（遗传学专业论文）水稻86136est的功能注释、表达图谱比较及可变剪接形式分析.pdf

a b s t r a c t u s i n gh i g h - t h r o u g h p u ts e q u e n c i n g t e c h n o l o g i e sd e v e l o p e d i n g e n o m ep r o j e c t s ， e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ( e s t ) s e q u e n c i n g a n d a n a l y s i sh a sb e c o m e au s e f u lt o o lf o r i d e n t i f i c a t i o no fg e n e s e s ta n a l y s i sy i e l d si m p o a a n t ，n o v e li n s i g h t s a b o u tt h e f u n c t i o na n d e x p r e s s i o no fg e n e s ，e s p e c i a l l yw h e n u s e di nc o m b i n a t i o nw i t hg e n o m i c d a t a r i c e ( o r y z as a t i v a ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tc r o p si nt h ew o r l d i no u r r e s e a r c h ，w es e q u e n c e d8 6 ，13 6r i c ee s t sa n da n a l y z e dt h eg e n ef u n c t i o n ，e x p r e s s i o n p r o f i l e ，a n da l t e r n a t i v es p l i c i n go fr i c e w ec o m b i n e dt h en e wr i c ee s t sw i t ha l l p u b l i c l ya v a i l a b l er i c ee s t s a sw e l ta st h er i c eg e n o m ed a t a w ed i dc o m p r e h e n s i v e l i b r a r yq u a l i t ya s s e s s m e n t ，s e q u e n c eq u a l i t ye v a l u a t i o n ，s e q u e n c i n gp r o c e s s e v a l u a t i o n ，c l u s t e r i n gc h e c k ，f u n c t i o n a la s s i g n m e n t ，p a t h w a y o r p r o c e s sc l a s s i f i c a t i o n ， e x p r e s s i o np r o f i l i n g a n dd i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o na n a l y s i s ，a n d a l t e r n a t i v e s p l i c i n g a n a l y s i s a n dp r e d i c t i o n o u rn e wm e t h o do fl i b r a r y q u a i l t y a s s e s s m e n ti sm o r e d e t a i l e da n ds y s t e m a t i ct h a na n y p r e v i o u sm e t h o d s w eu s e dar e f e r e n c ed a t a s e tt od o s e q u e n c i n gp r o c e s se v a l u a t i o n ，w h i c hp r o v e dt o b em u c hm o r es e n s i t i v e w ew e r e e x t r e m e l yc a r e f u la b o u tt h ec l u s t e r i n gs t e p ，i nw h i c hw ei n t r o d u c e dn e t , vc h i m e r i c d e t e c t i o na n da s s e m b l yq u a l i t ya s s e s s m e n ta p p r o a c h e st oa v o i dm i s sa s s e m b l y n o p u b l i c a t i o n sa b o u tp a t h w a y o r p r o c e s sc l a s s i f i c a t i o nw e r ea v a i l a b l eu n t i lr e c e n t l y 9 0 1 f i n a l l y ，w ed e s i g n e da n dc r e a t e dt h ef i r s ta l t e r n a t i v es p l i c i n gd a t a b a s ef o ra l lg r e e n p l a n t s ，p l a n ta l t e r n a t i v es p l i c i n gd a t a b a s e ( p a s d b ) i nt h ev e r t i c a l c o m p a r i s o n a m o n g d i f f e r e n tg r e e np l a n t s ，w ef o u n dp o s s i b l en o v e la l t e r n a t i v es p l i c i n gv a r i a n t si n r i c e ，s u c ha sd t d p d g l u c o s e4 , 6 d e h y d r a t a s e t oa u t o m a t et h e a n a l y s i s ，w eh a v ea l s od e v e l o p e da n a l y s i st o o l st h a th a v eh i g h t h r o u g h p u t ，h i g hs t a b i l i t ya n dh i g ha c c u r a c y ，w h i c ha l s ot a k ea d v a n t a g eo fg e n o m e s e q u e n c e s a n dc a r lb e e a s i l y e x t e n d e di n t oa g e n o m i c s a n n o t a t i o n p l a t f o r m i n p a r t i c u l a r ，af i r s tt o o li su n i b l a s t ，ab l a s t p o s t - p r o c e s s i n gp r o g r a md e s i g n e da n d w r i t t e nb yt h ea u t h o r as e c o n dt o o li sa na u t o m a t e da n n o t a t i o n p i p e l i n et h a tt a k e sf u l l a d v a n t a g eo ft h en e wa n n o t a t i o na s s i g n m e n ta l g o r i t h m sd e v e l o p e di nu n i b l a s t t h e f e a t u r e s ，d a t as t r u c t u r ea n di n f r a s t r u c t u r ew e r ed e s i g n e db yt h ea u t h o r , w h oa l s od i d m o s to ft h ea s s e m b l yo ft h ep i p e l i n ea n dm o s to ft h ea n a l y s i so fr i c ee s t s a n d t h e a u t h o rd i da l lo ft h ef e a t u r ed e s i g na n dt h em a j o ri n f r a s t r u c t u r ed e s i g no f p a s d b a n d r e v i e w e dm o s to f t h e i m p o r t a n tr e s u l t s k e y w o r d s b i o i n f o r m a t i c s ，e s t , g e n o m i c s ，a n n o t a t i o n ，e x p r e s s i o np r o f i l e ，a l t e r n a t i v es p l i c i n g p a g e 2o f 6 6 f u d a nu n i v e r s i t y 摘要 运用在基因组项目中成熟起来的高通量测序技术使得e s t 测序项目及其数据分 析已经成为基因识别的有力工具。e s t 数据分析可以为我们提供关于基因功能与 表达的重要信息，特别是在与基因组序列一同分析时，我们可以得到更有价值的 信息。水稻是世界上最重要的粮食作物之一。我们对8 6 ，1 3 6 条水稻e s t 序列进 行测序，并且对其基因功能、表达谱和水稻的剪接形式变化进行了分析。( 在分析 过程中，我们综合了所有的水稻e s t ( 包括公共数据库中已有的水稻e s t ) 和水 稻基因组数据。我们做了严格的文库质量评估，序列质量评估，测序进度评估， 序列拼接检测，功能预测及分类，表达量分析和剪接形式分析等工作。其中，文 库质量评估比以前的工作详细得多，使用了新的错拼识别机制与拼接质量评估流 程，将可能错拼的序列重新拼接，并且借助于基因组序列信息对拼接结果进行了 合并，尽最大可能保证拼接的正确性。我们在测序进度评估中加入了参考序列库， 使得评估更加灵敏。我们所使用的基因功能分类方法也是与国内外研究同步的， 一直到最近才有相关报道 9 0 1 。植物剪接形式数据库( p a s d b ) 是唯一也是第一 个针对绿色植物剪接形式变化的数据库。这个数据库几乎涵盖了所有已报道的植 物可变剪接并且运用数据可视化的方法使剪接形式的变化一目了然，为进一步在 预测水稻中的可变剪接打下了扎实的基础。在剪接形式变化的物种横向比较中， 我们在水稻中发现了一些新的剪接形式变化。比如，d t d p d g l u c o s e 4 , 6 一d e h y d r a t a s e 可能在3 端具有可变剪接。 与此同时，还开发了些高通量，高稳定性与高准确性的分析软件将这些分析过 程自动化。这些分析软件大量利用基因组序列信息帮助分析，并且可直接扩展为 基因组信息分析平台。其中u n i b l a s t ，一个b l a s t 结果后处理程序完全由作者 设计与完成。功能注释系统由作者设计( 功能，数据结构，程序结构等等) 与集 成。p a s d b 的功能设计，主要技术实现与重要结果分析由作者完成。其中，功 能注释系统已经申请了版权，f 在审批过程中。扩，一 e 关键词 j 兰生猫息学，i 茎! 堑列标签，墨里组学，塑嬖注释妻荃谱，要塞剪接 p a g e3o f 6 6 f n d a nu n i v e r s i t y 1i n t r o d u c t i o n r i c ei sam a j o rc r o pc o n s u m e db yh u m a n ，e s p e c i a l l yi nt h i sp a r to f t h ew o r l d r i c ei s a l s oam o d e lo r g a n i s mf o rp l a n tb i o l o g y f o re x a m p l ei t i sam o d e ll a b o r a t o r yp l a n t f o rm o n o c o ta n dg r a s s ，am o d e lf i e l dp l a n tf o ro t h e rc r o p s ，s u c ha st o m ，s o r g h u ma n d m i l l e t ，a n d a m o d e g e n o m ef o r a l l p l a n t s 、e s p e c i a l l y m o n o c o t ，g e n o m e s t h e e u c h r o m a t i c p o r t i o no f t h er i c eg e n o m ei se s t i m a t e dt ob e4 3 0 - m b1 9 2 j ：i 7 4 j ：i 2 i j ： 孔， w h i c hi st h es m a l l e s to f t h ec e r e a lc r o p s i ti s3 7t i m e sl a r g e rt h a n a t h a l i a n af | 1 lf 5 6 1 1 9 a n d6 7 t i m e ss m a l l e rt h a nh u m a ni 5 1 1 ll r 5 3t h ew e l l e s t a b l i s h e dp r o t o c o l sf o r h i g h e f f i c i e n c yg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n w i d e s p r e a da v a i l a b i l i t y o f h i g h d e n s i t y g e n e t i c a n dp h y s i c a lm a p sf 8i j l 9 u ，a n dh i g hd e g r e e so fs y n t e n ya m o n gc e r e a l g e n o m e s h o ： 8 7 j ：f 3 。j i 5 7 j ：f 3 3 j ，c o m b i n et om a k e r i c eau n i q u eo r g a n i s mf o r s t u d y i n g t h ep h y s i o l o g y ，d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y , g e n e t i c s a n de v o l u t i o no f p l a n t s ( c i t e df r o m i 9 2 nt h e r eh a v eb e e ns e v e r a le f f o r t si nb o t ha c a d e m i ca n di n d u s t r yt os e q u e n c et h e r i c eg e n o m e t h ei n t e m a t i o n a lr i c eg e n o m e s e q u e n c i n gp r o j e c t ( i r g s p ) h a sa l r e a d y d e l i v e r e da s i g n i f i c a n ta m o u n t o f s e q u e n c ef o rt h e j a p o n i c a ( n i p p o n b a r e ) s u b s p e c i e s ， t h r o u g hc l o n e - b y - c l o n ea p p r o a c h w o r k i n gi n d e p e n d e n t l y , m o n s a n t oa n ds y n g e n t a i | 9 】l f 2 2 1 e s t a b l i s h e dw o r k i n gd r a f t sf o rj a p o n i c a ，i na p r i lo f2 0 0 0a n df e b r u a r yo f 2 0 0 1 ，r e s p e c t i v e l y t h ed r a f tg e n o m e s o ft w or i c es u b s p e c i e sh a v eb e e np u b l i s h e di n a p r i l2 0 0 2 o n eb yb e r i n gg e n o m i c si n s t i t u t e 【9 3 ，t h eo t h e rb ys y n g e n t a 【3 4 i d e n t i f y i n gr i c eg e n e sa n dg e n ee x p r e s s i o np a t t e r n si si m p o r t a n tf o rt h eu n d e r s t a n d i n g o fr i c eb i o l o g ya sw e l la sf o rt h es t u d yo ft r a i t ss u c ha sh i g hy i e l d ，d i s e a s er e s i s t a n c e ， s t r e s sr e s i s t a n c e ，e t c t h em o s te f f e c t i v ea p p r o a c ht oi d e n t i f yl a r g en u m b e ro f g e n e si s e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ( e s t ) s e q u e n c i n g ，w h i c hc o m p l e m e n t sg e n o m i c d n a s e q u e n c i n gb ye x p l i c i t l yi d e n t i f y i n gt r a n s c r i b e dr e g i o n s 3 j ；1 3 9 e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ( e s t s ) h a v ea p p l i c a t i o n si nt h ed i s c o v e r yo fn e wg e n e s ， m a p p i n g o f t h eg e n o m e ，a n di d e n t i f i c a t i o no f c o d i n gr e g i o n si ng e n o m i c s e q u e n c e s1 2 1 t h ev a s tb o d yo fe s td a t ai nt h ep u b l i cd a t a b a s e sp r o v i d ea ni m p o r t a n tr e s o u r c ef o r c o m p a r a t i v ea n df u n c t i o n a lg e n o m i c ss t u d i e sa n d a ni n v a l u a b l et o o lf o rt h ea n n o t a t i o n o f g e n o m i cs e q u e n c e s ，t h ep r o f i l i n go fg e n ee x p r e s s i o n 4 1 ，a n dn o n - h o m o l o g yb a s e d f u n c t i o na s s i g n m e n t l 8 6 1 a l t h o u g hm o r ea n dm o r e g e n o m e s a r eb e i n g s e q u e n c e d ，g o n e i d e n t i f i c a t i o na n da n n o t a t i o nr e m a i n sac h a l l e n g e ，f o rw h i c he s t s e q u e n c i n ga n d a n a l y s i s s e r v e sa sav e r yu s e f u lt o o le s tp r o j e c t sa r es t i l lam a j o r l a r g e s c a l e p a g e 4o f 6 6 f u d a nu n i v e r s i t y e x d e r i m e n t a le x p r e s s i o n p r o f i l i n gt o o lf o rs p e c i e st h a th a v es p e c i a lf e a t u r e s ，a n df o r d i s c o v e r i n gg e n e st h a tf l f f ed i s e a s er e l a t e d c o m p a r e d t og e n ec h i p s ，o rm i c r o a r r a y s ， e s t p r o j e c t sm a k ep o s s i b l en o to n l yg e n e i d e n t i f i c a t i o na n de x p r e s s i o np r o f i l i n g ，b u t a l s oo t h e rf u r t h e ra n a l y s i s ，s u c ha sa l t e r n a t i v es p l i c i n gd e t e c t i o n 13 1 t h ea l g o r i t h m s f o re s td a t am i n i n ga r em o s t l yw e l ld e v e l o p e da n db e n c h r n a r k e d 【5 4 】，t h er e m a i n i n g c h a l l e n g e sa r eh o w t oa r r a n g et h ea n a l y s i sd a t af l o wf o rh i g ht h r o u g h p u t ，h o w t os t o r e t h ed a t ar e a d i l yf o re x p r e s s i o np r o f i l ec o m p a r i s o na n df u r t h e rr e s e a r c hi n t e r e s t ss u c h a sa l t e r n a t i v es p l i c i n ga n a l y s i s ，a n dh o wt og r a p h i c a l l yd i s p l a y t h er e s u l t st h a tw i l l p r o v i d ei n s i g h t sa tag l a n c e u p t om a y2 0 0 2 ，r e s e a r c h e r sh a v er e p o r t e da b o u t9 5 ，0 0 0r i c ee s ts e q u e n c e s ，t h e m a j o r i t yo f w h i c ha r ef r o mn i p p o n b a r e ，a j a p o n i c av a r i e t y 9 2 】w i t ht h e8 6 ，1 3 6n e w r i c ee s t sw es e q u e n c e d ，t h et o t a ln u m b e ro fr i c ee s t sn e a r l yd o u b l e d t oa l l o wf o r h i g h t h r o u g h p u t a n a l y s i s a n dr e a lw o r l d d a t a m i n i n g ，w ei m p l e m e n t e d a g e n e r a l - p u r p o s ee s t d a t aa n a l y s i sp i p e l i n ef o rq u a l i t yc o n t r o l ，g e n er e c o g n i t i o n ， f u n c t i o na s s i g n m e n ta n dp r o f i l ec o m p a r i s o no fe s tp r o j e c t s w i t ht h eh i g hp e r f o r m a n c es e q u e n c i n ga n dl i b r a r yc o n s t r u c t i o nt e c h n i q u e sp r e p a r e d i nh u m a ng e n o m ep r o j e c t ，a n dt o t a l g e n o m es h o t g u ns t r a t e g y ，g e n o m ew o r k i n g d r a f t so rf i n i s h e dm a p sw i l lb ea m a s s e da taf a s t e ra n df a s t e rw a y w e v ce n t e r e di n t o an e we r ao f a n n o t a t i o na n df u n c t i o n a lg e n o m i c s a n n o t a t i o ni so n eo f t h em a j o rg o a l s i no u rr e s e a r c h b l a s t ( b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht 0 0 1 ) 5 1 ； 6 】i so n eo f t h em o s t f r e q u e n t l y u s e df i r s t - r u nt o o l si n a n n o t a t i o n h o w e v e r ，i n t e r p r e t a t i o no fb l a s t o u t p u t i s c o m p l i c a t e db yt h eh i g hr e d u n d a n c yi n g e n b a n k an u m b e ro fd i f f e r e n t a p p r o a c h e sh a v eb e e nd e v e l o p e dt o a d d r e s st h i sp r o b l e m s o m ea i m e dt op r o v i d e b e t t e rg r a p h i c a ld i s p l a yo f s e q u e n c ea n a l y s i sr e s u l t s 【2 4 】；【5 0 】；【1 2 】n c b id e v e l o p e dt h e k o c u s l i n kd a t a b a s et h a ta s s o c i a t e sal o c u sw i t hc o p i o u si n f o r m a t i o na b o u tt h eg e n ea t t h el o c u s ，a n dt h er e f s e qd a t a b a s et h a ts e l e c t so n er e f e r e n c es e q u e n c ef o re a c hg e n e ， t h u ss t a n d a r d i z e st h el e x i c o nf o rg e n o m e a n a l y s i s 【6 9 1 h o w e v e r , b o t hp r o j e c t sc o n t a i n o n i yav e r ys m a l ln u m b e ro fo r g a n i s m sa n dal i m i t e dn u m b e ro fl o c ib e c a u s et h e a n a l y s i sp r o c e s sc a n n o tk e e pu pw i t ht h ee x p o n e n t i a lg r o w t ho fg e n b a n k o t h e r a p p r o a c h e sh a n d l e t h er e d u n d a n c y p r o b l e mb yc l u s t e r i n gt h em r n a ，e s t a n dp r o t e i n s e q u e n c e d a t a b a s e s f 1 7 】； 4 8 】； 5 3 】；【5 8 】；【7 0 】= 【7 7 】h o w e v e r , d a t a b a s e - w i d e s e q u e n c e c l u s t e r i n gi sav e r yc o m p u t a t i o n a li n t e n s i v ea n de r r o r - p r o n ep r o c e s s ，a n do f t e nc a n n o t k e e pu p w i t ht h er a p i dg r o w t ho f g e n b a n ke i t h e r w ed e v e l o p e dan o v e lp r o g r a m d e s i g n a t e du n i b l a s t t of a c i l i t a t et h ef u n c t i o n a l z h o u y a “ p a g e5o f 6 6 f u d a nu n i v e r s i t y a s s i g n m e n tp r o c e s s ( a c c e p t e db y b i o i n f o r m a t i c s ，2 0 0 2 ) u n i b l a s tf i l t e r s ，d i s p l a y 5 ， a n dc l u s t e r sb l a s tr e s u l t s ( b o t hb ys e q u e n c es i m i l a r i t y a n db yl o c u s l i n k ) ，a n d a u t o m a t i c a l l ya s s i g n s a u n i q u eg e n ea n n o t a t i o n t oe a c hq u e r y s e q u e n c e a l t e r n a t i v es p l i c i n g i sa n i m p o r t a n t c e l l u l a rm e c h a n i s mt oi n c r e a s et h eg e n e e x p r e s s i o nd i v e r s i t y 【7 8 】，a n di t h a sb e c o m ea ni n t e r e s t i n gp a r to fa n n o t a t i o nw o r k s - d i f f e r e n ta l t e r n a t i v es p l i c i n gf o r m sh a v eb e e na s s o c i a t e dw i t hd i f f e r e n tp h y s i o l o g y a n db i o l o g i c a lp h e n o t y p e s 【3 6 】t h e r ea r ee s t i m a t e d4 0 o f h u m a ng e n e st h a th a v e a l t e r n a t i v es p l i c i n gf o r m s 5 9 1 ； 6 1 】i nc o n t r a s t ，a l t e r n a t i v es p l i c i n gi sr a r e l yr e p o a e d i n r i c ef 7 9 】：f 8 0 】：【8 3 】w i t ht h ea v a i l a b i l i t yo ft h ed r a f to f t h er i c eg e n o m e sa n do u re s t s e q u e n c i n gp r o j e c t ，w e w a n t e dt o p r e d i c ta n yp o s s i b l e n o v e la l t e r n a t i v e s p l i c i n g v a r i a n t si nr i c e t h e r eh a v eb e e ns e v e r a le f f o r t st oc o m p i l ed a t a b a s e sc o n t a i n i n gg e n ea l t e r n a t i v e s p l i c i n gf o r m s s o m ea r eb a s e do nb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so ng e n es e q u e n c e sw h i l e o t h e r sa r ed e r i v e df r o ml i t e r a t u r ee v i d e n c e b u ta l lo ft h e ma r e f o rm a m m a l s 2 3 1 ； 3 2 1 ： 6 i 】： 4 5 】；【18 】：【1 4 j ； 4 2 】：【1 8 m 6 3 a sa f i r s ts t e pi na l t e r n a t i v es p l i c i n ga n a l y s i s ，w e d e s i g n e da n dc o m p i l e da na l t e m a t i v es p l i c i n gd a t a b a s ee s p e c i a l l yd e d i c a t e dt og r e e n p l a n t s ，c a l l e dp a s d b w eh a v ec o l l e c t e da l l k n o wa l t e r n a t i v ev a r i a n t si 1 1 s e q u e n c e d a t a b a s e sa n dm e d l i n ep u b l i c a t i o n s ，a n dw i l lf u r t h e rp u ti na l lp r e d i c t e da n dp r o v e d r i c ea l t e r n a t i v es p l i c i n gi s o f o r m s e x p r e s s i o ns e q u e n c et a gc l u s t e r i n ga n da l i g n m e n ti s t h em o s tc o m m o na p p r o a c ht o i d e n t i f y a l t e r n a t i v e s p l i c i n g f o r m si nt h eh u m a n g e n o m e 61 】；【1i 】d i f f e r e n t c o m p u t a t i o n a la l g o r i t h m s h a v e b e e n d e v e l o p e dr e c e n t l y t od e t e c ta n d p r e d i c t a l t e r n a t i v e s p l i c i n gs i g n a l s f r o m c o d i n g a n dn o n - c o d i n g r e g i o n s o ft h e g e n o m e 21 】；【4 4 】； 6 7 】a n o t h e ra p p r o a c hi so l i g o n u c l e o t i d ec h i pb a s e d 1 3 7 1 o u rp r e d i c t i o no f a l t e r n a t i v es p l i c i n gi sb a s e do ng e n o m es e q u e n c e sa n de s t s e q u e n c e s w eh a v et a k e n f u l la d v a n t a g eo f t h ee s t a n a l y s i sp i p e l i n ea n d t h er i c ei n d i c aw o r k i n gd r a f t p a g e 6 o f 6 6 f u d a nu n i v e r s i t y 2t e x t 2 1m a t e r i a l sa n dm e t h o d s i nt h i sc h a p t e r , w ed e s c r i b ei nd e t a i lt h em a t e r i a l su s e da n dm e t h o d sd e v e l o p e d i nt h e s e q u e n c i n ga n da n a l y s i so f r i c ee s t s f i g u r e1s h o w sa no v e r a l lw o r k f l o wo ft h e d i f f e r e n tc o m p o n e n t so fo u ra n a l y s e s f i g u r e l w o r k f i o wo fo u rr i c ee s td a t aa n a l y s i s f i g u r e 1 ：t h i sf i g u r eg i v e sa no v e r v i e wo ft h er e l a t i o n s h i po fo u re s ts e q u e n c e a n a l y s i s m e t h o d s a f t e r l i b r a r y a n ds e q u e n c e q u a l i t yc h e c k ，h i g hq u a l i t y e s t s e q u e n c e so fg o o dl i b r a r i e sw e n tt h r o u g hs e q u e n c i n gp r o g r e s sm o n i t o rt om a k e s u r e e n o u g hs e q u e n c e sh a db e e nc o l l e c t e d t h e nh i g hq u a l i t y n o n e r e d u n d a n td a t a s e tw e r e g e n e r a t e db yc l u s t e r i n ga n dc o n t i gc h e c k c o m p l e t eo r f s e a r c h ，f u n c t i o