聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用.doc

聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis发明，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94 C 95 C 退火（annealing）:40 C 70 C 延伸（extension）:72 C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。二、PCR的反应体系和反应条件（一）PCR反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。1 模板包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板。模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng2、引 物（Primers） 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段。引物的合成可以采用化学方法。引物设计时必须遵循一些原则。 设计引物的原则：1）二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补2）长度为18 25个核苷酸3）二条引物之间避免形成引物二聚体4）引物的碱基组成应平衡5）引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+（C+G）6）引物的5端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）3、脱氧核苷三磷酸（dNTP） 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加 dNTP浓度：20 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。4、DNA聚合酶从一种生活在热泉（8090）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。Taq 酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3, 5 -磷酸二酯键，使DNA链沿53方向延伸，催化DNA合成。 最适酶量：1-2.5U （酶量过多，导致非特异性扩增）Taq DNA聚合酶复制的保真性，Taq DNA聚合酶无35外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。耐热的 DNA多聚酶有Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2 10倍。5、镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响。虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。 当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。6、其它反应因素 pH：调节至酶反应所需的最适pH（ pH =7.2左右）盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交基质：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性）（二）PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）1、温度 变性温度：94 97 退火温度：低于引物Tm 5 左右。温度过高会降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增。 延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶促活性。2、时间 第一次变性应给予足够时间（5 7分钟）。每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒 1分钟，时间过长易导致非特异性扩增3、循环次数 重复次数一般设为2535个循环扩增反应的平台效应：理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。平台效应产生的因素：引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等。三、PCR技术的质量控制（一）实验室的规范化设置实验室的规范化设置： 试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应区、产物分析区 PCR技术的质量保证： 基因扩增检验的全过程的质量保证 室内质量控制和室间质量评价 防污染体系：正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施、反应体系中以dUTP取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量（二）PCR技术的质量保证 分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理、贮存 分析中因素：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置 对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等） 分析后因素：报告形式、反馈的信息等三、常见问题与解决策略1、扩增失败的原因（1）试剂错加或漏加实验中发现阳性对照扩增失败，可用原试剂重复一次，以确定试剂是否错加或漏加。（2）试剂失效若以上方法仍不出阳性结果，可新启封一套试剂，有阳性标本，可用此标本与阳性模板同时再检一次加以确认。试剂中，阳性模板失效较常见，仅阳性模板失效，更换模板或用阳性标本代替即可。当怀疑试剂有质量问题时，用保存的阳性标本作为阳性对照检测一次，即可得到明确结论。（阳性标本保存时间不宜过长，一般不要超过3周，并经常更换。）（3）扩增仪温度偏差 扩增仪温度的偏差是PCR失败最常见因素。退火、延伸，上下偏差2通常不影响实验结果。但变性高于96或低于92，对某些检测带来不良结果，甚至导致实验失败。2、拖尾现象（1）裂解所用沉淀物过多标本裂解后未经充分离心，上清较混浊。组织标本虽经规范化处理，会有拖尾产生，标本是否新鲜相关。（2）裂解液、反应液变质标本中DNA含量过高或杂质过多。降低加样量拖尾可明显改善（3）Taq酶加量过大或扩增循环数太多3、非特异条带（1）试剂因素（引物特异性不佳， Taq酶质量问题）（2）个别标本引起，无法避免（3）酶量过大，循环次数太多（4）裂解时沉淀物太多4、引物二聚体（1）试剂因素PCR试剂均会或多或少产生一些引物二聚体。二聚体形成的原因：引物之间的互补和瞬时错配。引物二聚体过强，则会降低PCR效率，导致检测敏感性下降。（2）操作不当当一个反应体系建立后，在室温放置时间过长，会引起扩增后的二聚体加重。因此，PCR操作时，一旦管内所有试剂均加好后，应立即上机扩增。一旦由于某种原因不能扩增，则将反应管置4暂存。5、假阳性污染不一定导致所有标本均出阳性结果，有些标本中存在一定的抑制剂，虽受轻微污染但不足以出阳性结果。但会引起阴性对照出现阳性结果。由污染引起的阳性条带一般较弱，标本出现的条带强度基本一致或差异不明显。6、非特异引起某一病原体通常不出现非特异带，但个别标本偶有一条与阳性对照不一致的带且强度也较好，则多半为阳性，是由野生突变株引起。有时可看到某一标本可出现2-3条带，若与阳性对照位置在同一水平上的带最强，其余带则较弱，则仍可判阳性结果，否则应判阴性。 二温法扩增可有效降低非特异扩增。对有非特异条带的标本，必要时可用94变性30秒、64 延伸60秒，35次循环的条件，再检一次，往往可以得到满意结果。7、假阴性（1）试剂失效 当阳性对照出阴性结果，并用以往保存的阳性标本也不出阳性结果时，排除了仪器因素，便可认定试剂中反应液或Taq酶失效。（2）裂解液失效 裂解液室温放置过久或多次反复冻融，导致裂解液效果明显下降，引起阳性率下降和假阴性的常见原因。 由于反应体系正常，仅裂解液失效，因此，阳性对照不受影响。（3）试剂贮存过久 试剂贮存过久（接近或超过有效期，其间已反复冻融数次），导致检测敏感性下降，而出现假阴性。（4）标本处理不当（见标本处理）（5）变性温度偏低 不同病原体DNA由于所含G、C碱基对的百分比不同，Tm也不一样。有些DNA所含G、C碱基对丰富，当变性温度低于92时，双链DNA不能完全解链，扩增往往失败，产生假阴性结果。以PCR为基础的相关技术以PCR为基础的相关技术 逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 定量PCR (quantitative PCR ) 多重PCR (multiplex PCR) 免疫PCR 差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR) PCR诱导定点突变 原位PCR (in situ PCR) 一、逆转录PCR（RT-PCR） 以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。 主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等逆转录生成cDNA方式： 以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物 以oligo(dT)作为引物， mRNA3末端polyA尾与之互补 以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增二、定量PCR对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析。主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等。在定量PCR反应体系中，除了常规PCR反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是b-肌球蛋白基因荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法。FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进荧光信号的检测方法：DNA结合染料技术、水解探针技术（TaqMan probe）技术、杂交探针技术三、多重PCR在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。四、差异显示PCR（differential display PCR,DD-PCR）一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。五、免疫PCR将PCR产物用ELISA方法加以检测的技术。在对目的基因扩增时，dNTP中同时混有用生物素标记的Bio-16-dUTP，使扩增产物带有生物素标记。若该产物能与突变点特异的寡核苷酸探针（3端地高辛11-DIG-ddUTP标记）杂交，则该产物便带有地高辛标记信号，可利用与抗地高辛抗体共价结合的酶标检测系统进行显色反应，从而判断突变的存在。（一）寡核苷酸探针检测系统（二）RNA探针-抗体捕获系统六、PCR诱导定点突变（一）引入点突变（二）引入大片段缺失第三节 PCR产物的检测PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP） 等位基因特异性寡核苷酸（allele specific oligonucleotide, ASO）单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP） 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 融点曲线分析（melting curve analysis）PCR产物的序列分析 一、PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。二、PCR-SSCP单链DNA分子具有特定的二级空间构象，取决于该分子本身的碱基组成。突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DNA。PCR-SSCP是在完成靶DNA的PCR扩增之后进行单链DNA多态性分析的一种新方法。将单链的扩增DNA或组织基因组DNA通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱基的改变。1.常规PCR扩增DNA片段或其他被标DNA片段的提取。2.将提取的DNA在20ml变性溶液（95%甲酰胺、 1mmol/L EDTA, 0.05%溴酚蓝、0.05%二甲苯青），95 10分钟，冰浴3分钟。3.将混合液加到中性的聚丙烯酰胺凝胶板孔中，在含1xTBE的电泳液中，电泳。4.将凝胶中DNA片段转移到硝酸纤维薄膜上，烘干后以放射自显影拍摄记录。或银染色银染原理 根据核酸分子带有多个氨基和亚氨基，一定条件下可以与银离子结合，在甲醛等还原剂的作用下，形成黑或褐色的银沉淀条带。PCR-SSCP 的应用1.基因点突变的监测2.多态性检测 3. 外显子的筛查 4.cDNA筛查 三、PCR产物的序列分析（DNA sequencing） 主要见于分子克隆时对于目的基因扩增片段的序列鉴定以及对致病基因检测时分析扩增片段中点突变的位置和性质。可将产物纯化后作为模板直接测序，也可将PCR产物克隆入载体后再测序，后者测序的效果更好 ，常用T-A克隆。Sanger测序技术：以待测序列的单链DNA作为模板，加入一个引物和dNTP作为底物，并加入一定比例的2，3-ddNTP，在DNA聚合酶的作用过程中，正常dNTP的掺入使链延伸，若ddNTP的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种ddNTP结尾的DNA片段，经电泳后可直接读出碱基序列。第四节 PCR技术在分子诊断中的应用PCR技术在分子诊断中的应用 感染性疾病中病原微生物核酸的检测 单基因遗传性疾病的基因诊断 多基因病相关基因的检测 肿瘤相关基因的检测 移植配型和法医学上的应用一、感染性疾病的分子诊断 定性或定量检测致病微生物的核酸，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染的诊断。动态、定量地检测病原体核酸能对疗效判断和病情预后提供客观的依据