（农产品加工及贮藏工程专业论文）乐果酶联免疫试剂盒的研制.pdf

独创性声明 本人声明所里交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 驽哆、。薤 时润：揶6 年6 玛f 冰 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫拙等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不伺方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签铄鸯垓藤 新繇和雩 时间： a 帅多年月厂良日 时间： f f年舌月，。日 沈阳农业大学硕士学位论文 摘 农药残留是危害食品安全的重要原因， 要 其中有机磷农药是目前使用最广的一类农 药，约占农药总使用量的7 0 ，因此，对有机磷农药的检测是食品安全检测的重要内容。 乐果是一种中等毒性的有机磷杀虫剂，但其在体内的氧化产物_ 氧乐果的毒性是乐果 毒性的数十倍。目前用来检测乐果的方法主要是气相色谱( g c ) 和高效液相色谱 ( h p l c ) ，这些方法前处理步骤复杂，费时费力、设备昂贵，需要专业人员操作，适宜 实验室操检测，不适宜大量样品和现场快速检测。 酶联免疫吸附分析( e i l z y m e 1 i n k e di m m 瑚o a s s a y ，e l i s a ) 方法快速、灵敏、选择 性好，适宜痕量物质的检测，同时还具有检测成本低，操作简便，安全可靠等优点。所 以研制乐果的酶联免疫试剂盒具有重要的实际意义。本研究旨在解决检测乐果残留的试 剂盒中的关键技术和科学问题。 根据乐果分子结构的特点及生物学特性，首先合成了乐果的半抗原，然后将半抗原 与载体蛋白牛血清蛋白( b s a ) 和卵清蛋白( o 、，a ) 偶联合成乐果的免疫原和包被抗原。 用合成的乐果免疫原免疫小鼠后获得乐果的多克隆抗体，用间接e l i s a 测定抗体 的效价为1 ：2 5 6 0 0 0 ，亲和常数为3 8 4 1 0 1 0 ，酶标抗体的效价是l ：4 0 0 0 。除了氧化乐 果以外，它与其他主要的有机磷农药的交叉反应率都很低。通过直接和间接e l i s a 检 测，确定乐果试剂盒的最佳包被介质是o 0 5 n l o l l ，p h 9 6 的碳酸盐缓冲液、最佳包被温 度和包被时间是4 、1 2 h ，包被原、抗体和酶标二抗的最佳工作浓度分别0 8 p g m l 、1 ： 3 2 0 0 0 和1 ：4 0 0 0 ，检测限为o 0 1 n 虮，实验的回收率为9 5 6 l ，并且与g c 有很好的 符合率，符合率为9 9 4 6 。试剂盒的批内和批间变异系数均低于7 7 2 。这表明试剂 盒有很好的稳定性。 关键词：半抗原；免疫原；多克隆抗体；酶联兔疫 a b s t r a c t a b s 扛a c t p e s t i c i d er e s i d u ei so n eo f廿l e i m p o r t a n t l l a 盟r d s t oh u m a nh e a l m a t p r c s e n t ，o r g a n o p h o s p h o m sp e s t i c i d e i st h em o s tp o p u l a rp e s t i c i d eu s e di n a g r i c l l l t u r c ， o c c u p y i n ga b o u t7 0 t ot h et o t a ll l s e d s od c t e c t i o no fo r g a i l o p h o s p h o m sp e s t i c i d ei so f s i g n i a n c ef o rf o o ds a f e l m d i m e 出o a t ei so n eo fm e d i u mt o x i co i g a i l o p h o s p h o m sp e s t i c i d e ，b u ti t sm e t a b o l i t e ，o d i m e t l l o a t ei sn m c hm o r et o x i c c u n _ e n t l y ，g 觞龇m a t o g c a p h y ( g c ) o rl l i g hp e r f 0 n a n c e l i 删dc l l r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a r et w oc o m m o na p p r o a c h e sf o rd e t e c t i o no fd i m e m o a t e ， i n v o l v e di nl o n gs a m p l ed e a n u pp r o c e d u r e a n dc o n s i d e r e da sr e l a t i v e l yt i m e _ c o n s u m i n g ， e x p e n s i v ea n dl a b o r i o u s t h e ya r en o tf b a s m l ef o rd e t e c t i o no fl a 略en u m b e r so fs a m p l e sa n d f 缸td e t e c t i o na ts p o t 0 nt l l eo t l l e rh a l l d ，e l i s ai sar a p i d ，s e n s i t i v ea i l ds e l e c t i v ed e t e c t i o na t 仃a c el e v c l s n d e p e n d so n t 1 1 eh j 曲s p e c i f i c 时r e a c t i o nb e t w e e na n t i b o d ya n d 距t i g ，谢t hl o wc o s t ，s 疵坝 e a s i l y _ h a n d l i n g a n dr e l i d b i l i 畔s od e v e i o p m e n to fe n z 蛐n e l i n k e di m m u n o 嬲s a yk “o f d i m e t l l o a t eo fi n l p o r t a n c ei np r 觚蛙c e t h i sr e s e a r c ha i m st oa d d r e s sm ek e yt e d m o l o 酉e sa 1 1 d s c i e n t i f i ci s s u e sr e l a t e dt 0e s t a _ b l i s l l i n e mo fb 吆y m e l i i l l di i 】1 i 】m n o a s s a yl ( i t f o r r a p i d d e t e c t i o no fd i m e m o a t e a c c o r d i n gt om em o l e c u l a r 蚰舭a n db i o l o g yc h 趾a c 蜘s t i co fd i m e t l l o a t e ，t l l eh a p t e n w a ss y n t h e s i z e d ，w h i c hm e nw 够c o n j u g a t e dt 0b o v i n es e n l i na l b u ma n do v a l b u m i nf o r p m d c u i n gi m m u n o g e na n dc o a 廿i 培眦t i g e n ap o l y c l o n a l 趾t i b o d yo fd i m e m o a t e 谢t 1 1at i t e r o f1 ：2 5 6 0 0 0a n d 衄n 时c o n s t a i i to f 3 8 4 1 0 1 0h a db e e no b t a i n e db yi m m u i l i z m gm i c e t h e t i t e ro fh r _ p l a b e l e da m i b o d yi sl ：4 0 0 0 nh a sr e l a t i v e l yl o wc m s s r e a c t i v i 哆谢血o t h e rm 司o r o r g a l l o p h o s p h o m sp e s t i c i d e ，e x c e p tf o ro - d i l n e m o a t e b yi n d i r e c t 趾dd i r e c te l i s a ，t l l e o p t i m 啪c o a t i n gm e d i 啪o fd i m e t h o a t ei s 0 0 5 m 0 1 lc 曲o n a t eb u 船r ，、v i mp h 9 6 ；廿1 e o p t i r i l u r nc o a t i n gt e m p r c t l 珊a i l dt i m ei s4 f o r1 2 h ；t l l e0 p t i m u mw o r k i n gc o n c e n t r a t i o no f c o a t i n g 姐t i g e n ，a n t i b o d y 叭dh r p - l 妇l e dg o a ta n t i - n l o u s ek g i s0 8 删h l 、l ：3 2 0 0 0a i l d 1 ：4 0 0 0 芦s p e c t i v e l y ；虹l ed 帆t i o nl i m i ti so o l m g l ；m er e c o v e r yo fs a r i l p l e i s9 5 6 1 ；a r o o dc o 玎e l a t i o ni so b s e e db 帆e nm ee l i s a 趴dg cw i d lr _ 9 9 4 6 t h ev i a 廿o n c o e f f i c i e n to fa m o n gb a t c h e sa i l d 、】v i m i i lab a t c ha r ea l ll o w e r l a i l7 7 2 ，s h o w i n gt h e s t a b i l i t yo f t h es e dk i t s k e yw o r d s ：h a p t e n ；i m m u n o g 嘲；p o l y d o n a l ；e m 可m e - i i n k e di m m u n o a s s a y 6 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 国内外食品安全的现状 食品是人类生存的第一物质需要，食品安全关系到人类的健康与生命，也关系到社 会的稳定和繁荣。随着食品贸易的国际化，一些重大的食品安全事件频频发生，二恶英、 0 1 5 7 ：h 7 、疯牛病、口蹄疫等食品安全问题引起了世界各国政府和人民的广泛关注。 基于食品安全的重要性，世界卫生组织将食品安全确定为公共安全的优先领域，并制定 了全球食品安全战略( 韩俊，2 0 0 5 ) 。食品卫生和安全领域出现的问题除了对人体健康 造成巨大的威胁外，对政治经济造成的影响也不容忽视。在英国发生的“疯牛病”事件， 除了几百万头牛被宰杀外，还导致全球各国对英国牛肉长达数年的抵制，使英国经济因 为“疯牛病”遭受了沉重的打击，经济损失高达3 0 0 亿美元。德国因“疯牛病”导致卫 生部长和农业部长辞职。1 9 9 9 年比利时的二恶英事件，不但造成本国市场的混乱，还秧 及欧洲其他国家，使成千上万吨比利时生产的禽、蛋、猪和牛肉被回收和销毁。这一事 件造成的直接经济损失达3 5 5 亿欧元，如果加上与此相关的食品工业，损失己超过1 0 亿 欧元，同时造成内阁政府倒台( 陈锡文与邓楠2 0 0 4 ) 。 与国外相比，我国的食品安全形势严峻，食品安全问题不容忽视。近年来，因食品 安全问题造成的重大损失和严重危害常见于报端。同时。食品安全问题也严重影响到了 我国食品的对外贸易，使我国食品出口严重受阻( 吴永宁，2 4 ) 。一些不法商贩为牟 取暴利在食品中掺杂使假，如：利用工业酒精勾兑假酒、在水产品中使用甲醛、在米粉 中使用吊白块、在木耳中掺入地耳等；某省粮食加工厂，在米粉、粉丝中加入能使人致 癌的荧光增白剂，其中有一个县就有2 2 个加： 厂生产加增白剂的米粉，共1 0 多万公斤； 1 9 9 8 年山西朔州特大假酒中毒事件，造成3 1 2 6 人中毒，数百人致残，1 6 7 人死亡( 许 牡丹，2 0 0 3 ) ：安徽阜阳劣质奶粉事件共有2 2 9 名婴儿因食用劣质奶粉造成营养不良， 其中1 2 名婴儿死亡。另外，农药、兽药、化肥的滥用，工业三废和各种污染物的污染， 也给消费者的健康带来了巨大的潜在隐患。为了防治病虫害，提高产量，改进外观品质， 大多数农作物、畜禽都要使用一定种类和数量的农药、兽药、化肥、饲料、化肥、农药、 除草剂等农用化学品的长期、大量、不合理使用，对我国农业生态环境和农畜产品的安 全生产及人体健康与生命构成丁严重威胁。全国每年因农业污染造成的直接经济损失高 达1 6 0 多亿元。2 0 世纪8 0 年代阻来，我国蔬菜和水果农药残留引起人畜中毒死亡事件 这1 6 0 多亿元。2 0 世纪8 0 年代以来，我国蔬菜和水果农药残留引起人畜中毒死亡事件 前言 频繁发生。据统计，1 9 8 1 年众国农药中毒人数2 8 9 万，死亡l 。8 7 万，1 9 8 5 年全鼹农药 孛海入数1 0 。7 万，死亡l 。2 5 万；遥l o 馨泉，我善乎穗每年孛毒入数约1 0 万，魏亡l 万多人。其中1 9 9 2 年至1 9 9 6 年全国2 6 个省市发生农药中毒事件2 4 7 3 4 9 例，死亡2 4 6 1 2 人，我国每年因农药中毒的人数占世界同类事故中毒人数的5 0 。搬农业部2 0 0 0 年底 对我国1 4 令省会藏枣2 1 1 0 个样品豹捡灏结暴，蔬菜孛农药超标离逡3 l 。1 ，萁串j 京、 炎棒、上海、广州、南宁、昆明等大城市蔬浆农药残留越标率超过5 0 ( 陈茹玉，2 0 0 3 ) 。 随着新技术的不断应用，转基因食品、新的食品添加荆与包装材料等也向我们提出 瑟瀚魏酸。嚣魏翔蔼确保食赫鹃安全往是擦在当今致潦酃门、食鑫整产金整及食熬科技 工作者面前亟待解决的重要课题，食品的飘生安全隐患融经成为我圈乃至全球关注的焦 点之一( 石阶平，2 0 0 3 k ，2 农药残餮的危害 农药残留怒揩农药使用厝残存于生物体、食品( 农副产品) 和环境中的微量农药原体、 露毒代谢物、黪艇物积杂质的总称。农药遥遘壹接或阉按途径( 大气、承、主壤) 对食瑟 造成污染。人类处予食物链瓣最顶端，所受农药残留生物富集的危密也最严重。蕊今农 药残留已成为中国膳食中的擞要食品安全性问题。严徽污染食品的农药主要是有机磷、 蠢钒氯、氨基擎黢醚类帮羧滁蠢蘩蘸类瓣杀虫裁、杀蘩粼翻除草裁。髓赛上农药鬻用品 种约5 0 0 种。我国的农药品种只有2 0 0 多种，各种农药产量中，以杀虫剂为主，占总产 量的7 0 ；在杀虫剂中有机磷农药产量占杀虫剂总产擞的7 0 ；在有机磷农药中高毒 熬秘熬产量又占窍撬磷农药产爨瓣7 0 ，遮麓是赝谖缝狻不会理豹三令7 0 ( 彭楗德， 2 0 0 0 ) 。 我国虽然予1 9 8 3 年决定停止生产和使用有机氯农药，但至今仍广泛残留予土壤和 农套产晶孛。浚滚涕d d d 彝六六六( b 珏c ) 等农楚残整凌食菇孛提当簧遥。壶予蠢掇氯 农翁脂溶性强，斑要积蓄予幼植物脂肪组织和谷物糠皮与水果皮的禽蜡质部分，故动物 性食品和植物油中的有机氯禽量远高于植物性食品，丽在植物性食品中粮食又商予果 蔬。j 篼乡 ，盘予鸯凝巍农药残效羯长，麴d d t 经l g 年才分簿一举，敖长麓大爨使爱 这兴化合物，易污染农作物、水产品及周嗣环境( 李潭溪，2 0 0 0 ) 。入长期摄入肖机磷 农药可引起肝功能下降、血糖升高、白细胞吞噬功能减遐等一系列瘸理变化，并脊致畸、 羧癌、致突变豫矮。孛毒爱袭溪麓盘滚孛麓碱蘩酶螽戆爨鹫霖，嶷灸分簿乙蘸簇簸豹 能力，从而引超一系列的中繇症状，严爨者可导致中枢神经系统功能异常( 巴德年， 客 垫塑懿些杰璺堡主鲎燕笙塞 1 9 9 8 。 由此褥见，农药残鼹对人体健康惫害极大，故研究农药残黎躲快速、岚效的搜测方 法，对保证食晶安全和加强食品中农药残粥量的梭测和脏督管理具有重要意义。 。3 我国农赘残蟹麴特点 我国熬农魏使魇及管璞髂割和发这黧家摆溅蠢 蕤大鲢差鼷。憨傣上有以下足令特 点： 农药馒瘸警爨涣教，农蕊释酱逶农炎溺营理鼗经营，寒鼓佟麓蠡毒穆专管。 农药使翔不辩学，激耀豹撩嚣l # 鬻酱遗。这主要是爨予农民姣乏翔药知识，按零疆罢 部门的经济效豁和用药蠛挂钩造成的。 农药佼翔菇耱牵复配农蓊鞫溺毒或毒戆较大静农蓊熬耱多，遗成了在农产麓中虢辩季孛 类较复杂、残黧毒蠖较大。 1 4 目前农药残留的检测方法 传统鼢农药残鹜分祈方法主要怒应糟波谱、色谱等理化分析学浚在实验嶷进行。但 凌予受检测器瓣潮约，测黎耩发不麓，基撵要繁毵豹分褰、鬟欷、冷纯等藏麓溪过程， 分析速度慢，耗时耗力、设备昂贵、操作繁琐。邋年来检测器褥到改避，使检测限达到 了p _ 曲承平( 剐贤迸，2 l ，同辩萃取方法匏改进，大大减少了前处理过程，但是由 予灌绽努橱技术本身鹣满隈靛，热上对纹嚣讫熬簧求程发较商，难黻逶应大蕊复杂样品 的现场快速检钡4 。 近l o 年来，国外蔬、聚、茶等农产懿和农田环域农药残留的检测技术，取祷了突 飞猛逶鹣发震，主要体现在三个寿瑟：稔澜戆力不精疆高，幽予懿新技零瀚液髑，检 测灵敏度越来越高，残觏物的超痕量分析水平已达到l o d l 克； 检测速度不断加快，智 能化计算机酾辩性能电予器件与检测器的使用，使检测周期太大缩斑；选择性不断提 离，商簸分离学段、各种纯攀和生貔选择饿黄惑嚣的使溺，使在复杂混合钵中直接送行 澎染物选择性测定成为可能( 董国体，2 0 0 1 ) 。农产晶焱全检测技术的发展趋晦予离技 术化、智能健、速测化、动态化、便携化。 1 ，5 国肉外农药残翟快速检测技术的现状 农药戮嚣怒国内酆农产黯安全螅最鬟要懿指蜷之一，遣楚擞赛蛰霪技本性熨翳保护 接艇中最常用懿援标之一。农药残懿豹严整超标会引起人体的急性中毒、慢瞧中繇娃及 内分泌紊乱。遂正是全世界高度关注农药残留限擞标凇和监控技术的根本原因之所在。 9 前言 国际上农药残留监控大体上分为三种：粗筛测定、精确分析和确证分析( b a r b o r a m i c k o v a a ，2 0 1 ) 。这三郝势鏊本穆残瓣麓发达国家药耱残蟹营建霸鎏控体系。精酸分 析和确证分析主藤由仪器分析组成，尤其怒依赖g c 、瑚l c 、g c ，m s 、l c 府“s 甚至g c m s + m s 、l c ，m s 十m s 等高级设备完成。谣方发达国家从上世纪七十年中厢期逐步建立了 圭述傣系。我嚣途些工捧主要获上整纪寒嚣始。毽我鏊瓣建设速凌遨遮，发这逮送褒5 l o 年内基本可以接近发达国家的装备水平，但技术人员水平的提高邂要更长的时间。 e 免疫检测技术是匿前国际上快速检测的主流技术。掘不完全统计；目前围绕农药残 餐检测弱试蠢l 鑫骞毒0 多耱，缀遂懿农药残整受疫检溺技术涉及为耱左右懿农瑟瑟耱。 加上一些类似的小分子环境污染物，合计越过1 0 0 种。免疫检测技术在9 0 年代中期进 入我国市场，但因价格因素翻我国的技术暇因，没有被大量使用( 潘家荣，2 0 0 2 ) 。 警内癸农药残蟹速溺按零主要毽蘩魏下足耱： ( 1 ) 活体嫩物测定法 活体生物测定法是通过敏感生物的游性测定来进行定量的一种方法。目前主要有两 秘器本方法，一是翻建发光细菌傣内静荧光素在有氧参每对经荧光酶静俸矮会产生荧 光，但当受到菜赋有毒化合物作用时发光会减弱，其减弱的程度与游物的浓度里一定的 线形相关关系，测用这一特点肘农药残壁试样进行测定。该方法已能用于测定甲胺磷、 寒胺藤磷、氧貔琛采、数敌摄、辛巯磷、翠基对巯磷等鬻晁有辊磷爽农药，方法豹最夺 检测浓度为3 m 砒左右( s h u ow a i l g a ，2 0 0 2 ) 。该种方法的优点就是快速、简便、灵 敏、徐廉、适用予现场，缺点是农药浓发砖发光强度的线形关系不够准确，因此只能半 宠羹。另一种方法就是藕嗣实验室培养韵对农药敏感瓣黛物( 琵虫、瘸藤菌、杂攀等) 为实验材料，当敏感生物接触到含有农药的试样后，通谶测定敏感擞物的中毒程度( 或 巍亡情况) 采确定试样中是餐残整有农药。采用这种方法可以餍来对食品中杀虫粼、杀 麓粼、除草荆以及其匏污染物避行测定。家蝇是一静容易饲养、茏葵对叛除虫菊酾类农 药敏感的理想实验昆虫，在荧国等发达国家普遍使用家蝇活体测定i 表朱检测食品中农药 簸凑( e i 】dw a 协a b e ，2 0 0 0 ) 。 ( 2 ) 纯学法检测农药残窝 该方法原属于农药含量的化学分析技术，主要有两种途径：一魑运用测定有机磷农 驽中戆磷元素暇璎建立懿定磷法；另一秘途经是通过承鳃骞枫磷农努戏磷酸纯含物麴磷 酸法。这些方法秘前已在农翡豹含量分析巾基本被淘汰了，用予有机磷农药残留的测定 鎏塑壅些盔鲎堡圭堂垡黧塞 程我国届部蟪医秘膏瘦矮( 昊永宁，2 0 0 1 ) 。 ( 3 ) 酶纯攀检测法 酶化学检测法是利用菊荆对酶的活健j 辞j 制作用原理建立的检测搜术。该方法通过建 立懿辛牵裁和蓊糖浓度之润翡搽准鏊线，维葵农药熬残落羹。这释方法籍前常爝瀚愚商祝 磷靳氨基甲酸嚣i 类杀虫翔辩不虢疆碱醅酶高等旗糖中的丁酸艟碱醅鹣) 的榔铡韵测定 方法，另外也有痧餐韵爱磁利翔了酪酶绒其他药荆糕标酶进行。己酰胆碱酯酶抑制法早 潮蔻一释农药瀚豢理学研究霸翡物辩选鹣努法( 瓤蕊a n g a h n ，2 0 馘) ，近年来，溺内 狲均有学者将就及应用来避行农药( 傻限煮梳磷秘氮蓬甲酸酪类杀虫荆) 的残辍或簸毒 分析。该反_ 陂是灵敏度和测试所用酶韵来源有很穴关系。目前市场有家蝇、棉铃虫、面 粉、猪及其稳动物歼靛戏斑液簿中提取的酶。丽籍尊掇鼯酶豹来源不同，有些兔了酰勰碱 髓酶为主，有些粼戳己酰髓碱黼酶为堂( 刘绝租，2 1 ) 。比较谢富，剥用丁雠题碱醢 酶的反应体系对鬻握残留农药对入督的海性更直接。根据酶反成的系统不同，奎要可分 为试管魄色法、酶标嫒魄德法、试纸暾照法帮生讫魁极或传感器法等。 ( 4 兔痰梭溺技术 免疫分析法用于农药娥留快速梭测的研究也十分活跋。免疫分析汰是将抗体抗原反 成与现代测试手段耜结合酌越微量分攒法，它集测定胞麓荧敏褴秽抗体反应的强特辩性 予一体，在巢些鬟要生物激性物质( 翅餐瓯睫、激索、蓊物等) 静痰爨检溅方麟墩键了 很大成就，可以定性定艇检测残留的农药。目前小分子农药的残留最低检测下限可达到 o o l 啪，接逐彼器分析水警。免疫分析法舆有旃筚、快速、灵敏度离、特异性强、梭测 赞鼹低等优点。只露缀少的仪器设备弱专业培训，是初簿及测定一魑剥毒农药靛好方法。 但它的开发过程需要投入较多资金和较长时间，且般只适于分析一种农药戏一类农药 ( 鼹德年，1 9 9 8 ) 。兔疫分辑法可分为茨党免疫测定法、酶免痰溅定法、放蓦圣熊痰溆定 法葶鞋流动注射兔痰测定法+ 冀中流动注射免疫分辑是农簿残罄分掇中较必巍避憋技术。 免瘦反应通常均猩酶标板上进行，也可以在凝胶板上、层析板上、纤维薄膜戏其他辍料 板等基震糖料上进行，还西在试管袋专翔填充管鹃鸯考瓣孛进行，竣鬻茨反威爨逐甩3 9 6 褒密度扳或蕊瞧基片进褥( 交大壤，1 6 貔) 。困| l 怼，搬撼免疫及摩麴熬矮楗料，免疫梭 测搜术又阿分为兔疫检测试剂盒、检测试纸条、梭测锋及检测芯姥等n 中国农救大学从美国攀 遴魏酶联免疫测定技零，是邋过酶联热痰吸黠分援( e 戮s a ) 及黢髂金技零露镰农瑟抗体，黪生产攘凝酶农药竣璧瑗场抉逮捡骥l 试粼鑫秘试纸条。该 前盲 方法可检测n m l 级的农药残留，检测时间一般为l 1 5 1 1 1 i n ，具有很高的特异性、敏感 性与准确性( 籍保平，2 0 0 3 ) 。中国农业大学目前已制各出几种农药的特异性抗体，抗 原及抗体制备技术也基本成熟。 ( 5 ) 生物传感器 生物传感器由生物识别元件和信号转换器组成，能够选择性地对样品中的待测物发 出响应，通过生物识别系统和电化学或其他传感器把待测物质的浓度转为电信号，根据 电信号大小定量测出待测物质的浓度。目前应用于食品分析中的生物传感器主要有酶生 物传感器、免疫传感器、微生物传感器、组织传感器、d n a 杂交传感器、细胞传感器、 仿生型生物传感器和分子印迹传感器。生物传感器是一种经济、简便的检测方法，一般 不需要进行样品的预处理即可直接用于测定，而且对特定待测物质的专一性强，不受颜 色、浊度的影响，灵敏度高、操作简单，但稳定性、可靠性和一致性还不理想，批量生 产的工艺也尚待建立( 高志贤，2 0 0 0 ) 。 ( 6 ) 生物芯片技术 生物芯片技术是2 0 世纪9 0 年代初发展起来的一种全新的微量分析技术，综合了分 子生物学技术、微加工技术、免疫学、计算机等多项技术，实现了样品检测分析过程的 连续化、集成化、微型化和信息化。通过对农药小分子的改造后与载体蛋白偶联，制各 抗体，并通过双功能试剂将抗原或抗体共价结合在载玻片表面，制作用于检测小分子污 染物的蛋白质芯片是目前农药残留快速检测技术发展的新方向。应用该技术对阿特拉津 的最低检测限可达0 0 0 1 g ，m l ( 韩丽君，2 0 0 2 ) 。 ( 7 ) 仪器分析的快速多残留检测技术 仪器分析法是农药残留检测中最经典、最常用的技术。由于农药的活性成分大多是 小分子有机化合物，故多使用气相色谱( g c ) 、高效液相色谱( 玎，l c ) 、气相色谱质谱 联用( g c m s ) 和高效液相色谱质谱联用( h p l c m s ) 等技术。其中研究最多的是色 质联用技术。因为色质联用特别适合于多残留分析，所以国外把它划为农药残留快速检 测技术之列。部分农药( 如有机氯、有机磷等) 残留可使用g c m s 检测，检出限一般 为l 1 0 u g 墩g ( 涂忆江，2 0 0 3 ) 。但对分子量较大、极性或热不稳定性太强的农药及其 化合物g c - m s 不适用，需采用高效液相色谱质谱联用( h p l c m s ) 来检测。仪器分 析法具有灵敏度高、准确度好等优点。但需要昂贵的仪器、专业的分析人员，且样本预 处理较繁琐。近年来固相萃取( s p e ) 、固相微萃取( s p m e ) 、超临界流体萃取( s f e ) 、 沈阳农业大学硕士学位论文 凝胶色谱c p c ) 吸辩柱惩潜、微波辘韵萃欷( m a e ) 、样繇鞠穗分散萃联、翻瀚索氏 舔取( s 嚣) 、态线礤，纛c 苯取等撵零_ 疆簸溪技寒纛在餐瓣、省力、减少溶麓、徽疆佬及 自动化方面毅褥了很大突破。绘仪器的快速分析带来了希望。此步卜，现在研究较多的超 褊界流体色谱( s f c ) 、：缎气穗色谱( c e x e e ) 、琵细管电泳( e 勰) 直接光谱分析技 零等选蛰试溺霸蔷浚遴豹秀淘发震( 裁蠢鬻，2 0 激) 。 从以上的分析可以看娃l ：食品审农药残留快速梭测技术正作中所需的快速检测技 术，主簧藏惫稻西蓠静藤识警法释兔痰捡攒l 方法。各糖检溺技术在特定韵情形下务商其 痰矮稔德。及痰霜角凌逡靛，氇校豢琴鬻检测方法灏灏鹣梭溅材精鞍仪器遴褥分类。魏 辩纯学法中，鼹前常见的试祷魄色法( 遴涮仪法) 、酶标仪眈色法、试纸祭检测法( 速 测幸法) 、酶睡袋法等。在麓疫梭澜方法串，嚣黼常懿麓有酶标投徐测法( 免疫检铡试 裁盒) 、篼痰稔溺警法、免疫捡溅纸片法( 金莸i 试纸、斑点薄貘浚镰) 等，麓罄痰酶栋 鬏法、抗体传感器等。随饕科技的进步，盼对免痰速测技术中爨现的闽题，避年来又出 璐了a 潦新的免疫检测搜术( k o j i 鹣a b 淑，2 0 0 4 ) 。 势予锑遮技术 。攀挠添设谤辩霉粳澎楚突滋特定农蕊豹缝秘躐 考一类农楚孛莛蠢熬绪枣弩孪荸援，对应豹揍髂髂建攀一特舅毪挽俸袋卷簇特舅装巯髂。辩 不其器活性基函髂农药分予通常以直接衍生化娥者以原料合成，也可藤待测农药代谢或 降熊产物髂搀半抗原。 2 1 材料与方法 2 。 试秘与搜嚣 毪&篱莼集鹭化学试剂霄限公简 分析纯 觅水c h 3 0 h北京化学试剂公闭含爨不少于9 9 5 三己胺j b 京化学试粼公霹 分掇缝 翠蘩衮毒 二学试裁公霹分攒楚 垫堕查些查堂堡主兰垡堡塞 n a o h 北京化学试剂公司 分析纯 n h 4 0 h 北京化学试剂公司 分析纯 n a 2 c 0 3 北京化学试剂公司 分析纯 氯乙酸 北京化学试剂公司 分析纯 d c c ( n n 一二环己基碳二亚胺) m e r c k s c h u c h 跚打( 德国) b s a 北京元亨圣马生物技术研究所 0 v a 北京元亨圣马生物技术研究所 d m f 北京化学试剂公司 三正丁胺 北京化学试剂公司 氯甲酸异丁酯 a c r o s 公司 透析袋 美国s i 凹 1 a 公司 磁力搅拌器 江苏荣华仪器制造有限公司 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂 核磁共振仪a 、硝n c e ( 德国) 熔点测定仪 b - 5 4 5 型北京普析通用仪器有限责任公司 电加热套 江苏常州市国华电器有限公司 油泵 台州市黄岩汇丰真空泵厂 调压器 天津四通节能调压器厂 紫外分光光度计t u - 1 8 1 0 北京普析通用仪器有限责任公司 p h 计 北京赛多利斯仪器系统有限公司 其它玻璃仪器 2 1 2 乐果半抗原合成的探索 ( 一) 探索一 p 2 s 5 + c h 3 0 h ( c h 3 0 ) 2 p ( s ) s h + h 2 s ( 1 ) 试剂及仪器的前处理： p 2 s 5 ：真空恒温干燥2 4 小时。 c h 3 0 h ：先用n a 2 s 0 4 做初步干燥，后用c a s 0 4 做进一步干燥，次日重蒸。 三乙胺：加入适量的金属钠在三角瓶中，瓶中加塞，塞中插入一无水c a c l 2 干燥管， 使h 2 排空而水分不致进入，放置过夜，次日重蒸，再放入适量的钠备用。 1 7 乐果人工免疫原的合成 甲苯：先用c a c l 2 处理，再加入钠加热处理。 所有玻璃仪器都需要洗净，烘干。 ( 2 ) 步骤：水浴预热升温到3 5 ，加入甲苯6 m l ，保温一段时间，缓慢加入p 2 s 5 5 9 ， 温到5 5 时，逐滴加入甲醇，反应缓慢进行，完全加入后保温在5 5 6 0 ，2 5 h ，生成 无色液体。在此温度下逐滴加入三乙胺5 m l ，边加边搅拌，搅拌反应1 5 m i n 后，静置2 0 m i n ， 得产物做核磁鉴定。经鉴定产物不是我们的目的产物，而且副产物较多，分离纯化困难。 在第一种尝试中，我们是利用三乙胺做缚酸剂，时利用其中的氨基合成o o 一二硫代 磷酸酯铵盐，可以利用其中的铵根进行下一步反应，但是三乙胺很粘稠，流动性很差， 脱氨基的效果不好。而且产物中混有未反应完的甲苯和三乙胺，这些杂质很难除去，所 以并没有得到我们的目标产物。 ( 二) 探索二 p 2 s 5 + c h 3 0 h c h 3 0 ) 2 p ( s ) s h + h 2 s ( c h 3 0 ) 2 p ( s ) s i + 】娜4 0 h 吖c h 3 0 ) 2 p ( s ) s n h 3 + h 2 0 c l c h 2 c h 2 c l + n i 七一p r o t a i n 斗 c l c h 2 c h 2 - p r o t a i n + n i 4 c l p 2 s 5 、c h 3 0 h 和仪器干燥处理同探索一 步骤： ( 1 ) 三口瓶中加入五硫化二磷5 9 ，随即加入甲醇6 m l ，开动搅拌器，使甲醇与五 硫化二磷混合均匀充分反应。用水浴加热到3 0 ，同时接通水泵，持续升温到5 2 左 右，在反应容器上方抽气，反应在5 2 士2 下保温2 。5 h 。反应结束后，降温至3 0 以下， 静置1 5 m i n ，进行抽滤，得到甲基硫化物粗品。将粗品在低热下高真空处理，脱去过量 的醇，并排除所溶的硫化氢，过滤得精制品。 ( 2 ) 按甲基硫化物与水的质量比3 ：1 ，将水加入到三颈瓶中，开动搅拌器加入甲 基硫化物。在3 5 以下匀速滴加氨水约l h ，甲基硫化物的颜色由黑色逐渐变为浅黄色， 显示滴定终点，调节口h 为4 5 5 5 时，停止加氨水，继续搅拌1 5 i n i n ，移入分液漏斗 静置分离，上层为甲基硫化物铵盐，下层为中性油，分液后取上层。 ( 3 ) 称取b s a 4 0 m g 溶于4 m i ”o 2 m o l l 的p h 8 7 的磷酸缓冲液中，将氯乙酰氯于 室温搅拌下逐滴滴加到b s a 溶液中，然后在室温搅拌下反应过夜，次日，将偶联物置 沈阳农业大学硕士学位论文 透析袋中，4 下搅拌透析，每4 小时换一次透析液，共约6 次，至透析液中测不出偶 联物的紫外l 吸收值为止。精确计算偶联物溶液的体积，b s a 的浓度和偶联比。 在这一次尝试中，我们用氨水代替三乙胺，氨水可以很好的提供铵根离子，叉不引 入别的干扰离子，有利于目标产物的生成。在第三步中考虑到氯乙酰氯的两个氯都较活 泼，如果用氯乙酰氯直接与甲基硫化物铵盐反应，则出现的副产物较多，主产物的产率 较低。我们采用氯乙酰氯先与大分子蛋白连接，生成的产物再与甲基硫化物铵盐反应。 但是在反应中发现氯乙酰氯遇水后剧烈反应生成氯乙酸和盐酸，这两种酸性很强的酸使 体系的p h 值迅速降低，导致蛋白质变性，影响了蛋白质与氯乙酰氯中活性氯的连接，