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+ 、 四川大学硕十学位论文 复合菌对胜利油田石油的降解研究 作者：钟伟 指导教师：高平 专业：遗传学 摘要 在石油开采炼制过程中，产生大量的石油污染物，据估计，全世界每年有8 百万吨石油通过不同途径渗透到地表水、地下水和土壤中。石油污染给海洋资 源带来极大的危害，破坏土壤结构和生态平衡。生物修复因其经济有效而成为 一种最具发展潜力的治理石油污染的技术。但是石油生物可利用性低是限制其 生物降解的主要因素。分泌生物表面活性剂菌株与降解菌株能有效提高石油的 生物可利用性。结合自腐真菌的广谱降解作用，可盟使石油污染物得到高效的 降解。 本研究从胜利油田石油污染的废水中分离筛遄到3 株能产生表面活性剂的 细菌，根据菌落形态与生理生化特征，分离到的3 潦l 化株菌经仞步鉴定分别属 短芽孢杆菌属，芽孢杆菌属和假单胞菌属。对它们乳化石油的性能以及对白腐 真菌降解石油的影响和促进作用进行了研究。 z s h 7 和z s h l o 产生的生物表面活性剂为脂肽类，而z s h l l 产生的表面活性剂 为糖脂类。以胜利石油作为唯一碳源和能源的发酵液具有最佳的表面活性。这 三株菌对煤油具有良好的乳化作用，油膜空斑实验表明发酵液能使空斑直径大 于1 9 c m 。分别预先4 小时接种3 株菌株，然后在接种白腐真菌，在7 2 小时内可显 著提高白腐真菌对原油的降解率，从4 2 分别提高至l j 9 0 、9 3 、9 5 4 关键词；石油污染乳化菌生物可利用性生物降解自腐真菌 、。 、 删川大学硕 学位论文 a b s t r a c t i nt h ep r o c e s so fc r u d eo i le x t r a c t i o na n dr e f i n i n g ，l a r g eq u a n t i t i e so fp e t r o l e u m p o l l u t a n t sw e r ep r o d u c e d , i ti se s t i m a t e dt h a t8m i l l i o nt o n sp e t r o l e u mw a sp o u r e d i n t ou n d e r g r o u n dw a t e r , g r o u n dw a t e ra n ds o i lt h r o u g hv a r i o u sa p p r o a c hi no n ey e a r i nt h ew o r l d p e t r o l e u mp o l l u t i o nb r i n g sag r e a td a n g e rt oo c e a nf i s h e r yr e s o u r c e ， d e s t r o yt h en a t u r a ls t r u c t u r eo fs o i la n da f f e c tt h ee c o l o g i c a lb a l a n c e b i o r e m e d i a t i o no fp e t r o l e u mp o l l u t a n t sh a sp e r f o r m e dag r e a tp r o m i s ea sa p o t e n t i a l l ye f f e c t i v ea n dl o w - c o s tt r e a t m e n to p t i o n h o w e v e r , t h el o wb i o a v a i l a b i l i t y o fh y d r o c a r b o n sl e a d st ot h e i rs l o wb i o d e g r a d a t i o n a no p t i o nt oe n h a n c et h e b i o a v a i l a b i l i t yo fc r u d eo i l i st oa d db a c t e r i aw h oc a l lp r o d u c eb i o s u f f a c t a n t st o e m u l s i 母c r u d eo i l w i t hi t sb r o a d s p e c t r u md e g r a d a t i o na b i l i t y , w h i t er o tf u n g ih a sa e x c e l l e n td e g r a d a t i o no f c r u d eo i l i nt h i ss t u d y , 3s t r a i n sc a p a b l eo fp r o d u c i n gb i o s u r f a c t a n t sw e r ei s o l a t e df r o m w e l ls i tw a s t e w a t e ra t s h e n g l ia n dg r o wu p t h e s eb i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g m i c r o o r g a n i s m sw e r ei n v e s t i g a t e df o rt h e i rp o t e n t i a li ne n h a n c i n gb i o a v a i l a b i l i t ya n d b i o d e g r a d a t i o no fc r u d eo i la n dt h e i ri m p a c t so nt h ec a p a b i l i t yo f w h i t er o tf u n g ii n e r o d eo i lb i o d e g r a d a t i o n t h em a i nr e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： r e s p e c t i v e l y , t h et h r e e s t r a i n sh a de s p e c i a l l ye x c e l l e n ts u r f a c ea b i l i t y t h e b i o s u r f a c t a n t sw h i c hw e r ep r o d u c e db yz s h 7a n dz s h l 0w e r el i p i d p e p t i d ea n dt h e b i o s u r f a c t a n t sp r o d u c e db yz s h l1w a sg l y e o l i p i dt y p e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et h r e eb a c t e r i a ls t r a i n sc o u l dm a k et h ed i a m e t e ro f o i l m e m b r a n es p o ts p r e a dm o r et h a n1 9 c m c r u d eo i lw a sd e g r a d e dw e l lb yi n o c u l a t e d w h i t er o t f u n g ia f t e rb e i n gp r e t r e a t e db ye a c hi s o l a t e db a c t e r i a l s t r a i n ，t h e d e g r a d a t i o nr a t i o sc o u l d b e e n h a n c e df r o m7 1 t o9 0 4 、9 1 、9 2 i ns e v e n d a y s k c y w o r d s ： o i l c o n t a m i n a t i o n ； b i o a v a i l a b i l i t y ；b i o d e g r a d a t i o n ； e m u l s i f y i n g - b a c t e r i a ；w h i t er o tf u n g i 2 四j i l 大学硕士学位论文 第一部分实验研究部分 第一章石油乳化菌分离筛选与乳化性能的研究 1 前言 气 石油以及石油产品与人类社会的发展密切相关。石油既是重要的工业原料， 同时又是重要的燃料与能源，是国民经济建设的重要支柱。随着社会经济、工 业的不断发展，对石油及石油产品的需求量大幅度增加，使得歼采面积不断扩 大。但在石油的开采、运输、贮藏和加工过程中，由于种种原因，造成石油及 其制品对环境的污染日益严重。在开采、运输、贮藏、加工过程中，由于意外事 故或管理不当。导致石油排放到农嗣、地下水、海洋，使环境遭受污染。直接危 害人类生产与生活“1 。目前，石油污染已成为世界公害之一，每年全世界约有8 0 0 万吨的石油进入环境，污染土壤、地下水、河流和海洋。1 水体中的石油对水体危害相当大，石油在水中自然降解，或被微生物吞噬 降解，都要消耗掉水体中大量的溶解氧。一旦发生大规模的石油泄漏事件，就 会引起大面积海域严重缺氧，使水中的生物面l 豳死亡的威胁。石油对土壤的污 染主要是破坏土壤结构，影响土壤通透性。损害植物根部，阻碍根的呼吸与吸收， 最终导致植物死亡。石油烃的主要成分是烷烃、苯、甲苯、二甲苯和复杂芳香 烃等，许多成分，特别是多环芳烃( p a h s ) 具有严重的致癌变、致突变、致畸 变。三致”作用。并且，污染物进入食物链后最终于会造成人体损伤鉴于石 女 油污染对环境的严重危害，对石油污染进行治理，恢复污染区域生态环境，在 ，环境污染日益严重，人类对生存环境质量要求日益提高的今天，显得越来越紧 迫。 治理石油污染势在必行，许多发达国家已对此高度重视，不断采取措施， 治理和控制石油污染我国石油污染相当严重，污染治理较为落后，与发达国 四川大学硕十学位论文 家相比晚十年左右，利用生物降解石油烃在国内还处于研究阶段。由于生物技 术具有其它方法不可比拟的优势，美国联邦环保局将其定为最可行和最有效的 方法。我国为经济飞速发展的国家，土壤石油污染正在不断扩大，相对于别的 方法，生物降解法是一种高效低费用的治理技术，能最好最彻底的处理石油污 染。必将在我国得到广泛的应用”， 生物表面活性剂是由细菌、酵母菌或真菌产生的一种表面活性物质。生物 表面活性剂的种类包括由杆菌或其它物种合成的脂肽；假单胞菌和假丝酵母菌 合成的糖脂；氧化硫硫杆菌合成的磷脂；不动杆菌合成的多糖脂混合物等；甚 至有些微生物细胞本身就是表面活性物质。生物表面活性剂具有降低表面张力， 形成稳定乳化液，促使形成泡沫等性能，与化学表面活性剂相比生物表面活性 剂有无毒能生物降解等优点，更适合于广泛的工业用途。 大量研究表明，在自然界净化石油烃类污染的综合因素中，微生物降解起 着重要作用。微生物降解是去除环境中石油污染物的主要途径。已经发现能够 降解石油的微生物有2 0 0 多种o 】，包括细菌，真菌以及藻类。真菌的氧化能力具 有普遍性，其中研究较多的为白腐真菌( w h i t er o t f u n g i ) ，其产生的木质素降 解酶的底物特异性较低，可以催化多种烷烃以及p a h s 的降解“1 。在微生物降解的 基础上发展起来的生物修复技术具有投资小，操作简单，不易产生二次污染等 优点。成为世界各国竞相开发的用于水体土壤和底泥有机污染治理的新技术5 “”。但由于石油组分疏水性较强，易于吸附在土壤中的天然有机物中，因此生 物可利用性差，降解速度缓慢，治理效率低下。 化学方法与生物方法相结合是当前最具潜力的治理疏水性有机污染的修复 方式。它是利用表面活性剂对有机污染物的增溶洗脱作用，提高有机污染物的 生物可利用性，以强化有机污染物的生物降解。在应用表面活性剂提高疏水性 有机污染物的生物可利用性时，选择合适的表面活性剂及其浓度是十分关键的， 表面活性剂的毒性、增溶效率及可降解性都是应该考虑的重要因素。1 许多人工 合成的表面活性剂由于其毒性和在环境中的持久性，不仅对微生物有毒害作用， 还会对环境产生二次污染，因而人们把研究方向转向了天然绿色的生物表面活 性剂。 作为表面活性剂家族中的后起之秀，生物表面活性剂不仅具有乳化、增溶、 4 ， 气 网川大学硕 学位论文 润湿、降低表面张力等功能，而且具有安全无毒、等独特优点，因而在疏水性 有机污染的环境生物治理方面具有极大的应用潜力埘以特定的方式加入或利用 微生物自身所产生的生物表面活性荆可以提高烃类污染物的生物可降解性，己 成为一个重要的研究方向。 本研究从胜利油田东辛采油厂含油废水中筛选分离了1 2 株能以原油为唯一 碳源和能源产生表面活性剂的菌株，并对其做了生理生化鉴定，以其中三株最 具表面活性的菌株为例，做了乳化性能的研究。 染的采出水中多点取样 品，均匀混合，转入无菌的塑料瓶中，密封，4 c 低温保藏，用于菌种的筛选。 2 2 培养基 乳化菌的筛选和培养试验过程中使用到的培养基如下： ( 1 ) 牛肉膏蛋白胨培养基，用于细菌的富集 盛坌盒量! 型12 牛肉膏 3 蛋白胨 1 0 n a c i 5 p h 7 o 7 2 斜面和平板等固体培养基的制作，另加1 5 2 0 9 的琼脂。 ( 2 ) 无机盐培养基 盛坌盒量! 趔2 n h t c l3 0 4 k 2 h p 0 4 3h 2 0 8 1 2 m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 c a c l 2 2h 2 0 0 0 2 玉米浆 3 根据实验需要选择性添加碳源 ( 3 ) 芽孢菌糖发酵培养基 盛坌盒量! 醴2 ( n 1 - 1 4 ) 2 h p 0 4 1 0 6 蛋白胨 5 9 葡萄糖 5 9 k 2 h p 0 4 3 h 2 0 5 9 ( 5 ) 淀粉水解培养基 肉膏蛋白胨中加0 2 可溶性淀粉，分装三角瓶，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 r a i n ，倒 平板备用。 ( 6 ) 脲酶试验培养基 成分含量( 酬) 蛋白胨 l g n a c l 5 9 葡萄糖 1 9 k h 2 p 0 4 2 9 酚红( o 2 )6 m l 琼脂 2 0 9 ( 7 ) 吲哚试验培养基 l 胰蛋白胨水溶液；调p h 7 2 7 6 ，分装1 2 1 4 试管，1 1 5 灭菌3 0 r a i n 。 ( 8 ) 脂酶( t w e e ns o ) 实验培养基 盛坌盒量! 型12 蛋白胨 l og n a c l 5g c a c l2o 1g 7 g t l 川大学颂 学位论文 琼脂 p h t w e e n8 0 1 2 1 灭菌2 0 m i n 2 3 试剂以及主要仪器 1 2 9 7 4 l 实验用石油采自胜利油田东辛油矿。 化学试剂；硅胶薄层层析板，硅胶g 一6 0 ( 青岛化工厂) ：二氯甲烷、氯仿、 甲醇( 均为化学分析纯) 1 结品紫的混合液 甲液：结晶紫2 o g ，乙醇( 9 5 ) 2 0 m l 乙液：草酸铵o 8 9 ，蒸馏水8 0 r n l 将甲、乙两液相混，静置4 8 h 后过滤使用。此染液较稳定，在密闭的棕色 瓶中可储藏数月。 2 碘液 碘 1 o g 碘化钾 2 o g 蒸馏水 3 0 0 m l 先用少量( 3 5 m 1 ) 蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，待碘完全溶解后，加水 稀释至3 0 0 m l 。 3 脱色液 ( 1 ) 9 5 乙醇 ( 2 ) 丙酮乙醇溶液；乙醇( 9 5 ) 7 0 m l ，丙酮 3 0 m l 4 复染液 0 5 的番红( s a f r a n i n eo ) 水溶液 番红2 5 的乙醇溶液 2 0 m l 蒸馏水80ml ( 可将2 5 番红o 乙醇溶液作为母液，使用时再稀释。) 8 8 c - h e s s 试剂 a 液：对氨基苯磺酸 稀醋酸( 1 0 ) b 液：a 一萘胺 蒸馏水 稀醋酸( 1 0 ) 9 二苯胺试剂 0 5 9 1 5 0 r a l 0 i g 2 0 m l 二苯胺o 5 9 溶于1 0 0m l 浓硫酸中，用2 0 r n l 蒸馏水稀释 1 0 吲哚试剂 对二甲基氨基苯甲醛 8 9 乙醇( 9 5 ) 7 6 0 m i 浓h c i1 6 0 r a l 实验用到的主要仪器： h z q f 1 6 0 恒温振荡培养箱( 哈尔滨东联电子技术开发有限公司) 超净工作台( 苏静集团安泰公司) d n p 一9 0 8 2 型电热恒温培养箱( 上海精宏实验设备有限公司) y x 0 6 0 2 型电热式高压灭菌锅( 山东新华医疗器械厂) j z - 2 0 0 型表界面张力仪( 河北承德精密试验机厂) p h s 一3c 精密p h 计( 上海雷磁仪器厂) t g l - 1 6 c 高速离心机( 上海安亭科学仪器厂) 电子显微镜 9 2 4 1 原油乳化茵的筛选 取l o o m l 胜利油田东辛油矿含油乳化废水于2 5 0 m l 无菌三角瓶中，用手轻 轻震荡，使乳化液混均匀，取l o m l 接种到装有9 0 m l 肉膏蛋白胨培养基的三角 瓶中，3 0 摇床培养，转速为1 2 0 转分。培养4 8 h 后，再取l o m l 培养物转接 到9 0 m l 新鲜培养基中培养。 用平板稀释法分离纯化富集出来细菌，将不同菌落形态的菌接种到原油培 养基中，3 0 ，1 2 0 转分震荡培养2 3 天，转接两次。观察三角瓶中的原油变 化情况，将原油有乳化现象的样品保留，接种于肉膏斜面，用于鉴定和后续试 验。 2 4 2 表面活性剂的定性检测 生物表面活性剂主要包括糖脂、脂肽、脂蛋白类，生物表面活性剂的类型 与菌株有关，也与作为底物的碳源有关。取发酵液l o o m l ，2 0 0 0 转分离心，收 集上清液，加盐酸将p h 值调到2 左右，放置在冰箱( 4 ) 过夜，观察是否有白 色沉淀产生，若是脂肽、脂蛋白类表面活性剂者有白色沉淀产生，若是糖脂类 表面活性剂则无白色沉淀“”双缩脲、茚三酮显色反应检测脂肤、脂蛋白类表 面活性剂。用莫氏实验检测离心后的上清夜中的糖或糖的衍生物“”薄层层折 分析：将获得的发酵液离心( 8 0 0 0r ，2 0m i n ) ，上清液用氯仿甲醇( 2 1 ，v v ) 抽提后用于薄层层析。用毛细管吸取抽提液，在制备好的硅胶g 薄板上， 距底边1 0c m 的直线处点样，斑点直径 1 9 z s h l 01 1 o1 7 51 5 5 1 9 z s h l l6 o1 8 51 4 5 1 9 表2 可以看出，以石油为唯一碳源和能源培养三株菌，发酵液都具有叫好 的表面活性作用，油膜空斑直径比用其他碳源组大。用纯葡萄糖培养的菌液表 面活性作用最低。 2 l 四川大学硕士学位论文 一 e 毫 一 r 畿 旧 槲 棚。鹂隐。慰 l234 碳源( 1 代表4 g l u 、2 代表4 液蜡、3 代表2 g l u + 2 液蜡4 代 表4 囱油) 盥z s h 7口z s h l 0田z s h l l 图6 碳源对发酵液表面张力的影响 f i g 6t h e e f f e c to f c a r b o ns o u r c e so ns u r f a c et e n s i o n 图6 表明z s h l l 菌以葡萄糖和液蜡作为共同的碳源培养时，发酵液表面张 力下降至最低。以石油为唯一碳源三株菌的发酵液表面张力较高。不加葡萄糖 的培养基中表面张力比较一致。 ；号弘弛n黔鹅卯孙 四川大学硕上学位论文 鬟 、， 案 卷 基 酥 腿憾 1234 碳源( 1 代表4 g l u ，2 代表4 液蜡、3 代表 2 g l u 十2 液蜡、4 代表4 自油) r 一1 圈z s h 7 团z s h l 0 口z s h l l ： l 一一一 j 图7 碳源对发酵液乳化能力的影响 f i g 7t h ee f f e c to f c a r b o ns o u r c e s o re m u l s i f y i n ga b i l i t y 图7 表明，z s h 7 和z s h l 0 在以石油为唯一碳源的培养基中培养，发酵液对 煤油的乳化能力最强。而碳源对z s h l l 乳化煤油的能力影响似乎并不大 3 4 2 培养时间对发酵液表面活性的影响 将z s h 7 ，z s h l 0 和z s h l l 分别接种到装有1 0 0 m l 无机盐培养基的2 5 0 m l 的三 角瓶中，4 灭菌的东辛原油作唯一碳源和能源。每株水平接种两瓶，放在摇床 上，3 0 3 5 ，1 2 0 r m 振荡培养，在0 、8 、1 6 、2 4 、3 2 、4 0 、4 8 、5 6 、7 2 小时 时候分别取样，测发酵液的表面活性 诣踮坜坫加0 0 四川大学硕士学位论文 表3 培养时间对油膜空斑直径的影响 t a b 3t h ee f f e c to f c u l t u r et i m eo nt h ed i a m e t e r so f o i ls p o t s 时间o h 8 h1 6 h2 4 h3 2 h4 0 h4 8 h7 2 h z s h 72 33 51 6 5 1 9 1 91 7 51 6 51 5 5 z s h l 01 83 o1 6 7 1 9 1 91 7 6 1 6 o 1 5 o z s h l l1 52 81 5 51 7 5 1 91 7 9 1 5 o 1 4 5 从表3 中可以看出，3 株菌均在培养3 2 h 左右表现出最大的表面活性。其中 z s h 7 和z s h l 0 两菌在培养2 4 h 后就表现出最大的表面活性，两者的性能表现得 胞代谢过程中的变化有关在培养后期，培养槐中的营养物质逐渐被消耗。菌 体有可能对产生的表面活性剂进行代凯 四川大学硕i 学位论文 时间( h ) 巨三叵三i 叵两翊 图8 培养时间对发酵液表面张力的影响 f i g 8t h ee f f e c to f c u l t u r et i m eo ns u r f a c et e n s i o n 从图8 可以看出，培养的前8 小时，三株菌的发酵液表面张力几乎没有下 降，可以推测此时表面活性物质还没有合成。8 至4 0 小时期间，表面张力迅速 下降，4 8 小时后，表面张力持续在较低水平 加 卯 蚰 加 m o 一nm一文擞嚼僻 明川夫学硕十学位论文 拿 r 罐 s 辞 081 6 2 43 24 0 4 85 66 47 28 0 时h 1 ( h ) 一一一+ 一一 _ z s h 7 _ z s h l 0 _ z s h l l 图9 培养时间对发酵液乳化能力的影响 f i g 9t h e e f f e c to f c u l t u r et i m eo ne m u l s i f y i n ga b i l i t y 图9 表明，在培养4 0 到4 8 小时的时候，三株菌对煤油都具备比较高的乳 化能力其中，在培养4 0 小时的时候，z s h l 0 和z s h l l 比z s h 7 的乳化能力稍强。 3 4 3p h 对发酵液表面活性的影响 将z s h 7 ，z s h l 0 和z s h l l 分别接种到装有1 0 0 m l 不同p h 系列的无机盐培养 基的2 5 0 m i 的三角瓶中，每株水平接种两瓶，放在摇床上，3 0 3 5 ，1 2 0 r m 振荡培养，用稀盐酸将p h 分别调整在5 0 、5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、8 0 、 8 5 。3 2 h 后取样。 们 m o 四川大学硕士学位论文 且 0 娆 删 碳 捌 一 ol23456789 p h 医砸i 西1 9 一；j s h l l 。 图1 0p h 对发酵液表面活性的影响 f i g 1 0t h ee f f e c to f p ho i lt h ed i a m e t e r so f o i ls p o t s 图l o 表明，p h 对z s h l l 发酵液的表面活性能力影响较大，在p h 7 到p h 8 之间，z s h l l 发酵液的表面活性最大，而z s h 7 和z s h l 0 的发酵液在p h 7 处均有 最大的表面活性，在p h 6 到p h 8 之间有较高的表面活性。 加堪m h 挖m 8 6 4 2 o 刚川大学碗卜学位论文 看 、一 长 装 目 僻 0l234 56789 p h 巨三夏三亘叵三垂回 图1 1p h 对发酵液表面张力的影响 f i g 1 1t h e e f f e c to f p ho ns u r f a c et e n s i o n 图l l 表明，在p h 4 8 之间，z s h l l 发酵液的表面张力都比较低，而z s h 7 和z s h l 0 在p h 6 $ 之间有最低的表面张力，其中，z s h 7 在p h 7 时候表面张力 最低，仅2 8 m n m 。 铂柚拍衢坫m；o x v r 拦 篁 谅 0l 23456789 p h 西i i 画画圃 图1 2p h 对发酵液乳化能力的影响 f i g 1 2t h e e f f e c to f p ho ne m u l s i f y i n ga b i l i t y 图1 2 表明，在酸性环境下，三株菌的发酵液对煤油的乳化能力都比较低， 而在p h 7 8 之间则有很高的乳化能力，这可能与 h 浓度有关，而未必与表面 活性剂的筘关系。 ， 3 4 4 温度对发酵液表面活性的影响 将z s h 7 ，z s h l o 和z s h l l 分别接种到装有1 0 0 m l 无机盐培养基的2 5 0 m l 的三 角瓶中，将p h 调节在7 5 左右。每株水平接种两瓶，放在1 2 0 r m 摇床上，分 别在2 0 ( 2 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 c 下培养。3 2 h 后取样，测发酵液的表面活 性。 四川大学硕十学位论文 0 g 蜘 丞 h 3 03 5 温度( ) f 面i 面j = 面司 圈1 3 温度对油膜空斑直径的影响 f i g 1 3t h e e f f e c to f t e m p e r a t u r eo nt h ed i a m e t e r so f o i ls p o t s 从图1 3 可以看出，2 5 时，z s h 7 和z s h l o 发酵液的表面活性低于z s h l l 发 酵液的表面活性。在3 0 c 3 5 c 之间，三株菌都有最高的表面活性，4 0 c 时则 有不同程度的下降。 o 8 6 4 2 o 8 6 4 2 0 塑! ! ! 查兰堡! ：兰堡丝苎 e e 崇 陋 群 3 0 2 0 0 2 02 53 0 3 54 04 5 温度( ) 隔矿二= 磊i 而= i ：商订 t - 一一- t j 图1 4 培养温度对发酵液表面张力的影响 f i g 1 4t h e e f f e c to f c u l t u r et e m p e r a t u r eo ns u r f a c et e n s i o n 图1 4 表明，2 5 c 4 0 c 之间，z s h l l 的表面活性基本没有变化，在3 5 m n m 左右，而z s h 7 和z s h l 0 在3 5 c 时的表面活性最低，分别是3 0 m n m 和2 9 m n m 。 朋川大学颂十学位论文 3 03 5 温度( ) 巨i 画叵= j 回 图1 5 温度对发酵液乳化能力的影响 f i g 1 5t h e e f f e c to f t e m p e r a t u r eo ne m u l s i f y i n ga b i l i t y 图1 5 表明，3 5 。c 培养的z s h 7 和z s h l 0 发酵液对煤油具有最高的乳化能力 均为5 0 。4 0 c 时候，两株菌发酵液对煤油的乳化能力略有下降，为4 5 。z s h l l 在3 0 至, j4 0 c 之问均有较高乳化能力，约4 5 。 3 4 5 摇床转速对发酵液表面活性的影响 将z s h 7 ，z s h l o 和z s h l l 分别接种到装有1 0 0 m l 无机盐培养基的2 5 0 m l 的三 角瓶中，将p h 调节在7 5 左右。每株水平接种两瓶，放在摇床上，3 0 3 5 ， 分别将摇床转速调节在8 0 r m 、1 0 0 r m 、1 2 0 r m 、1 4 0 r m 、和1 6 0 r m 振荡培养。 卯 蚰 (一、r耀晕簖 四川大学硕十学位论文 3 2 h 后取样，采用油膜扩散法测发酵液的表面活性。 ! 8 01 0 01 2 01 4 01 6 0 转速( r m ) 卜s n ，上j s h l i + - z s h l l l 。, 图1 6 转速对油膜空斑直径的影响 f i g 1 6t h ee f f e c to fr o t a t es p e e do nt h ed i a m e t e r so f o i ls p o t s 图1 6 表明，摇床转速对发酵液的表面活性能力有很大的影响，低转速不利 于菌体的生长，从而影响到表面活性剂的合成，转速在1 0 0 r m 到1 6 0 r m 之间， 发酵液具有良好的表面活性作用z s h 7 和z s h l 0 的最佳转速为1 2 0 r m ，而z s h l l 的最佳转速为1 4 0 r m 。 3 5 表面活性物质的初步分析 取发酵液1 0 0 m l ，2 0 0 0 r m 离心，收集上清液，加盐酸将p h 值调n 2 左右，放 置在冰箱( 4 ) 过夜，观察。z s h 7 和z s h l 0 发酵液有白色沉淀产生 暑墟埔地如0 0 0 0 8v、壬缸斟斜 阴川大学硕十学位论史 图1 7 ( a ) z s h 7 和嚣h 1 0 产物的薄层层析 图1 7 ( h ) z s h l l 产物的薄层层析 t l c 官能团显色结果表明：在层析板上喷茚三酮试剂后，z s h 7 ，z s h l 0 均出 现红色条斑，为阳性反应，钼酸铵一高氯酸和葸酮一硫酸反应均无特征性色斑 出现，为阴性。说明z s h 7 ，z s h l 0 产生的表面活性剂主要是脂肽类物质。莫氏试 验表明z s h l l 发酵液主要含糖脂。这与前人的研究较为一直。李祖义等“。从铜绿 假单胞菌发酵液中分离出以鼠李糖脂。张翠竹1 等从芽孢杆菌发酵液中分离得 到了脂肽类表面活性剂。 3 6 分离筛选的石油乳化菌的鉴定及特性 选择乳化能力和表面活性能力较强z s h 7 、z s h l o 和z s h l l 作为代表，根据伯 杰氏细菌鉴定手册鉴定，对分离纯化得到的1 2 株具有表面活性的菌株进行鉴 定，主要生理生化指标如下表。其中，除z s h l l 为假单孢菌外，其他l l 株菌均 为产芽孢菌。 表4 三株菌的主要生理生化特征 t a h at h e p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i co ft h e t h r e es t r a i n s z s h 7z s h l o嚣h l lz s h 7z s h l o z s h l l 芽孢 + 革兰染色 + 需氧 + g l u 发酵 一 氧化酶 一 v p m r一 酯酶 + 脲酶 产硫化氢 n 0 3 还原 明胶液化 淀粉酶 t r o p h c 吲哚 一 一 + + + + 一 一 一 + + + 一 + 一 一 一 一 + 一 + + 一 一 一 一 + 一 一 一 一 + + + + + 一 一 一 + 朋川大学硕十学位论文 4 小结 4 1 发酵液表面活性的测定 三株菌的表面活性能力各不相同，环境因素对表面活性能力的影响也各不 一样。多种实验表明，z s h 7 和z s h l o 两株细菌的生理生化特性较为相似，乳化能 力和表面活性能力也比较相近。而z s h l l 与z s h 7 和z s h l o 的特性和乳化能力有较 大的差异。 油膜空斑直径与表面张力和发酵液的乳化能力是有一定关系的，发酵液的 排油能力越强，表面张力越小，乳化能力越强。与其他许多学者的研究基本一 致。如b o d o u r ( 2 0 0 3 ) 的研究表明这两者之间有很大的相关性。而n o h a h y o u s s e f 等“”研究表明油膜空斑法与表面张力法测得的结果有很强的相关性，r 。= 一 0 8 2 。说明油膜空斑直径越大，表面张力越小。在体系的表面活性不是很强的 时候，油膜空斑法具有比表面张力法更高的灵敏度。本实验同时表明，油膜空 斑直径与发酵液的乳化能力呈一定的相关，但是受到多种因素的影响，从而三 种检测方法检测到的数据的关联性不强。油膜空斑直径的测定方法相对其他两 种实验方法都要简单，因此，可用此法测定的结果来作为乳化菌的表面活性能 力的主要指标。乳化菌对石油的乳化也未必与对煤油的乳化作用一致。 4 2 表面活性成分的鉴定 经过初步分析，两株产芽孢的菌株产生的表面活性剂为脂肽类物质，而假 单孢菌产生的表面活性剂为糖脂。 4 3 乳化菌的筛选和鉴定 从胜利油田东辛油矿含油采出废水中分离筛选出1 2 株能以东辛油田的原油 为唯一碳源和能源生长，产生表面活性剂的细菌选择其中三株表面活性能力 四川大学硕士学位论文 较强的菌株做鉴定，经过鉴定，这三株乳化菌分别对z s h 7 为短芽孢杆菌属、z s h l o 为芽孢杆菌属、z s h l l 为假单胞菌属。 叫川大学颁十学位论文 第二章乳化菌对白腐真菌降解石油的影响 剐吾 石油组分复杂，单一细菌菌株难以有效降解石油中的多种化学成分，这是 很过细菌降解石油降解率不高的主要原因之一另外，细菌对外源物质的降解 往往存在着一定阀值，也就是降解到一定程度后就不再降解，这一问题在自然 界中普遍存在。研究表明，利用白腐真菌胞外氧化还原酶系车富，底物专一性 低，对外源物质廖降解不受浓度大小的影响等优点。利用细菌和真菌联合降解 污染物的研究在国内外少有报道，侯树字等“”利用白腐真菌和芽孢杆菌协同降 解芘，结果表明，混合菌大大降低了芘的残留阀值。 本论文针对石油污染生物治理过程中石油烃污染物生物可利用性差、生物 降解速率低等问题，结合从胜利油田东辛采油厂采采出废水中筛选出能以石油 为唯一碳源和能源产生物表面活性剂的细菌对石油的乳化作用，利用白腐真菌 的广谱降解能力来强化石油烃污染物的生物降解；重点考察生物表面活性剂在 强化白腐真菌降解石油烃污染物过程中的作用，为提高原油污染物的生物降解 率提供了瓤的思路和途径。 四川大学硕上学位论文 1 材料与方法 1 1 菌种来源 实验用的自腐真菌来自中国科学院成都生物所环境研究室菌种保藏中心。 1 2 培养基 白腐真菌种子培养基( p a d ) 培养基 成分含量 马铃薯 2 0 0 9 葡萄糖2 0 9 水 1 0 0 0 m l p h 自然 马铃薯去皮后切称块，煮沸3 0 m i n ，然后用纱布过滤，再加糖，溶化后补 加水至1 0 0 0 m l 。斜面培养基加2 0 9 琼脂，1 2 1 灭菌3 0 m i n 无机盐原油降解培养基( g l ) 成分含量 n i - 1 4 n 0 3 2 5 k 2 h p 0 4 3 h 2 0 o 6 n a c l 0 3 5 玉米浆 3 微量元素液 5 m l 东辛灭菌原油4 p h 7 0 - - 7 5 培养基中的东辛原油换成0 1 的葡萄糖作为白腐真菌菌种培养基。 微量元素液：m g s 0 4 7 h 2 0 4 0 、c u s 0 4 5 h z 0 1 0 、m n s 0 4 h 2 0 1 0 、f c s 0 4 7 h o 1 o 、无水c a c l 21 o 、水5 0 0 m l 。 。 四川大学硕士学位论文 1 3 实验用到的仪器 h z q - f 1 6 0 恒温振荡培养箱( 哈尔滨东联电子技术开发有限公司) 超净工作台( 苏静集团安泰公司) d n p - 9 0 8 2 型电热恒温培养箱( 上海稽宏实验设备有限公司) y x 0 6 0 2 型电热式高压灭菌锅( 山东新华医疗器械厂) j z - 2 0 0 型表界面张力仪( 河北承德精密试验机厂) p h s - 3c 精密p h 计( 上海雷磁仪器厂) t g l - 1 6 c 高速离心机( 上海安亭科学仪器厂) 电子显微镜 s 眦一c 型往复式振荡器( 常州国华电器有限公司) 电热恒温水浴锅( 绍兴县医疗器械一厂) 1 4 方法 1 4 1 原油降解率的测定 水中原油含量采用重量法测定m 1 ，采用以下公式计算石油降解率“”( r ) ，7 ：o ) o - ( 9 s l o o 式中： 对照组中残余原油含量 叱样品降解后培养液中残余原油含量 1 4 2 白腐真菌生物量的测定 将待测培养物置于离心机中，1 0 0 0 r m 离心i o m i n ，小心倒掉上层含油发酵 四川人学硕士学位论文 液，收集底部菌丝球，放入干净烧杯中。加入适量蒸馏水，然后用玻璃棒小心 搅拌，静置，离心。如此反复用蒸馏水清洗三次。最后将所得茵体放在称重后 的干净滤纸上，置于6 5 的烘箱中烘干直至衡重。 4 1 一 网川大学硕卜学位论文 2 结果与分析 2 1 碳源对白腐真菌降解石油的影响 将白腐真菌分别接种到装有l o o m l 含有不同葡萄糖浓度的东辛原油( 4 ) 培养基的2 5 0 m i 三角瓶中。葡萄糖浓度分别为0 ，l ，2 ，3 ，4 每个 样品平行做两瓶，3 0 3 5 c ，1 2 0 r m 振荡培养7 2 小时，重量法测白腐真菌对原 油降解率。 美 v 船 琏 鞋 0 23 45 葡萄糖浓度( ) 图1 葡萄糖对白腐真菌降解石油的影响 f i g 1t h e e f f e c to fg l u0 1 1t h ed e g r a d a t i o nr a t e 蛎们弘拍坫加0 0 堕型盔竺竺生竺丝丝塞 图2 不含葡萄糖的白腐真菌培养物 f i g 2t h ep h o t oo fw h i t er o tf u n g ic u l t u r ew i t h o u tg l u c o s e 四川大学硕卜学位论文 图3 含i 葡萄糖的白腐真菌培养物 f i g 3t h ep h o t oo fw h i t er o tf u n g ic u l t u r ew i t h1 g l u c o s e p q 川人学顾 学位论文 图4 以葡萄糖为纯碳源的白腐真菌培养物 f i g 4 t h ep h o t oo f w h i t or o tf u n g ic u l t u r ew i t hj u s tg l u c o s e 从图l 至图4 可以看出，葡萄糖作为最简单的常见的单糖之一，极易于被 白腐真菌作为碳源利用。在不含葡萄糖的试验中，由于接种的白腐真菌无法获 得碳源生长，石油漂浮在培养基面上，与白腐真菌菌丝接触的几率很小，因此， 白腐真菌最终死亡，石油几乎没有被降解。随葡萄糖浓度的增大，培养基内的 白腐真菌大量繁殖，石油降解率也随着增大。当葡萄糖浓度继续增大的时候， 自腐真菌对石油的降解下降。 2 2p h 对白腐真菌降解石油的影响 将白腐真菌分别接种到装有1 0 0 m l 含有2 葡萄糖的东辛原油培养基的 2 5 0 m l 三角瓶中，灭菌原油含量为4 。将p h 分别调整到4 ，5 、6 、7 、8 。每 个样品平行做两瓶，3 0 3 5 c ，1 2 0 r m 振荡培养7 2 小时，重量法测白腐真菌对 原油降解率 四川大学颂上学位论文 5 0 x4 0 墼3 0 鞋2 0 l o o 456 789 p h 图5p h 对白腐真菌降解石油的影响 f i g 5t h ee f f e c to fp ho l ld e g r a d a t i o nr a t e 从图5 中可以看出，在偏碱性的环境下，白腐真菌对原油具有良好的降解 作用，在p h 7 5 左右，降解率达到最高，为4 6 。 2 3 培养温度对白腐真菌降解石油的影响 将白腐真菌分别接种到装有l o o m l 含有2 葡萄糖的东辛原油培养基的 2 5 0 m i 三角瓶中，灭菌原油含量为4 。分别放置在2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、 4 0 c 摇床上。1 2 0 r m 振荡培养7 2 小时，p h 为7 7 5 。重量法测白腐真菌对原 油降解率 网川大学硕士学位论文 6 0 5 0 4 0 x 糌3 0 琏 遴2 0 1 0 o 2 0 2 53 03 5 4 0 温度( ) 图6 温度对自腐真菌降解石油的影响 f i g 6t h ee f f e c to ft e m p