（微生物与生化药学专业论文）鸟苷产生菌bacillus+subtilis+jsimg518的改良及其发酵条件优化.pdf

摘要 摘要 鸟嘌吟核苷( g u a n o s i n e ，乌苷) 商品名称为g r ，又名9 1 3 - d 呋喃核糖基鸟嘌呤。 其用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体，可用于合成食品增鲜剂5 鸟苷酸二 钠、呈味核苷酸二钠和核苷类抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦等，也是用于制造三磷 酸鸟苷钠等药物的主要原料。随着越来越多的企业进入生产利巴韦林、阿昔洛韦和5 - 鸟苷酸的行列，国内鸟苷市场需求量激增。 本论文以提高鸟苷产量为目标，通过对已分离菌株b a c i l l u ss u b t i l i sj s i m g 518 进行 原生质体紫外诱变，分离得到一株产量较高的突变菌株j s i m g u 1 2 4 1 9 ，然后对其发 酵条件进行优化以进一步提高鸟苷产量，并对鸟苷补料发酵和调控进行了初步研究。其 主要研究内容和结果如下： 1 通过对酶解浓度、酶解温度的实验分析，确定了j s i m g 5 1 8 原生质体形成率与 再生率较高的最佳条件：溶菌酶终浓度控制在2 4m g m l ，酶解温度3 6 的水浴中处理 4 0m i n 。对j s i m g 5 1 8 原生质体直接进行紫外诱变处理，方法简单、效果好，能在较短 时间内较大幅度提高菌种的生产能力、改善菌种性能。本实验的出发菌株j s i m g 5 1 8 并未缺失核苷水解酶，所以纸电泳测定鸟苷含量时混有了鸟嘌呤，使得鸟苷实际产量降 低。为了进一步提高该菌株的生产性能，本实验以原生质体的紫外诱变方式，获得了核 苷水解酶缺失的突变菌株，阻止了鸟苷代谢为鸟嘌呤，并进一步获得了磺胺胍，狭霉素 c 的抗性突变株，解除了终产物的抑制和阻遏，使鸟苷产量达到2 4 0g l 。 2 采用单因素优化方法对鸟苷发酵培养基成分和培养条件进行了一系列的研究， 并在此基础上采用响应面实验方法对发酵培养基中最主要的三种影响因素葡萄糖、酵母 粉、豆饼水解液进行了进一步的优化。建立了鸟苷发酵的最优发酵条件：发酵最适p h 值为6 4 ，最适发酵温度为3 6 ，溶氧控制在4 0 ，并于种子生长时间1 0h 时转入发酵 培养基进行发酵。确立了鸟苷的最优发酵培养基组成：葡萄糖1 2 5 ，酵母粉1 4 ， ( n h 4 ) 2 s 0 41 5 ，m g s 0 40 5 ，k h 2 p 0 40 4 ，谷氨酸钠l - 0 ，c a c l 20 2 ，豆饼水 解液4 0m l d l ，玉米浆1 7m l d l ，c a c 0 32 0 。优化后鸟苷的最高发酵产量可达到 2 8 3 l 。 3 通过对鸟苷补料发酵和调控的研究，确立了谷氨酸钠和二噫烷的最佳流加方式 和浓度。实验表明，分批加入总量为o 2 5 的谷氨酸钠较起始时一次性加入1 0 的谷 氨酸钠，鸟苷产量没有影响，降低了生产原料成本。在发酵3 0h 加入终浓度为1 0 0m g l 的二噫烷，缩短了发酵周期，具有显著的经济效益。 关键词：鸟苷；原生质体；诱变；发酵；响应面分析 a b s t r a c t g u a n o s i n ea sk n o w na s9 13 d r i b o f u r a n o s y l g u a n i n e i sa ni m p o r t a n ti n t e r m e d i a t eo f f o o d sa n dm e d i c i n e s i tc a nb eu s e dt os y n t h e s i s5 - d i s o d i u mg u a n y l a t e ，d i s o d i u mn u c l e o t i d e a n dn u c l e o s i d ea n t i v i r a ld r u g ss u c ha sr i b a v i r i n ，a c y c l o v i r a n di ti st h em a i nm a t e r i a lt o m a n u f a c t u r es o d i u mg u a n o s i n et r i p h o s p h a t e a sm o r ea n dm o r ee n t e r p r i s e sa l eg o i n gt o p r o d u c ea c y c l o v i r , r i b a v i r i na n dg u a n o s i n e5 - a c i d ，t h ed e m a n do fg u a n o s i n ei si n c r e a s i n g q u i c k l y w i t l lt h e g o a l o fi n c r e a s i n gt h ey i e l do fg u a n o s i n e ，t h i ss t u d ys h o w sam u t a n t j s i m g u 一12 4 19s e l e c t e df r o mb a c i h u ss u b t i l i sj s i m g 518 ，o b t a i n e df r o map r o d u c t i o n s t r a i n 谢t l lp r o t o p l a s tm u t a t i o n ，w h i c hp r o d u c e dg u a n o s i n ei nah i g hy i e l da f t e ro p t i m i z i n gt h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n a n dt h ef e d - b a t c hf e r m e n t a t i o na n dr e g u l a t i o no fg u a n o s i n ew e r e s t u d i e d t h em a i nr e s e a r c ha n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 af a s ta n dr e l i a b l em e t h o do fo b t a i n i n gp r o t o p l a s t sf r o mj s i m g 5l8w h i c hc a n p r o d u c eg u a n o s i n ei ss t u d i e d t h ec o n d i t i o n so fp r o t o p l a s tf o r m a t i o na n dt h er e g e n e r a t i o n w e r ed e t e r m i n e dt h r o u g ht h ea n a l y s i so fe n z y m ec o n c e n t r a t i o na n dt e m p e r a t u r e 1 1 1 e l l i 曲- y i e l do fp r o t o p l a s ti s i n4 0m i n u t e ，2 4m g m l ( t h ef i n a ll y s o z y m ec o n c e n t r a t i o n ) a t 3 6 c 啊1 em e t h o do fp r o t o p l a s t sm u t a g e n e s i si ss i m p l ea n de f f e c t i v e ，i tc a ni m p r o v et h e p r o d u c t i o nc a p a c i t ya n dp e r f o r m a n c eo fb a c t e r i ai nas h o r tt i m e t h ep a p e re l e c t r o p h o r e s i s d i s p l a yt h a tf e r m e n t a t i o nb o t hc o n t a i ng u a n o s i n ea n dg u a n i n e ，s oi no r d e rt oo b t a i na h i 曲- y i e l dg u a n o s i n es t r a i nw eh a v et og a i nam u t a n tw h i c hl a c k sn u c l e o s i d eh y d r o l y a s e t h r o u g hp r o t o p l a s t sm u t a g e n e s i s a tt h es a m et i m ea m u t a n t 谢t l ls g l ，p s i lw a so b t a i n e d ，t h e m u t a n tc o u l dp r o d u c eg u a n o s i n e2 4 0g l ，w h i c hi n c r e a s e db y3 0 o ft h eo r i g i n a ls t r a i n 2 t h eo p t i m i z a t i o n so fm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rt h ep r o d u c t i o no f g u a n o s i n eb yt h em u t a n tj s i m g u 12 4 19w e r ec a r r e do u to nt h eb a s i so fs i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n t sa n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r e ：p h6 4 ， t e m p e r a t u r e3 6 d i s s o l v e do x y g e n4 0 i n o c u l a t i o nt i m el0h t h eo p t i m i z e dm e d i u mw a s ： g l u c o s e12 5 ，y e a s tp o w d e r1 4 ，( n h 4 ) 2 s 0 41 5 ，m g s 0 4o 5 ，k h 2 p 0 4o 4 ，s o d i u m g l u t a m a t e ( m s g ) 1 0 ，c a c l 2o 2 ，s o y b e a nd i g e s t4 0m l d l ，c o r ns t e e pl i q u o r l 7m l d l ， c a c 0 32 o t h ey i e l do fg u a n o s i n ew a si n c r e a s e dt o2 8 3g la f t e ro p t i m i z a t i o n 3 t h ef e d b a t c hf e r m e n t a t i o na n dr e g u l a t i o no fg u a n o s i n ew e r es t u d i e da n dt h ef l o w m o d ea n dc o n c e n t r a t i o no fs o d i u mg l u t a m a t ea n dd i o x a n ew e r ee s t a b l i s h e d t h e e x p e r i m e n t ss h o wt h a ta d d i n g0 2 5 s o d i u mg l u t a m a t ec a nr e d u c et h ec o s to fr a wm a t e r i a l s i n3 0h a d d i n gt h ef i n a lc o n c e n t r a t i o no f10 0m g ld i o x a n ec a ns h o r tt h ef e r m e n t a t i o np e r i o d k e y w o r d s ：g u a n o s i n e ；p r o t o p l a s t ；m u t a g e n e s i s ；f e r m e n t a t i o n ；r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y u 缩略词汇对照表 g r ：鸟苷 i 御：肌苷酸 x m p ：黄苷酸 p r p p ：5 磷酸核糖焦磷酸 a d e ：腺嘌呤营养缺陷型 t h i ：硫氨素营养缺陷型 g m p r e a ：g m p 还原酶阴性 8 - a g 。：8 氮鸟嘌呤抗性 a d e + ：腺嘌呤营养缺陷回复突变 p s i r ：狭霉素c 抗性 r s m ：响应面分析法 n h a s e 。：核苷水解酶阴性 缩略词汇对照表 g m p ：鸟苷酸 触旧：腺苷酸 s a m p ：腺苷酸琥珀酸 p r a ：5 一磷酸核糖胺 h i s 。：组氨酸营养缺陷型 d e a m ：腺嘌呤脱氨酶阴性 m s o 。：蛋氨酸亚砜抗性 s m r ：链霉素抗性 s g r ：磺胺胍抗性 d e a l ：德夸菌素抗性 m s g ：谷氨酸钠 s m m ：原生质体稳定液 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名： 蓝翠 日期：兰堕：竺：兰兰 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名： 叁聱 导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 核苷酸的研究概况 核苷酸是一类在代谢上极为重要的生化物质，除作为d n a 、r n a 的前体外，在细胞 的生长代谢、能量的储存和转化、免疫反应及信号传导中，都有核苷酸的参与。核苷酸 在食品行业中，已经由最初的食品助鲜剂，扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食 品添加剂，特别是在婴幼儿食品中，核苷酸能有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力， 减少腹泻的发生。同时，核苷酸在抗癌、抗病毒、治疗心血管疾病、糖尿病及干扰诱导 等方面具有独特的疗效，被用于多种药物的合成。据统计，目前核苷酸类物质可以合成 5 2 种抗病毒、抗肿瘤药物，而这些药物有望成为继磺胺类药物、抗生素之后的又一类新 型的抗病毒、抗肿瘤药物。此外，核苷酸还可作为农用激素调节植物生长，用于农作物 的生产，有明显的增产、增重功效。 1 1 1 核苷酸及其衍生物的生产方法 2 0 世纪6 0 年代初，日本的国中明率先发现了利用橘青霉( p e n i c i l l i u mc i t r i n u m ) 提取 的5 磷酸二酯酶可以降解r n a 生成5 核苷酸。随后，日本利用该方法首先开始了核苷酸 的工业化生产。在几十年的研究中，已形成生产核苷酸及其衍生物的多种方法，归纳起 来主要有以下4 种：化学合成法、r n a 酶解法、微生物发酵法以及生物催化法【1 1 。 ( 1 ) 化学法 化学法生产核苷酸，通常是用磷酸或者焦磷酸的活性衍生物对核苷进行磷酸酯化反 应。一般常用的焦磷酸的活性衍生物有三卤氧化磷、焦磷酰氯、双对硝基苯焦磷酸等。 另外，要得n 5 - 核苷酸，必须在磷酸化反应前以适当的保护基保护核苷上核糖的2 ，3 羟 基。一般采用乙酰基、苄基、0 3 亚异丙基或苯亚甲基的功能化基团保护。目前已知的核 苷酸化学合成方法主要有：o t t 法和l u d w i g 法。 ( 2 ) 酶解法 酶解法生产5 核苷酸的工艺流程为：酵母经稀碱或浓盐抽提后，在p h 值为2 5 的条 件下沉淀得到r n a ，再经5 磷酸二酯酶酶解得n 4 种核苷酸的混合液，将该混合物经离 子交换树脂分离纯化可以得到4 种核苷酸的纯品。磷酸二酯酶主要是通过橘青霉固体发 酵生产的核酸酶p 1 ，它是一个胞外酶，提取后的粗酶液酶活一般在0 0 0 6 7 - - 一0 0 1 2k a t l ( ! ! p 4 0 0 - - 7 0 0u m l ) ，可以直接用于水解核酸，其水解率一般为7 0 0 , - - , 8 5 0 ，除了橘 青霉的核酸酶p 1 外，还可从麦芽根中提取磷酸二酯酶进行酶解反应。 ( 3 ) 微生物发酵法 国外微生物发酵法生产核苷、核苷酸类物质的研究工作，起步于二十世纪五十年代， 目前在国外尤其在日本，已成功的运用微生物发酵法生产核苷、核苷酸类物质，如核苷 类物质辅酶a 、辅酶i 、辅酶i i 、核糖等；嘌呤类物质肌苷、肌苷酸、鸟苷、鸟苷酸、腺 苷、腺苷酸、黄苷等；嘧啶类物质尿苷、尿苷酸、胞苷、胞苷酸、乳清酸、乳清酸核苷 江南大学硕士学位论文 等。所使用的菌种多为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 和产氨棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u m a m m o n i a g e n e s ) 前者主要用于生产核苷和嘌呤核苷酸，而后者是目前利用微生物工业化 合成核苷酸及其高级衍生物的主要菌种。 ( 4 ) 生物催化法 微生物催化转化合成核苷酸，就是利用微生物作为酶源，催化核苷酸的前体物质转 化为核苷酸。用于催化转化法合成核苷酸的微生物一般是产氨棒杆菌。转化反应中需要 适当的表面活性剂增加细胞膜通透性，使底物能进入胞内参与反应，产物核苷酸能分泌 到胞外。 1 1 2 目前已研究出的核苷类药物 ( 1 ) 抗h i v 药物 2 1 磷酸酯前药第二代核苷类h i v 逆转录酶抑制剂分子中含有一个磷酸，又称核苷酸类 似物。它们可绕过体内活化限速的单磷酸化，提高活性，但脂溶性差不易穿透细胞膜。 如图1 1 ： 胃 取 鬈：譬二：嚣脚 c h 3 ) 2 c h o c o c 一o 函9 i ( c h 3 ) 2 c h o 一旨一。一c h 2 可 舌h 3 0 一。 。i i 暾n ， ( c h 3 ) 3 c - 争。毗0 邑o j ( c h 3 ) 3 c - c 一。一g h 2 一u 图1 - 1 磷酸酯前药 f i g 1 - 1p h o s p h a t ee s t e rp r o d r u g 鸟苷前药在鸟嘌呤环的6 位带上氨基可改善鸟苷n r t i s ( 核苷类逆转录酶抑制剂) 的 药代动力学性质，如脂溶性、溶解度、口服生物利用度。如图1 2 ： h 2 a b a c a v i r1 1 图1 - 2 鸟苷前药 f i g 1 2g u a n o s i n ep r o d r u g 2 a m d o x o v i r1 第一苹绪论 无环嘧啶核苷酸类似物抗h i v 核苷类药物大多含五元环糖。 聚酰胺核苷酸类似物病毒基因功能研究表明，在h i v r n a 上有一个转录激活应答 区，当转录激活因子t a t 结合到t p 吣端的2 3 - - 2 5 位核苷酸( c u g ) 时即可激活病毒转录。 ( 2 ) 抗疱疹病毒药物 西多福韦 苯并咪唑核苷类似物 双环呋 2 ，3 d 嘧啶核苷类似物 n 一，r 1 9r = 阢r 2 = h “ 一 h ：玲： 怕d训 窀。h 窀。h 皂。h h 钒0 裂苎孑审n h 2 叫眠刊：之，r h - ；等c 眦：b h r o , - a - n 帅叫 v a t o r e i 协b i 聃2 8 o h o f o h m i v - 2 1 02 ， m c c - 4 7 83 0卜z f d 4 c3 l_ - 3 - f c l 4 c3 2 图l - 4 抗h b v 候选药物 f i g 1 - 4a n t i - h b vd r u g 3 n n 江南大学硕士学位论文 1 2 鸟苷的研究背景和意义 1 2 1 乌苷简介 鸟苷即鸟嘌呤核苷，英文名称：g u a n o s i n e ，商品名称：g r ，化学名称：9 - 1 3 - d - 呋 喃核糖基鸟嘌呤。 优级品为白色结晶性粉末或类白色结晶性粉末，合格品为微黄色结晶性粉末或结晶 性颗粒。 分子式：c 1 0 h 1 3 n 5 0 5 ，相对分子质量2 8 3 2 4 ，化学结构式如下： 0 舯0 h 水溶液的紫外吸收高峰在2 5 6 岬，克分子消光系数1 2 2 x 1 0 3 ，低峰在2 2 8 岬，克 分子消光系数2 4 x 1 0 3 ；难溶于冷水，易溶于温水，1 8 c 下1 3 2 0m l 水中溶解1g ，沸水 浴中，3 3m l 水中溶解1g 。可溶于酸碱，不溶于有机溶剂，熔点：2 3 7 - - 2 4 0 。 1 2 2 鸟苷的用途 ( 1 ) 鸟菅在医药工业主要用作医药中间体 鸟苷在医药行业中作为合成原料是很有前途的，特别是在合成抗病毒药物方面。核 苷类抗病毒药物是目前临床上治疗艾滋病( h i v ) 、疱疹、肝炎( h b v ) 等病毒性疾病 的首选药物，其作用靶点是r a n 病毒的逆转录酶或d n a 病毒的d n a 聚合酶。它们模 拟天然核苷的结构，竞争性作用于酶活性中心，嵌入正在合成的病毒d n a 链中，终止 d n a 链的延长，从而抑制病毒复制2 ，4 1 。目前这方面已成为医药工作者研究的重点1 5 , 6 1 。 由于鸟苷是由核糖和鸟嘌呤组成，以鸟苷原料合成三氮唑核苷( 利巴韦林) 时，其 核糖部分用于合成三氮唑核苷，降解下来的鸟嘌呤就成为合成无环鸟苷( 阿昔洛韦) 的 原料。一种原料药同时可以用来合成两种抗病毒药物，大大降低了两种抗病毒药物的成 本。 ( 2 ) 鸟苷在食品工业用作增鲜剂 鸟苷核糖分子的第五位碳原子上连接上磷酸即形成5 一鸟苷酸，5 鸟苷酸是强烈呈味 剂，它的鲜味是味精鲜味的1 6 0 倍。少量的鸟苷酸与味精相混合可以提高味精的鲜味1 0 4 第一章绪论 倍，是目前特鲜味精的主要原料【7 1 ，也是我国食品调味品行业中极待开发的一个品种。 1 2 3 国内外研究概况 ( 1 ) 国外研究概况 早在二十世纪六十年代日本就大规模开展了发酵法生产鸟苷的研究，并取得了一系 列成就，进人了工业化生产规模。小西【8 】等在选育鸟苷生产菌时，选育了抗鸟嘌呤或鸟 嘌呤结构类似物的突变株，发现丧失g m p 还原酶的菌株主要积累鸟苷。日本的渡边【8 j 等将鸟苷生物合成途径中的关键酶p i 冲p 转酰胺酶基因克隆到载体质粒中，然后将该重 组质粒导入到枯草芽胞杆菌中，结果鸟苷的产量提高了4 倍。三井等采用体外诱变的方 法构建出s a m p 合成酶缺失株，该工程菌株于3 4 发酵7 0h ，其鸟苷产量为1 9 0g m 。 n o g 锄i 【9 】等人证明g m p 还原酶阴性菌的鸟苷产量比阳性菌要高，并发现腺嘌呤或 腺苷抑制i m p 到g m p 途径中酶的活性，据此以枯草芽胞杆菌n 0 1 0 2 为出发菌，得到 抗腺嘌呤，腺苷突变株n t l 0 1 7 ( 8 - a g a d e + h i s + a a r 8 + g m p r c d 。) ，可在发酵液中积 累5 4g m 鸟苷。m o m o s e l l o 】等研究发现8 氮杂鸟嘌呤和8 氮杂黄嘌呤都抑制菌体的生长， 而这种抑制可以被鸟苷所解除，据此得到的抗这两种嘌呤类似物的突变株能够解除其对 g m p 合成途径的抑制，从而提高鸟苷的产量。k o m a t s u 1 l 】等根据同样的原理筛选了腺嘌 呤缺陷，抗8 氮杂黄嘌呤，g m p 还原酶阴性的突变株，并进一步筛选到核苷水解酶部 分缺失的g r 2 1 7 6 可积累鸟苷l o 3g l 。1 9 8 0 年发现对8 氮杂鸟嘌呤、半胱氨酸和6 一甲 基氨基嘌呤等多种化合物有抗性的枯草芽胞杆菌a j l1 3 1 5 可积累鸟苷1 6 3g l 。 ( 2 ) 国内研究概况 国内在二十世纪八十年代初期开展了鸟苷的研究工作，由于国内在研究鸟苷方面基 础工作不扎实，始终未能选育出优良的鸟苷生产菌种。 九十年代上海工微所从日本引进了鸟苷菌种，在此基础上进行了一些改良研究，菌 种摇瓶水平在1 0 0g l 左右。生产菌种及生产工艺转让给了广东肇庆星湖味精厂。工厂 在接受转让后单独完成了菌种的中试研究，并投入工业化生产。现在有产品出售，生产 水平2 0 0g l 。 华东理工大学张嗣良0 2 , 1 3 等开发的鸟苷发酵新工艺，不仅打破了日、韩等国对鸟苷 产品的垄断局面，而且将对整个发酵工业的技术进步产生重大影响。 汤生荣【1 4 l 等研究了分批补料对鸟苷发酵的影响，最终得率为1 5 6g l ，随后进行的 生产性试验中在2 5 0 0 0l 反应器中产苷1 1 0g m 。 1 2 4 微生物发酵法生产鸟苷的机理 选育优良的鸟苷产生菌是实现发酵法生产鸟苷的前提，在鸟苷发酵的建立和改进中 起着非常重要的作用。在鸟苷生产菌的选育方面，一般都利用磷酸单酯酶活力很强的枯 草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 或短小芽胞杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) 作为诱变出发菌株比 较合适，采用物理或化学诱变方法，选育出产苷水平较高的生产菌株。 枯草芽孢杆菌的嘌呤核苷酸合成途径1 1 5 , 1 6 是从p r p p 经i m p 然后分为2 条环形途 径，加之此菌自身5 一核苷酸酶活力强，因此常被用来嘌呤核苷的合成。对枯草芽胞杆菌 5 江南大学硕士学位论文 的研究结果表明，在g m p 生物合成中专一性酶( i m p 脱氢酶) 仅受g m p 系物质的反 馈阻遏，与a m p 、g m p 合成共用的i m p 生物合成有关的酶( i m p 转甲酰酶，s a m p 裂 解酶，p i 冲p 转酰胺酶) 受a m p 系及g m p 系任一物质的反馈阻遏。嘌呤核苷酸生物合 成途径中的关键酶有p r p p 转酰胺酶、i m p 脱氢酶和s a m p 合成酶。其中p r p p 转酰胺 酶特异性地受a m p 、a d p 完全反馈抑制，但受i m p 、g m p 、a t p 的抑制很弱，受g m p 的最大抑制度为6 0 左右。肌苷酸脱氢酶受g m p 的反馈抑制最强( 5 8 ) ，其次为 a t p ( 5 0 ) 、x m p ( 3 9 ) 、g t p ( 2 6 ) 。综合这些结果，枯草芽胞杆菌中嘌呤核 苷酸生物合成的调节机制如图1 5 所示。在g m p 的生物合成中，i m p 脱氢酶受g m p 的反馈抑制，i m p 生物合成系的酶和g m p 生物合成系的酶受g m p 反馈阻遏。从i m p 合成a m p 、g m p ，倾向于优先合成g m p t 引。 合成途径 - 优先合成 一反馈抑制 反馈阻遏 图1 5 枯草芽孢杆菌中嘌呤核苷酸生物合成的代谢调节机制 f i g 1 5t h em e t a b o l i cm e c h a n i s mo ft h eb i o s y n t h e s i so fp u r i n en u c l e o t i d ei nb a c i l l u ss u b t i l i s 运用核酸代谢调控理论，采用诱变育种的方法，有目的的阻断或回复微生物代谢过 程中的某些关键酶，逐步有序的获得多种营养缺陷型突变株和抗性突变株，使得这些突 变株的核酸代谢流向积累鸟苷的方向【17 1 。如图1 - 6 所示： 6 第一章绪论 q i n , 匕= = ： 设竣加强的代澍缀 1 s 设法瞰断成减弱的代搿城 图1 - 6 鸟苷的生物合成 f i g 1 - 6b i o s y n t h e s i so f g u a n o s i n e 1 3 本论文的选题依据 1 3 1 市场分析 目前我国年产抗病毒药物三氮唑核苷5 0 0 吨，无环鸟苷2 0 0 吨。三氮唑核苷用肌苷 为原料，约2 公斤肌苷合成l 公斤三氮唑核苷；无环鸟苷用化学合成的鸟嘌呤为原料。 1 公斤鸟嘌呤合成1 公斤无环鸟苷。3 0 0 吨鸟苷可以同时合成1 5 0 吨三氮唑核苷和3 0 0 吨无环鸟苷。目前用鸟苷为原料合成三氮唑核苷成本虽然略高于用肌苷作为原料的生产 工艺，但是合成无环鸟苷的主要原料鸟嘌呤是用化学合成的方法得到的，鸟嘌呤合成成 本为每吨1 l 万元【1 8 】。用鸟苷同时合成三氮唑核苷和无环鸟苷两种抗病毒药物，生产总 成本低于用肌苷作为原料的生产方法，并且在生产过程中无废物产生，同时替代了化学 合成鸟嘌呤的生产工艺，减少了环境污染，因此鸟苷市场前景广阔。 与合成药物原料相比，鸟苷在食品工业上的应用前途更为广宽。鸟苷是合成呈味核 苷酸鸟苷酸二钠的主要原料，其呈味能力是味精的1 6 0 倍。鸟苷酸二钠( g m p ) 与肌苷 酸二钠( i m p ) 以l ：1 混合后简称为i + g 。i + g 以一定量比例添加到味精中就是特鲜味 精。若味精中添加2 i + g ，其鲜味增加4 倍；添加8 i 十g ，鲜味增加7 倍。目前我 国味精年产1 1 0 万吨，如有5 0 的味精( 即5 5 万吨) ，若以2 比例的i + g 添加到味精 中，i + g 的年需求量为1 1 万吨，消耗鸟苷4 2 3 0 吨。鸟苷发酵生产前景是广阔的。 1 3 2 已有的工作基础 江苏省微生物研究所核苷类药物研究室成立于19 8 2 年，主要从事核苷酸领域的研究 工作，多年来经过不断的深入研究，研制成功了生产腺苷、肌苷、核糖、乳清酸等一系 7 p 扇 土一9专一b 江南大学硕士学位论文 列核苷类物质的产生菌，获得多项科技进步奖和国家专利，现正着眼于研究鸟苷和胞苷。 鸟苷产生菌j s i m g 5 1 8 是以肌苷产生菌j s i m 1 0 1 9 为亲株，运用核酸代谢调控理论，有目 的地阻断或回复微生物核酸代谢过程中某些关键酶，最终选育出一株缺失s a m p 合成酶、 g m p 还原酶、a m p 脱氨酶活性，并对蛋氨酸亚砜具有抗性的突变株。该突变株核酸代 谢流向积累鸟苷的方向，完全丧失了积累肌苷的能力，只产鸟苷。 1 4 本论文的研究内容 在已经具有的鸟苷菌株和工艺技术基础上，进一步选育菌种，提高产鸟苷能力，完 善生产工艺【1 9 。2 1 】，提高后提取收率，降低生产成本，并推广使用，必将产生巨大的经济 效益。所以本论文的研究目标是：采用原生质体诱变法，对出发菌株鸟苷产生菌 j s i m g 5 1 8 进行遗传诱变育种，对诱变获得的鸟苷菌株进行发酵条件的优化研究，以进 一步提高产量。主要研究内容包括： ( 1 ) 原生质体诱变选育鸟苷高产菌株的研究 通过实验详细研究了酶浓度和温度对b a c i l l u ss u b t i l i sj s i m g 5 1 8 原生质体制备和再 生的影响。通过对b a c i l l u ss u b t i l i sj s i m g 5 1 8 原生质体进行紫外诱变遗传育种，获得核 苷水解酶缺失并具有多种抗药性的高产菌株。 ( 2 ) 发酵条件优化研究 采用统计学方法对经过上述诱变筛选获得的鸟苷高产菌株进行发酵条件优化研究， 以进一步提高鸟苷发酵产量。即通过单因素实验、响应面实验，优化培养基配方和发酵 条件。 ( 3 ) 鸟苷补料分批发酵和调控的初步研究 研究谷氨酸钠不同流加方式对鸟苷发酵产量的影响；研究在发酵3 0h 时流；0 n - - 嗯烷 对鸟苷发酵产量的影响。 8 第二章鸟苷高产菌株的诱变筛选 第二章鸟苷高产菌株的诱变筛选 2 1 引言 鸟苷作为多用途的核苷，是抗病毒药物三氮唑核苷、无环鸟苷和食品增鲜n 5 - 鸟苷 酸的合成原料，在食品和医药工业中起着不可估量的作用【捌。早在二十世纪六十年代日 本就大规模开展了发酵法生产鸟苷的研究，并取得了一系列成就，进入了工业化生产规 模；而我国对鸟嘌呤系化合物的研究始于2 0 世纪8 0 年代。随着越来越多的企业进入生产 三氮唑核苷、无环鸟苷和5 ，鸟苷酸的行列，国内鸟苷市场需求量激增n 8 , 2 3 , 2 4 。发酵法生 产鸟苷的研究也得到更广泛的重视。本文所用的出发菌株是本实验室经紫外线诱变和化 学诱变处理获得的突变株，如果再重复使用常规诱变法来提高菌株的产苷能力，将会受 到较大的限制。七十年代以来，原生质体技术迅速发展，已成为工业微生物菌种选育的 一种重要手段，并取得了很大的成效1 2 5 1 。对原生质体直接进行诱变处理，较一般常规诱 变方法效果好，且能在较短时间内较大幅度地提高菌种的变异率。利用原生质体技术选 育鸟苷高产菌，国内还少有研究。 通过分析枯草芽孢杆菌的嘌呤生物合成途径及其代谢调控机制闭可知，鸟苷在核苷 水解酶的作用下进一步代谢成为鸟嘌呤，致使鸟苷的产量降低。为了阻断发酵过程中所 积累的鸟苷分解成鸟嘌呤，从而使得代谢产物单一，提高鸟苷的产量，利于发酵产物鸟 苷的分离，所以选育完全缺失或部分缺失核苷水解酶活性的突变菌株，在鸟苷发酵生产 上是非常有意义的。本章以一株鸟苷生产菌为出发菌株，采用原生质体紫外诱变方法， 获得缺失核苷水解酶的突变菌株，同时为了更好的解除终产物对代谢过程的抑制和阻 遏，还增加了磺胺胍，狭霉素c 等抗性，得到的突变株用于鸟苷的生产，其产量远高于 出发菌株。 2 2 实验材料 2 2 1 出发菌株 b a c i l l u ss u b t i l i sj s i m g 5 1 8 菌株的遗传标记为：腺嘌呤、组氨酸、硫氨素营养缺陷 型、腺苷酸脱氨酶阴性、鸟苷酸还原酶阴性、蛋氨酸亚砜抗性( 缩写：a d e 。、h i s 。、t h i 、 d e a m 。、g m p 佗出、m s o 。) 。b a c i l l u ss u b t i l i sj s i m g 5 1 8 突变菌株发酵产物为鸟苷，完全 丧失了积累肌苷的能力。 2 2 2 培养基 ( 1 ) 斜面培养基( ) 蛋白胨1 0 ；酵母膏1 0 ；葡萄糖0 5 ；氯化钠0 5 ；谷氨酸钠0 5 ；琼脂2 0 ；p h7 0 。 ( 2 ) 基本培养基( ) 葡萄糖0 5 ；柠檬酸钠0 1 ；( n h 4 ) 2 s 0 40 2 ；k h 2 p 0 4o 6 ；k 2 h p 0 41 4 ：m g s 0 40 0 2 ； m n s 0 40 0 0 1 ；f e s 0 40 0 0 1 ；腺嘌呤5 0l , t g m l ；组氨酸5 0i t g m l ；v b l5 0g g m l , ：琼脂 9 江南大学硕士学位论文 2 0 ；p h7 2 0 ( 3 ) 再生基本补充培养基( ) 1 2 7 】 葡萄糖o 5 ；柠檬酸钠o 1 ；( n h 4 ) 2 s 0 4o 2 ：k h 2 p 0 4 0 6 ；k 2 h p 0 41 4 ；m g s 0 40 0 2 ； m n s 0 40 0 0 1 ；f e s 0 40 0 0 1 ；腺嘌呤5 0l a g m l ：蔗糖o 5m o l l ；组氨酸5 0 鹏肺l ；v b i 5 0 p 酌：l l l ；琼脂2 0 ；p h7 o 7 2 。 ( 4 ) 高渗完全培养基( ) 2 s 1 蛋白胨1 0 ；酵母膏1 0 ：葡萄糖o 5 ；氯化钠o 5 ；谷氨酸钠o 5 ；蔗糖0 5m o l l ： m g c l 22 0m m o l l ；顺丁烯二酸2 0m m o l l ：琼脂2 0 ；p h7 0 。 ( 5 ) 无糖基本培养基( ) ( n i - h h s 0 40 2 ；k h 2 p 0 40 6 ；k 2 h p 0 41 4 ；m g s 0 40 0 2 ：m n s 0 40 0 0 1 ；f e s 0 4o 0 0 1 ； 腺嘌呤5 0p 咖l ；谷氨酸钠o 1 ；鸟苷1 0m g m l ；组氨酸5 0i x g m l ；v b l5 0g g m l ：琼 脂2 o ；p h7 2 。 ( 6 ) 抗性培养基( ) 抗性药物+ 基本培养基。 ( 7 ) 种子培养基( ) 葡萄糖2 0 ；酵母膏1 0 ；蛋白胨1 0 ；玉米浆1 0 ；尿素o 2 ；氯化钠0 2 5 ；谷氨酸 钠o 5 ；p h7 o 7 2 。 在5 0 0m l 三角瓶中装3 0m l 种子液，1 2 0 灭菌1 5m i n 。 ( 8 ) 发酵培养基( ) 葡萄糖1 0 o ；酵母粉1 6 ；( n i - 1 4 ) 2 s 0 41 5 ；m g s 0 4o 4 ；k h 2 p 0 40 2 ；谷氨酸钠1 o ； c a c l 20 2 ；豆饼水解液3 3m l d l ；玉米浆1 7m l d l ：c a c 0 32 o ；p h7 0 - 7 2 。 在5 0 0m l 三角瓶中装2 5m l 种子液，1 2 0 灭菌1 0m i n 。 2 2 3 主要试剂 ( 1 ) 0 1m o l lp h6 0 磷酸缓冲液 ( 2 ) 高渗缓冲液 于o 1m o f lp h6 0 磷酸缓冲液中加入0 5m o l l 蔗糖。 ( 3 ) 原生质体稳定液( s m m 缓冲液) 1 2 9 1 0 5m o l l 蔗糖，2 0m m o l lm g c l 2 ，2 0m m o l l 顺丁烯二酸，p h6 5 。 ( 4 ) 酶试剂的配制 称取所需浓度的溶菌酶，用s m m 溶液配制，过滤除菌备用。 2 2 4 主要仪器 y x qs g 4 12 8 0 c 高压蒸汽灭菌锅 t d l 一4 0 b 离心机 p c - 1 0 0 离心机 超净工作台 d k - s 2 4 型电热恒温水浴锅 1 0 无锡市第二医疗器械有限公司 上海安亭科学仪器厂 德国西格玛公司 无锡空气净化设备厂 上海精宏实验设备有限公司 第二章鸟苷高产菌株的诱变筛选 3 0 3 2 电热恒温培养箱江苏省东台县电器厂 d y 弘6 c 型电泳仪北京市六一仪器厂 往复式摇床江苏太仓市实验设备厂 7 5 1 g 紫外可见光分光光度计上海天普分析仪器有限公司 7 2 2 n 可见光分光光度计上海精密科学仪器有限公司 2 3 实验方法 2 3 1 种子生长曲线的测定 取新鲜活化斜面菌种一支，接一环菌种至装有3 0m l 种子培养基的5 0 0m l 三角瓶 中，8 层纱布封口，置于往复式摇床上3 6 振荡培养，每隔一定时间取样，稀释后用7 2 2 n 分光光度计在6 6 0n m 处测定o d 值。 2 3 2 最小抑制浓度的选择 配制含不同浓度药物的平板，将出发菌株的菌悬液稀释到合适的浓度后涂布于药物 平板。将涂菌平板置于培养箱内培养3d ，选择完全抑制鸟苷产生菌生长的最小药物浓 度。 2 3 3 原生质体的制备 ( 1 ) 培养鸟苷产生菌【3 0 3 4 】 取菌株j s i m g 518 新鲜斜面分别接一环到装有3 0m l 液体完全培养基的三角瓶中，置 于往复式摇床上3 6 振荡培养1 2 h ，然后以5 的接种量接人3 0 m l 新鲜的完全培养基中， 3 6 振荡培养至对数生长期。 ( 2 ) 收集细胞 取菌液2 0m l ，4 0 0 0r p m 离心l om i n ，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心， 重复洗涤两次，将菌体悬浮于5m ls m m 中。 ( 3 ) 总菌数测定 取菌液o 5m l ，用生理盐水稀释，取1 0 、1 0 石、1 0 。7 稀释液各0 1m l ( 每稀释度做两 个平板) ，倾注完全培养基，3 2 c 培养2 4 - 4 8h 后计数，此为未经酶处理的总菌数。 ( 4 ) 脱壁 取悬浮于5m ls m m 中的菌悬液，加入溶菌酶溶液，混匀后于3 6 水浴保温处理3 0 - 4 0m i n ，然后4 0 0 0r p m 离心10m i n ，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质 体悬浮于5m l 高渗缓冲液中，立即进行剩余菌数的测定。 ( 5 ) 剩余菌数测定 取0 5m l 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取1 0 、1 0 d 、 1 0 4 稀释液各0 1m l ，涂布于完全培养基平板上，3 2 c 培养2 4 4 8h ，生长出的菌落应是 未被酶裂解的剩余细胞。 计算原生质体的形成率：原生质体形成率：丝1 0 0 江南大学硕士学位论文 2 3 4 原生质体