凝固力，其硫酸根含量越高越易溶解，但是不溶于乙醉、内酮、乙醚及正 丁醇等有机溶剂，所以常常用这些溶剂作为沉淀剂。用乙醇沉淀是一种从溶液中定量回 收海藻多糖的简单方法，由于不同性质或不同分子量的海藻多糖沉淀所需乙醇浓度不 同，它同样也可以用于样品中不同海藻多糖组分的分级分离。分级的方法有多种，一般 是按分子量的大小及其形状分级。如用十六烷基三甲基氢氧化钱、斐林试剂、d e a e 一 纤维素类柱、有机溶剂等方法从不同的材料中提取多糖，一般都先用乙醇等有机溶剂将 原料物质脱脂，根据具体情况选用不用的溶剂提取，其中需要考虑的包括海藻多糖的浓 度及盐浓度。在d e a e - 纤维素类层析柱上进行层析，用不同浓度的盐、碱梯度洗脱，可 2 辽宁师范大学硕士研究生学位论文 得到不同的级分。近年来的研究表明藻类多糖具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、 降血脂、提高免疫功能等活性哺9 1 。 藻类多糖可以根据它在藻体中的分布情况，分为三类：第一类是细胞壁多糖，多数 为微细纤维状结晶；第二类是细胞壁多糖间的粘多糖，大多为无定形的胶状；第三类是 最内层的存在于细胞内的贮藏多糖。按从海藻中分离出的多糖的种类来分，主要有纤维 素与半纤维素( 均属细胞壁多糖) ，琼胶、岩藻多糖、褐藻胶、琼脂糖与硫酸糖( 均属 细胞粘多糖) ，海藻淀粉( 贮藏多糖) 等。而其中构成细胞粘多糖的琼胶、岩藻多糖、 褐藻胶、琼脂糖等是藻类所特有的糖类，同时也是藻类工业生产及应用最广泛的糖类。 1 2 2 海藻多糖抗凝血抗血栓的研究概况 许多海洋生物多糖具有抗凝作用，其中以海参多糖、海藻多糖为甚。1 8 8 1 年s t a n f o r d 首次在海带中发现褐藻酸是研究海藻多糖的开始。彭波等【lo 】对从海带中提取的褐藻多糖 硫酸酯的抗凝和纤溶活性进行了研究，结果显示：它对内源性和外源性凝血途径均有较强 的抑制作用，并且能够增强纤溶系统的活性。在绿藻中，z h a n g 等【l i 】从石莼目的宽礁膜 ( m o n o s t r o m al a t i s s i m u m ) 中分离出分子量从1 0 6 7 2 5 4 k d a 的5 种硫酸化多糖，抗凝血 实验表明这5 种多糖在浓度为1 0 0 u 酌 i l l 、2 0 0 ug m l 是，均能延长t t 和a p t t 的时间 且均以鼠李糖为主。日本科学家在对绿藻门中八种硫酸多糖的抗凝血作用研究了后发砖 现，这几种糖都具有依赖于h c i i 的抗凝血酶作用。施松善等人对长叶蜈蚣藻多糖进行 了研究，发现该糖具有很强的抗h i v 1 的活性，且抗血管生成活性显著，其抗血管生成 作用主要是通过下调组织因子来实现。刘志峰等【1 2 】人发现萱藻多糖的抗凝血活性及硫酸 基含量明显高于其它海藻多糖，且海藻多糖的抗凝血活性与硫酸基的含量呈正相关。 当内皮细胞受损时，血小板在内皮细胞损伤处聚集，形成血小板块和白色血栓，局 部凝血过程已开始进行，血小板大量暴露磷脂表面，为凝血酶原的激活提供了极为有利 的条件。辛现良【1 3 】等人运用新型的抗脑缺血海洋药物9 8 9 ，对由胶原和花生四烯酸诱导 的大鼠进行静脉注射，观察其血小板聚集情况，发现该药能明显的抑制动脉或静脉血栓 的形成，并能延迟由激光导致小鼠肠系膜微血栓出现的时间，降低由花生四烯酸致小鼠 肺栓塞引起的死亡率。松藻科的刺松藻( c o d i u m f r a g i l e ) 中分离得到的阿拉伯半乳聚糖 通过增强抗凝血酶( h c i i i ) 和抗凝血酶i i ( a ti i ) 的活性而具有抗凝血活性【1 4 】。郑 军【1 5 】等分离纯化海带褐藻糖胶后得到3 个级分，皆有明显的抗凝血活性，其主要是通过 内源性凝血途径起作用，对外源性凝血途径的影响不明显。温扬敏【1 6 1 等研究了鼠尾藻多 糖的抗凝血活性，实验表明鼠尾藻多糖原液和不同程度的降解液均能显著延长小鼠的凝 血时间和出血时间，但随着降解程度的增加，其抗凝血活性的某些指标下降趋势明显。 周慧萍【1 。刀等人发现紫菜多糖( p p ) 具有体内及体外抗凝血作用。 刺松藻多糖生物活性的初步研究 1 2 3 海藻多糖抗肿瘤活性的研究概况 藻类多糖的抗肿瘤作用可以分为两大类：第一类是对肿瘤细胞的直接作用，即直接 杀死了肿瘤细胞，包括对肿瘤细胞膜的生化特性的作用、抗自由基作用、诱导分化与诱 导凋亡以及对肿瘤细胞超微结构的影响：第二类是作为生物免疫反应调节剂，通过增强 机体的免疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞。肿瘤细胞不仅是一种比其来源组织生长更 快的细胞，同时也是一种凋亡率相对较少的细胞，肿瘤的发生与发展与细胞凋亡密切相 关，是细胞的增殖与凋亡失衡所致，肿瘤细胞凋亡的调控失调是肿瘤发生的主要原因之 一。 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 或细胞程序性死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ) ，是生物体生理和病 理最重要的现象之一，对于维持生物体正常生长发育、功能的发挥、清除肿瘤细胞、自 身反应性淋巴细胞和病毒感染的细胞，起着重要的作用；实验表明，几乎所有的促凋亡 和抗凋亡蛋白的表达皆与肿瘤的发生与发展都有联系n 射。肿瘤在进行放化疗或用细胞毒 性药物进行治疗时，凋亡细胞的数目明显增多，但是当与凋亡相关基因的表达出现异常 时，便会阻止细胞凋亡的发生，最终导致恶性肿瘤的发生n 引。 f u j h i a r a 等报道褐藻胶对小鼠肉瘤s 1 8 0 细胞，实体瘤、e h r l i h c 腹水瘤细胞和i m c 肿瘤细胞均具有很强的杀伤活力，同时发现褐藻胶能够增强巨噬细胞的吞噬作用及细胞 溶解作用，由此认为褐藻胶的抗肿瘤活性是由于增强巨噬细胞的功能所致。肉瘤毒素a 是毒性极强的神经毒，以1 7 l d s o 剂量给小鼠供毒l h 后，用l m g k g 体重的马尾藻科的洋 栖菜水提物进行对抗，9 6 h 后存活率为7 3 3 幢。1 9 9 8 年卢睿春等啪1 报道，亨氏马尾藻硫 酸多糖对小鼠艾氏腹水瘤和腹水型肉瘤$ 1 8 0 表现出明显的抑制作用，抑制率分别达 3 3 0 7 和3 0 2 7 。邓志峰等3 1 对采集于青岛的龙须菜和扁江篱的琼胶型多糖进行抗肿瘤 效果实验比较，结果表明，龙须菜的冷水提多糖与扁江篱的热水提多糖，初筛的抑瘤率 分别为4 5 和6 0 。张伟云等硷q 在体外共同培养紫菜多糖p y 3 与白血病k 5 6 2 细胞7 2 h ，结 果表明：p y 3 对慢性髓性白血病k 5 6 2 细胞的增殖有明显的抑制作用，而且呈时间剂量性 依赖；e 1 1 0 u a l i 嘲等发现一些海藻多糖具有相对低分子质量的，能够抑伟i j c c l 3 9 成纤维 细胞瘤及c o l 0 3 2 0 d m 的增生；某些硫酸多糖( 硫酸墨角藻多糖、卜角叉菜胶) 能抑制 大鼠乳腺癌1 3 7 6 2 m a t 细胞向肺组织的转移，同时发现它们的抗转移的作用与这些硫酸 多糖抑制的，由肿瘤细胞产生的一种“类肝素酶 ( h e p a r a n a s e ) 有关。而海带多糖在脂 多糖( l p s ) 1 0l x g l 存在的条件下，能激活小鼠腹腔巨噬细胞，能在体外分泌肿瘤坏死因子嘲。 张尔贤阱1 等人探讨了鼠尾藻多糖对核酸、蛋白质合成的影响，实验结果表明，鼠尾藻多 糖同多数抗癌剂不同，并不是通过阻碍d n a 的合成而致使细胞数减少，从而达到阻止肿 瘤细胞增殖的效果。我国科学家从海带中提取了一种天然生物大分子海带多糖，是由l 一 4 辽宁师范大学硕士研究生学位论文 岩藻糖、d 一半乳糖等糖基组成的硫酸酯化多聚物，该多糖对小鼠肉瘤$ 1 8 0 的抑制率可达 到8 6 5 啪1 。王雪等嘲3 利用m t t 法证明了裙带菜多糖在体外对人肝癌细胞h e p g 一2 有很 强的抑制作用，同时也用小鼠体内实验验证了裙带菜多糖抗肿瘤的作用较强。翟振国啪1 等检验了海藻硫酸多糖( s p a ) 对肿瘤的影响，实验结果表明：小鼠体内用药对l e w i s j 市癌 的生长具有明显抑制作用，且含有s p a 兔血清在体外抑制肺癌细胞增殖的作用明显。 1 2 4 海藻多糖抗病毒 人类在与病原体的持续斗争中面临着巨大的挑战，病毒性疾病及抗病毒药物的研发 成为世界医药领域关注的焦点。但是目前抗病毒药物的研究尚未取得突破性进展。从马 尾藻热水提取物中分离到的硫酸多糖，主要成分为岩藻多糖，实验证明亦具有抗h s v - i 、 c i v i v 、h i v 1 的能力，不仅抑制病毒的吸附与穿入，同时也抑制穿入后的复制( p r e e p r a m e e ta 1 2 0 0 1 ) 。b e r e s s 等( 1 9 9 3 ) 从褐藻f u e a s v e s i c u l o s u s 中分离出一种多糖，该多糖对h i v 逆转录酶有抑制作用，但无细胞毒作用。2 0 0 3 年，p o n c c 【3 1 】等研究了褐藻中褐藻糖胶的 结构与抗病毒活性的关系，在室温条件下分离提取的褐藻糖胶( f u c o i d i n ) 对疱疹单纯病毒 ( h e r p e ss i m p l e xv i r u s ) l 和2 的抑制作用都很强。在h i v 病毒的复制过程中，反转录酶( i m 是不可或缺的，而有的硫酸化多糖则能抑制r t 的活性【3 2 1 。作为饵料添加剂，用海藻多 糖饲喂中国对虾2 0 天后、测定该虾血细胞的吞噬功能及体液免疫因素的影响，结果表明 【3 3 1 ：海藻多糖可显著提高中国对虾的血细胞吞噬能力、吞噬细胞的吞噬率、血清s o d 的 活力及酚氧化酶活力，同时对溶菌酶的活性也有一定程度的提高。褐藻糖胶对几种包膜 病毒，如人免疫缺陷病毒和人细胞巨化病毒的复制皆有抑制作用w i t v r o u w 蚓等还发现， 对h i v 病毒分子的抑制作用，从海藻中提取的多糖与人工合成的多糖是不同的，海藻多 糖能抑制h i v 所造成的细胞突变、巨型细胞，其抗病毒活性随海藻多糖的分子量的增大、 硫酸基团含量的增而增强。实验研究表明红藻中提取制备的硫酸化多糖是一类广谱病毒 抑制剂，尤其对疤疹家族病毒的抑制作用明显【3 5 1 ，在抑制d n a 病毒的同时，又可抑制 r n a 病毒。1 9 9 5 年，李凡【3 6 1 等报道，从渤海湾海带( s e a k e l p ) 分离制备的褐藻糖胶， 在体外有抗r n a 、d n a 的作用。卡拉胶是一些红藻的细胞壁多糖，目前对于卡拉胶抗 病毒作用已有很多报道，对囊膜病h i v 1 、白岭热病毒( s f s v ) 、小鼠巨细胞病毒 ( m c m v ) 、沙粒病毒及棒状病毒、h s v - 1 和h s v _ 2 等均有较强的抑制作用，而且对 正常细胞无明显毒性口圳，采自北戴河的红藻h a l y m c r d ns i n e n s i s ，分离纯化制备的红藻 多糖( r p l 和r p 2 ) ，能在细胞水平上显著抑制牛免疫缺陷病毒b w 的生长，其抑制率分 别为8 5 9 6 和8 8 6 5 ，同被临床批准使用的抗a i d s 药物叠氮脱氧胸腺嘧啶( a z t ， 8 9 5 2 ) 类似，亦证实了红藻多糖作为抗a i d s 药物的可行性。a m o u r n r u t 等( 1 9 9 9 ) 报 道，硫酸化匀多糖同硫酸化杂多糖相比，其抗人类t 淋巴细胞病毒i 型的活性更强，而 5 刺松藻多糖生物活性的初步研究 肝素化硫酸化杂多糖只具有微弱的抗人类t 淋巴细胞病毒i 型的活性。不同浓度的海带 多糖对毛癣菌、石膏样毛癣菌、孢子丝菌、絮状表皮癣菌等也有一定的抑制作用【4 1 1 。实 验证明，海带多糖能明显增强宿主的噬菌细胞的活性，迸一步研究发现，注射海带多糖 能明显增强鱼类抵抗气单胞菌的能力【4 2 】。太平洋裂膜藻( s c h i z y m i n i a p a c i f i c a ) 总的硫酸多 糖是h v i 病毒逆转录酶的特异性抑制剂，其浓度为2 0 0 0 i u m 1 时，对病毒逆转录酶活 性的抑制率高达9 2 ，而对宿主细胞d n a 和r n a 的合成无影响。这一物质不仅可抑 制h v i 逆转录酶，而且对其它病毒的逆转录酶也有抑制作用【4 3 1 。 1 2 5 海藻多糖的抗衰老作用 虽然没有人能长生不老，但克服早衰，延续衰老过程是完全可能的。海藻多糖特指 海藻中所含的各种高分子碳水化合物，化学结构极其复杂。研究发现】：在恶性肿瘤患 者的血液或组织中，其超氧化自由基的特异性清除超氧化物歧化酶( s o d ) 和过氧化氢酶 ( c a t ) 的活性明显下降，而过氧化脂质( l p o ) 的含量显著增高，这说明d n a 被过量的活性 氧氧化损伤，抗氧化功能严重损害，最终导致影响基因表达，从而诱发细胞发生癌变。 y a s a n t h a 1 研究了从海藻e c k l o n i ac a v a 中的酶解提取物中的抗肿瘤和抗氧化活性，结 果表明，其中的粗多糖组分具有很好的清除d p p h 自由基的活性。螺旋藻多糖能显著降 低小鼠组织中丙二醛( m d a ) 含量，促进红细胞、肝、脑等组织中s o d 的活性，能使肝 组织中谷肮甘肤过氧化物酶的活性恢复至正常水平，增强了机体抗氧化及抗自由基损伤 的能力吲。此外z h a n g m l 的研究表明，从p o r p h y r a ( r h o d o p h y t a ) 中提取的一种硫酸多糖 可以通过增强大鼠抗氧化酶的活性而延缓大鼠的衰老，从而也降低了脂质过氧化反应的 风险。鼠尾藻多糖具有较高的抗氧化活性，杨方美等【镌l 研究了鼠尾藻多糖的清除自由基 和体外抗氧化活性，结果表明鼠尾藻多糖是一种长效的抗氧化剂，6 0 m i n 后其抗氧化活 性即趋于稳定。从海藻f u c u sv e s i c u l o s u s 、l a m i n a r i aj a p o n i c a 和e c k l o n i ak u r o m e 中提 取的硫酸多糖也显示出很高的抗氧化活性呻1 。通过对患有白血病的小鼠进行研究，可以 发现海藻多糖能够通过增加过氧化氢酶及g s h 的活力，从而导致脂质过氧化物的含量 降低，使自由基的产生受到抑制及清除，降低或防止原初氢氧自由基及单线态氧的产生， 抑制细胞分裂的发生，而抑制肿瘤的生长【则。滕霞等【5 l 】研究发现海藻多糖能提高抗氧化 酶的活性，对过多的自由基进行清除，减轻活性自由基对免疫系统的损伤。 生物体的氧化代谢会产生阴离子自由基与羟基自由基( o h ) 及活性氧易引起脂质的 过氧化，对细胞产生很大的毒性作用。海藻硫酸多糖具有清除活性氧的作用，是有效的 自由基清除剂。目前看来，天然抗氧化剂得到广泛的应用，如在营养品、食品添加剂、 化妆品及医药领域等，并获取了人们的认可。市场上已出现了含天然抗氧化剂的化妆品、 6 辽宁师范大学硕士研究生学位论文 食品添加剂，所以说，天然抗氧化剂未来的应用前景非常广阔。因此，很希望通过对海 藻多糖的研究，研制出能作为延寿、抗衰老的药物，为人类造福。 1 2 6 海藻多糖的免疫作用 大量的实验研究表明海藻多糖、海带多糖等具有免疫调节作用或免疫增强作用，多 糖的免疫调节作用，具有多途径、多环节、多靶点的特点。多糖能起到刺激机体各种免 疫活性细胞的成熟、分化和繁殖，海藻多糖的抗肿瘤作用机理，一般认为主要与免疫促 进作用有关。作为一种重要的生理代谢调节物质，海藻多糖能激活非特异性免疫、细胞 免疫、体液免疫，且对正常宿主细胞无直接的毒副作用，并且可以激活相关免疫细胞的 活性，诱导白细胞介素一l 、白细胞介素一2 、肿瘤坏死因子、干扰素等细胞因子的产生 和细胞因子受体的表达，促进抗体形成，活化补体系统的经典途径及变更途径等作用。 从海藻中提取分离经化学修饰得到的海洋硫酸多糖类化合物9 1 1 ，在适宜剂量时能较弱 地刺激小鼠胸腺、脾脏淋巴细胞增殖：显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力，说 明9 1 1 能增强机体的免疫力，起到免疫调节作用【5 2 】。王庭欣等【5 3 】从细胞免疫、体液免疫、 非特异性免疫3 个方面研究了海带多糖的免疫功能，发现海带多糖能明显增强巨噬细胞 吞噬功能，增强小鼠的细胞免疫力。 ? 细胞免疫是抗肿瘤免疫的主要方式，淋巴细胞在免疫作用中的地位很重要，t 淋巴 细胞( 主要参与细胞免疫) ，是在胸腺中培育成熟的淋巴细胞，被称为胸腺依赖性淋巴细 胞，在血液与再循环中的作用是很重要的。t 细胞是不均一的群体，一般可以分成t c r 7 8 ( i 型) t 细胞与t c r a l b ( i i 型) t 细胞。t c r 邙t 细胞可分为调节性t 细胞和效应性 t 细胞两类，约占成熟t 细胞的9 5 ，而t c r t 8 仅占很少的部分。淋巴细胞受到抗原 刺激后，除了本身被致敏，转化为具有特异性免疫力的原淋巴细胞外，尚可释放出一系 列可溶性物质例。杨晓林掣5 5 】研究发现，褐藻糖胶体内给药可增强小鼠t 细胞、b 细胞、 巨噬细胞和n k 细胞的功能，能够促进对绵羊红细胞的初次抗体应答。魏文青等【5 6 】报道 海藻硫酸多糖对小鼠由环磷酞胺所致的免疫低下进行调节，通过血象的调节、增加胸腺 指数、提高t 淋巴细胞、促进t ，b 淋巴细胞增殖来缓解小鼠免疫功能的低下。s h a h 等 【5 刀也发现这种海藻多糖除了能作用于b 细胞外，还能提高c t l 细胞的活性，同时增加 体液中i g g ，但不增加n k 细胞的分裂。杨氏等报道【5 引，褐藻糖胶是小鼠b 细胞的有丝 分裂原，有多克隆激活b 细胞增殖的作用，同时对大鼠脾脏淋巴细胞和人外周血液单核 细胞也有激活作用。 研究表明，海带多糖经腹腔注射给药后( 1 0 0 m g m 1 ) f l 邑显著提高免疫低下小鼠的胸腺、 脾指数，促进小鼠脾细胞产生一2