（细胞生物学专业论文）细胞分化在细胞周期进程中的时相性研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已标明引用的内容外，本论文不包含任何其他人或集体已 经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明 确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：文若剑 日期：2 0 0 6 年4 月5 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密田。 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：文若剑指导教师签名：余从年龚建平 日期：2 0 0 6 年4 月5 日r 期：2 0 0 6 年4 月5 日 华中科技大学同济医学院2 0 0 6 届硕士学位论文 细胞分化在细胞周期进程中的时相性研究 硕士研究生：文若剑 导师：余从年教授 龚建平教授 华中科技大学同济医学院细胞生物学教研室同济医院分子医学中心 引言 细胞是复杂生物的基本单位，其增殖、分化、凋亡的协调控制是生物体复杂 性的重要基础。细胞周期研究是肿瘤、病毒感染、自体免疫性疾病及神经退行性 病变等人类重大疾病的核心研究内容i l j ，因此2 0 0 1 年和2 0 0 2 年的诺贝尔生理 学医学奖分别授给了对酵母和线虫等低等生物在细胞周期和细胞凋亡分子机制 领域卓有成效研究的科学家们【2 圳。现在认为恶性肿瘤是一类细胞周期性疾病【4 】， 许多癌基因、抑癌基因直接参与细胞周期的调控，其突变的结果导致了细胞周期 的失控，使细胞获得以增殖过多，凋亡过少为主要形式的失控性生长的特征【5 - 9 1 。 另一方面，在肿瘤学领域“一旦成为癌细胞，永远就是癌细胞”的观念曾经 长期占据统治地位。这一概念的基本观点就是恶性细胞是不能逆转的。直到t 9 6 1 年p i e r c e e l 0 】在鼠畸胎瘤的实验中观察到了一些恶性细胞的后代可以自发的分化 成为正常或良性细胞，才打破了这一观点。肿瘤细胞区别于正常细胞的一个主要 特征在于分化障碍，但肿瘤细胞并没有丧失调控正常生长和分化的基因之表达能 力，故癌变有可能逆转。在某些因子的影响下肿瘤细胞能发生分化，向正常细胞 方向转变，在此基础上提出的应用各种诱导分化剂将恶性细胞转化为良性细胞的 治疗设想，称为诱导分化治疗。作为肿瘤生物治疗的一个新策略，它强调逆转肿 基金项目：国家9 7 3 肿瘤计划瓷助项目( 2 0 0 4 c b 5 1 8 7 0 5 ) ；卫生部临床学科重点项目( n o 2 0 0 1 2 5 3 7 ) 项目负责人 l 兰壁垫查堂型堑垦兰堕! ! 竺旦堡主兰垡丝苎 瘤细胞恶性表型，使其趋于成熟分化，克服了以往传统疗法在杀伤肿瘤细胞的同 时对正常组织细胞的损伤，减少了治疗的毒副作用。实际上，与细胞恶性增殖或 凋亡受阻一样，细胞分化异常在恶性肿瘤发病学上同样占有重要地位，深入认识 细胞分化及其异常的发生机制可能为恶性肿瘤的治疗提供新的手段 h q 2 】。 自上世纪8 0 年代中期，我国学者率先应用全反式维甲酸( a 1 r a ) 治疗急性 早幼粒细胞性白血病( a p l ) 以来，探讨诱导分化治疗的作用机理成为近年来肿 瘤治疗研究的一个热点。在这其中，白血病细胞分化的分子机制和诱导分化治疗 策略尤其受到各国学者的高度重视，多数学者认为诱导细胞分化首先要使大量细 胞退出增殖周期转入静息状态而起到增殖抑制的效果，也就是细胞分化的启动先 要让细胞停止增殖，退出细胞周期1 1 3 。h j 。那么细胞分化一定发生在细胞退出细胞 周期后，即进入g o 期时，还是细胞分化和细胞周期之间有其他不同的关系呢? 本课题选用三种不同分化诱导剂对人类急性早幼粒自血病细胞h l 6 0 进行诱导 分化，成功构建出三种不同细胞周期阻滞的分化实验模型，并创新应用 c d l l b d n a 双参数流式细胞数术同时检测分化细胞表面抗原c d l l b 的表达及核 d n a 含量，拟研究细胞分化与细胞周期的相互关系，为探索细胞周期调控细胞 分化的具体机制打下基础。 兰! 翌蔓查堂塑鳖墨兰堕 ! ! 塑旦堡主鲎垡堡苎 参考文献 【l 】t h o m p s o nc b a p o p t o s i si nt h ep a t h o g e n e s i sa n dt r e a t m e n to fd i s e a s e s c i e n c e t 9 9 5 ，2 6 7 ：1 4 5 6 6 2 【2 】b a i t e rm ，v o g e lgs c i e n c ea w a r d sp a c kaf u l lh o u s eo fw i n n e r s s c i e n e e 2 0 0 1 ，2 9 4 ：5 0 2 5 0 3 【3 1 m a r xj n o b e lp r i z ei np h y s i o l o g yo rm e d i c i n e t i n yw o r mt a k e sas t a r t u r n s c i e n c e 2 0 0 2 ，2 9 8 ：5 2 6 【4 龚建平细胞周期与肿瘤【m 】见：曾益新肿瘤学北京：人民卫生出版社， 1 9 9 9 ：9 7 1 1 9 【5 】n o r m i l ed c e l lp r o l i f e r a t i o n c o m m o nc o n t r o lf o rc a n c e r , s t e mc e l l s s c i e n c e 2 0 0 2 2 9 8 ：1 8 6 9 6 】f r a n ks a ，n o w a km a c e l lb i o l o g y ：d e v e l o p m e n t a l p r e d i s p o s i t i o n t o c a n c e r n a t u r e 2 0 0 3 ，4 2 2 ( 6 9 3 1 ) ：4 9 4 【7 】m a s e rr s ，d e p i n h or a c o n n e c t i n gc h r o m o s o m e s ，c r i s i s ，a n dc a n c e r s c i e n c e 2 0 0 2 。2 9 7 ( 5 5 8 1 ) ：5 6 5 9 8 】h u n t e r t a n d p i n e sj c y c l i n s a n dc a n c e r s c e l l 1 9 9 1 ；6 6 ：1 0 7 1 【9 】m a r xj h o wc e l lc y c l et o w a r dc a n c e r s c i e n c e 1 9 9 4 ；2 6 3 ：3 1 9 【1 0 p i e r c eg b t e r a t o c a r c i n o m a s c a n c a n c e r c o n f l 9 6 1 ；4 ：1 1 9 1 3 7 1 1 p e t e r s e n0 w ：r o n n o v - j e s s e nl ，w e a v e rv me ta 1 d i f f e r e n t i a t i o na n dc a n c e ri n t h em a m m a r yg l a n d ：s h e d d i n gl i g h to na no l dd i c h o t o m y a d vc a n c e rr e s 1 9 9 8 ； 7 5 ：1 3 5 【1 2 】d is a n t a g n e s sp a n e u r o e n d o c r i n ed i f f e r e n t i a t i o ni np r o s t a t i cc a r c i n o m a ：a n u p d a t e p r o s t a t es u p p l 19 9 8 ；8 ：7 4 1 3 ，l i n s k e ym e ，g i l b e r tm r g l i a ld i f f e r e n t i a t i o nar e v i e ww i t hi m p l i c a t i o n sf o r n e w d i r e c t i o n si nn c u r o o n c o l o g y n e u r o s u r g e r y 1 9 9 5 ；3 6 ( 1 ) ：1 2 2 【1 4 陈竺，别、关林，陈赛娟等全反式维a 酸诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病 的机制研究【j 】上海第二医科大学学报2 0 0 2 ，2 2 ：5 - 9 3 华中科技大学同济医学院 2 0 0 6 届硕士学位论文 第一部分 全反式维甲酸诱导h l 6 0 细胞分化的细胞周期时相性 【中文摘要】 背景和目的： 细胞分化是细胞生物学研究的核心问题之一，研究发现当细胞受细胞外生长 信号刺激后，细胞周期机制驱动着细胞的增殖，联系着细胞的凋亡，进而发现其 调控着细胞的分化。但细胞周期机制如何调控细胞分化尚不明确。在本部分实验 中我们用全反式维甲酸( a l lt r s l l sr e t i n o i da c i d ，a t r a ) 诱导h l - 6 0 细胞分化，研 究此分化模型中细胞周期的变化以及细胞分化在细胞周期中的时相性规律。 方法： h l 6 0 细胞经分化诱导剂a t r a ( 终浓度为1um o l l ) 诱导不同时间点后， 通过流式细胞仪检测细胞表面分化标志物c d l l b 的表达以及分选后共聚焦显微 技术来证实细胞分化模型构建成功；用单参数流式细胞术检测细胞内d n a 含量 来分析分化细胞的细胞周期分布；创新应用c d l l b d n a 双参数流式细胞数术同 时检测分化细胞表面抗原c d l l b 的表达及分化细胞核d n a 含量，观察分化细胞 在细胞周期中的时相性表达。 结果： h l 6 0 细胞经a t r a 诱导后，细胞表面分化抗原c d l l b 表达明显升高，诱 导7 2 小时阳性率达到1 6 6 8 ( 对照组细胞阳性率为1 6 5 ) ，分选c d l l b 表达 阳性的细胞用共聚焦显微镜观察，细胞核形态向成熟粒细胞变化。诱导后h l 6 0 细胞阻滞于g 0 g 1 期，且c d ll b 表达阳性细胞主要位于g 0 g 1 期。 结论： a t r a 能诱导h l 6 0 细胞分化，分化细胞主位于细胞周期进程中的g 0 g 1 期。 关键词： 全反式维甲酸；h l 6 0 细胞；细胞分化；细胞周期 4 华中科技大学同济医学院2 0 0 6 届硕士学位论文 p a r ti c e l lc y c l ea n a n l y s i sf o rd i f f e r e n t i a t i o no fh l - 6 0c e l l s i n d u c e db ya t r a 【a b s t r a c t 】 b a c k g r o u n da n do b j e c i i v e ： c e l ld i f f e r e n t i a t i o ni sac o r ep r o b l e mi nc e l lb i o l o g y m a n yr e s e a r c h e r sb e l i e v e d t h a tc e l ld i f f e r e n t i a t i o ni sr e l a t e dw i t l lc e l lc y c l e b u tm e c h a n i s m st h a th o wc e l lc y c l e r e g u l a t e sc e l ld i f f e r e n t i a t i o nr e m a i n su n k n o w n i nt h i sp a r t w eu s e 久n ia ( a l l - t r a u s r e t i n o i da c i d ) t oi n d u c et h ed i f f e r e n t i a t i o no fh l 一6 0c e l l s ，a n dt o e x p l o r et h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nd i f f e r e n t i a t i o na n dc e l lc y c l ep r o g r e s s i o ni nt h i sm o d e l m e t h o d s ： t h ec e l l u l a rs u r f a c ea n t i g e nc d il be x p r e s s i o no fh l - 6 0c e l l sw e r ed e t e c t e db y f l o wc y t o m e t r ya f t e rt h ec e l l sb e e ni n d u c e db yll am o l la r r af o rd i f f e r e n tp e r i o d m o r p h o l o g i c a lc h a n g e s o fd i f f e r e n t i a t e dc e l l sw e r es t u d i e d b yp o s t - s o r t i n g c o n f o c a l ( p s c ) t h e nw eu s e dm u l t i - p a r a m e t e rf l o wc y t o m e t r yt od e t e c t et h ec d ll b e x p r e s s i o na n dd n a c o n t e n ts i m u l t a n e o u s l y s ow ec o u l da n a l y z et h ec e l l c y c l e d i s l r i b u t i o n o f t h ec d l l b p o s i t i v ec e l l sw i t h i nd i f f e r e n tc y c l ep h a s e s r e s 哪s ： 7 2h o u r sa f t e rt h ei n d u c t i o nb ya i r a t h ec d l l b - p o s i t i v eh l - 6 0c e l l sw a s e v i d e n t l yi n c r e a s e df r o m1 6 5 t o1 6 6 8 d n ah i s t o g r a ma n a l y s i sr e v e a l e dt h a t c e l l sw e r ea r r e s t e da tg 0 g 1p h a s eu p o na t r at r e a t m e n t p o s t - s o r t i n gc o n f o c a l ( p s c l s h o w e dt h a tt h en u c l e a rm o r p h o l o g yo ft h ec d ll bp o s i t i v ec e l l sw a sc h a n g e dt o m a t u r a t i o n c d il b d n am u l t i p a r a m e t e rf l o wc y t o m e t r yc o n f i r m e dt h a tm o s to ft h e d i f f e r e n t i a t e d c e l l s h a d t h e d n a c o n t e n t o f g o g lp h a s e c o n c l u s i o n ： a t r ac a ni n d u c eh l - 6 0c e l lg ot od i f f e r e n t i a t ea n dt h ed i f f e r e n t i a t i o nm o s t l y e 兰主型垫奎兰塑堕墨堂堕 ! ! 竺旦堡主兰壁垒苎 o c c u r si ng 0 g 1p h a s e k e yw o r d s ： a t r a ；h l 6 0c e l l ；c e l ld i f f e r e n t i a t i o n ；c e l lc y c l e 6 华中科技大学同济医学院 2 0 0 6 届硕士学位论文 前言 肿瘤的诱导分化研究最多的是对血液系统疾病的分化治疗，其中应用最成功 的是维甲酸诱导白血病细胞向成熟细胞转化。维甲酸( r e t i n o c a c i d ，r a ) & 0 视黄酸， 由环乙烯、侧链和极性基团三部分组成，是最早开发的诱导分化剂，在血液系统 肿瘤，淋巴瘤的临床治疗中取得了很好疗效。体外研究发现它能抑制多种肿瘤细 胞生长并促其分化，在调控细胞生长、分化、凋亡等生命活动中起重要作用【1 1 。 维甲酸类化合物的体内生理活性代谢产物包括全反式维甲酸( a t r a ) 、1 3 顺维甲 酸( 1 3 一c i s - r a ) 和9 顺维甲酸( 9 - c i s - r a ) ，它们均可通过核维甲酸受体( p a r ) 结合 于d n a 应答元件调节靶基因的转录，解除p m l r a r n 的分化阻滞效应1 2 卅。在 本课题研究初始，我们选择全反式维甲酸( a t r a ) 对人早幼粒白血病细胞系 ( h e 6 0 细胞) 进行诱导分化。 材料与方法 1 细胞株及试剂器材 人早幼粒细胞性白血病细胞株h l - 6 0 是武汉大学生命科学院惠赠。 细胞培养中所用胎牛血清购自g i b c o 公司，实验所用全反式维甲酸( a t r a ) ， 核糖核酸酶a ( r n a s e a ) ，地高辛( d i g i t o r t i n ) 和碘化丙啶( p i ) 购白s i g m a 公司， f i t c 标记的鼠抗人c d l l b 抗体购自b i o l e g e n d 公司，多聚甲醛购自美国 p o l y s c i e n c e 公司。 f a c s o r t ，f a c s v a n t a g es e 流式细胞仪为美国b d ( b e e t o nd i c k s o n ) 公司产品， c e l lq u e s t 软件分析数据。激光扫描共聚焦显微镜购自美国莱卡公司。 2 实验方法 2 1 药品制备 全反式维甲酸用无水乙醇配成1l am o l l 的工作液，过滤除菌，一2 0 避光 保存。处理细胞时，乙醇的终浓度小于0 1 ，该浓度下乙醇对h l 6 0 细胞的生 7 华中科技大学间济医学院 2 0 0 6 届硕士学位论文 长和分化没有影响嘲。 2 2 试剂的配制 1 ) 8 0 乙醇溶液：用8 0m l 无水乙醇和2 0m l 双蒸水混合配成，置于- - 2 0 冰箱保存，备用。 2 ) 4 多聚甲醛溶液：称取多聚甲醛4 0g 溶于1 0 0 m l p b s 缓冲液中，置于 7 0 。c 水浴槽过夜，待溶解完全后置于4 c 冰箱保存，备用。 3 ) p b s 缓冲液：称取n a c i4 0g ，k c lo 1g ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 01 4 3 9g ，k h 2 p 0 4 0 1 2g 溶于5 0 0m l 双蒸水中，置于室温下保存，备用。 4 ) s u b g 1 1 6 - 7 法的p i 染液：精确称取p i5m g ，e d t a3 7m g ，t r i t o n x - 1 0 0o 1 m l 溶于1 0 m l p b s 中，置于4 。c 冰箱保存，备用。 5 ) a p i 法嘲的p i 染液：精确称取p 10 5m g ，d i g i t o n i n5m g ，r n a s e1m g ， p i p e s3 4 6m g ，c a c l 22 7 7m g ，n a c l5 8r a g 溶于1 0m l 双蒸水中，置于4 冰箱 保存，备用。 2 3 细胞培养及a t r a 处理 h l 6 0 细胞置入含有1 0 胎牛血清、抗生素( 1 0 0u m l 青霉素、1 0 01 1g m l 链霉素) 和2m m o l l 谷胺酰氨的r p m i - 1 6 4 0 培养液中，于3 t c 、5 c 0 2 的培 养箱中培养。在对数生长期细胞中加入终浓度为1um o l l 的a t r a ，分别于 2 4 、4 8 、7 2 、9 6 、1 2 0 h 后收获细胞，以未加a t r a 的h l 6 0 细胞作为实验对照 组。 2 4 细胞分化抗原c d ll b 的表达和细胞分选后的共聚焦显微镜形态学观察 收获a t r a 诱导7 2 h 后的细胞及对照组细胞各1x1 0 6 个，离心( 1 0 0 0r p m ， 5m i n ) ，弃培养基，p b s 液洗一次，1 0 0ulp b s 液重悬后加入f i t c 标记的小鼠 抗人c d l l b 抗体1 0i ll ，4 下避光孵育3 0 m i n ，p b s 洗一次，加4 0 0ul p b s ， 上流式细胞仪检测c d l l b 阳性率，并在f l l h f l 2 a 散点图上选取c d l l b 表达 阳性的细胞进行分选，分选后细胞用p b s 洗一次，加入4 多聚甲醛固定1 h ， p b s 洗两次，再加入s u b - g l 法的p i ( 5 0m g l ) 1 0 ul ，避光染色1 h 后涂片，用共 聚焦显微镜观察细胞核形态变化。 2 5 细胞周期分布的分析 华中科技大学l 司拼医学院2 0 0 6 届硕士学位论文 分别收获a t r a 诱导上述各时间点的细胞及对照组细胞各约1 1 0 6 个，离 心( 1 0 0 0r p m ，5 m i n ) ，弃培养基，p b s 洗一次，加入r n a 酶( 1 0 9 l ) 1 0u l ， s u b g i 法的p i ( 1 0m g l ) 1 0 1 11 ，避光染色3 0 m i n ，加p b s4 0 0i tl ，上流式细胞 仪检测和分析。 2 6 细胞分化周期时相性表达的检测 分别收获a t r a 诱导上述各时间点的细胞及对照组细胞各l 1 0 6 个，标记 小鼠抗人c d l l b 抗体后，p b s 洗一次，加入l m l4 多聚甲醛冰浴固定3 0 r a i n ， p b s 洗两次，再加5 0 0ula p i 法的p i ( 5 0m g l ) ，避光染色1 h 后上流式细胞仪 检测分化细胞的周期时相性表达。 9 华中科技大学同济医学院2 0 0 6 届硕士学位论文 结果 1 h l 6 0 细胞经a t r a 诱导分化抗原c d l l b 表达增加，细胞核形态发生变化 流式细胞仪检测显示：在a t r a 诱导7 2 小时后，h l 6 0 细胞表面分化抗原 c d l l b 的阳性率增高( 见图1 ) 。将c d l l b 表达阳性的细胞分选下来染色涂片， 用共聚焦显微镜观察，与对照组细胞相比，处理组细胞核形态发生明显变化( 见 图2 ) ：核仁减少，核形不规则，出现杆状核，肾形核及分叶核，说明a t r a 作 用7 2 小时后可诱导h l 6 0 细胞向成熟粒细胞系分化。 a m 1 区域为c d l l b 阳性表达的细胞 图l 全反式维甲酸诱导7 2 小时h l - 6 0 细胞的c d l l b 表达阳性率 b a 对照组细胞 ba t r a 诱导7 2 小时后分化细胞 图2 全反式维甲酸诱导h l 6 0 细胞7 2 小时后分选的激光共聚焦显微镜图 l o 竺! 型垫查兰塑堑垦堂堕! ! 竺璺堡主兰壁笙苎 2 h l 6 0 细胞经a t r a 诱导分化后细胞周期阻滞于g 0 g 1 期 对照组细胞和诱导组细胞固定后染色，流式细胞仪检测显示( 见图3 ) ：对照 组细胞分布g o g 1 期占4 3 4 4 ，s 期占3 5 2 ，g 2 m 期占2 1 3 ，经a t r a 处理后的h l 6 0 细胞随着药物作用时间的延长，g 0 g 1 期的峰值逐渐升高，诱 导1 2 0 小时后细胞百分数上升到5 5 9 4 ，而s 期和g 2 m 期的峰值逐渐下降。 可见a t r a 能阻滞h l 6 0 细胞从g 1 期向s 期运行，g 0 g 1 期细胞数目增多。 a 1 m 14 3 4 4 m 23 52 0 - 躬 2 13 3 2 0 0 , t o o6 0 08 0 0 t 0 0 0 f l 2 - a 棚1 0 0 m i5 0b 1 m 22 8 0 6 懈2 1 _ 2 8 2 0 04 0 0 6 0 08 1 0 0 0 f l 2 - a m a d g a t e d l | 1 0 0 m 1 e 22 5 2 19 6 m 3仃7 3 图3a t r a 诱导h l 6 0 细胞分化不同时间点细胞周期的分布 舛s 他1 ；打博朋州 耵；俜蠹；坫棚惜驺韩卵筋博舢抛m 竺! 型垫查堂堕鳖墨兰堕 ! ! 竺星堡主堂垡堕苎 3 分化的h l - 6 0 细胞主要分布于细胞周期中的g 0 g l 期 通过双参数流式细胞术同时检测细胞表面分化抗原c d l l b 及细胞核d n a 含 量来分析分化细胞在细胞周期中的时相性表达，以c e l l q u e s t 软件分别计算a t r a 诱导不同时间点后c d l l b 表达阳性的细胞在g 0 g 1 期，s 期和g 2 n 订期三期中所 占比例。结果如图4 、5 示：随着诱导时间的延长， g 0 g 1 期c d l l b 阳性细胞 所占比率呈上升趋势，而s 期和g 2 m 期c d l l b 阳性细胞所占比率基本不变。 图4a t r a 诱导h l 一6 0 分化细胞表达c d l l b 和细胞周期的关系 r 2 、r 3 、r 4 分别显示在g 0 g 1 、s 、g 2 m 细胞周期中的c d l l b 阳性细胞 1 2 兰! 型堡查兰型鲨堕兰堕 ! 业旦堡圭堂垡堡塞 9 8i 7 窑6 篓s 暑4 = 83r 2 1 f 0 。一一 。 4 b - g o g i 期细胞+ s 期细胞一g 2 棚期细胞 4 8 h7 2 h 9 6 h a t r a 作用时间 图5a t r a 诱导不同时间点分化细胞占各期细胞比例 1 3 华中科技大学同济医学院2 0 0 6 届硕士学位论文 讨论 h l 6 0 细胞是人急性早幼粒白血病细胞系，它是体外研究白血病细胞增殖、 分化、死亡及探讨白血病发病机理的理想模型，该细胞系的最显著特征是：在不 同的诱导分化剂作用下可以向成熟的中性粒细胞或单核巨噬样细胞系方向分 化”，其细胞表面分化抗原c d l l b 的表达增加是粒系细胞分化标志【记1 ，应用单 克隆抗体测定细胞分化抗原c d l l b 的表达可较精确地判断诱导后细胞是否发生 分化及所处的分化阶段。本实验以c d l l b 作为h l 6 0 细胞的分化标志物，用流 式细胞仪检测a t r a 诱导7 2 小时后的细胞，发现c d l l b 阳性率明显增高。 目前，国内外研究细胞分化与细胞周期的相互联系通常采用间接推测法，即 用诱导分化剂诱导细胞分化后检测细胞周期分布的变化来推断细胞增殖受阻后， 细胞发生分化，或者选择几种与细胞增殖和分化相关的基因，检测其蛋白表达的 变化来提示细胞分化与细胞周期之间存在一定联系 7 1 。但这些方法缺乏直观 性，不能直接显示细胞周期进程与细胞分化发生之间的关系。在本实验中，我们 先用单参数流式细胞术观察a t r a 诱导h l 6 0 细胞分化过程中细胞周期分布的 改变，发现a t r a 能阻滞h l 6 0 细胞由g l 期向s 期运行，细胞不能进入分裂周 期从而引起g 0 g 1 期阻滞。进而我们应用双参数流式细胞术同步标记检测分化 细胞表面抗原c d i l b 和核d n a 含量，从实验结果中看到c d i i b d n a 双参数流 式细胞数术能将细胞膜表面c d l l b 分化抗原的表达和分化细胞在细胞周期中所 处的位置结合起来，直观地展现细胞分化抗原在细胞周期中的时相性表达： c d l l b 表达阳性的细胞首先出现在g 0 g 1 期，随诱导分化时间的增加，位于 g 0 g 1 期的阳性细胞数逐渐增多，而s 期和g 2 m 期阳性细胞数变化不明显。将 不同时间点各期分化细胞所占比例的数据绘成线形图发现，分别代表g 0 g 1 期， s 期，g 2 m 期的三条曲线走行趋势显示c d l l b 表达阳性的细胞主要位于g 0 g 1 期。将c d l l b 表达阳性的细胞用流式细胞仪分选下来染色涂片，用共聚焦显微 镜进行观察，发现这些细胞的细胞核形态明显朝着成熟粒细胞方向变化，因此我 们初步认为c d il b 表达阳性的细胞已经分化或处于分化进行阶段。 1 4 竺翌垫查堂型塑垦堂堕! 塑! 星堡主兰壁堡奎 在许多组织中，细胞由增殖到分化的转化是一个细胞周期阻滞与细胞分化激 活相互协调的过程。目前对白血病分化相关研究一般认为细胞分化的启动，首先 要有细胞增殖的停止，退出细胞周期【l ”。因此g l s 期阻滞可能是增殖分化相 互转化的枢幺丑【”1 。既往研究表明，许多诱导分化剂诱导肿瘤细胞分化，是由于某 些增殖分化相关基因表达的抑制或激活所致。g 1 一s 转换是细胞周期重要的调控 点，参与g l s 转换的正性调控因子( 如c y c l i nd 、c y c l i ne 、c y c l i n a 和c d k 2 4 6 ) 或负性调控因子( 如i n k 家族p 1 5 、p 1 6 和c i p k i p 家族p 2 1 、p 2 7 ) 的表达 变化，均可影响g l 期调控点。近来研究表明c y c l i nd 和c y c l i ne 表达下降和 p 2 7 表达增高与多种细胞阻滞于g l 期而趋向分化有关 2 0 - 2 2 1 。p 1 5 和p 1 6 是细胞 周期调控中重要的负向调控分子，主要通过抑制c d k 4 6 活性而发挥作用。在 血液系统肿瘤中常见p 1 5 和p 1 6 由于启动子5 c p g 岛甲基化而导致转录下调 2 3 瑙l 。如果诱导分化药物干扰甲基转移酶的活性使其活性下降，可使p 1 5 和p 1 6 基因的重新表达，阻滞细胞于g l 期。抑癌基因p 5 3 在人类细胞周期g l 期检测 点起着关键性作用，当药物因素导致p 5 3 蛋白升高，它会启动p 2 l 的转录，后者 升高后能与多种c d k - c y c l i n 复合物结合，抑制c d k 的激活，阻滞g l s 期的 过渡。大量资料表明c - m y c 作为一种癌基因，其过度表达与细胞恶性转化和肿瘤 形成有关，而其表达下降则与细胞周期受阻有关的肿瘤细胞分化密切相关。 本部分实验研究发现全反式维甲酸诱导h l 一6 0 细胞分化后细胞周期阻滞于 g 0 g 1 期，代表分化的c d l l b 阳性细胞主要位于g 0 g i 期。根据以上相关研究 报道，出现这种现象的原因可能是在a t r a 作用下，一些抑制增殖及细胞周期的 基因如p 2 1 、p 2 7 等上调，而有利于d n a 合成以及g 卜- s 期过渡的转换基因如 c m y c 、c y c l i n a 及c y c l i n e 等下调，这些上调和下调的基因在相互作用和协调下， 形成一个复杂的阿络，最终能够使h l 6 0 细胞进入分化成熟。 华中科技大学矧济医学院 2 0 0 6 届硕士学位论文 参考文献 【1 】d el u c al m r e t i n o i d sa n dt h e i rr e c e p t o r si nd i f f e r e n t i a t i o n e m b r y o g e n e s i sa n d n e o p l a s i a j f a s e bj ，1 9 9 1 ，5 - 2 9 2 4 【2 】m a n g e l s d o r fd j ，e v a n s r v 1 t h er x rb e t e r o d i m e r s a n d o r p h a n r e c e p t o r s j c e l l ，1 9 9 5 ，8 3 ：8 4 1 【3 】c h a m b o nea d e c a d eo fm o l e c u l a rb i o l o g yo fr e t i n o i ca c i dr e c e p t o r s j f a s e b j ，1 9 9 6 ，1 0 ：9 4 0 4 c h e r t o w b s ，d r i c o l l h k ，g o k i n g n q ，e t a l r e t i n o i d - xr e c e p t o r s a n d t h ee f f e c t s o f9 - c i s - r e t i n o i ca c i do ni n s u l i ns e c r e t i o nf r o m r i n m 5 f c e l l s 叨m e t a b o l i s m 19 9 7 ，4 6 - 6 5 6 【5 】s a c h sl c o n t r o lo fn o r m a lc e l ld i f f e r e n t i a t i o na n dp h e n o t y p i cr e v e r s i o no f m a l i g n a n c yi nm y e l o i dl e u k e m i a 【j 】n a t u r e ( l o n d ) ，1 9 7 8 ，2 7 4 ( 5 6 7 1 ) ：5 3 5 - 5 3 9 【6 】g o n gj p , t r a g a n o sf ，d a r z y n k i e w i c zz as e l e c t i v ep r o c e d u r ef o rd n ae x t r a c t i o n f r o ma p o p t o i cc e l l sa p p l i c a b l ef o rg e le l e c t r o p h o r e s i sa n df l o wc y t o m e t r y 叨 a n a lb i o c h e m ，1 9 9 4 ，2 1 8 ：3 1 4 - 1 9 7 】舒丹，陶德定，龚建平流式细胞术的亚g l 峰法分析细胞凋亡的重新评价 【j 】中华实验外科杂志2 0 0 0 ，1 7 ( 1 ) ：5 9 6 0 8 】t a nd ，w uj ，f e n gy e ta 1 n e wm e t h o df o rt h ea n a l y s i so fc e l lc y c l e - s p e c i f i c a p o p t o s i s 川c y t o m e t r ya ，2 0 0 4 ，5 7 ( 2 ) ：7 0 7 4 【9 】d r a y s o nm t ，m i c h e l lr h ，d u r h a mj ，b r o w ngc e l lp r o l i f e r a t i o na n dc d l l b e x p r e s s i o na r ec o n t r o l l e di n d e p e n d e n t l yd u r i n gh l 6 0c e l ld i f f e r e n t i a t i o ni n i t i a t e db y 1 ，2 5a l p h a - d i h y d r o x y v i t a m i nd ( 3 ) o ra u - t r a n s - r e t i n o i ca c i d 【j e x pc e l lr e s ，2 0 0 1 m a y1 5 ；2 6 6 ( 1 ) ：1 2 6 - 3 4 【1 0 1 z h o up y a oy ，s o hj w , w e i n s t e i ni b o v e r e x p r e s s i o no f p 2 1 c i p lo rp 2 7 k i p li nt h e p r o m y e l o c y t i cl e u k e m i ac e l ll i n eh l 6 0a c c e l e r a t e si t sl i n e a g e - s p e c i f i cd i f f e r e n t i a t i o n 【j 】a n t i c a n c e rr e s ，1 9 9 9n o v - d e c ；1 9 ( 6 b ) ：4 9 3 5 - 4 5 6 华中科技大学周济医学院2 0 0 6 届硕士学位论文 【1 1 】s h a mr l ，p h a t a kp d ，b e l a n g e rk a ，p a c k m a nc h f u n c t i o n a lp r o p e r t i e so f h l 6 0c e l l sm a t u r e dw i t ha l l - t r a n s r e t i n o i ca c i da n dd m s 0 ：d i f f e r e n c e si n r e s p o n s et oi n t e r l e u k i n - 8a n df m l p l e u kr e s 1 9 9 5j a n ；1 9 ( 1 ) ：l 一6 【1 2 】王振义，陈竺肿瘤的诱导分化和凋亡疗法 m 1 上海：上海科学技术出版社， 1 9 9 8 ，3 7 9 【1 3 】黄韧敏 袁淑兰，宋毅，等月。参酮诱导h l 一6 0 细胞分化及凋亡的流式细胞术分 析 j 】中国肿瘤临床，1 9 9 7 ，2 4 ( 7 ) ：5 0 0 5 0 3 【1 4 d e c k e rt ，h i p ps ，r i n g s h a u s e ni ，e ta 1 r a p a m y c i n i n d u c e dg 1a r r e s ti n c y c l i n gb c l lc e l l si sa s s o c i a t e dw i t hr e d u c e de x p r e s s i o nc y c l i nd 3 ，c y c l i ne ， c y c l i n a a n ds u r v i v i n g b l o o d ，2 0 0 3 ；1 0 1 ：2 7 8 2 8 5 【15 1 t a r n i ra ，p e t r o c e l l it ，s t e t l e rk ，e ta 1 s t e mc e l lf a c t o ri n h i b i t s e r y t h r o i dd i f f e r e n t i a t i o nb ym o d u l a t i n gt h ea c t i v i t yo fg 1 - c y c l i n d e p e n d e n t k i n a s ec o m p l e x e s ：ar o l ef o rp 2 7i ne r y t h r o i dd i f f e r e n t i a t i o nc o u p l e dg ia r r e s t c e l lg r o w t hd i f f e r ，2 0 0 0 ；1 1 ：2 6 9 2 7 7 【1 6 1 d i m b e r ga ，o b e r gf r e t i n o i ca c i d i n d u c e dc e l lc y c l ea r r e s to fh a m a nm y e l o i d c e l ll i n e s l e u k l y m p h o m a 2 0 0 3 ；4 4 ( 1