（森林保护学专业论文）三色革裥菌lenzetis+tricolor胞外漆酶纯化及性质研究.pdf

俑蛩 摘要 通过正交实验研究了碳源、氮源、木索类似物以及初始p h 值对三色革裥菌l e n z e t i s t r i c o l o r 产胞外漆酶的影响，并经不同碳源及氮源浓度的验证，得到最佳培养基为 ( 班) ：淀粉2 0 ，牛肉虽白胨2 0 ，n a 2 h p 0 4 1 2 t 2 00 4 7 ，k h z e 0 40 4 5 ，m g s 0 4 - 7 h 2 0 0 5 ，c a c ho 0 1 ，m n s 0 4 4 h 2 00 0 0 1 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 1 ，z n s 0 4 7 h 2 00 0 0 1 ， c u s o ( 5 h 2 00 0 0 1 ，愈创木酚0 0 6 2 及v b l5 0i x g ，高压灭菌后p h 约5 0 。在此基础上 检测了不同培养方式下漆酶活性、菌丝干重、残糖量及p h 值变化情况，确定最佳培养 方式为母液和发酵液均为静鬣培养。 对该菌产漆酶的粗酶采取两种方法纯化：方法一，( n m ) 2 s 0 4 盐析、透析、聚乙二 醇浓缩上s e p h a d e x g 1 5 0 凝胶柱( 1 6 x 6 0 ) 、收集有漆酶活性部分聚乙二醇浓缩上 e d a e - s e p h a d c x a 2 5 离子交换层析柱( 2 6 x 4 0 ) ：方法二，( n m ) 2 s 0 4 盐析、透析、超滤 浓缩、上d e a e - s e p h a r o s ef f 离子交换凝胶柱( 1 6 x 5 0 ) 、收集有漆酶活性部分聚乙二 醇浓缩上s e p h a d e x g - 7 5 凝胶柱( 1 6 x 5 0 ) 。第一种纯化方法最终纯化倍数达9 3 6 ，活力 回收率为8 6 。分析s e p h a d e x g 1 5 0 层析过程中2 8 0n m 吸收值、活力变化二者的关系 表明，分离本菌种产漆酶选用s e p h a d e x g 1 5 0 分子筛介质分离范围过大。第二种纯化方 法最终纯化倍数达1 8 5 4 ，活力回收率为3 7 1 7 。从e d a e s e p h a r o s ef f 离子交换层析 及s e p h a d e x g 7 5 分子筛层析过程中活力值与2 8 0l l m 吸收恤曲线重叠情况肴，分离此漆 酶选择e d a e s e p h a r o s ef f 与s e p h a d e x g 7 5 两种介质更合理。 对漆酶部分动力学特征进行测定：反应过程曲线表明该漆酶符合酶促反应动力学特 征。粗漆酶最适反应温度为加，而纯化漆酶较商为6 0 ；粗漆酶最近反应p h 值为 6 0 ，纯化漆酶为4 6 。金属离予对纯化漆酶活力的影响很大，当金属离子浓度为5 m m o l l 时，n a + 、b a 2 + 对漆酶活力无明显影响，f e 2 + 、f e 3 + 对漆酶是完全的抑制作用，而 c a “对漆酶有明显的促进作用。所测试浓度下的抑制剂乙二氨四乙酸和乙二氨四乙酸二 钠盐对漆酶有完全的促进作用，乙二氨四乙酸的浓度为1 0m m o l l 时促进作用最大，其 活力为对照组活力的9 7 8 倍；而硫脲、叠氮化钠和二硫苏糖醇在足够低的浓度下列漆酶 有一定的促进作用，在较高定浓度下对漆酶完全抑制。该酶氧化丁香醛连氮的米氏常数 k m 值为2 6 6 2p m o l l 。 关键词三色革裥菌；胞外漆酶；培养条件；纯化；性质测定 a b s t r a c t t h i sp a p e rr e s e a r c h e dt h ec h a r a c t e r so fc r u d ee x t r a c e l l u l a rl a c c a s ef r o ml e n z e t i st r i c o i n ， a tf i r s t w ed e s c r i b e dt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n tt os t u d yt h ee f f e c t so fc a r b o nr e s o u r c e ， n i t r o g e nr c s o u r c c ，l i g n i n l i k es u b s t a n c e sa n di n i t i a lp h v a l u eo nt h ep r o d u c t i o no fe x t r a c e l l u l a r l a c e a s eb yl e n z e t i st r i c o l o r t h e nw ev a l i d a t e dt h ee f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fc a r b o n r e s o u r c ea n dn i t f o g e nr e s o u r c eo i ll a c c a s ea c t i v i t y f i n a l l y , t h eo p t i m u mp r o d u c i n gl a c c a s e m e d i u mw a s ( g l ) ：s t a r c h2 0 ，b e e fp e p t o n e2 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 00 4 7 ，k h 2 p 0 40 4 5 ， m g s 0 4 7 h 2 00 5 ，c a c l 20 0 1 ，m n s 0 4 4 h 2 0o 0 0 1 ，f c s 0 4 7 h 2 00 0 0 1 ，z n s 0 4 。7 h 2 0 0 0 0 1 ，c u s 0 4 5 i - 1 2 00 0 0 1 ，g u a i a c o l0 0 6 2 ，v b i5 0i x ga n dp i t5 0 o nt h eb a s i so fa b o v e r e s u l t s ，w ei n v e s t i g a t e dt h ec h a n g eo ft h el a c c a s ea c t i v i t y , t h ed r yw e i g h to fm y c e l i u m ，t h e r e s i d u a ls u g a rc o n t e n ta n dt h ep hv a l u er e s p e c t i v e l yb yd i f f e r e n tc u l t i v a t i o nm e a n s w e o b t a i n e da l s ot h eb e s tc u l t i v a t i o nm e a n sw a ss e e da n df e r m e n t a t i o nl i q u i dw e r eg r o w nb ys t a t i c m e a n s t h el a c c a s ew a sp u r i f i e db yt w os e r i e so fm e t h o d s t h eo n es e tm e a n sw e r ec o m p o s e do f t h e s ea s p e c t sw h i c ha r e ( n i - 1 4 ) 2 5 0 4s a l t i n g o u t ，d i a l y z i n g , p o l y e t h y l e n eg l y c o l2 0 0 0 0 ( p e g 2 0 0 0 0 ) c o n c e n t r a t i n gt h e n ，s e p h a d e x g - 1 5 0g e lc h r o m a t o t o g r a p h y ( 1 6 x 6 0 ) a n de d a e - s e p h a d e x a 2 5i o ne x c h a n g ec h r o m a t o t o g r a p h y ( 2 6 x 4 0 ) w eo b t a i n e d t h a t p u r i f i c a t i o n m u l t i p l ew a s9 3 6 a n dt h e a c t i v i t yr e c l a m a t i o nr a t ew a s8 6 b yt h i sp u r i f i c a t i o nm e t h o d a n o t h e rg r o u pm e t h o di n c l u d e df o l l o w i n gp a r t sa l s o ，w h i c he m b o d y ( n h 4 ) 2 5 0 4s a l t i n g - o u t ， d i a l y z i n g ， u l t r a f i l t r a t i o n c o n c e n t r a t i n g t h e n d e a e - s e p h a r o s e f 1 7 i 曲 e x c h a n g e c h r o m a t o t o g r a p h y ( 1 6 x 5 0 ) a n dt h e ns e p h a d e x g 一7 5g e lc h r o m a t o t o g r a p h y ( 1 6 x 5 0 ) t h es e c o n dm e t h o dp r e s e n t e dt h er e s u l l st h a tp u r i f i c a t i o nm u l t i p l ew a s1 8 5 4a n dt h ea c t i v i t y r e c l a m a t i o nr a t ew a s3 7 1 7 t h es e c o n dp u r i f i c a t i o nm e t h o di sm o r es c i e n t i f i ct h a nt i l ef i r s t o n et oc o m p a r et h ec u r v eo f2 8 0n ma b s o r p t i o nv a l u ea n dl a c c a s ca v t i v i t yd u r i n gt h e c h r o m a t o t o g r a p h yc o u r s e t h er e a c t i o np r o c e s sc u r v es h o w e dt h a tt h i sl a c c a s ea c c o r dt h ed y n a m i c a lc h a r a c t e ro f e n z y m ec a t a l y t i cr e a c t i o n f o l l o w i n gp u r i f i c a t i o n ，w cm e n s u r a t e ds o m ed y n a m i c a lp a r a m e t e r o ft h i sl a c c a s ew i t h s y r i n g a l d a z i n e ( 3 , 5 d i m e t h o x y - 4 - h y d r o x y b e n z a l d e h y d e a z i n e ) s u b s t r a t e t h eo p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r eo fc r u d el a c c a s ei s4 0d e g r e e sa n dt h ep u r i f i e d l a c c a s ei s6 0d e g r e e s t h eo p t i m u mr e a c t i o np hv a l u eo fc r u d el a c c a s ei s 6 0 ，w h i l et h e p u r i f i e dl a c c a s ei s4 6 m e t a li o n h a sav e r yi m p o r t a n ti n f l u e n c eo v e rl a c c a s c t h i sp a p e r m a i n l yi n v o l v e dt h a ts o d i u ma n db a r i u mi o nh a v e1 1 0o b v i o u se f f e c t ，b i v a l e n ta n dt r i v a l e n c e i r o ni o nr e s t r a i ne n t i r e l yl a c c a s ea c t i v i t y , w h i l ec a l c i u mp r o m o t ee v i d e n t l yt h ee n z y m er e a c t i o n w i t h i nac e r t a i nc o n c e n t r a t i o nr a n go fi n h i b i t o r s ，t h et e s tr e s u l ti su n e x p e c t e d e d t aa n d e d t a n a 2a d v a n c e da b s o l u t e l yt h el a c c a s er e a c t i o n t h ea d v a n t a g e o u se f f e c ti st h es t r o n g e s t w h e nt h ec o n c e n t r a t eo fe d t ar e a c h e d1 0m m o l la n dt h ea c t i v i t yi s9 7 8t i m e si nc o n t r a s tt o c o n t r 0 1 t h i o u r e a s o d i u ma z i d ea n dd t th a v ed e f i n i t es t i m u l a t i v ef u n c t i o nj nt h es u f f i c i e n t l o wc o n c e n 打a t c ，h u tt h e yr e s t r a i nt h el a c c a s er e a c t i o nu n d e rt h e u p p e rc o n c e n t r a t e t h e m i c h a e l i sc o n s t a n ti s2 6 6 2 , m o l lt h a tt h i sl a c c a s eo x i d i z es y r i n g a l d a z i n e k e y w o r d s l e n z e t i s t r i c o l o r ；e x t r a c e l l u l a rl a c c a s e ；f e r m e n t a t i o n m e a n s ；p u r i f i c a t i o n ； c h a r a c t e r sm e n s u r a t i o n l 绪论 1 1 引言 1 绪论 漆酶( 1 a c c a s e ，e c i 1 0 3 2 ) 是一种发现较早的含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗 坏血酸氧化酶( e c i 1 0 3 3 ) 、哺乳动物血浆铜蓝蛋白酶( e c i i 0 3 i ) 同属铜蓝氧化酶 ( b l u ec o p p e ro x i d a s e ) 家族中的同一小族。早在1 8 8 3 年，日本学者吉田( y o s h i d a ) 从 漆树的分泌物中发现了一种蛋白质，它可使油漆迅速固定化【1 】，1 8 9 4 年b e r t r a n d 将这种 蛋白质命名为漆酶【2 】。真菌漆酶是在1 9 世纪9 0 年代被发现的，真菌漆酶最重要的生产 者是担子菌中的白腐菌。白腐菌是目前己知能够将木质素彻底降解为二氧化碳和水的唯 一生物，而且发现自然界中有少数几利白腐菌( w h i t e r o tf u n g i ) 能独立降解木素【3 l 。 目前国内对漆酶的研究主要集中在基础性研究方面。随着上世纪7 0 年代) ) 后聚丙 烯酰胺凝胶电泳和分子克隆等生物学技术的问世，漆酶的研究也掀开了新的一页，在分 子性质和功能研究方面，取得了巨大的进步。如，很多来源的漆酶得到了纯化并进行了 理化、生化性质研究；漆酶的分子遗传 4 j 基因表达f 5 j ，基因转录 6 l 及克隆f 7 j 等分子生物 学性质也已有了很深入的研究。 由于许多漆酶的氧化底物为环境污染物，具有降解木素，可与有毒的酚类物质作 用，具有使苯氧基类除草剂、石油工业废水去除毒性等作h j 。因此，漆酶在环境保护中 有很好的应用前景。由于对漆酶固定化和漆酶，介体系统的研究，使漆酶在造纸、饮料 加工、环保、痕量物质的分析、染料合成与降解、食品性质的改良和皮革工业等方面显 示了较高的应用价值。在国外，漆酶的生物制浆、纸浆漂白已经达到准商业化阶段i 8 1 。 漆酶具有广泛的应用价值，目前研究涉及的真菌菌种还很有限，已经纯化出来并对 其性质进行研究的真菌漆酶也为数不多。纯化分离检测技术手段的快速发展，将会有效 促进对漆酶分子结构的认识和漆酶特性的改善，为获得高效漆酶打下坚实的基础。本文 主要在探索漆酶的纯化方法方面展- 丌研究。 1 2 漆酶的理化性质 1 2 1 漆酶的来源 漆酶存在于自然界的多种植物和菌类分泌物中。按其来源主要分为漆树漆酶( r h u s l a c c a s e ) 和真菌漆酶( f u n g a ll a c c a s e ) 两大类。根据研究资料介绍，漆树、野漆树、 芒果等漆树科植物和桃树、苹果、银杏、牛蒡、毒常春滕、马铃薯等植物中富含漆酶； 在真菌中，漆酶广泛存在于担子菌( b a i d h n y c e t e s ) 的多孔菌( p o l y p o r u s )、子囊菌 ( a s o m y c e t e s ) 的脉孢菌( n e u r o s p o r a ) 和柄孢壳菌( p o d o s p o r a ) 及半知茵 ( d e u t e r o m y c o t i n a ) 的曲霉菌( a s p e r g i l l u s ) 等1 9 , 1 0 1 。g i v a u d a n 等还从稻根中分离出产生 漆酶的细菌- 生脂固氮螺菌( a z o s p i r i l l u ml i p o f e r u m ) 1 1 1 1 ，这足第个从细菌中发现的漆 尔北林业人学付州j 学位论文 酶。d i a m a n t i d i s 等( 2 0 0 0 ) 还从根际土壤的生脂固氮嫘苗( al i p o e r u m ) 中捉纯漆酶， 并测定和分! j i 了漆酶的特征【”1 。最近自f 良多报道表叫漆酶广泛存在：j = 细菌巾【1 3 4 ，在昆 虫体内也发现了漆酶的存在 1 7 , 1 8 1 ，甚至在一些动物肾脏和皿清。p 也陆续发现了漆酶 i o , 1 9 1 。但日前最主要的生产菌仍足一些- 人型真旧。 1 2 , 2 漆酶结构及催化机理 1 2 。2 1 漆酶的分子结构特征 除柄弛壳菌( p o d o s p o r a ) 漆酶是四聚体外，其他漆酶一般是山约5 0 0 5 5 0 个氨丛 酸单一多太组成的，有n 端分泌信号肽。序列分析表明，不刚来源的漆哺其氨基酸序列 相似性并不商，但在捌锕原子连接的1 个c y s 刺1 0 个t l i s 及) e 删山的氨丛酸残丛足保 守的，这些氨基酸都分m i 在含柑历划l t i s 的n 水端区域，或赴分“ r i - j 二c 术端的c y s _ = f i j 其余结合铜离子h i s 之问。真菌漆酶分予量在5 9 8 0k d 之间，等l u 点p i3 - 6 ，旨为糖 蛋白。山于漆酶的含糖量高，难以得到x 射线分析丌j 的漆酶单品，它的三维空间结构还 不很清楚。但可根据光谱、磁性和实验事实推测铜离子的配位结构。直到1 9 9 8 年研究 者才制备了第一个来自担子菌狄盖鬼伞( c o p r i n u sc b t e r e u s ) 的漆酶i i j ! i 体【2 0 】。最近，另 两种漆酶晶体也被解析山米了，一种足来自担子菌的彩绒革盖菌( t r a m e t e sv e r s i c o l o r ) 【2 1 】，另一利1 足来自予囊菌的m e l a n o c a r p u sa l b o m y c e s 2 引。通过已扶得九勺不同真菌漆慨的 结构与其它监色多铜氧化酶( 如执坏血酸氧化酶) 的结构比较，叫以詹：且他们在催化q - ，c a g , j 结构上足高度保守的【2 3 i 。通过刈漆酶蛋白质品体结构的研究，发现漆怖具有3 个钏 离子结合位点( t 1 ，t 2 ，t 3 ) ，兆结合4 个钢离子。根谢它们的氧化还原i u 势、光学脚磁 学特征划分为3 种类型：i 型c u “平 i i i 型c u 2 + 各一个，足单】u 予受体，里顺磁一k - ，州j + l 顺磁共振光谱( e s r ) 测定；l l i 型c “2 4 + 两个，是双 【= l 子受体，里反磁性，b s r 检测不 出来。l 型c u “呈蓝色，在6 1 41 1 1 1 3 , 处有特征吸收峰，能与包括水在内的溶剂作川；1 i 型c u “非监色，没订特征吸收光潜，足山砥分子的l 眯咄和一分予的水i 1 1 1 位形成松敞的扭 曲四面体几何构型：1 1 j 型c u 2 4 + 是偶合的离予刈( c u 2 + 一c u 2 + ) ，在3 3 0l i r a 处有宽的吸收 带，与三个纰氨酸分子和一个氢氧化物分予形成受阻四面体儿t u 构型，征f r 氧分予存诒： 时，这刈铜离子以氢氧化物为桥结合在一起，c u c u ，价仆广：生强烈n 勺反铁磁性，检测 不到e s r 光谱信号。这类二价复合物在3 3 0n m 处的吸收陡活性位点f l q 还原i n j 淌火i 巩 2 5 1 。 1 2 2 2 漆酶的底物专一性 漆哺在催化底物的氧化反应过榭中，以分子氧们：为il ! l 予受体，通过还原分子辑为 水，来氧化酚类化合物和芳香股等。该酶催化中心1 1 1 分：l 1 i 川j _ j 勺三型俐组成：i 型俐催 化电予传递、i i 型锕活化分予铽、l 儿型锕为 ! | 1 4 二聚体二l i 要i 牧收氧。一= ；! u 研究漆酶的催化 氰化反应足以二酚及芳香胺作为底物。随着硼f 究的深入，发眦漆瞬：订广泛的底物作用 范山，按底物结构可归纳为6 炎1 2 6 j ：酚及1 衍生物；劳股及j e 衍生物：羧酸及j 衍生 物：f “体激素年生物色素，如雌f ( 1 二醵、胆红索；金腻甜机化合物和其他二l # f l i ；) 类底物， 如二戍铁。 1 2 2 3 漆酶催化氧化作用 漆酶是单电子氧化还原酶，以0 2 作为电予受体催化多酚化物经4 次单电子传递形成 醌及自由基的含铜蛋白酶。它催化不同类型底物氧化反应机理主要表现在底物自由基中 间体的生成和漆酶分子中4 个铜离子的协同作用。 当漆酶催化酚类( 如氢醌) 氧化时，首先是底物氢醌向漆酶转移1 个电子，生成半 醌氧自由基中间体，用e s r 可观察到明显的氧自由基信号；其次足不均等非酶反应， 二分子半醌生成一分子对苯醌和一分子氢醌，氧自山基中间体还能转变成碳自山基中间 体，它们可以自身结合或相互偶联，产物中除醌外还有聚合物和c 0 、c c 偶联产物。 在0 2 存在下，还原态漆酶被氧化，0 2 被还原成水，通过4 个铜离予协同地传递电子和 价态变化实现对漆酶催化底物氧化和肘0 2 的还原【9 ，2 0 1 0 近年来由于对漆酶降解非酶底物污染物珂f 究的深入，人们5 1 ：始沙及漆酶介体的研 究。漆酶介质系统，即l m s ( l a c c a s em e d i a t o rs y s t e m ) 足指漆酶在介体和氧的存在下 进行生物催化的过程。介体在漆酶的作用下会形成活性高且有一定稳定性的f - | 间体，这 些活性中问体能从氧分子中获得电子传递给底物，从而使底物降解。日f j 报道的有效的 介体主要有a b t s 、h b t 、n h a 及n h a 的衍生物：n i t b 、n h t b 、n n p h 、b p h a 、 c m n h a 、c n h a 等1 2 7 埘l 。4 4 n , 日。r # j t 3 0 l 研究漆酶n h a 对苇浆残余木质素的作用，残余水 质素在反应后甲氧基、酚羟基减少，醇羟基和羰丛增多，木质索结构的苯环结构也发生 了开环反应。 1 2 3 漆酶活性检测方法 1 2 3 1 平板分析法 用这种方法可以快速检测j 也外培养r i ，是否含有漆酶，一般用于粗筛产湍酶菌种。刘 尚旭等以b a v e n d a m m 反应来检测漆酶f 3 ，主要足把白腐菌产生的漆脯与术素降解能力 联系起来。出于漆酶有广泛的底物作用范围，在b a v e n d a m m 反应的基础上发展了许多 检测漆酶的方法，其原理和方法上基本与b a v e n d a m m 法类似。如紫磊等报道的刚丁香 醛连氮法检测漆酶【3 2 】；朱显峰等利用漆酶与三种不同底物的颜色反应定性地检测1 1 利- 自腐菌是否产漆酶( 愈创木酚与漆酶反应显浅红色、联苯胺与漆酶反应显黄色、a 萘盼 与漆酶反应显紫色) ，其r | j 愈创_ 水酚和a 豢酚两种方法检测结果较为统一和珂e 确【3 3 j 。 一些底物由于自身的原因限制了与之秆i 关检测方法的广泛使用。如，愈创术酚反应 对木索氧化酶系专一性不强；联苯胺有一定的敛癌作f j ；a 萘酚对皮肤有刺激作用并对 环境不友好。赵敏博士【3 4 j 总结并改进了日i 人的丁香醛连氮法，一次检测了3 4 个菌利， 确定了1 3 个菌种有漆酶活性。其检测方法更肌i 简沽，更加实月j ，成本更低。 1 2 3 2 用分光光度计测定漆酶酶活 划苯二胺( k m a x 4 9 5n m ) 、愈创术酚( l m a x4 8 5n l n ) 、邻连l l i 苯胺( x m a x6 0 0 n m ) 、邻苯二酚( l m a x4 0 0n m ) 、永i 漆酚( m a x4 2 0h i l l ) 都呵用做漆酶括力测定的底 物。由于不同柬源( 植物，细菌，昆虫，真菌) 的漆脯与底物反应f 由亲和力足不一样 的，即使是同一来源的漆酶，反应的底物4 i 川，反应的亲和力也吖i 州；咐活测定办法t i i 所用的反应底物、反应条什以及酶活m 位f 门定义刘漆酶酶活的测定结粜也有j m 大的影 东北林q k 人学f ! i j1 ：学他沧义 l i _ 。所以在斗u 同的反应体系一| 、测定的活力位才具有l u 比性。 目1 ) f 常以2 ，2 连氮二( 3 乙丛苯井噻唑6 磺酸) ( 简称a b t s ) 为底物，洲定漆陆 氧化速度，但a b t s 价格昂贵；邻联甲苯胺水溶性不太好；以愈创术酚为底物时反应时 间长，反应非常稳定，但山于测得的酶活值很低，故近年来国内外较少采用；以丁香雌 连氮为底物时，酶活力虽然较i 笥，但当底物和酶液用量较火时反应不太稳定，若采取减 少底物和酶液用量的方法，可以较大程度地克服反应不易终止的缺陷。 1 2 3 3 通过检测酶与底物中间体来测定漆酶活性 在酶促反应中，分析过渡态的结构对酶促反应机理的研究极其重要。过渡态的几何 构型和电荷分布为酶底物相互作用提供基本信息。酶底物复合物的结构可通过快速反 应技术测定。在酶反应开始时产物生成量微少，而中问体生成的速率较快。若采用初始 速率法测定中间体的浓度，可间接测定漆酶活性，火火捉- 茴方法灵敏度。用微量热法测 定漆酶的活性，样品用量少，并且对酶的懋浮液体也能测定，适宜研究酶促反应【3 5 1 。黄 应平等【3 6 】利用反相胶束介质。l j 漆酶氧化邻苯二胺( o p d a ) 反应中间体动态吸收光谱来 测定漆酶活性。该方法山于在反相胶束介质t i j 采用初始迎率法进行测定，具有较高的灵 敏皮年u 选择性。 1 3 漆酶纯化及性质研究 1 3 1 漆酶纯化 漆酶的本质是一种蛋白质，所以漆酶的纯化方法与蛋白纯化方法人体一致。大多采 用硫酸铵盐析、超滤浓缩、分子筛、离子交换层析等几个纯化步骤。划真菌漆酶的研究 还涉及如何优化产酶条件、提高漆酶的稳定性、研究漆酶特性等方1 ： i j 的l 勾容。丁少军等 吲研究了云芝0 0 9 菌株漆酶的培养和分离纯化，采州的培养丛为d o d s o n 低碳培养丛， 起始口h 为3 5 ，添加了一定量的藜芦醇作为诱导剂。经过超滤、d e a e 纤维索柱利 s e p h a d e x g 1 0 0 分离纯化，发现云芝0 0 9 菌株漆酶山组分a 和b 组成，其中b 纰分占总 酶活的8 5 以上。吴圳j 等【3 8 】 技道杂色云芝( c o r i o l u sv e r s i c o l o ，) 发酵液，仪经超滤、 d e a e s e p h a d e xa 2 5 柱层析两步分离，纯化出两型漆酶，且可以达到f 匕泳纯，但j 卫l 收率 很低。 1 3 2 漆酶动力学特性 不同来源的漆酶性质有i ! j 显箍别，其最通酶解温度，p h 值和金属离子划漆酶的影 响都有明显的差异。王宜磊1 3 9 1 报道彩绒革盏菌( c o r i o l u sv e r s i c o l o r ) 和多孔茵 ( p o l y p o r u s w 3 ) 漆酶最适酶解温度为2 5 ，毛栓茵( t r a m e t e st r o g i i ) 为3 0 ：彩绒 革盖菌( cv e r s i c o l o r ) 漆酶最适酶解p h 值为4 5 ，多孔佑( p o l y p o r u s w 3 ) 为4 2 ，毛 栓菌( zt r o g i i ) 为4 0 ；k + 、z n ”对彩绒革盖茵( cv e r s i c o l o r ) 所产漆酶有激活作 用，k + 、z n “、c u 2 + 刑毛栓茵( zt r o g i i ) 所产漆酶有激活作用，m n “、m 矿+ 刈多孔诸 ( p o l y p o r u s w 3 ) 所产漆酶毕r 激活作用，a g + 、f c “划_ = i 种f j 所产漆胁均有j 川盟抑制作 l 绪论 用。这说明来自不同真菌菌株的漆酶其组成和性质有i i = l 火差别， 根据不同的用途和应用环境条件选择来源合适的漆酶。 漆酶的抑制剂大多是铜离子螯合剂，有卤化物、半胱氨酸、 强度不同对漆酶的活力影响也不同【1 9 】。 1 4 漆酶的工业应用 1 4 1 造纸工业 敞在j ji ：发利川漆酶时应 e d t a 和s d s 等，离予 1 4 1 1 木素降解 漆酶在植物体内，它主要是催化木质素的聚合过科，使木质素沉积，1 蛳真菌产生的 漆酶则进行相反的过程，使木质索发生降解。从漆酶与各种酚类化合物，尤其是丁香醛 型化合物的反应中可以肯定其在木索降解q 1 起一定作用。hl 订认为，漆酶划小索的反应 机理主要是通过单电子转移，生成自由基，然后自由基进一步发生歧化、偶合等非酶反 应，使得木素发生降解或聚合。木质索i i 主要易受漆酶攻击的特征功能基是苯环上的盼 羟基和甲氧基，尤其是甲氧基，特别容易受漆酶的攻击。 有人指出，只有在漆酶和木索过氧化酶的协同作j i j 下，木质索的降解才明显。有报 道【柏】确定l a c c a s e 和m n p 单独存在都不能很好的降解木质索，而两种酶同时存在，木 质素却能得到很好的降解，表明两种酶具有协司作川。小质索的，上物降解牵沙到胞外大 分子氧化降解和胞内小分子分解代谢反应，各种酶系具体如何分j ：协作降解小质索，尚 不清楚。 1 4 1 2 纸浆的生物漂白 纸浆中的色素物质主要来自木素的芳香化合物，故木聚糖酶仅起助漂作用，不能真 正替代化学漂剂。1 9 9 4 年，一项称之为l i g n o z y m 或l m s 生物漂白的专利技术问世 1 4 1 1 ，使漆酶在纸浆生物漂白和提高纸浆漂白质量等方显示了诱人的i j 口景。 l e v l i n 等【4 2 j 研究了桦木硫酸盐浆的l m s 漂白，并采川热解和g c m s 分析残余木崇 结构。结果表明，漆酶h b t 系统能有效地脱除桦木硫酸盐浆和经氧脱术素的桦木硫酸 盐浆中的术素，在适中的条件下，脱木素率接近6 0 。研究表i ! j j l 4 ”，漆酶介体系统能 有效地对浆进行脱木质索作用，但是刈浆的白度有损害；副反应强烈地抑制漆酶介体 系统对木质素的脱除，碱抽提u 以有效地解决上述两个u j 题。另外，用木聚糖酶对浆进 行预处理能显著地提高漆酶介1 木系统的脱术质索效率l “1 。 1 4 2 染料脱色 合成染料常被设计成防水、抗光j 姒、抗氧化的生物难降解化含物从嘶使废水处理难 度加大。在活性污泥处理中很难得到有效处理，有时降解后染料毒性反而增强；分离得 到的可降解染料的细菌通常对染料结构有高度的专一性，刑+ 结构多样- e _ 4 f f , j 染料废水望尘 莫及。近年来发现漆酶与木质素降解酶系统t 1 过氧化物酶川比，义具有亚大的潜在应刚 价值i 矧。 东北林业大学硬l ：学位论义 怂醌类染料是漆酶的底物，叮以被漆酶直接氧化，脱色和降解程度与酶活呈正比 l 。偶氮类和靛青类染料不是漆酶底物，在染料和酶分子之间需要小分予介体( 如 a b t s 、h b t 等) ，因此这类染料的脱色率取决于介体的浓度，而不足漆酶酶活。科研 人员设想象蒽醌类染料这样的漆酶底物也应叫以抛商? 帅缸底物类染料垮解，实验证l 叫 了这一推论1 “1 。 漆酶在染料降解方面的应刚主要采刚其固定化形式。一株真菌s m 7 7 删藻脘酸钠刚 定，研究表l ! j = 1s m 7 7 对o r a n g eg 的脱色主要出漆酶完成。脱色能力随d h 的增加而增 加，1 6h 内脱色率达9 6 1 4 7 1 。有报道1 4 8 j 说将彩绒革盖菌( zv e r s i c o l o r ) 漆酶共价固 定，酶活力儿乎没损失，对纺织活性染料的降解效果很好，短时间的光化学预处理效果 更好。 1 4 。3 去毒作用 工业“三废”、化学农药分解时往往含有有毒的酚或芳胺，将他们用固定化漆酶处 理，生成醌或聚合物后分离除去而起到解毒的作用。b o l l a g 等1 4 训用固定化漆酶处理纸厂 废水，有效地除去甲基酚；以硅藻土等为载体固定化漆酶催化农药分解成2 ，4 二氯酚， 氧化生成不溶性的低聚物除去。 氯酚类有机化合物及其衍生物，划环境和人类健康造成，“巫危害。一般认为，在氧 存在下，漆酶氧化聚合氯酚类物质，通过降低这些有礴物质的溶解度从而减少其毒性。 其中包括氯酚、q l 基酚和甲氧丛酚等。 1 4 4 饮料加工 漆酶足饮料加： 中常见的酶之一，土要用于饮料的澄 占与色洋控制。在饮料加： 过 程中利用漆酶可以氧化酚类物质，使其聚合。既可以使果汁在加工过程中快速澄清，又 解决了果汁长时间储存所产_ i 的后浑浊问题。而l l 刁i 川p v p p ( 聚乙烯吡咯烷酮) 、活性 碳及吸附削处理，污染问题少。d es t e f a n o ( 1 9 9 6 ) = i | j 逝，成功地将彩绒! i ! m 圆 ( p o l y p o r u sv e r s i c o l o r ) 漆酶吸附在琼脂粘凝胶4 b e p i i d a c u “上，采用该法幽定化吸 附率高，稳定性好，对环境适应能力强，l ：且城体可以l 丑l 收利刚。 1 4 5 生物检测 生物i u 极是以固定化生物体作为分子以别元件的敏感材料，与氧r u 极、脱r i 极年燃 料r b 极等构成生物传感器，将被测物的浓i ! = 与可测量的i u 信号关联起米。在发配工业、 环境监测、食品监测、临床医学等方f 甜到j 泛的应删。将漆酶吸i ；j 铂：碳上制成必定化 酶 乜极，能有效催化负极氧化还原，叫* j f 确测量浓度z 1 12 0 x l f f 5 7 0 1 0 4m o l l 范的 多酚、多胺越苯等底物1 5 0 l 。嘛法免疫分析( e t a ) 足利川标记酶与各种性质眦体( 如抗 原，抗体，蛋白质a 等) 的札i 互结合。j f j 漆酶作标记酶，其抗原一沫峰的接合灵敏度 有很大捉商同时对培养越r i i 变价金属离二j 二的含量具有亚r 盔的敏感性。 1 5 研究展望 1 5 1 采用定向固定化技术 漆酶在造纸、食品、染料及废水处理等工业领域有着广阔的应_ 碍 l 前景，因此漆酶作 为一种具有潜在应用价值的酶越来越受到人们的关注。但漆酶本身的一些蛋白特性，如 不能重复利用，对变性剂、不利因素及毒理作用的高度敏感性，都抑制了漆酶的有效使 用。固定化酶较游离酶在催化性能上有更多的优势。近年来，国际上对真菌漆酶的固定 化进行了较深入研究1 5 1 矧；国内在这方面的研究是在近几年爿开展起来的【5 3 巧5 1 。 由于酶蛋白多点附着在载体上，引起了固定化酶蛋白结构变形的增加，酶固定化以 后活性部分失去，甚至全部失去。为解决这个问题，可。考虑采用酶自，j 定向固定化技术。 1 5 2 寻找廉价高效、应用面广的介体 漆酶的氧化还原电势比较低，为3 0 0 8 0 0 m v ( 对标准氢电极) ，只能氧化酚型化 物。它需要一些低氧化还原势的化合物作为介体( m e d i a t o r ) ，介体在酶的作用下会形成 活性高且有一定稳定性的中间体，使得反应的速度加快，效率提高，氧化底物范围可进 一步扩大。但由于介体价格比较昂贵，这项技术的工业化难以推广。 1 5 3 提高漆酶耐热、耐酸碱特性 漆酶在制浆、造纸、废水处理中的应用技术成本较低，对反应条件、反应设备的要 求不象微生物处理那样苛刻。但大多数漆酶是在很窄的p h 范幽内( p h 3 豇6 5 ) 起脱水 素作用的，对高温不稳定。 1 6 本课题的来源及主要研究内容 1 6 1 课题来源 国家自然科学基金资助项目( 3 0 1 7 0 7 7 5 ) 。 1 6 2 论文研究内容 本论文主要涉及大型真菌三色革裥菌( l e n z i t e st r i c o l o r ) 胞外漆酶生物化学研究。 具体包括以下几方面内容： ( 1 ) 培养条件的优化： ( 2 ) 纯化方法研究； ( 3 ) 漆酶性质测定。 2 1 材料与方法 2 1 1 菌种 2 培养条件优化 三色革裥菌( l e n z i t e st r i c o l o r ) ，采自东北林业大学凉水国家自然保护区，山潘学仁 教授鉴定，保存于东北林业大学微生物及免疫学实验室。 三色革裥菌( l t r i c o l o r ) 在分类地位上届于担子茵亚门层菌纲多孔凶科革裥菌属。 2 1 2 药品 丁香醛迮氮( s y r i n g a l d a z i n e ) 、愈创木酚( g u a i a c 0 1 ) 、d l - i j 一苯丙氨酸( d l - b p h e n y l a l a n i n e ) 、香兰素( v a l l i l i n ) 为s i g m a 公司产品；其他试剂均为田产分析纯或园产 生化试剂。 2 1 3 仪器 高压湿热灭菌锅 d g x 一9 2 4 3 b 1f 乜热鼓风干燥箱 b c n 1 3 6 0 b 生物洁净工作台 h h b i i 电热恒温培养箱 t d l - 5 型低速台式大容量离心机 u v - 2 0 0 0 紫外可见光分光光度汁 电子恒温水浴锅 2 1 4 培养基 f i 木三洋公司 上海奇i i ；玛实验设备有| i 艮公司 哈尔滨7 1 i r ；联r | = l 予技术开发有限公司 上海跃进医疗器械厂 上海安亭科学仪器厂 尤尼柯( 上海) 仪器有胀公司 天津市泰斯特仪器有限公司 ( 1 ) 3 f 板活化培养基( l ) ：葡萄糖2 0 ，k h 2 p 0 43 ，m g s 0 4 7 h 2 01 5 ，马铃薯 2 0 0 t 琼脂1 5 ，v b l 微量，p h 自然。 ( 2 ) 液体产酶培养基( g l ) ：葡麴挑1 0 ，天门冬酰胺2 0 ，n a 2 h p 0 4 - 1 2 h 2 0o 4 7 ， k h 2 p 0 40 4 5 ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 ，c a c l 20 0 1 ，m n s 0 4 4 h 2 00 0 0 1 ，f c s 0 4 7 h 2 00 0 0 1 ， z n s 0 4 7 h 2 0