（环境科学与工程专业论文）有机磷农药残留快速检测的电化学生物传感器研究.pdf

独创性声明 川舢 y 1 7 8 7 8 9 百 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：王飞导师签名： 鏖丞趑 日期： 窒q ! q 生墨旦 原礅 4 摘要 摘要 有机磷农药( o p s ) 是用于防治植物病、虫、害的有机化合物。这一类农药品 种多、药效高，易分解，在人、畜体内一般不积累，在农业生产中应用极为广泛。 甲基对硫磷俗称甲基1 6 0 5 ，学名，二甲基一( 4 一硝基苯基) 硫代磷酸酯，是一种有机 磷杀虫剂。乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 是与神经化学传递有关的乙酰胆碱( a c h ) 的水解酶， 有机磷农药能与胆碱酯酶不可逆结合形成性质稳定的磷酰化胆碱酯酶，使其失去活 性，难于发挥正常作用而引起中毒。全氟有机化合物尤其是其代表性化合物，全氟 辛烷磺酸( p f o s ) 和全氟辛酸( p f o a ) 以及它们的盐类作为持久性有机环境污染物新 成员，其所造成的全球性生态系统污染已成事实。 电化学传感器在污染物的检测中有广泛的应用，近年来，有许多关于建立在化 学修饰电极基础上的电化学传感器的文献报道。经过电化学预处理的玻碳电极能使 不同物质的反应速率、可逆性、灵敏度等显著提高，对电化学的反应呈现出很强的 电催化效应。本论文主要将贵金属纳米粒子、纳米管等纳米材料应用于构建电化学 传感器和生物传感器。 l 、本文通过在n a f i o n 膜修饰的玻碳电极表面电沉积金微粒，制各了甲基对硫 磷电化学传感器( a u n a f i o n g c e ) 。利用循环伏安法研究了甲基对硫磷在该传感器上 的电化学行为，优化了实验参数，并且在此基础上建立了用方波伏安法测定甲基对 硫磷的定量方法。当富集时间为2 m i n 时，在磷酸盐缓冲溶液( p h7 ) 中，甲基对 硫磷的还原峰电流与其浓度在5 o x l o 7 1 2 1 0 4m o l l 范围内成良好的线性关系。 ( r = o 9 9 8 8 ) 。检测限为1 0 x 1 0 m o 儿。 2 、本文报道了一种用于检测有机磷农药的生物传感器，通过戊二醛交联牛血清 白蛋白和乙酰胆碱酯酶，将酶固定在修饰了纳米金粒子和碳纳米管的玻碳电极表面， 制成生物电极，并确定了最佳实验条件。在p h7 的磷酸盐缓冲溶液中，当甲基对硫 磷的浓度在8 o l o 7 5 1 0 4m o l l 的范围内，硫代胆碱的氧化峰电流与甲基对硫磷 浓度呈良好的线性关系，检测限可达到5 o 1 0 。7 m o l l 。本文所提出的测定甲基对硫 磷的方法具有较高的灵敏度和较好的重现性。 3 、本文制备了a u 过氧化聚吡咯d n a 电化学生物传感器，以亚甲基蓝为指示 剂，研究了新型有机污染物全氟辛酸在该电极上的电化学响应。通过电化学沉积方 法制备了d n a 过氧化聚吡咯修饰金电极，并对该电极进行了形貌表征，通过一系 列实验研究全氟辛酸( p f o a ) 对d n a 的损伤。通过损伤时间、体系离子强度和电子 北京：i = 业大学工学硕士学位论文 传递性能刈响应的影响，发现全氟化合物p f o a 对d n a 存在者一定程度上的损伤 作用。 本论文考察了以上三种纳米微粒电化学传感器和生物传感器对于不同污染物的 检测，实验结果表明，上述三种传感器具有响应速度快、灵敏度高，选择性好、重 现性和稳定性好等优点，在环境污染物的快速检测中具有良好的应用前景。 关键词甲基对硫磷；金属纳米粒子；碳纳米管；修饰电极；生物传感器 摘要 a b s tr a c t o r g a n o p h o s p h o m sp e s t i c i d e s ( o p s ) u s e dt oc o n t r o lp l a n t d l s e a s e s ， l n s e c t s ，v l c t l m s o fo r g a n i cc o m p o u n d s t h e s ep e s t i c i d e s a r ev a r i e t i e s ，h i g he m c a c y ；a n de a s yt o d e c o m p o s e g e n e r a l l yi td on o ta c c u m u l a t ei n t h eh u m a nb o d y 0 唱a n o p h o s p h o l l l s p e s t i c i d e sa r ew i d e l y 印p l i e di na g c u l t u r a lp r o d u c t i o n m e t h y ll6 0 5c o m m o m y k n o w i l a sm e t h y l p a r a t h i o n ， s c i e n t i 厅cn a m ed i m e t h y l 一( 4 一i l i t r o p h e n y l ) p h o s p h o m t l l i o a t e ，1 sa n o r g a n i cp h o s p h o r u si n s e c t i c i d e a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e( a c h e ) i st h ec o n c e m e do f n e u m c h e m i c a lt r a n s f e ra c e t y l c h o l i n e ( a c h ) h y d r o l y s i se n z y m e s 0 略a n i cp h o s p h o r u s d e s t i c i d ei 盯e v e r s i b l ec o m b i i l a t i o nw i t hc h o l i n e s t e r a s et o i n a c t i v ea n dt o h n a t l o no ta s t a b l ep h o s p h o 科l a t e dc h o l i n e s t e r a s e ，d i f ：e i c u l tt oe x e r tan 狐l r a lr o l ec a u s e db yp o l s o n l n g p e r n u o r i n a t e do r 苫a n i cc o m p o u n d s ， i n p a r t i c u l a r ， i t sr 印r e s e n t a t i o np e r t l u o r o o c t a n e s u l f o n a t e ( p f o s ) a n dp e r n u o r o o c t a n o i ca c i d ( p f o a ) a n d t h e i rs a l t sa sn e wm e m b e r so t p e r s i s t e n to r g a n j cp o l l u t a n t si nt h ee n v i r o n m e n t ，i th a sc a u s e da 出o b a le c o s y s t e m p o l l u t i o nh a sb e c o m ear e a l i t y r e c e n t l vt h e r ea r em a n yr e p o r t sa b o u r te l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r s b a s e do nc h e m l c a l i y m o d i 厅e de l e c t r o d e s e n s i t i v 吼r e v e r s i b i l i t y ，r e a c t i o nr a t eo fd i f f e r e n td e t e n n i n e ds p e c l e s c a nb ei m p r o v e db ye l c c t r o c h e m i c a lp r e t r e a t m e n tg l a s s y c a r b o ne l e c t r o d e ln e e l e c t r o c h e m i c a lp r e t r e a t m e n ts h o w sp r e f e r a b l yc a t a l y z i n ga c t i v l t y t oe l e c t r o c h e m l c a i r e a c t i o n i i lt h i sp a p e r ， p r e c i o u sm e t a l sn a n o p a r t i c l e s ， c a r b o nn a i l o t u b e sw e r ea p p n e dt o c o m p o s i t ee l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r s a n db i o s e n s o r s 1 g o l dn a n o d a n i c l e sw e r ee l e c t r o c h e m i c a l l yd 印o s i t e do nan a f i o nf l l mc o a t e d g l a s s vc a 而o ne l e c t r o d et op r e p a r e as e n s o rf o rd e t e r m i n gm e t h y lp a r a 吐l i o n t h e e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so fm e t h y lp a r a t h i o n a tt h es e n s o r b a s e do ng o l dn a n o p a n l c i e s a j l dn a f i o nf i l mm o d m e dg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e s ( a u n a f i o n g c e ) w e r es t u d i e db y c v c l i cv 0 1 t a m m e 时t h ee x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r sw e r eo p t l m l z e d ，a i l ds q u 盯e w a v e v o l t a m m e t r yf o rd e t e r i n i n i n gm e t h y lp a r a t h i o nw a sd e v e l o p e d t h e i n ? e v e r s i b l er e d u c t l o n p e a kc u r r e n to fm e t h y lp a r a t h i o nw 2 l sp r o p o r t i o n a l t ot h ec o n c e n t r a t l o no tm e t h y i p a r a t h i o no v e rt h er a n g eo f5 o 1 0 7 1 2 xl o - 4 m o l lw i t h t h ed e t e c t i o nl i m i to f 1 0 xl o 。7 m o l l ( r = 0 9 9 8 8 ) 2 as i m d l em e t t l o df o ri m m o b i l i z a t i o no fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( a c h e ) o ng o l d n a n a o p a r t i c l e sa n dm u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ( m w n t s ) w a sp m p o s e d a c h ew a s i m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo fg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ew h i c hw a sm o d i n e dw i t hg o l d i i i 北京：l ：业大学 ：学硕士学位论文 n a n o p a n i c l e sa n dc a r b o nn a n o t u b e sb yg l u t a l 。a l d e h y d e c l o s s l i n k e db o v i n es e r u m a l b u m i n t h ep r e p a r e dc o n d i t i o n so ft h eb i o s e n s o rw e r eo p t i m i z e d i np h o s p h a t eb u f r e r s o l u t i o no fp h7 ，al i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eo x i d a t i o np e a kc u r r e n ta n dt h em e t h y l p a r a t h i o nc o n c e n t r a t i o nw a so b t a i n e do v e rt h ec o n c c n t r a t i o nr a n g ef r o m8 0 l0 叫t o 5 1o m o l l w i t hac o r r e l a t i o nc o c m c i e n to f0 9 9 8 8a n dad e t e c t i o nl i m i to f5 o 10 一 m o l l t h i sm e t h o dp r c i p o s e di n t h i s p a p e rp o s s e s s e sh i g hs e n s i t i v i t y a n dg o o d r e p r o d u c i b i l i t y 3 t h ea u p p y o x d n ae l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sw c r e p r e p a r e d t h e e l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s eo fan e w t y p eo i 苫a n i cp o l l u t a n t s ，p f o a ，o nt h e b i o s e n s o r sw e r e s t u d i e d m e t h y l e n eb l u ew a su s e da s t h ei n d i c a t o ro fo r g a n i cp o n u t a n tp f o ao nt h e e l e c t r o d er e s p o n s e t h em o 印h o l o g yo ft h ee l e c t r o d e sw a sc h a r a c t e z e d t h ed a m a g eo f p f o ao nt h ed n aw a ss t u d i e db yas e r i e so fe x p e m e n t s t h er e s u l t ss h o w st h a tt h e n e w p 0 1 1 u t a n t sp f o ac a nd a m a g ed n a t oac e r t a i ne x t e n t t h ei n j u r yt i m e ，t h es y s t e m i o n i cs t r e n g t ha n dt h ee l e c t r o nt r a n s p o np r o p e n i e so ft h ei m p a c to fc h a n g ew e r e e x a m i n e d i tw a sf o u n dt h a tp f o ad 锄a g e dd n at os o m ed e g r e e t h cm i c r o p a t i c l e sm o d i 行e de l e c t r o c h c m i c a ls e n s o r sa n db i o s e n s o r se x b i t e dg o o d r e c o v e r ya n dr e p r o d u c i b i l i t yw h e nt h e yw e r cu s e dt oa 1 1 a l y z et h er e a ls a m p l c s t h e e x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee l e c t r o c h e m i c a ls c n s o r sp o s s e s s e dt h ea d v a n t a g e s i n c l u d i n gf a s tr e s p o n s e ， h i g hs e n s i t i v i t y ，g o o ds c l c c t i v i t ya n dr 印r o d u c i b i l i t y ，e t c t h e s e n s o r s ，t h e r e f o r e ，p r e s e n tg o o dp r o s p e c t si nt h ea p p l i c a t i o n so fr 印i dd e t e c t i o nt h e d o l l u t e n t s k e y w o r d sm c t h y lp a r a t h i o n ； m e t a ln a n o p a r t i c l e s ；c a r b o nn a n o t u b e s ；m o d i 6 e d e l e c t r o d e s ：b i o s e n s o r s - 目录 目冰 摘要i a b s t r a c t 1i i 第1 章绪论一1 1 1传感器简介1 1 1 1电化学传感器简介1 1 1 2 玻碳电极的基本情况1 - 1 1 3 生物传感器简介一1 1 2 有机磷农药检测及相关领域的研究现状2 1 2 1 甲基对硫磷常用检测方法2 1 2 2 甲基对硫磷的生物检测方法一6 1 2 3 纳米电化学传感器7 1 3 乙酰胆碱酯酶简介一1 0 1 3 1 乙酰胆碱酯酶特性一1 0 - 1 3 2 胆碱酯酶电化学生物传感器- 1 0 - 1 4 全氟有机污染物简介一1 2 1 4 1 全氟类化合物特性及污染现状一1 2 - 1 4 2 全氟化合物的检测技术一1 3 1 4 3 d n a 电化学生物传感器一1 4 一 第2 章基于金一n a f i o n 膜修饰电极检测甲基对硫磷的电化学传感器一1 7 2 1 n a fio n 简介一一1 7 2 1 1n a fio n 的结构一1 7 2 1 2n a fio n 膜修饰电极的性质一1 7 2 1 3n a f i o n 膜修饰电极在分析化学中的应用一1 9 2 2 实验部分一1 9 2 2 1仪器和试剂一1 9 2 2 2 电化学传感器的制备一2 0 - 2 2 3 实验方法一2 0 2 3 结果与讨论一2 卜 2 3 1a u n a fio n g c e 的s e m 表征一21 2 3 2 甲基对硫磷在a u na fio n g c e 的电化学行为一2 2 2 3 3 n a f i o n 用量对甲基对硫磷的影响一2 5 2 3 4 金微粒负载量的影响一2 6 2 3 5 富集电位和时间的选择一2 7 2 3 6 p h 值对甲基对硫磷还原峰电流的影响。2 8 2 3 7 工作曲线一2 9 2 3 8 干扰实验一3 0 2 3 9 电极的重现性与稳定性3 1 2 3 1 0 水样及蔬菜实际样品分析一3l 一 本章小结一3 3 一 第3 章基于纳米金碳纳米管复合物修饰玻碳电极的乙酰胆碱酯酶生物传感器 v ：i e 京丁、i k 火学t 学硕j j 学何论文 检测有机磷的研究一3 5 3 1 引言3 5 3 1 1生物传感器的分类，3 6 3 1 2 生物传感器在食品检验中的应用一3 6 3 2 实验部分一3 7 3 2 1 仪器和试剂- 3 7 3 2 2 碳纳米管制备一3 8 3 2 3 碳纳米管负载纳米金修饰酶电极的制备3 8 3 2 4 实验方法3 8 3 2 5乙酰硫代胆碱的测定一3 9 3 2 6农药的测定一3 9 3 3 结果与讨论3 9 3 3 1 乙酰硫代胆碱酯酶生物传感器的电化学行为3 9 3 3 2 碳纳米管用量的选择4 2 3 3 3 金微粒负载量的影响4 4 3 3 4 酶用量的选择一4 5 3 3 5乙酰硫代胆碱的测定一4 6 3 3 6 温育时间的选择4 7 3 3 7 农药的测定一4 8 3 3 8 电极的重现性与稳定陛一4 9 3 3 9 酶的再次活化一5 0 一 本章小结。5 1 第4 章过氧化聚吡咯修饰金电极研究全氟化合物对d n a 的损伤一5 3 4 1 实验部分5 3 4 1 1 仪器和试剂一5 3 4 1 2吡咯聚合液的合成5 4 4 1 3 修饰电极的制备5 5 4 2 结果与讨论一5 5 4 2 1电极表面性能研究5 5 4 2 2 d n a p p y o 生物复合膜的a f m 的表征一5 6 4 2 3 a u d s d n a p p y o x 的交流阻抗的表征5 8 4 2 4 双链d n a 和单链d n a 分别修饰金电极在m b 中的表征一5 9 4 2 5 a u d s d n a p p y o x 在m b 中不同富集时间的表征一6 0 4 2 6 a u d s d n a p p y o x 在p f o a 中不同浸泡时间的表征一6 0 一 4 2 7 a u d s d n a p p y o x 在p f o a 中不同离子强度的表征一6 1 本章小结6 3 结论一6 4 一 参考文献一6 5 一 攻读硕士学位期间发表的学术论文一6 9 一 致谢一7 1 一 v i 第1 章绪论 1 1 传感器简介 1 1 1 电化学传感器简介 第1 章绪论 电化学传感器是应用最为广泛的化学传感器之一，它主要由识别待测物的敏 感膜和将待测物的浓度转化为电信号的电化学转换器两部分组成，在一定条件 下，被测物质在电池中引起的电化学信号的改变可反映其浓度大小。根据产生的 电信号类别，可将电化学传感器分为电流型和电位型两大类。 电化学分析技术己越来越引起分析工作者的重视，而其中的电化学传感器由 于在生物医学、环境分析领域中的广泛应用，己成为当前电化学研究的热点。开 发便携式的、适用于现场检测和便于操作的检测仪器是我们的主要目标。 1 1 2 玻碳电极的基本情况 玻碳电极材料具有良好的化学和机械稳定性、比较宽的电势窗口、容易抛光 成镜面和相当好的电催化活性；它又是一利一化学惰性物质，不溶于汞，不容易 氧化，与汞电极相比，它具有无毒、可以在正电位下使用、能用于介质交换体系 和连续流动体系等优点。由于玻碳电极本身具有的这种物理和电化学特性，它已 经成为电化分析化学中常用的电极材料 2 】。人们常用的电极预处理方法主要有电 化学处理法，激光处理法，真空热处理法，等离子体侵蚀法等。 1 1 3 生物传感器简介 生物传感器是在化学传感器的基础上发展起来的，也是电化学分析和生物技 术研究最为活跃的领域之一。它是将生物活性物质与各种固态物理传感器相结合 而形成的一种检测仪器，具有灵敏度高、准确度高、选择性好、检测限低、价格 低廉、稳定性好、能在复杂的体系中进行快速在线连续监测等特点，能广泛应用 于基础研究、生物、临床化学和诊断、农业和畜牧兽医、化学分析、军事、过程 控制与检测、环境监控与保护等领域。 酶传感器是生物传感器领域中研究最多的一种类型。生物传感器中的生物活 性物质是传感器的核心部分，然而它们一般都溶于水，其本身也不稳定，需要固 ：f l ：京丁业人学丁学硕j j 学化论文 定在各利载体上，才可延长生物活性物质的活性。固定化技术的运用很人程度上 决定着1 冬感器的性能，包括选择性、灵敏度、稳定性、检测范围与使用寿命等。 1 2 有机磷农药检测及相关领域的研究现状 有机磷农药( o p s ) 是用于防治植物病、虫、害的有机化合物。这一类农药 品种多、药效高，用途广，易分解，在人、畜体内一般不积累，应用极为广泛。 但有不少品种刈人、畜的急性毒性很强，在使用时特别要注意安全，近年来，高 效低毒的农药品种虽然有所增加，并且逐步取代了一些高毒品种，但足有机磷农 药造成人类中毒事件仍经常有发生，特别是有机磷农药残留对农产品和水环境的 污染受到了全社会的广泛关注，因此，开展有机磷农药残留快速检测的应用基础 研究具有十分重要的意义，本科题以甲基对硫磷作为有机磷农药的模型分子，开 展有机磷农药的电化学传感和生物传感技术研究。 甲基刘。硫磷俗称甲基16 0 5 ，学名，一二甲基一( 4 一硝基苯基) 硫代磷酸酯，它 是一种应用比较广泛的有机磷杀虫剂。工业产品为带蒜臭的黄棕色油状液体，纯 品为白色结晶，难溶于水，易溶于有机溶剂，加热会异构化，高温或遇碱易分解。 甲基刈硫磷具触杀和肖毒作用，能抑制害虫神经系统中胆碱酯酶的活力而致死， 杀虫谱广，常加工成乳油或粉剂使用，主要用途是防治多种农业害虫，由于毒性 高，要严格按规定施药，并加强安全防护措施。甲基对硫磷能通过食道、呼吸道 和皮肤引起中毒，治疗可采用注射或服用阿托品或解磷定，还应控制肺水肿、脑 水肿和呼吸抑制。 甲基对硫磷的常用分析检测方法有光谱法，薄层色谱法、气相色谱法、高效 液相色潜法、色谱一质谱联用技术，超临界流体色谱法，酶法，免疫法，传感器 法等技术，例如：电化学传感器法、生物传感器法等。 1 2 1 甲基对硫磷常用检测方法 1 2 1 1 光谱法p 1 光谱法足根据o p s 中某些官能团或水解、还原产物与特殊的显色剂在一定 的条件下发生氧化、磺酸化、酯化、络合等化学反应，产生特定最大吸收波长的 有色化合物来进行定性或定量测定，检出限在p g 级水平，主要用于商品农药的 鉴别试验，灵敏度不高，试验干扰因素多，含不同基团的o p s 的反应也不一样， 易出现假阴性。 为提高灵敏度，用分光光度计等来测定o p s 的方法( 即光谱法) 逐渐代替 了微量化学试验。美国政府分析化学家协会( a s s o c i a t i o no fo 伍c i a la n a l 如c a l 篼1 章绪论 c h e m i s t s ，a o a c ) 规定了片j 红外光谱法检测敌敌畏、保棉磷、甲拌磷，用分光光 度法检测马拉硫磷、对硫磷等【5 】。但光谱法一次只能测定一种或带相同基团的一 类o p s ，且灵敏度不高，一般只能作为鉴别方法粗选，对含各种不同o p s 残留的 样品以及呈阳性的样品还需用其它方法来进行确证试验。 1 2 1 2 色谱法 ( 1 ) 高效液相色谱法( h p l c ) 高效液相色谱法是在液相色谱柱层析的基础上，引入气相色谱理论并加以改 进而发展起来的色谱分析方法。该方法在农药残留分析的应用越来越广泛，这是 因为它适合分析沸点高而不太容易汽化、热不稳定和强极性农药及其代谢产物。 与气相色谱法相比，不仅分离效能好，灵敏度高，检测速度快，而且应用面广。 ( 2 ) 气相色谱法( g c ) 气相色谱法是利用经提取、纯化、浓缩后的o p s 注入气相色谱柱，程序化升 温汽化后，不同的o p s 在色谱柱中分离，经不同的检测器检测扫描，绘出气相色 谱图，通过保留时间来定性，通过峰高或峰面积与标准曲线对照来定量。一次可 同时测定多组份，简便快捷，灵敏度高，准确性好。张曙明等【8 】以丙酮一石油醚混 合溶剂提取残留农药，选用氮磷检测器和s p b 1 7 0 1 毛细管柱，建立了同时测定中 药中8 种有机磷农药残留量的前处理及其毛细管色谱测定法，结果表明：敌百虫、 敌敌畏等8 种农药在2 5 m i n 内有良好的分离，其回收率为7 4 9 6 1 1 6 1 8 ，相对标 准偏差为0 7 1 1 6 9 l 。 目前，随着气相色谱仪的普及，对可能存在o p s 残留的样品如食品、果蔬、 谷物、饲料、茶叶、水产品、土壤、植物材料、水体、以及血液、化妆品、羊毛 脂、牛奶都建立了气相色谱检测方法。 ( 3 )薄层色谱法( t l c ) h 1 薄层色谱法是一种较成熟的、应用也较广的微量快速检测方法。它在农药残 留测定技术上有它独特的用处，它既是重要的分离手段，又是定性、定量的分析 方法。 薄层色谱法的检测过程是：一般先用适宜的溶剂提取o p s ，经纯化浓缩后， 在薄层硅胶板上分离展开，显色后与标准的o p s 比较比移值( 即：r f 值) 进行定 性测定或用薄层扫拙仪进行定量测定。 在检测农药残留量时，原位化学显色技术的检出限一般在l o 1 p g ，荧光显色 技术( 薄层扫描) 在o 1 。0 0 1 嵋，酶抑制技术可达0 0 1 - 0 0 0 1 肛g 数量级水平。 由 于样品中农药残留成分复杂，o p s 含量较低，为此，国内外针对该方法的不同实 验步骤，如提取方法，纯化、浓缩方法，薄层板的吸附剂种类，展开剂的配制， 展开方式( 如单向和双向展开) 以及显色方法都作了深入的研究和改进。 v a h k e v i c ho v 刚酶抑制显色的高效薄层色谱( h t l c ) 来检测马铃薯中的0 p s ， ：i 匕京丁业火学t 学顺l j 誓：1 市沦义 检测限量提高剑o 0 1 5 n g 。 ( 4 ) 超临界流体色谱( s p c ) 超临界流体色谱是上个世纪8 0 年代的新技术，以超临界流体( 一般使用c 0 2 ) 作为色谱流动相，综合利用了气相色谱和液相色谱的优点，传质速度快、萃取效 率高、低消耗、无毒性、条件温和，适宜于高含量杂质分析。超临界流体色谱可 与气桐色谱和液相色谱检测器相匹配，也可与红外、质谱联用，已成为一种强有 力的分离和检测手段。 ( 5 ) 色谱一质谱联用技术哺一1 色谱一质谱联用技术集两种仪器分析方法的长处，利用气相色谱仪和高效液 村l 色谱仪作为农药残留分析的分离器，利用质谱仪作为检测器，可弥补单一仪器 分析方法的不足，解决以前难以解决的复杂混合物的分析测定，使测定结果更精 确、更可靠。气相色谱质谱联用分析技术( g c m s ) 是目前常用的分析方法。 高效液村i 色潜质港联 分析技术( h p l c m s ) 多用于生物和环境领域，由于其 价格昂贵，接口技术还彳i 是很成熟，普及的难度大，有关生物样品中有机磷农药 分析的报道很少。 1 2 1 3 酶抑制法( eim ) e i m 法是利用0 p s 的毒理特性建立的一种快速检验方法，用于分析此类农药 在食品中的残留量的技术，近年米国内外在此技术上进行了大量的研究。 目前应用e i m 法来检测0 p s 的方法主要有纸片法和电化学生物传感器法。由 于o p s 能抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使该酶分解乙酰胆碱的速度减慢或停止，再 利剧纸片作为载体将乙酰胆碱酯酶吸附在上面，如果酶的活性没有被抑制，生成 了基质水解产物，使用呈色剂显色。反之，如果被测样品巾含有农药残留，则酶 的活性被抑制，基质就不被水解，遇显色剂不显色。这样，通过纸片的颜色变化 可以测定o p s ，与标准o p s 比较则可定量。 纸片法最大的优点是操作简单、速度快、不需昂贵的仪器，特别适合现场检 测以及大批样品的筛选，易于推广普及，但灵敏度比仪器法要差一些，重复性、 回收率还有待提高。检测有机磷农药残留量可用胆碱酯酶7 1 、植物酶8 1 和水解酶 【9 】等进行快速检测。 ( 1 ) 应用胆碱酯酶快速检测有机磷农药残留 有机磷农药的杀虫机理主要是抑制害虫体内胆碱酯酶的活性。因此可以应用 胆碱酯酶的抑制率快速检测有机磷农药残留。乙酰胆碱在胆碱酯酶的作用下可以 产生醋酸，有机磷农药存在可以抑制胆碱酯酶的活性，使乙酰胆碱的水解产物醋 酸的量也相应减少，因此胆碱酯酶活性被抑制的程度反映了有机磷农药残留的多 少，胆碱酯怖活性的高低可以通过产酸量的多少来判断，而产酸量可以通过酸碱 指示剂颜色或p h 值变化来估算。 - 4 _ 第l 章绍论 ( 2 ) 应用植物酯酶快速检测有机磷农药残留 由于胆碱酯酶主要来源于动物，材料昂贵，且保存困难。近年来发展了用植 物酯酶代替胆碱酯酶的方法。运用植物酯酶依据的原理是有机磷、氨基甲酸类杀 虫剂能抑制植物酯酶活性，而植物酯酶被抑制的程度可用比色法来测定。 ( 3 ) 水解酶 有机磷水解酶能催化水解有机磷农药( p o 和p s 键水解) 和神经毒剂气体 ( p f 或p c n 键断裂) 。有机磷水解酶对农药如对氧磷、对硫磷和化学战剂如 s o m a n 、s 撕n 和t a b u n 有较强催化水解作用。有机磷水解酶生物传感器与乙酰胆 碱酯酶抑制型生物传感器相比，因消除了有机磷农药对酶的抑制过程，缩短了分 析时间，能一步对有机磷农药直接检测，与胆碱酯酶生物传感器相比，有机磷水 解酶生物传感器最大的优点是用同一支这种传感器可以多次重复检测有机磷农 药，而不必面对因酶的活性受到抑制使测定灵敏度显著降低这样的难题。 1 2 1 4 免疫法 有机磷分子与大分子蛋白质结合后制备成抗原物质，再免疫动物，让动物机 体产生具有特异性的抗体。这种方法用于有机磷农药的检测灵敏度高、特异性强， 但有机磷抗体制作过程难度较大。 1 2 1 5 传感技术 传统的分析技术，如薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱、色谱质谱联用 等技术，虽在农药残留检测技术中发展得比较成熟，但由于仪器设备昂贵、检测 程序复杂、分析周期长、样品前处理耗时以及专业技术性强等，目前，仅靠这些 技术难以对蔬菜、水果等生产和销售环节进行全面监控。 电化学法【1 0 】已经用于有机磷农药的检测。带有硝基芳环的有机磷农药( 图 3 1 ) 例如，对硫磷，甲基对硫磷，对氧磷和杀螟硫磷，具有较好的电化学活性。 电化学法检测带有硝基芳环的有机磷农药具有快速、灵敏的优点。z e n g 以n a f i o n 膜修饰的玻碳电极用伏安法检测对硫磷。l i u 和l i n 制备了纳米二氧化锆修饰的 金电极阳极溶出检测有机磷农药。“等用碳纳米管和n a 6 0 n 膜修饰的玻碳电极 制备了对硫磷的电流型传感器。s b a i 提出了用修饰的碳纤维微电极检测有机磷。 金属纳米粒子具有较高的比表面积和独特的表面性能，在催化等方面表现出非常 优良的特性【】。碳纳米管具有较大的比表面积、优异的机械性能和电子传递能力 以及独特的化学稳定性【1 2 】，在新型复合材料、纳电子器件和光电池等高科技领域 具有重要的应用前剥3 】。碳纳米管与纳米金属材料制成复合材料可产生奇特的协 同作用，因而被广泛用于制备各种化学和生物传感器【l 引。纳米p t ，c u ，c o ，a g ， p d ，a u 等与碳纳米管的复合物被用于检测葡萄糖，t n t ，d n a ，肼等化合物。 ：i 匕京下业火学t 学硕一l j 学仲论文 1 2 2 甲基对硫磷的生物检测方法 1 2 2 1 生物芯片技术 生物芯片的概念源于计算机芯片，生物芯片技术是在一小片固相载体上储存 大量的生物信息( 多至几十万个) ，并与生物化学处理等技术相结合而发展起来 的。将有机磷抗体固定于生物芯片上，通过被标记过的抗原( 有机磷与其他大分 予物质的结合物) 与抗体的特异性结合反应达到对有机磷的检测。 在o p s 中，最常用的显色技术是酶标技术、荧光素标记技术与发光免疫标记 技术。l u e l d n g 等【2 3 】将已知蛋白点印在p v d f ( p l o y v i n y l i d e n ed i f l u o r i d e ) 膜上， 制成蛋白微阵列，并将抗体与该芯片进行孵育反应，再将辣根过氧化物酶( h r p ) 标记的第二抗体与：b 片一抗体复合物反应，通过显色反应检测抗体的存在情况， 从而刈抗体进行筛选。a l c o c e r 等利月j 生物：卷片对2 9 种o p s 测定分析，以b s a 包被 支持物，用划硫磷标准液做竞争分析，线形范围为1 5 6 2 5 0 p m l 。生物芯片技 术是一种新兴技术，具有检测快速、灵敏度高、背景干扰低等优点，但与传统检 测技术相比，尚缺乏稳定性，需要继续完善。 1 2 2 2 活体生物测定法 活体生物测定法主要用发光细菌、敏感家蝇以及大型水蚤等作为测试对象进 行检测。发光细菌体内的荧光素在有氧时经