（遗传学专业论文）一种基于“纳米酶”体系的dna检测新方法.pdf

四川大学硕士学位论文 一种基于“纳米酶 体系的 d n a 检测新方法 遗传学专业 研究生李江指导教师赵云樊春海 摘要 本文构建了一种用于d n a 杂交检测的“纳米酶”体系首先通过柠檬酸 三钠还原氯金酸的方法制备粒径约1 5 r i m 的纳米金颗粒( a un a n o p a r t i c l e s ，a u n p s ) ，利用蛋白分子与纳米金颗粒之间的相互作用，在纳米金颗粒表面连接 辣根过氧化物酶( h o r s er a d i s hp e r o x i d a s e ，h r f ) 分子，然后利用金硫键的作 用在纳米金表面组装末端带有巯基修饰的单链d n a 检测探针，构成了一种以 纳米金为中心的“d n a 一纳米金一m 强”结构的纳米单元，集成了靶物质 检测与信号放大功能，被我们命名为“纳米酶”。在应用该“纳米酶”体系进 行夹心法检测d n a 的实验中，首先在亲和素包被的磁性微粒( m a g n e t i c m i c r o p a r t i c l c s ，m m p s ) 表面组装上生物素修饰的d n a 捕获探针，通过与靶 d n a 序列的杂交作用捕获游离在检测样品溶液中的靶d n a ，经过磁性分离对 产物进行富集之后，再与纳米酶进行杂交反应。洗脱非特异的吸附之后，加 入显色底物a b t s ( 2 ，2 一a z i n o b i s ( 3 一e t h y l b e n z t h i a z o l i n e 6 一 s u l f o n i ca c i d ) ) 或荧光底物h p p a ( 3 ( 缸h y d r o x y p h c n y l ) p r o p i o n i ca c i d ) 进 行酶催反应。结果表明，反应后产物溶液的光吸收值或者荧光强度与靶d n a 四川大学硕士学位论文 的浓度在一定范围内呈良好的线性关系由于一个纳米金颗粒上可以结合多 个d n a 和h r p 分子，起到了信号放大的作用，且磁性微粒起到了浓缩样品、 富集靶物质的作用，这种检测方法显示出良好的灵敏度和可重现性。采用显 色底物反应，根据酶催反应产物在4 0 5 n m 处的吸光值绘制工作曲线，该方法 对靶d n a 的最低检测限在3 0 p m 左右，有效检测范围大约在1 0 0 p m 至3 r i m 之 间；采用荧光底物反应，反应产物在激发波长3 2 0 n m 、发射波长4 0 5 r i m 条件下 测得荧光强度，结果能够将检测极限降低至b 3 p m 左右，且具有更大的检测范 围，大约在l o p m 至1 0 n m 之间在对照实验中，这种应用。纳米酶”的杂交 检测体系表现出良好的特异性，用不能与探针互补的d n a 作为阴性对照，与 含有靶d n a 的阳性对照、不含任何d l 峨样品的空白对照进行平行实验，结果 显示，阴性对照与空白对照产生的信号强度相当，远远小于含有较低浓度的 靶d n a 的阳性对照所产生的信号。此外，本文对于在建立该检测系统的过程 当中所遇到的一些问题，如非特异性吸附、底物的选择等进行了讨论，总结 了目前该检测方法存在的一些不足，提出了下一步工作的方向，并对纳米酶 技术的应用前景进行了展望。 关键词：纳米酶纳米金磁性微粒辣根过氧化物酶h r pd n a 检测 d n a 杂交 a b t sh p p a 四川大学硬士学位论文 an e w s t r a t e g yo fd n a d e t e c t i o nb a s e do n n a n o - e n z y m e m a j o r ：g e n e t i c s p o s t g r a d u a t e ：l ij i a n g s u p e r v is o t ：p r o f z h a oy u n ，p r o f f a nc h u n h a i a b s t r a c t ad e wr e a g e n tn a m e dn a n o - e n z y m ew a sd e v e l o p e df o rd n a h y b r i d i z a t i o n d e t e c t i o n 1 5 n mg o l dn a n o p a r t i c l e s ( a um s ) w e r ee m p l o y e dt oa s s e m b l e m u l t i p l em o l e c u l e so fh o r s er a d i s hp e r o x i d a s e ( m 冲) a n dt h i o l a t e dd n a d e t e c t i o n p r o b e st of o r ma “d n a - n f - h r p ”n a u o - s t r u c t u r e , w h i c hh a df u n c t i o n so fd n a d e t e c t i o na n ds i g n a la m p l i f i c a t i o n i no u rd e t e c t i o ne x p e r i m e n t ，t a r g e td n a sw e r e c a u g h tb yc a p t u r ep r o b e s l a b e l e do n m a g n e t i cm i c r o p a r t i c l e st m m p s ) ， m a g n e t i c a l l yc o u e c t e d , a n dh y b r i d i z e dw i t ht h el l a n o - e n z y m e a f t e rw a s h i n g a w a yu n s p e c i f i ca d s o r p t i o n s ，s u b s t r a t e sw e r ea d d e dt ot h em i x t u r et ot a k et h e e n z y m ec a t a l y z e do x i d a t i o nr e a c t i o n s ，a n dg a v eo u to p t i cs i g n a l sc o r r e s p o n d i n gt o t h ed n ah y b r i d i z a t i o n t w od i f f e r e n ts u b s t r a t e sw c 托u s e di no u re x p e r i m e n t s a b t s ( 2 ，2 一a z i n o b i s ( 3 一e t h y l b e n z t h i a z 0 1 i n e 一6 一s u l f o n i c a c i d ) ) w a sf o ra b s o r b a n c ed e t e c t i o n , a n dh p p a ( 3 - ( 4 - h y d r o x y p h e n y l ) p r o p i o n i c a c i mw a sf o rf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n b e c a u s eo n eg o l dn a n o p a n i c l ec a nc a r r y m u l t i p l em o l e c u l e so fh r p , t h es i g n a l sw e r ew e l la m p l i f i e dc o m p a r e dt ot h e m e t h o di nw h i c ho n l yo n eh r pm o l e c u l ew a sl a b e l e do uad e t e c t i o np r o b e t h i s s i m p l ea n di n e x p e n s i v es t r a t e g ye x h i b i t e dg o o ds e n s i t i v i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t y t h ea b s o r b a n c e - b a s e dd e t e c t i o nm e t h o du s i n ga b t sh a dad e t e c t i o nl i m i to f a b o u t3 0p mw i t had e t e c t i o nr a n g eo f1 0 0 p m - 3 n m ，w h i l et h ef l u o r e s c e n tm e t h o d u s i n gh p p a h a dad e t e c t i o nl i m i ta sl o wa s3p mw i t hab r o a d e rd e t e c t i o nr a n g eo f 3 四川大学硕士学位论文 1 0p m - 1 0n m i nc o n t r o le x p e r i m e n t s ，t h es i g n a l sr e s u l t e df r o mh i g h c o n c e n t r a t e dn o n - c o g n a t ed n a s a m p l e ( n e g a t i v ec o n t r 0 1 ) w c 鞯硒w e a ka st h e b l a n kc o n t r o l ，a n dm u c hw e a k e rt h a nt h ep o s i t i v ec o n t r o l ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h e d e t e c t i o nm e t h o db a s e do nn a n o - e n z y m eh a dag o o ds p e c i f i c i t y o t h e rp r o b l e m s a n di s s u e sw e r ed i s c u s s e di nt h i sp a p e r t h ep o t e n t i a lo fu t i l i z i n gn a n o - e n z y m ei n o t h e rr e a l m sw a sa l s oi np r o s p e c t k e yw o r d s ：n a n o - - e n z y i l l e n a n o g o d m i c r o p a r t i c l e d n ad e t e c t i o f f 。d n a p e r o g id a s e h r p b t s h p p - d - g o i dn a n o p a r t i c i e g a g n e t i c h y b r i d i z a t i o l l h o r s er a d j s h 四川大学硕士学位论文 1 引言 d n a 是遗传信息的承担者，d n a 检测在很多领域都发挥着举足轻重的 作用不论是在疾病诊断、病原微生物检验、基因组研究、还是在生态研究、 环境保护、司法鉴定等方面，都成为越来越不可缺少的有力的工具【 多年以来，人们一直致力于发展和完善d n a 的检测方法，使其更加灵敏、 精确，便捷、经济，以满足基础研究和临床诊断等领域对d n a 检测越来越 高的要求 d n a 检测方法多种多样，如核酸杂交检测、聚合酶链式反应( p c r ) 、连 接酶链式反应( l c r ) 等嘲其中杂交检测是一种目前仍然广泛采用的经典 检测模式，具有特异性高、能够区分单碱基错配的优点从s o u t h e r n 杂交、 n o r t h e r n 杂交到近年来迅速发展的基因传感器、基因芯片等，都属于杂交检 测的范畴。杂交检测通常在探针d n a 序列上进行标记，通过探针与目的d n a 之间的杂交给出对应于目的d n a 的信号。从早期的放射性标记到后来的荧 光标记、地高辛标记、生物素标记等1 3 l ，这些标记都需要解决如何将一定的 化学基团或生物大分子与探针d n a 有效连接起来的问题。这些连接过程往 往是繁琐费时而且代价高昂的。 在生物技术和医学应用当中，如何高效便捷地将各种不同功能不同性质 的生物大分子连接组装在一起一直是一个重要的课题 在经典的酶联免疫吸附检验方法( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b c n ta s s a y , e l i s a ) 当中，将检测抗体与酶按照一定的方法连接起来，当检测抗体与特 异的靶抗原相结合之后，就可以通过其上的酶分子催化显色反应给出一个与 靶抗原浓度相对应的信号【4 】 近年来发展起来的免疫p c r 技术( i p c r ) 5 1 ，其原理与e l i s a 方法相似， 也是用于蛋白质检验。i p c r 要求将抗体与寡核苷酸分子连接起来。试验中当 抗体与抗原结合后，通过p c r 反应，以连接在抗体上的寡核苷酸分子为模板 进行扩增，扩增产物的量与抗原的量相对应。i p c r 利用p c r 方法对于核酸 的近乎指数扩增的能力对免疫反应的信号放大，因此检测灵敏度可以比传统 的e l i s a 试验高出约2 4 个数量级i “。但是，如何高效便捷地将抗体与d n a 四川大学硕士学位论文 分子相连接，一直是m c r 方法当中的一个技术难题，成为制约i p c r 推广应 用的瓶颈1 6 1 连接生物大分子的方法很多，例如：通过基因工程的方法，将两个基因 融合到一起进行表达，可以产生由两种蛋白构成的嵌合体( 融合蛋白) ，这一 方法被成功应用到酵母双杂交系统当中，以研究两种不同的蛋白之间的相互 作用但是，利用基因工程进行蛋白质融合的代价往往是高昂的，而且不同 的蛋白质在宿主细胞当中进行表达的过程还可能会遇到各种问题，并不是所 有的蛋白都适合在异源的宿主当中表达 7 1 利用生物素一亲和素之间的高特异性和高亲和力的相互作用对不同的生 物大分子进行连接也是一种被广泛应用的方法。一个亲和素分子上有4 个生 物素的结合位点( 实际上由于空间位阻的关系，一个亲和素分子通常只能结 合两个生物素分子) ，因此只要将需要连接的生物大分子进行生物素的标记， 就能以亲和素分子为桥梁把它们连接起来嗣目前e l i s a 和i p c r 方法当中 将抗体与酶相连或者抗体与d n a 相连多是采用生物素一亲和素系统【6 们 采用化学合成的方法直接对生物大分子进行共价键连接也是一种选择。 但是，一般的生物大分子如蛋白等通常很难耐受化学合成方法中的一些苛刻 的反应条件嗍另外，一些高分子化合物也被用作耦联生物大分子的载体i l o 】 纳米金是一种对蛋白质等生物大分子亲和力极强的材料，早在2 0 世纪7 0 年代就被广泛用于在电镜染色中标记蛋白分子【1 1 1 同时，由于金硫键的作用， 可以使纳米金与带有巯基修饰的d n a 分子共价连接在一起。m i r k i n 等人已 经对于d n a 标记的纳米金的性质和应用进行了深入的研究【1 2 1 作为生物大分子的耦联剂，除了可以很容易地与生物大分子进行连接之 外，纳米金还有很多其他材料无法比拟的优越性。纳米颗粒由于其特殊类型 的结构导致了它具有四方面的效应：表面效应、体积效应、量子尺寸效应和 宏观量子隧道效应，并由此产生出许多特殊性质，独特的光学、电学、磁学 和结构特性等【1 3 1 纳米尺度的材料有着极大的比表面积，这就使得同样体积 的材料可以组装更多的生物大分子；其次，纳米金在溶液中的分散性较好， 包被在其上的生物大分子与溶液当中其他物质之间的反应可以被看作是类均 相反应，反应的效率大大高于固相与均相之间的反应：更重要的是，如果将 蛋白质直接吸附在裸的金表面，蛋白质通常会变性和失去生物活性，而组装 四川大学硕士学位论文 在纳米金表面的蛋白质，如抗体分子和酶分子，仍然能保持其原有的活性基 本不受影响【l l 】，这在其他的材料中是比较少见的。这种特性便于我们利用纳 米金上的蛋白分子开展各种生化反应 m i r k i n 等利用纳米金的这些性质建立了一系列的d n a 检测方法，利用 d n a 杂交作用改变溶液中纳米金颗粒之问的距离，造成溶液颜色的改变，利 用这种纳米材料的光学性质进行特定d n a 序列的检测【体垌另外，他们还 建立了一种i p c r 蛋白检测方案【1 7 1 ，即在纳米金表面组装检测抗体与信号 d n a ( 被称为b a r c o d ed n a ) ，通过抗体抗原反应与被固定的靶蛋白结合之 后，以信号d n a 作为模板进行p c r 扩增。 除了利用纳米金结合d n a 分子进行d n a 检测之外，也有很多报道采用 用辣根过氧化物酶( h o r s er a d i s hp c r o x i d a s e ，h r p ) 包被的纳米金进行h 2 0 2 的检测【n s - 2 0 1 h r p 是一种在e l i s a 试验、w e s t e r n 杂交试验等检测方法中 常用的标记酶，在d n a 的检测中也被采用【2 1 - 2 2 1 ，通常被用来对p c r 产物进 行检验分析在h 2 0 2 的存在下，h r p 催化特殊底物的氧化反应，使底物转变 为容易被检测的产物。由于酶的催化效率极高，这一产生信号的过程同时也 起到了信号放大的作用 目前，尚未见到有利用纳米金同时连接d n a 分子与h r p 酶分子并用于 d n a 检测的报道。为了探索更便捷的生物大分子的连接方法以及新的d n a 检测方法，本文采用纳米金作为桥梁将d n a 分子与h r p 进行连接，并尝试 将其应用于d n a 的检测。本文使用了两种底物：a b t s 和h p p a 。a b t s 与 h 2 0 2 的溶液在h r p 的催化作用下由无色变为蓝绿色，可在4 0 5 r i m 处测得其 特征吸收值，该吸收值的大小与h r p 的量呈正相关；h p p a 与h 2 0 2 的溶液 在h r p 的催化作用下产生荧光，可在3 2 0 r i m 波长激发，在4 0 5 r i m 处测其荧 光强度其荧光强度与h r p 的量呈芷相关因此，对酶催反应产物进行定量 分析就能实现对目的d n a 的定量检测。 四川大学硬士学位论文 2 材料与方法： 2 1 实验材料 2 1 j 寡核苷酸序列的合成 实验所需的寡核苷酸序列全部由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成，全部序列见t a b l e l 所示捕获探针序列为1 5 个碱基，带有1 0 个t 以减 小与靶d n a 序列杂交时的空间位阻在捕获探针的3 末端带有生物素标记， 以便与亲和素包被的磁性微粒相连。检测探针为1 8 个碱基并带有1 5 个t ， 其5 末端带有巯基修饰，以便与纳米金颗粒相连靶d n a 为一段4 0 个碱基 的序列，与乳腺癌基因当中的一段致癌序列有判捌，其上游与下游分别能与 捕获探针和检测探针完全互补非互补d n a 为一段加个碱基的序列，与捕 获探针以及检测探针之间没有互补作用，被用作实验中的阴性对照。填充 d n a 为一段1 5 个t 的序列，与实验当中其他的任何序列都不会发生互补， 被用作填充材料，封闭反应当中可能造成d n a 非特异性吸附的位点，以降 低背景信号为了进行对照实验，同时还合成了不能与靶d n a 互补的假捕 获探针以及假检测探针 合成的序列在紫外光谱仪上测得o d 值，换算成对应的物质的量，并加 m i l l i q 水稀释到一定的摩尔浓度。分装后置于一2 0 冰箱保存。 2 1 2 化学试剂 辣根过氧化物酶( r r p ) 从华美生物工程有限公司购得，r z 值约2 8 。 a b t s 、h p p a ，小牛血清白蛋白( b s a ) 、聚乙二醇( p e g ，平均分子量 3 ，3 5 0 ) 均从s i g m a 公司购得。 带有链霉亲和素包被的磁性微粒( s t r c p t a v d i n c o a t e dm a g n e t s p h e r p a r a m a g n e t i cp a n i c l c s - 1 0 i lm d i a m e t e r , 1m g m 1 ) 从p r o m e g a 公司购得 其他的试剂均为普通分析纯。 2 1 3 缓冲液 缓冲液的配制如表2 所示所有溶液均用m i l l i q 水配制。 四川大擘硕士学位论文 表1 ：实验中的d t a 寡核苷酸序列 寡核苷酸序列名称碱基组成 捕获探针( c a p t u r ep r o b e ) 5 g a aa c cc t at i ta t gc t cr r r r r r t 丌t ( b i o t n m 3 检测探针( d e t e c t i o n p r o b e )5 s h - ( c h g 一1 r r t i t t r t t r r l l 广r g t a t g a a n 蛆 a a t c a a a 3 靶d n a ( t a r g e td n a ) 5 g a gc a ta c at a gg g tt i c 卫四t g g t t t c i t t g a t l ：a t a a t i z 氏c3 非互补d n a ( n o n - c o g n a t e5 a c a c g c l l bg t a g a c t r r t r r t l l r dna)1：gc a tc g _ a 1 a a c g t t3 填充d n a ( s p a c e r d n a ) 5 t r r t r r t r r r r r m 3 假捕获探针f a k ec a p t u r e5 t a g g g c a g g t i g g g g t g a l l t t r r p r o b e )t r r t ( b i o t 踯3 假检测探针( f a k ed e t e c t i o n5 s h - ( c h 2 ) 6 一r 1 1 r m t r r t r r t l l r t i g p r o b e ) g t r g g t g t g g l t g g 3 表2 ：缓冲液的配制 缓冲液名称组成 洗涤缓冲液 封闭缓冲液 储存缓冲液 杂交缓冲液 酶催显色反应溶液 酶噬荧光反应溶液 1 0 m m 磷酸氢二钠，磷酸二氢钠缓冲液。0 0 1 t w e e n - 2 0 , p h 7 4 ，1 0 0 m m n a c i 。 1 0 m m 磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液，p h7 4 ，1 ( 3 0m m n a c l , 5 p e g , 2 b s a 1 0m m 磷酸氢二钠滕酸二氢钠缓冲液，p h7 4 ，0 1m n a c i , l b s a , 0 0 1 柳硫汞 7 5 0m mn a c i ，1 5 0m l v l 柠檬酸三钠，p h7 4 0 0 5m 磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液，p r i5 0 ，o 0 1 a b t s ，0 0 0 7 5 h 2 0 2 ，在使用前新鲜配制 o 1 mt d s 盐酸缓冲液，州8 5 ，o 0 5 h p 队， 0 0 0 7 5 h 2 0 2 。在使用前新鲜配制 9 四川大学硕士学位论文 2 2 实验仪器和设备 t e c a ng e n i o s 多功能酶标仪；h i t a c h i 紫外光谱仪：h i t a c h i 高速冷冻 离心机；p r o m e g a 磁性分离架；e p e n d o f f 小型温控摇床、移液器；便携式精 密p h 计；电子天平；冷凝回流装置；烧杯、离心管、比色皿、c o s t a r 9 6 孔 透明平底板等 2 3 实验方法 2 3 1 纳米金的制备 纳米金的制备方法参考文献【1 1 1 ，将实验当中用到的所有玻璃器皿在重铬 酸钾硫酸洗液中浸泡过夜，用自来水彻底冲洗，并以m i u i q 水反复涮洗之后， 在干燥箱中干燥备用。 配制1 0 0 m l 0 0 1 h a u c h 溶液，然后将其倒入烧瓶中，加入搅拌子，置 于磁力搅拌加热器上加热并搅拌整个加热过程中应使用冷凝回流装置，以 尽量保持整个体系的体积不变。新鲜配制0 0 1 ( 1 0 m g m l ) 柠檬酸三钠溶 液，将2 5 m l 0 0 1 柠檬酸三钠溶液一次性迅速加入到沸腾并保持快速搅拌的 h a u c h 溶液中加入柠檬酸纳的体积决定最终形成的纳米金的粒径，2 5 m l 柠檬酸三钠溶液形成的纳米金大约在1 5 r i m 左右，浓度约2 3 n m 。保持溶液 沸腾且快速搅拌2 0 r a i n ，溶液应呈现亮红色，停止加热，保持搅拌2 0 r a i n ， 待溶液冷却到室温后，分装至灭菌的5 0 m l 离心管中，置于4 c 冰箱中保存 备用。 刚制各好的纳米金稳定性较差，容易发生团聚。可在4 c 条件下放置两天， 使其稳定性得到一定改善。在制备好的纳米金中加入硫柳汞溶液至终浓度 0 0 1 可以抑制细菌生长。 2 3 2 纳米酶的制备 取h r p 粉末溶解于m i u i q 水中。配成0 0 1 ( 1 0 m g m l ) h r p 水溶液。 取5 m l 纳米金溶液，以0 1 mn a o h 调p h 值到8 9 左右( 大约每毫升纳 米金加4 0 m l n a o h ，检验p h 值应使用精密p h 试纸，避免使用p h 计，因为 四川大学硕士学位论文 纳米金可对p h 计的探头造成损坏) 取1 0 0 # l i 姗溶液加入调好p h 值的纳 米金中，混匀后置于温控摇床3 7 8 0 0 r p m 温育3 0 m i n 4 1 2 0 0 0 r p m 离心 2 0 m i n 。吸掉多余上清液( 留下约l m l ，纳米金的终浓度约1 0 n m ) ，然后用移 液枪轻轻吸打沉淀，使其重新悬浮；在浓缩后的溶液中加入巯基修饰的d n a 检测探针至终浓度li ll ，混匀后，在4 条件下组装1 6 h ，然后逐步加入1 0 m m p b 1 mn a c l ( 可分4 次加，每两次之间间隔时间3 0 m i n 以上) ，直至n a c l 的 终浓度达到0 1 m ，在4 条件下放置2 4 h ；在溶液中加入1 0 的b s a 水溶液 至b s a 终浓度1 ，室温封闭3 0 r a i n 4 1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 m i n ，弃上清， 加入l m l 储存缓冲液( 见表2 ) 洗涤，用移液枪轻轻吸打沉淀，使其重新悬 浮，如此重复离心、洗涤3 次，最后一次加5 0 0 i il 储存缓冲液，置于4 冰 箱保存备用 2 3 3 标记捕获探针的磁性微粒( m a g n e t icm io r o p a r ticie s m m p s ) 的制备 取l m l 包被有链霉亲和素的磁性微粒，用磁性分离架进行磁性分离，去 掉上清，加入等体积的杂交缓冲液( 见表2 ) ，轻轻摇晃使其混匀，再进行磁 性分离，去掉上清，如此反复用杂交缓冲液洗涤磁微粒两次磁性分离去上 清后，加入l l n l 杂交缓冲液，其中含有生物素修饰的捕获探针d n a 约2n m o l ， d n a 的量相对于磁性微粒的结合能力是过量的( d n a 与p r o m c g a 的磁性微粒结 合能力大约是1 2 5 n m o ld n a ：l m g 蛐l p s ) 。将该混合物置于温控摇床2 5 下 摇晃温育3 0 分钟，避免磁微粒沉淀影响捕获探针的组装效率温育完成后， 磁性分离，用等体积洗涤缓冲液( 见表2 ) 洗两次，磁性分离去上清之后将 沉淀悬浮于封闭缓冲液( 见表2 ) 中封闭3 0 分钟，然后再用洗涤缓冲液沈两 遍，去上清，将沉淀悬浮于l m l 储存缓冲液( 见表2 ) 中，置于4 冰箱保存 备用。 2 3 4 夹心法检测靶d n a 检测的策略如图1 所示整个检测体系由检测探针标记的纳米酶、捕获 探针标记的磁性微粒和含有靶d n a 的样品溶液三部分构成。当这三种组分在 反应体系中同时存在时，就可以通过捕获探针一靶d i v a - - 检测探针三者之间 的杂交作用形成夹心结构。经过磁性分离富集磁性微粒之后。通过核酸杂交 四川大学硕士学位论文 结合在其上的纳米酶就可以高效地催化底物的氧化反应给出颜色信号而当 靶d n a 分子不存在时，上述的夹心结构就无法形成纳米酶就会在洗涤的过 程中被除掉，因此不会发生酶催反应，也就没有信号产生 具体的实验步骤如下：首先在1 s m l 离心管中( 离心管预先使用l 的 b s a 溶液封闭3 0 分钟) 加入5 0 u l 预先制各的捕获探针标记的m m p s 用杂 交缓冲液洗涤i v m p s 两遍，磁性分离，去上清加入l m l 含有不同浓度靶 d n a 的杂交缓冲液，置于温控摇床3 7 下摇晃温育1 小时。温育完成后， 将混合物进行磁性分离，加l m l 洗涤缓冲液( 见表2 ) 洗两遍，磁性分离去 上清加入纳米酶的工作溶液( 3 私l 杂交缓冲液2 舡l1 0 的b s a 0 和l 1 0 0 u m 填充d n a , x 0 m l 预先制备的纳米酶储存溶液) ，置于温控摇床3 7 下 摇晃温育1 小时。接下来，磁性分离去上清，加l m l 洗涤缓冲液洗涤如此 重复洗涤5 遍以去除未连接的纳米酶磁性分离去上清。 2 3 5 酶催显色反应以及光吸收值的测定 将杂交反应后得到的产物悬浮于1 0 0i il 酶催显色反应溶液( 见表2 ) 中， 置于温控摇床上2 5 c 摇晃反应3 0 分钟进行显色。反应完成后进行磁性分离， 取上清液转移至微孔板中，用酶标仪测吸收值( 采用双波长测试，用4 0 5 n m 处的吸收值扣除5 2 0 r i m 处的吸收值，以降低微孔板本身在不同位置的吸收值 差异所带来的误差) 2 3 6 酶催荧光反应以及荧光强度的测定 荧光法检测与显色法检测的区别仅仅在于所采用的底物和酶催反应的条 件不同。将杂交反应后得到的产物悬浮于1 0 0 l ll 酶催荧光反应溶液( 见表2 ) 中，置于温控摇床上3 7 摇晃反应3 0 分钟。反应完成后加入等体积2 mn a o h 溶液终止酶反应，磁性分离，取上清液至荧光比色皿中，用荧光光谱仪测荧 光强度，激发波长3 2 0 r i m ，发射波长4 0 5 r i m 。 璺型查兰堡主兰竺堡壅 1 3 ， 幸 4 田c口一u i l d p o 一暑o ， 匝龋惦雕隧蠼恹蘸鳟舌窨嚣米暴巾螂；l匾 c一aou ocfl一：o叱 曲由口oia毋-，_au c=；口。一o(1一正：苫 四川大学硕士学位论丈 3 结果与讨论 3 1 纳米金的制备 将制得的纳米金溶液置于原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e a f m ) 下进行观察，结果如图2 所示经统计，纳米金的粒径在1 5 r 珊4 - 3 n m 左右 分散性较好，没有明显的团聚现象。 图2 ：1 5 m 纳米金在原子力显徽镜下的图像 3 2 纳米酶的组装 d n a 与h r p 各自在纳米金上的组装都是比较成熟的技术，已有很多相 关文献报道【1 1 , 1 2 , 1 8 , 2 4 , 2 5 】，但是，目前还未见报道对二者同时在纳米金上组装 的效率问题做深入研究我们在实验中采用的是分步组装的办法，即先组装 h r p ，再组装巯基修饰的d n a 。采取这样的策略是基于以下的考虑：第一， 由于产生信号的是h r p 分子，因此每个纳米金颗粒表面组装的h r p 分子越 多，对结果的放大作用就越好，检测灵敏度就越高，相反地，纳米酶上检测 探针的数量对检测灵敏度的影响不大，理论上只要保证纳米酶能以较大的几 四川大学硕士学垃论文 率与靶d n a 杂交即可；第二，由于d n a 分子的空间结构，一旦在纳米金表 面形成密集的组装之后，加上空间位阻的作用，可供体积相对较大的h r p 分 子组装的位点就可能很少了 纳米金胶体溶液对于盐离子浓度是相当敏感的，因为纳米金颗粒之所以 能分散在整个溶液体系当中，依靠的是纳米金表面所带的电荷，使得颗粒与 颗粒之间由于电荷斥力而保持距离而在溶液中引入一定浓度的盐离子之后， 纳米金颗粒表面的电荷就会被屏蔽，导致纳米颗粒发生聚集所以，实验中 使用的h r p 应该事先经过脱盐处理防止组装h r p 时纳米金发生聚集。然 而，在纳米金表面组装上h r p 之后，其对盐离子的耐受力可以大大增强 对于组装于纳米金上的h r p 分子，我们很容易测得其酶催活性，而要对 组装的d n a 分子进行定量是比较困难的，但是最终的检测实验结果证实了 d n a 探针已经成功组装在了纳米金颗粒表面，否则不会产生特异的信号 实验中，h r p 组装溶液的浓度相对于纳米金对其的结合能力而言是大大 过量的，但是从对照实验来看，组装了h r p 之后再组装d n a 探针的纳米酶 溶液与不组装d n a 的对照组相比，其h r p 的酶活性降低了大约一半左右( 数 据略) 。造成这种现象的原因有两种可能： 第一，d n a 探针与纳米金的结合主要依靠巯基与金之间的共价作用，作 用力比较强；而h r p 作为一种蛋白质分子，其与纳米会的结合力比较复杂， 如静电力，疏水作用力等等，作用力相对较弱，因此在加入d n a 探针之后 有纳米金表面有一部分h r p 分子被d n a 分子取代，导致纳米酶催化活性下 降 第二，d n a 分子的空间结构对h r p 的活性区域造成了阻挡或者封闭， 虽然h r p 分子的数量没有太大变化，但是其单个分子的活性受到了较大影 响。当然，纳米酶酶催活性的下降也可能是上述两方面原因共同的结果。 3 3d n a 杂交检测 3 3 1 酶催显色反应检测 用a b t s 作为底物的实验结果显示：h r p 催化的a b t s 显色反应，产物 的吸收值与靶d n a 的浓度有着良好的正相关关系。当靶d n a 在一定的浓度 范围内改变时，显色反应的产物颜色深度会有很灵敏的变化，即使用肉眼观 四川大学硕士学位论文 察也能分辨出2 5 0 p m 靶d n a 样品与空白对照的颜色区别( 图3 ) 使用酶标仪读取产物的吸光度值，以吸光度值对靶d n a 浓度作图，可以 得到一条s 形工作曲线( 图4 ) 估计该检测方法工作范围在1 0 0 p m 到3 n m 之间，最低检测极限大约为3 0 p m 在对照实验中，这一检测系统表现出良好的特异性。当用非互补的d n a 序列作为阴性对照的检测样品时( 浓度为3 r i m ) ，结果表现出的信号强度与 空白对照相当，远小于5 0 p m 靶d n a 的阳性对照( 图5 ) 。 另外，实验表现出良好的重复性。实验误差在可以接受的范围内，而且 主要来自于实验操作过程当中的人工因素和实验条件的变化如果所有操作 全部实现自动化并且实验条件能够被严格控制，相信还可以进一步降低误差 并提高灵敏度。 3 3 2 酶催荧光反应检测 用h p p a 作为底物的实验结果显示：酶催反应产物的荧光强度与靶d n a 序列的浓度里正相关关系。使用荧光光谱仪记录产物的发射光谱，取波长 4 0 5 r i m 处的荧光强度值作图，可以得到一条s 形曲线( 图6 ) 估计该方法工 作范围在1 0 p m 到1 0 r i m 之间，最低检测极限大约为3 p m 。与显色法相比， 荧光法将检测极限降低了一个数量级，且检测范围更宽。 荧光法的对照实验同样显示出良好的特异性，即使加入浓度1 0 0 倍于靶 d n a ( 2 5 0 p m ) 的非互补d n a ( 2 5 n m ) ，结果的荧光信号仍然与空白对照相 当，远远低于阳性对照的信号水平( 图7 ) 图3 ：d n a 杂交后纳米酶催化显色反应的结果 6 个孔对应的靶i ) n a 浓度从左到右依次为：1 0 0 p m ，2 5 0 p u 。5 0 0 p m 1 n m ，2 n m ，3 n m 四川大学硕士学位论文 严a o ，a o ) e o u e q j o s q v 1 7 - n等4苫jjo。毛1iun鼍p1口8口薯占n 哥台；删堡共蠖*睬好蘑钽蛊悄氡獒 i占0i。最獒举幅赢划世经善霉暑毯霞蛭口辎斜暴寓卜捌鼎辱)c 璐鲁姐套!鐾水越苌暑世蜒vnd群胛0鼋8v埋粜昏g霉*慑堪脚嘣辱匝 芝一co一肖暑cocoo_o孕卜 嚣0c)0irk g 西 81恕 o o n on o，o峨oo 四川大学硕士学位论文 ( o a g q o g o 分o o ) o o u e c o s q v 1 8 爨始n 忸j bo j o 乏。 丑眭椭堡磐蜷*咔好蘸颦g悄vna饥睁v匪霞烈工vna惫州尝鼍nv匪靛掣匹、(vna群l占b锥钿v氍靛掣置状懿肇艄赢刈 卫c 叮一 舒林氍靛蠼脚嘣=9匝 m5；oz o 孽o 正 o o o o“o o o寸o o oo o oo o o0 1 o o“5 0 寸i o o 四川大学硕士学位论文 oooooooo 量呈墨曼品8 导。 血! s u 钟u ! e o u a o s a j o n l _ - i - 1 9 - o 丑舍舳堰搏蜂*睬辈；嚣颦客倒氯蒜 n k e q jojj。毛nhu“iido”“暑器毛日“农葵蟮椰赢刈世聪yna群蛊堪霞哐牛b鼙飘簌茁卜捌涮暴)【 睽墨姐京睡水氆霞g倒聪薹a肆玎18_(善斟，v世骥米弑髻霉k趟哒装弑9匝 =a、co謦巴芒oocoo苗6jj_ 0 8 i o o i o i _ 四川大学硕士学位论文 - 2 0 5 舂毒埘嚣毛器霉姐v曝埒匪茛掣匿农璐曩脚翳啭姆匪靛倒最舞租脚矧vn6卑一do口n忙姐v睬播醒葳掣置最蒜租棚瑚 匿謦米米粼雹睬播拳能露茛蠼米弑l田 四川大学硕士学位论文 p a o j o ) a o u e q j o s q v 2 1 一叵罂像林匪靛目肝霉牡啦篁株21蚓舌群肝怒睁蠡驻震爨一匪靛蛊茹啦霞颦鬻匠粜工叵甘|繇俅匪霞日胛露啦蜷掣琼2*虮nn群奸耀睁 拓蜷懵鞲v受霞g菇鹾攥鬟鬻匠眯xhun最蟛聪vn6霉表磁幕罐品靠蜷搽辍盆惫州vno群圩拦旺眯v匪霞目。状嚣蛏婚丽删 玺林睡靛善昏啸磐特宅工ji!燃柚吲旺：8匝 9qeuo弓苗口。蒿u eqojnirqd8皇l o o“on o寸0 四川大学硕士学位论文 3 4 非特异反应的避免 由于纳米酶检测系统所引入的材科种类很多，包括磁性微粒、生物素和 亲和素分子、d n a 分子、蝴冲分子、纳米金颗粒等，它们之间相互作用关 系可能会相当复杂因此，防止非特异的反应就是本实验的关键问题。 首先，在实验中我们注意到，普通的塑料离心管对亲和素包被的磁性微 粒、纳米酶等实验材料有强烈的吸附作用，如果不经过处理，实验结果就会 产生强烈的背景信号。这可能是由于高分子材料对蛋白质的非特异吸附所致。 因此，实验中所有的塑料离心管在使用前都用b s a 进行了封闭操作以避免对 实验材料的吸附b s a 是一种分子量相对较小的惰性蛋白，被广泛用于封闭 非特异吸附位点 其次，虽然在制备捕获探针包被的磁性微粒和纳米酶的过程中我们已经 进行了封闭，但是磁性微粒和纳米金颗粒表面潜在的空余位点以及蛋白质有 可能对实验中的样品d n a 造成非特异性吸附，即使这些d n a 序列并不能与 探针序列互补这样就会造成假阳性结果因此我们在反应体系中加入了填 充d n a 和b s a ，填充d n a 的序列不能与反应体系中的任何其他序列互补， 它和b s a 一起被用来填充磁性微粒以及纳米金表面的空余位点，防止样品中 非特异的d n a 的吸附实验结果表明，引入填充d n a 和b s a 之后，背景 信号有显著的降低，否则，非特异性吸附产生的信号甚至会完全淹没特异反 应产生的信号 另外，由于本检测系统采用夹心法检测，必须保证两个探针序列之间没 有有明显的互补序列，并且其自身不会形成二级结构 为了证明杂交实验的信号确实是由于靶d n a 与探针序列之间特异反应 产生，而不是由于靶d n a 与纳米酶或磁性微粒之间的非特异吸附，我们用 显色法进行了另一个对照实验，如图8 所示。用不能与靶d n a 互补的假捕 获探针组装对照的磁性微粒捕获系统，用不能与靶d n a 互补的假检测探针 组装对照的纳米酶，结果显示，在其他条件完全相同的情况下，以上的两种 对照所产生的信号远远小于正对照( 即捕获探针、检测探针均能与靶d n a 互补) 的信号 四川大学硕士学位论文 3 5 纳米酶检测系统存在的问题与解决方案 本文将纳米酶成功应用于d n a 杂交的显色法和荧光法检测，但是还有很 多技术细节和条件有待优化，以迸一步提高检测的灵敏度和特异性。 酶催反应底物的选择是决定该检测系统灵敏度和特异性的一个重要因 素通过选择不同的底物，可以在很大程度上适应不同的应用要求 选择像a b t s 这样的显色底物进行显色法检测，和其他方法比