（遗传学专业论文）apc和eb1基因表达与染色体数目异常胚胎关系.pdf

重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名：自盔至! 日期：! ! ：! ：竺 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文。 论文作者签名 白云讵 指导教师签名： ! 鱼 日 期 重庆医科大学硕士研究生学位论文 英文缩写 a p c e b l g a p d h b p c d n a d a b d d h 2 0 d e p c d n t p e b e d t a e p h r p h 2 0 2 k b o d p b s r 一p c r r q p c r 英汉缩略语名词对照 英文全称 a d e n o m a t o u sp o l y p o s i sc o l i e n d b m d m gp r o t e i n1 g l y s e r a l d e h y d e 3 p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a d i a m i n o b e n z i d i n e d e h y d r o n i u mh 2 0 d i e t h y lp u r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t h i d i u n lb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a - a c e t i ca c i d e p p e n d o r f h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e h y d r o g e np e r o x i d e k i l o b a s ep a i r o p t i c a ld e n s i t y p h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o n r e v e r s e t r a n s c r i p t p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v e - p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n p o t e n t i a l o t h y d r o g e n 1 中文全称 结肠腺瘤样息肉蛋白 微管末端结合蛋白1 3 一磷酸甘油醛脱氢酶 碱基对 互补d n a 二氨基联苯胺 去离子水 二乙基焦碳酸盐 脱氧核糖三磷酸 溴化乙啶 乙二胺四乙酸 微量离心管 辣根过氧化物酶 过氧化氢 千碱基对 光密度 磷酸盐缓冲液 逆转录聚合酶链发应 实时荧光定量聚合酶链 反应 酸碱度 重庆医科大学硕士研究生学位论文 m r n a r t t a q t r i s t b e m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d r e v e r s et r a n s c r i p t t h e r m o s a q u a t i c u s ( d n ap o l y m e r a s e ) t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e t r i s b o r i ca c i d e d t a 2 信使核糖核苷酸 反转录 耐热d n a 聚合酶 三羟甲基胺基甲烷 三羟甲基胺基甲烷一硼 酸一四乙酸缓冲液 重庆医科大学硕士研究生学位论文 a p c 和e b l 基因表达与染色体数目异常胚胎关系 摘要 背景：染色体数目异常在群体中的发生率约为3 ，在自然流产胚 胎中的发生率可高达3 0 左右，染色体数目异常胚胎中大多数表现为 细胞分裂受到抑制，乃至胚胎死亡。正常的染色体分离的前提是染色 体着丝粒与纺锤丝正常连接，通过纺锤体微管的牵引作用逐渐移向细 胞的两极并平均分配到两个子细胞中。有研究表明结肠腺瘤样息肉蛋 i 刍( a d e n o m a t o s i sp o l y p o s i s c o l ia p c ) 可以引起染色体数目的异常1 ，2 1 。 a p c 作为一种肿瘤抑制因子，在肿瘤中有着很深入的研究。传统上对 a p c 的研究基本上都是研究它对w n t 信号通路下游的一个主要成分b c a t e n i n 的负向调节功能。近年来发现a p c 具有负向调节w n t 信号通 路，同时还具有调节微管组装、微管稳定和使纺锤体微管附着到着丝 粒上并可发出连接成功的信号等一些重要功能。在a p c 蛋白的c 端存 在一个可以与微管末端结合蛋白l ( e n d b i n d i n gp r o t e i n1e b l ) 结合的结 构域【3 】。a p c 通过与e b l 的相互作用共同参与或调节纺锤体微管与着 丝粒附着 2 1 。e b l 是一种微管正端结合蛋白，其本身可以独自与微管 的正端结合，具有稳定微管和调节微管向着丝粒方向生长的作用，可 调节a p c 与b c a t e n i n 的相互作用 4 】，同时还具有调节另一微管末端结 合蛋白c l i p s 与微管末端的结合 3 。在许多a p c 基因突变而导致正常 a p c 缺乏的肿瘤细胞和a p c 基因和e b l 基因高表达的其它细胞株中， 重庆医科大学硕士研究生学位论文 均可见细胞分裂异常的现象。因此，对a p c 和e b l 是否与流产胚胎细 胞染色体数目异常有关是一个非常值得研究的课题。 目的：研究染色体核型正常人工流产胚胎和染色体数目异常自然 流产胚胎中a p c 和e b l 基因表达差异，为进一步探讨二者对染色体分 离的影响奠定重要基础。 方法： 1 用染色体分析技术将人工流产染色体核型正常胚胎作为正常对 照组，自然流产染色体数目异常胚胎作为实验组。 2 利用实时荧光定量p c r 检测a p c 和e b l 基因m r n a 表达水平 3 采用免疫组织化学方法检测a p c 和e b l 蛋白表达 结果：对照组a p c 基因m r n a 拷贝数g a p d h 基因m r n a 拷贝 数均值为0 0 0 9 11 0 0 0 5 0 4 ，实验组为0 0 9 7 9 _ _ 0 0 3 4 6 ；对照组e b l 基因m r n a 拷贝数g a p d h 基因m r n a 拷贝数均值为0 0 1 0 0 4 0 0 0 8 2 2 3 ，实验组为0 1 5 0 9 - t - 0 0 6 3 3 。免疫组织化学结果表明二者在实 验组中的表达也高于对照组。经统计分析，a p c 和e b l 二者的m r n a 水平( p o 0 0 1 ) $ h 蛋白水平( p 0 0 0 5 ) 在上述两组细胞组织中的表达均有 显著差异。 结论：a p c 和e b l 的表达在实验组中明显高于对照组；a p c 和 e b l 的高表达可能是导致胚胎细胞染色体分离异常原因之一。 关键词：a p c ，e b l ，荧光定量p c r ，胚胎，着丝粒 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 t 唧r e l a n o n s po fa p ca n de b lg e n e e x p r e s i o n sw i t hc h r o m o s o m 哐n u m 皿e r b a c k g r o u n d ： a b s t r a c t t h er a t eo fc h r o m o s o m en u m b e ra b n o r m i t yi sa b o u t3 i n p o p u l a t i o n ， b u ti ns p o n t a n e o u sa b o r t i o n ，i ti sr o u g h l y3 0 m o s to fc h r o m o s o m e n u m b e ra b n o r m i t ye m b r y o ss h o wc e l ld i v i s i o nr e s t r a i n e d ，e v e nc a u s e e m b r y ot od i e t h e a t t a c h m e n t b e t w e e nt h e s p i n d l e sa n dk i n e t o c h o r e s p r o v i d e se s s e n t i a lf u n c t i o n sf o ra c c u r a t ec h r o m o s o m es e g r e g a t i o n w i t ht h e t r a c t i o no fs p i n d l e s ，c h r o m o s o m e sg r a d u a l l ym o v et ot h ep o l e so fc e l l sa n d d i s t r i b u t ee v e n l yt od a u g h t e rc e l l s b u tb yn o w , t h em o l e c u l a rb a s i sf o r c h r o m o s o m en u m b e ra b n o r m i t yi su n k n o w n i tw a s r e p o r t e d t h a t c h r o m o s o m en u m b e ra b n o r m i t ym a yb ed u e ，a tl e a s ti np a r t ，t om u t a t i o n si n t h ea d e n o m a t o s i sp o l y p o s i sc o l i ( a p c ) i nac o u p l eo fp a p e r s a p ca sa t u m o ri n h i b i t i n gf a c t o rh a sb e e nw e l li n v e s t i g a t e di no n c o l o g y b u tt h e s e i n v e s t i g a t i o n sm o s t l yf o c u s e do n 、n ts i g n a lp a t h w a ya n df o u n da p cc a n n e g a t i v e l yr e g u l a t e b c a t e n i n ，w h i c hi sai m p o r t a n tc o m p o n e n to ft h e 、7 ts i g n a lp a t h w a y h o w e v e r , b e s i d e so fn e g a t i v e l yr e g u l a t ei nt h ew n t s i g n a lp a t h w a y , a p cc a na l s or e g u l a t em i c r o t u b u l ea s s e m b l i n g ，s t a b i l i t y 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 a n da t t a c h m e n to fs p i n d l e st ok i n e t o c h o r e s m o r e o v e r ，t h er e s e a r c h e so d t h es t r u c t u r eo fa p ci n d i c a t e dt h a tt h e r ei sas t r u c t u r a ld o m a i ni nt h e c t e r m i n a lo fa p ct h a tc a r lb i n dw i t he n d b i n d i n gp r o t e i ni ( e b1 、w i t h t h em a n n e r , a p ca n de b1t a k ep a r ti no rr e g u l a t et h ei n t e r a c t i o n so f s p i n d l e s a n dk i n e t o c h o r e st o g e t h e r e b1i st h eo n eo fm i c r o t u b u l e p l u s t e r m i n a l - b i n d i n gp r o t e i n s ，a n d c a nc o m b i n ew i t hm i c r o t u b u l e s p l u s t e r m i n a ls o l e l y b yt h i sm e a n s ，e b 1c a nm a k em i c r o t u b u l e sg r o w t o w a r d sc e n t r o m e r e sa n ds t a b i l i z em i c r o t u b u l e s f u r t h e rm o r e ，e b1c a n r e g u l a t e m i c r o t u b u l e s b i n d i n g w i t hc l i p st h a ta r ea n o t h e r g r o u p m i c r o t u b u l ee n d b i n d i n gp r o t e i n sa n di n t e r a c t i o no fa p ca n db c a t e n i n t h e s ei n v e s t i g a t i o n si n d i c a t e da p ca n de b1t a k ei m p o r t a n tr o l ei nt h e i n t e r a c t i o no fs p i n d l e sa n dc e n t r o m e r e s ，a n di nm a n yt y p e so fa p c m u t a t i o nt u m o rc e l l sa n dt h ec e l ls t r a i n sw h i c ha p ca n de b1 o v e r e x p r e s s e db ym a n m a d ea p p e a r e da b n o r m a lc e l ld i v i s i o n s a sw ek n o w , f e t a t i o na n do n c o g e n e s i sb e h a v es i m i l a rc h a r a c t e ri nm a n yf a c e t s s o ，i ti sa s i g n i f i c a n ts t u d yt oi n v e s t i g a t ei fa p ca n de b 1t a k ec r u c i a lr o l ei n c h r o m o s o m e sa b n o r m a le m b r y o n i cc e l l s o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t ea p ca n de b 1e x p r e s s i o ni ne m b r y o n i cc e l l sa n d a n a l y s i s t h e r e l a t i o n s h i p o fa p ca n de b1 g e n ee x p r e s s i o n s w i t h c h r o m o s o m en u m b e ra b n o r m i t yi n e m b r y o n i cc e l l s f r o m s p o n t a n e o u s a b o r t i o n m e t h o d s ： 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 g r o u p i n ga n dc h o o s ee m b r y o n i cc e l l sb yu s i n gc h r o m o s o m a lp r e p a r a t i o n t e c h n o l o g y 2 e n d o g e n o u sa p ca n de b 1m r n al e v e l sw e r ec o m p a r e db yu s i n g f q p c ri ne m b r y o n i cc e l l so ft r o p h o n e m af r o ma r t i f i c i a la b o r t i o na n d s p o n t a n e o u sa b o r t i o n 3 a p ca n de b1 p r o t e i n l e v e l sw e r ed e t e r m i n e d b yu s i n g i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y r e s u l t ：m e a r la p cr n r n 刖g a p d hm r n ai s0 0 0 911 0 0 0 5 0 4i n e m b r y o n i cc e l l so ft r o p h o n e m af r o ma r t i f i c i a la b o r t i o n ( c o n t r o lg r o u p ) ，b u t i ne m b r y o n i cc e l l so ft r o p h o n e m af r o ms p o n t a n e o u sa b o r t i o n ( e x p e r i m e n t a l g r o u p l i ti s0 0 9 7 9 0 0 3 4 6 c o r r e s p o n d i n g l y ( p 0 0 0 1 ) m e a n e b l m r n a g a p d hm r n ai n c r e a s e df r o m0 010 0 4 0 0 0 8 2 2 3i nc o n t r o l g r o u pt o o 1 5 0 9 _ _ + 0 0 6 3 3i n e x p e r i m e n t a lg r o u p 伊 0 0 0 1 ) t h ep r o t e i n l e v e l so fa p ca n de b1a r eh i g h e ri ne x p e r i m e n t a lg r o u pt h a nt h a to fi n c o n t r o lg r o u pr p 0 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ：t h ee x p r e s s i o n so fe b1a n da p ca r ed i s t i n g u i s h e dh i g h e ri n e x p e r i m e n t a lg r o u pt h a nt h a to f i nc o n t r o lg r o u p o v e r e x p r e s s i o n so fe b1 a n da p cm a yb eo n eo ff a c t o r st h a tl e a dt oa b n o r m a l i t yo fc h r o m o s o m e s e g r e g a t i o n k e y w o r d s ：e b 1 g e n e ；a p cg e n e ；f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep c r ； e m b r y o ；k i n e t o c h o r e s ( o rc e n t r o m e r e ) 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 a p c 和e b l 基因表达与染色体数目异常胚胎关系 刖吾 染色体是细胞内维持遗传物质稳定和保证其完整、准确传递的基本结构。它 由丝状的染色质在细胞分离过程中经过紧密缠绕、折叠、凝缩、精巧包装而成。 染色体由纵向排列的两条染色单体( c h r o m a t i d ) 在着丝粒( c e n t r o m e r e ) 处连在一起。有 丝分裂前期和中期，染色体通过着丝粒及其他蛋白的作用与纺锤体微管紧密相连， 并在纺锤丝的牵引下，使染色体有序的排列在赤道板上。有丝分裂后期，在纺锤 体微管的牵引下，两条姐妹染色单体均衡地向细胞两极分离并平均分配到两个子 细胞中。组成纺锤体微管的主要成分是由a 一微管蛋白和b 。微管蛋白形成的微管， 同时，具有连接染色体着丝粒等功能【5 “】。微管与这些细胞有形成分的相互作用还 涉及其他许多蛋白的参与和调节。有研究发现a p c 和e b l 直接或通过它们之间的 相互作用在纺锤体微管附着到染色体着丝粒上的过程中起到重要作用嘲( 见图1 ) 。 e b l 具有稳定微管的作用，主要通过直接与微管正端结合，并引导纺锤体微管向 染色体着丝粒方向延伸，并与着丝粒上的a p c 结合，达到识别着丝粒并与其结合 的目的，同时e b l 还可调节另一微管末端结合蛋白c l i p s 同微管的结合【3 】。a p c 在细胞周期间期游离存在于细胞质和细胞核中，而在细胞分裂的前期开始逐渐附着 到着丝粒上【”，通过识别e b l 并与之结合，使纺锤体微管与着丝粒稳定结合，a p c 还可通过对w n t 信号通路中起负向调节作用，调节细胞分裂。到细胞分裂中期， e b l 和a p c 将分别可从纺锤体微管正端和着丝粒上分离，纺锤体微管的稳定性下 降，微管降解并缩短，由此而牵引染色体向细胞的两极移动。这些研究表明如果 a p c 和e b l 的表达异常有可能引起染色体分离异常。 我们选择a p c 和e b l 作为一个切入口，通过研究二者在核型分析正常人工流 产和染色体数目异常自然流产的胚胎细胞组织中的表达，分析a p c 和e b l 基因 表达与染色体数目异常胚胎关系，初步探讨胚胎细胞染色体分离的机制。 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 图1 纺锤体微管与着丝粒关系模式图 f i g1a m o d e lf o rk i n e t o c h o r em i c r o t u b u l ea n dk i n e t o c h o r e 9 重庆医科大学颈士研究生学位论文 本课题研究的技术路线 1 0 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一部分 a p c 基因表达与染色体数目异常胚胎细胞的关系 1 材料与方法 1 1 实验材料 1 1 - 1 标本 在重庆医科大学附属第一、二医院共获得4 0 例人工流产、8 7 例自然流产胚胎 组织( 妊娠2 个月内) ，孕妇无有毒、有害物质接触史。对所有胚胎组织经过胚胎细 胞原代培养，并进行染色体核型分析得到3 3 例人工流产染色体数目正常的胚胎( 对 照组) 和2 8 例自然流产染色体数目异常的胚胎( 实验组) ，分别提取其总r n a ，用于 分析a p c 和e b l 的基因表达。用培养后剩余的组织分别提取总蛋白和进行石蜡包 埋，进行a p c 和e b i 蛋白表达分析。 1 1 2 主要仪器 细胞培养箱 梯度p c r 仪 荧光定量p c r 仪 电泳仪 凝胶成像系统 显微镜照相系统 ( 其他主要仪器见附录一) 1 1 3 主要试剂： 1 1 3 1r t p c r 和f q p c r 试剂 d e p c t r i z o l m m l v 逆转录酶 1 1 德国h e r a e u s 美国b i o r a d 美国b i o r a d 中国北京六一 美国b i o r a d 日本o l y m p u s 美国s i g m a 上海生工 美国p r o m e g a 重庆医科大学硕士研究生学位论文 d n t p o l i g o ( d t ) 1 8 t a q 酶 1 1 3 2 免疫组织化学试剂： 辣根酶标记羊抗兔二抗 兔抗人a p c 单克隆抗体 ( 其他常用试剂见附录二) 上海生工 上海生工 大连t a k a r a 北京中杉 美国s a n t ac r u z e 1 1 4 常用试剂配方 秋水仙素( 1 0 p 1 m 1 ) ：o 1 m g 秋水仙素粉末加入1 0 m l 生理盐水，过滤分装。 固定液：甲醇：冰醋酸= 3 ：1 ( 需新鲜配制) h a n k s 液：8 9 an a c l ，0 4 1k c lo 0 6 ln a h p 0 4 ，o 0 6 鲫k h 2 p 0 4 ，o 3 5 ；酣 n a h c 0 3 ，o 0 2 l 酚红 ( 其他常用试剂配方见附录二) 1 2 实验方法 1 2 1 细胞培养及鉴定 1 2 1 1 将刚从医院收集过来的绒毛标本在无菌条件下进行胚胎细胞的清洗和 粗筛，并转入小瓶中将其剪碎进行原代培养7 1 0 d ；待原代培养的细胞长满瓶壁， 用胰酶进行消化，离心后进行传代培养。( 具体操作见附录三) 1 2 1 2 采用细胞免疫化学的方法，用北京中山公司提供的c k 7 抗体鉴定绒毛滋 养层细胞为阳性，而非滋养层细胞为阴性；相反波形蛋白抗体作为阴性对照，鉴 定绒毛滋养层细胞为阴性，而非滋养层细胞为阳性，鉴定细胞为3 5 代的细胞。 l - 2 2 染色体制备和分析 1 2 2 1 培养3 5 代的细胞收获前6 8 小时加入秋水仙素，按常规方法制备染色体 标本，对每个标本进行分析( 具体操作见附录- - ) 。 1 2 2 2 染色体分析标准：在进行核型分析时，对人工流产胚胎细胞，当出现 染色体数目异常，但未见2 个相同异常核型的标本，根据染色体分析的国际标准， 这种异常主要由制片时引起，而非组织细胞自身异常，该胚胎组织细胞视为染色 重庆医科大学硕士研究生学位论文 体正常。对自然流产胚胎细胞，发现2 个相同染色体数目异常核型的标本视为异常 组。 1 2 3 组织总r n a 的提取 ( 1 ) 取清洁级流产胚胎组织培养细胞，每约1 0 0 m g 组织( 1 0 6 个细胞) 加入 l m l t r i z o l 提取液，放入匀浆器中于冰上研磨； ( 2 ) 加入2 0 0 u l 氯仿，充分振荡混合，于低温离心机上，1 2 0 0 0 r m i n 离一i 二, 1 5 m i n ； ( 3 ) 取上层水相移入另一e p 管，加入等体积的异丙醇，混均，于4 放置5 m i n ， 然后于低温离心机上，1 2 0 0 0 f f m i n 离，l ：, 1 0 m i n ； ( 4 ) 弃上清，加入7 0 0 u l 预冷的7 5 乙醇洗涤沉淀，低温离心，1 2 0 0 0 f f m i n 5 m i n ； ( 5 ) 以相同的方法再次处理沉淀： ( 6 ) 弃乙醇，室温挥发残留乙醇5 m i n ，j j n z 4 0 9 l 去离子水溶解沉淀； ( 7 ) 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，判断r n a 的完整性； ( 8 ) - - 8 0 保存备用。 1 2 4 引物及探针序列 a p c 引物及探针均由上海基康合成，序列如下： r m a a a a c g a g c a c a g c g a a g a a i a g c c a g a a f pg c g a t g g a a g a a c a a c t a g g t a c c r pg t r g c t r g g g a c t g t a a a a g c t g t g a p d h ：( 购自g e n e c o r e 公司) f a mc c t c a a c t a c a t g g r 兀a c f pc c a g c a a t g a c c c c t t c a t t g r pc a t g g g t g g a a t c a 工a t t g g a a c 1 25r t p c r 采用两步法( 包括逆转录和p c r 两步) 1 2 5 1 逆转录c d n a ( 反应体系为2 5 9 1 ) ： 试剂浓度体积 终浓度 总r n a 5 “l 重庆医科大学硕士研究生学位论文 r a n d o mp r i m e r 1 0 01 2 m 0 1 11u l4i x m o l 1 o l i g o ( d t ) l s 混均，7 0 ，5 m i n j 立即冰浴，1 r a i n 试剂浓度体积终浓度 m m l vb u f f e r5 5u l1 d n t p1 0m m o l i2u l0 8m m o l 1 r n a s i n2 5 u u l1l a l1u i t l d d h 2 0 1 0p 1 混均，3 7 。c ，5 m i n 立即冰浴，l m i n i i 试剂浓度体积终浓度 m m l v2 0 0 u u l1u l8 u u l 混均，3 7 。c ，6 0 m i n j 7 0 。c ，1 0 m i n ( 破坏m m l v ) 4 保存 1 2 5 2p c r 反应( 反应体系为2 5 a 1 ) ： 1 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 试剂浓度体积终浓度 t a qb u f f e r 1 0 2 5u l1 m g c l z 2 5m m 0 1 15p l 2 i j t l +5 m m o l l d n t p1 0m m 0 1 12p lo 8n l m 0 1 1 a p c e b l 上游引物 2 0p m o l l1 1p l0 8 8p m o l l a p c e b l 下游引物 2 0 p m o l l 1 1l a lo 8 8p m o l 1 c d n a 模板 3 “1 d d h 2 0 1 0u l t a q 酶 5 u u l o 3 l a l 0 0 6u u l + 在傲a p c 基因的p c r 时选用5 山的m g c l 2 和采用r a n d o mp r i m e r 逆转录的c d n a 模板；在做 e b l 基因的p c r 时选用2 ，d 的m g c j 2 和采i i | j o l i g o ( d d l 8 逆转录的c d n a 模板( 下同) 。 l 混均 i 9 4 3 m l n 预变性 1c y c l e 9 4 3 0 s 变性3 5 c y c l e 5 7 3 0 s 退火 7 2 3 0 s 延伸 7 2 1 0 m i n 延伸 1c y c l e 1 2 5 3 电泳( 具体方法见附录三) 用t b e 电泳缓冲液配置2 0 的琼脂糖凝胶，以1 2 0 v 恒压电泳约3 0 m i n 后在凝胶 成像仪下分析结果。 1 2 6 定量p c r 反应 1 2 6 1 标准曲线的制作( 具体方法见附录三) 操作流程： 提取r n i + j 煎转录+ p c r + 电泳胶回收与t a 载体连接， 转化 提质粒斗p c r 鉴定+ 测序+ 作标准曲线。 1 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 2 6 2 构建反应体系，放入定量p c r 仪进行操作 总体积：2 5 9 l 试剂浓度 体积 终浓度 t a qb u f f e r 1 0 2 5u ll m g e l 2 2 5r e t o o l 13p 13l n l n 0 1 l d n t p1 0r e t o o l 1 2p 1 o 8m m 0 1 1 a p c e b l 上游引物 2 0p m o l 1ii a l0 8p m o l l a p c e b l 下游引物2 0p m o l 1 1 i t l 0 8p m o l 1 t a q m a n 探针 2 0p m o l 1 0 8u lo 6 4p m o l 1 e d n a 模板十 5p 1 d 棚，o9 4g l t a q 酶 5 u u l 0 3u lo 0 6u p 1 9 4 1 0 m i n 预变性 9 4 3 0 s 变性 5 7 l m i n 退火，延伸 读板 4 0 个循环 1 2 7 免疫组织化学 主要步骤： ( 1 ) 石蜡切片经常规脱蜡、水化：二甲苯i2 5 m i n 一二甲苯i i2 5 m i n - - 无水乙醇 1 0 s - - 9 5 乙醇1 0 s 一8 5 乙醇1 0 s 一7 0 乙醇1 0 s 一蒸馏水冲洗； ( 2 ) 3 h 2 0 2 室温孵育1 5 m i n ，以消除内源性过氧化物酶的活性； ( 3 ) 蒸馏水冲洗，p b s 浸泡5 m i n ，用p h 7 01 0 m m o l 1 枸橼酸缓冲液，9 4 9 8 抗 原热修复处理1 5 m i r a ( 4 ) 自然冷却后，p b s 冲洗，5 m i n x 3 次； 1 6 也_ + 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ( 5 ) 用1 0 山羊血清工作液封闭，室温孵育2 0 m i n ，倾去； ( 6 ) 滴加一抗( a p c e b l ) 7 - 作液( 以1 ：1 0 0 稀释，稀释液为p b s ) ，4 c 孵育过夜； ( 7 ) p b s 冲洗，5 r a i n 3 ； ( 8 ) 滴加生物素标记羊抗兔i b g ( 对a p c ) 兔抗羊i g g ( 对e b l ) t 作液，室温孵育 3 0 m i n ； ( 9 ) p b s 冲洗，5 m i n 3 ； 0 0 ) 滴加辣根过氧化物酶( h r 9 ) 标记链酶卵白素工作液，室温孵育3 0 r a i n ： ( i dp b s 冲洗，5 m i n x3 ； d a b 显色剂显色：a 液、b 液、c 液各一滴加入i m l 水中，混匀，显色反应 在光镜下进行； 苏木精轻度复染，分片、脱水、透明，中性树脂封片； 显微镜下观察结果并拍照。 阳性标准：以出现棕黄色颗粒为阳性，按染色深浅分组。阴性( 一) ：无染色； 弱阳性( + ) ：浅染色；阳性( + + ) ：中度染色；强阳性( + + + ) ：强染色。 半定量测定：对每张切片取3 个视野，以视野数为单位，用h a i p s 1 0 0 0 高清晰 彩色病理图像测量系统进行测量，选取阳性平均光密度值( a 值) 为半定量参数，测 定a p c ( e b l ) 蛋白的表达。 1 2 8 统计处理f q - p c r 试验结果采用s p s s l 2 0 统计软件分析，采用t 检验；免疫 组化结果采用费歇尔精确概率分析和两个独立样本的t 检验分析。 2 结果 2 1 细胞培养及鉴定 所有器械均进行无菌处理，由专人将胚胎组织及时送达细胞培养室，立即对 胚胎组织进行洗涤和分选，获取其绒毛组织。基础培养液是d m e m ( f 氏糖) ，胎牛 血清浓度为2 0 ( h y c l o n e 公司特优级血清) ，原代细胞培养7 1 0 d 进行传代，以后 每次传代细胞的时间为3 4 d ( 如图2 ) 。采用细胞免疫化学的方法，用北京中山公 司提供的c k 7 抗体鉴定绒毛滋养层细胞为阳性，而非滋养层细胞为阴性：相反波 形蛋白抗体作为阴性对照，鉴定绒毛滋养层细胞为阴性，而非滋养层细胞为阳性， 1 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 鉴定细胞为3 5 代的细胞。 图2 胚胎细胞培养图a ：原代培养1 3 天情况；b ：传代培养3 代情况 n 9 2 e m b r y o n i c o d k a ：- f k i 。1 3d a y s b e p r i m a r y c u l t u r e d b ：i l f l t r 3g e n e r a t i o n s b e 辨r i i is u b e n l t n r e 正 2 2 染色体标本制备及分析 2 2 1 制备方法：培养3 5 代的细胞收获前6 9 h 加入秋水仙素，按照常规方 法制备染色体标本，对每个标本进行染色体分析( 如图3 ) 。 2 2 2 染色体分析标准：见1 2 2 2 。 图3 染色体分析图a ：正常染色体核型b ：染色体数目异常核型 f i g3k a r y o t y p e a ：n o r m a lk a r y o q 伊ei na r t i f i c i a la b o r t i o n ； b ：a b n o r m a lk a r y o v y p ei ns p o n t a n e o u sa b o r t i o n 2 _ 3r n a 样品的鉴定及r t - p c r 电泳结果 2 3 1 用紫外分光光度计测定r n a 的0 d 2 6 0 0 d 2 8 0 比值在1 8 2 0 之间，说明 1 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 r n a 有较高纯度，浓度为0 5 1 0 “l 。1 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果显示r n a 基本没降解，较完整( 如图4 ) 2 3 2r t - p c r 产物电泳图( 如图5 ) ：r t p c r 电泳图为胶回收前的电泳图及质粒 提取后的p c r 鉴定图。 图4 总r n a 电泳结果图 f i g4t o t a lr n ag e li m a g e 图5p c r 电泳图 f i g5e l e e t r o p h o r e g r a mo f p c r 1 ：a p c 基因p c r 电泳图 m ：d l 2 0 0 0d n am a r k e r 2 ：e b l 基因p c r 电泳图 2 4 测序结果 a p c 基因片断克隆到t a 载体( p m d l 8 一t ) 后的测序序列( 如图6 ) ： g t t g c t t g g g a c t g t a a a a g c t g t c g t a t a c g a a g l 、a t g t c c t t t t c g a r n 1 g c t g a a t t c t g g c t a t t c t t c g c t g t g c t c g t t t t t c c a t a t c c t g g c a g g t a c c t a g t t g t t c t t c c a t c g c 测序结果表明a p c 基因片断与预期的a p cm r n a 序列 刚好互补，因此可以认为该重组质粒可以作为a p c 基因的标准品用于后续实验。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 引 引 皇芗i ； 匿l 多 i 詈i： 喜l 慝i j l 垂 i ： 萋| ! 争 喜l 妻 | 8引 亨i 剿 垂l ： 引 妻i 妻 i ； 争 i 萋l ： 引 耋i 引 蚤i = 萋| ! 喜 ；。 塞i t 萝l ；喜! 蓉 毒 l ； 砉i 霎 l t 妻| ； 芋 i 。 三营 i 妻 ；。 争8 墨 i 。 ，再 i 喜i ； 穸； 事| ； ； i i i 亨i 善i i 亡 事i s i z 1 ； 蓬 垂 害 昏 墓 一一 乏 蟮 砭 蓑。 爹 图6 a p c 基因t a 裁体克隆后的测序图 f i g6 s e q u e n c i n gm a po f a p cg e n ef r a g m e n ta f t e rc l o n e di nt a - c a r r i e r 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 5 a p c 基因的标准曲线图及其在正常和异常胚胎细胞中的表达情况 a p c 标准曲线公式：y = 4 0 7 9 9 2 9 3 x ( r = o