（植物病理学专业论文）木霉菌制剂防治甜瓜枯萎病机理的研究.pdf

沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 甜瓜枯萎病是生产上危害十分严重的土传病害，给农民带来巨大的损失。 为此本文系统研究了由t 2 3 菌株为主要成份制备的木霉菌制剂对甜瓜枯蒗病 的防治效果及其防病机制，同时分析了田间常用杀菌剂及微量元素对木霉菌 在甜瓜根际定殖的影响，及旌用木霉菌制剂后甜瓜根际微生态的变化。明确 了木霉菌制剂防治甜瓜枯萎病的机制与木霉菌y a 2 2 和t 2 3 菌株的竞争、重寄 生和诱导抗性作用及微量元素的促乍和诱导抗性作用有关，为生防制剂的田 间大面积应用奠定了理论基础。 木霉菌可有效防治甜瓜苗期枯萎病的发乍。研究发现小霉菌t a 2 2 和t 2 3 生长速度极快，能迅速覆盖病原菌菌落，对枯萎病菌拮抗系数较高。利用木 霉菌t a 2 2 和t 2 3 复合处理防治甜瓜枯萎病的相对防效达到7 9 0 0 ，主要是 选择了木霉菌剂的最佳使用方法及最适使用量，为木霉菌生存及定殖提供理 想的环境条件，进而使其在与病菌竞争中处于优势地位。本研究汪实通过穴 旌和灌根相结合的方法施用木霉菌，对枯萎病可取得理想的防效。 木霉菌在接种病原菌条件下对宿主防御酶系有较强的刺激作用。先接种 木霉菌再挑战接种镰刀菌后，幼苗根部苯丙氨酸裂解酶( p a l ) 、过氧化物酶 ( p o d ) 、多酚氧化酶( p p o ) 和0 1 ，3 葡聚糖酶( b 。1 ，3 - g l u c a n a s e ) 活性 显著高于木霉菌或镰刀菌单独处理，且变化趋势基本相同。说明木霉菌和镰 刀菌复合处理有利于植物敏化，强化对防御酶系的诱导：先接种木霉菌再接 种镰刀菌可明显诱导甜瓜抗性的表达。 研究发现，百菌清、甲基托布津、福美霜、多菌灵和恶霉灵五种常嗣土 壤杀菌剂对木霉菌定殖有明显影响。在无菌土中，该五种常用杀菌剂低浓度 处理对木霉菌的定殖有促进作用，仅多菌灵与恶霉灵对木霉蔚的定殖表现出 一定的抑制作用。在自然土中，低浓度( 1 0 0 0 ) 的甲基托布津和恶霉灵处 理和中、低浓度的百菌清、福美霜处理的土壤中木霉菌数量明显高于对照。 多菌灵对木霉菌定殖的影响较大处理后甜瓜根际土壤中木霉菌的数量明显 低于对照处理，说明多菌灵对木霉菌的定殖有抑制作用。由此可见田间常用 的这五种杀菌剂在较低浓度下对木霉菌的定殖影响都较小，在定程度上能 促进木霉菌在田间自然土中的定殖。 微量元素影响术霉菌生长和在甜瓜根表的定殖。术霉菌在含有微量元素 摘蔑 的培养基( 除锌元素外) 上生长状态与不加入微量，二素的对照相比没有明显 差别，说明除锌元素外，其他微量元素对木霉菌的菌丝生长和产孢没有影响。 除锌外，其他微量元素能明显促进木霉菌在甜瓜根际的生长繁殖。这种促进 作用在接种初期表现的较差，随着时间的延长，木霉菌的数量逐渐增加，尤 其是硫酸锰和硫酸铜处理，平均分别高于对照1 5 1 】和7j ，0 8 。同时微量元 素能增加甜瓜根际微生物的数量。随着取样次数的增加，各微量元素处理的 甜瓜根际真菌、绌菌、放线菌数量明显增加。说明旄肥能显著增加根际土壤 的细菌、真菌和放线菌的数量。 用木霉菌与微量元素复合处理甜瓜后挑战接种镰刀菌，甜瓜根系苯丙氨 酸裂解酶( p a l ) 、过氧化物酶( p o d ) 、多酚氧化酶( p p o ) 和0 一i ，3 一葡聚糖 酶( p 1 3 - g l u c m l a s e ) 活性有不同程度升商，表明了在有病原菌存在的情 况下，木霉菌与微量元素复合处理能明显诱导甜瓜对枯萎病的抗性，这种诱 导作用在单独施用微量元素或单独接种木霉菌的情况下均不如两者复合处 理。 研究发现甜瓜根际微乍物数量动态变化与甜瓜的生长时期有关。开花座 果期和果实成熟期微生物数量较多，而果实膨大期根际真菌、细菌和放线菌 的数量明显低于其它时期。说明木霉菌制剂能明显改善甜瓜根际微生态环境。 通过本文的研究可以发现木霉菌制剂在室内岔栽试验中对甜瓜苗期枯萎 病的防效可达7 9 ，0 0 。该生防制剂具有多种生防机制，包括促生、竞争、重 寄生和诱导抗性。同时施用木霉菌剂后能明显改善甜瓜根际的微生态环境。 关键词：甜瓜枯萎病：木霉菌制荆；生防机制；诱导抗性；微量元紊 沈阳农业大学倾士学位论空 刖吾 甜瓜枯萎病是生产上危害严重的病害，近年来随着种植业结构的调整， 保护地和塑料大棚面积不断增加，瓜类枯萎病病原菌在土壤中的存活能力强， 使病原菌含量在土壤中不断积累，从向导致该病的发生门益严重，给农民带 来严重的损失，一般年份损失2 3 成，严重年份几乎绝收，成了瓜类生产卜 的癌症。 目前，防治甜瓜枯萎病的主要方法是嫁接防病和药剂灌根。嫁接防病费 工费时，又影响果实的品质；传统的化学农药灌根防治甜瓜枯萎病的方法不 但防治效果不是十分理想，而且会弓 起病菌产生抗药性变异，鼹高使用浓度 还会加重对环境的污染，据调奁有些地区仅针对甜瓜枯萎病- 个生长季每甫 平均用药量达5 k g 以上，一些地区达9 k g ，用药成本近5 0 0 元。近年来，随着 人们生态意识的不断提高，人们也越来越重视生活的质量，因此，绿色食品、 无公害防治的呼声也越来越强烈。人们丌始探索利用生物防治的方法解决病 害无公害防治问题。生物防治因而逐渐成为人们所关注的焦点、热点。 木霉菌是一类历史悠久的生防真菌，也是公认的很有前途的生防因子。 本霉菌以其资源丰富、特效期长、作用方式独特、对非靶生物安全及不污染 环境等优点而倍受重视。存国内外研究中，利用y r i c h o d e r m as p p 防治植物 病害特别是传病害的报道很多。利用木霉菌防治作物的猝倒病、立桔病、 灰霉病、纹枯瘸等都取得了良好的效果，其中本霉菌对作物枯萎病的防治也 有很多报道。美国和以色列等国已筛选出大量生防木霉菌菌株，开发、注册 的商品化生物农药，用以防治蔬菜苗期病害、蔬菜枯萎病、番茄灰霉病、茄 子和棉花黄萎瘸等病害，取得良好的防治效果。我国也_ ： i 继有离晶化的木霉 菌制剂问世，但针对其具体机理研究仍不是十一分系统，往往只局限于培养皿 内的对峙试验和简单的盆栽或田间防效测定。 微量元素不仅链使作物增产，而且能抑制某些病原菌、使植物抗病性增 强，同时促进植物对不良环境的抵抗力和怨耐能力。这已是被广泛接受的事 实，僵其与抗瘸的关系及其抗病机理在国内的报道较少。 因此，本文测定了术霉菌制剂在宅内及田间对甜瓜枯萎病的防治效果 同时砑究了常用杀菌剂及微量元素对木霉菌在甜瓜根际定殖的影响，并分别 前言 4 对木霉菌及微量元素对甜瓜的诱导抗性机理进行研究，进而分析了应用木霉 菌制剂后甜瓜根际微生态的变化。目的在丁系统阐明术霉菌制剂的主要生防 机理，为其田间大面积推广应用提供理论指导，并为对其进一步深入的研究 打下基础。 沈阳农业人学颈上学位论文 第一章瓜类枯萎病的生物防治及其机理 瓜类枯萎病概况 西瓜、甜瓜、黄瓜等瓜类的枯萎病是生产上危害严重的病害，近年来随 着种植业结构的调整，保护地和塑料大棚面积不断增加，瓜类枯萎病作为土 传病害，单的种植模式造成了瓜类枯萎病的发生逐年加重，几乎无法种植， 傲年份损失2 - 3 成，严重年份几乎绝收，成为瓜类生产上的癌症( 张元恩， 2 0 0 1 ) 。目前，对瓜类枯萎病的防治主要采用以嫁接防病为主的农业防治方 法，辅以化学防治。嫁接防病费工费时，又影响果实的品质；传统的化学农 药灌根防治甜瓜枯萎病的方法不但防治效果不是十分理想，而且会引起病菌 产生抗药性变异，提高使用浓度还会加重对环境的污染。近年来，随着人们 生态意识的不断提高，人们也越来越重视生活的质量，因此，绿色食品、无 公害防治的呼声也越来越强烈。生物防治也逐渐成为人们所关注的焦点、热 点。木霉菌作为一种已被广泛应用验证的生防菌，具有广泛的适用性，经过 大量的实验验证，是一种极有潜力的生防菌。虽然目前已有大量用木霉防治 瓜类枯萎病的报道，但针对其具体机理研究仍不多。为此，本文拟针对瓜类 枯萎病的防治现状以及木霉菌的生防机制作以综述： ( 一) 发生与危害 瓜类枯萎病( f u s a r i u mo x y s p o r u ms c h l f s pc u c u m e r i n u mo w e n ) 又称死 藤、死秧、蔓剖病、萎凋病，是一种世界性分布的土壤传播，根部侵入，在维 管束内寄生的系统侵染性病害，可危害西瓜、黄瓜和甜瓜、冬瓜、南瓜、瓠 瓜、葫芦等其他葫芦科属植物。其中黄瓜、西瓜上的为害较重，冬瓜、甜瓜 次之，南瓜甚少发病。1 8 9 4 年s m i t h 首次报道两瓜枯萎病。我国近几年由于 瓜类栽培面积扩大，瓜类枯萎病几乎在全国各地都有发生，吉林、辽宁、山 东、湖北、北京等l8 个省市许多地区发生均较严重( 金扬秀等，2 0 0 2 ) 。枯 萎病造成的损失依病情轻重及发病期早晚不同而异。轻者造成植株生长衰弱， 结瓜少，瓜小，品质蓑，淡而乏味，西瓜糖份含量少；发病严重者尚未采收 即枯死以至全无收成。据估计，一般在采收前发病的减产率为7 0 1 0 0 ；中 期发病的减产率为3 0 ，5 0 ；少数生长末期发病的则损失较小。 第一章文献综述 ( 二) 病原学 瓜类枯萎病由镰刀菌侵染引起，属半知菌亚门，经鉴定主要有两个种， 尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u ms c h lf s p ，c u c h m e f i 础p lo w e n ) 和瓜萎镰刀菌 ( f u s a r u mb u l b i g e n u mc k e ，e tm a s s v a tn i r e u mw l ) 。其中以尖孢镰刀菌为主。 根据对不同瓜类的侵染力不同，目前可将瓜类枯萎病菌分为8 个专化型，即 黄瓜，西瓜，甜瓜，丝瓜、葫芦、苦瓜、冬瓜专化型。目前西瓜专化型有3 个生理小种，黄瓜专化型有4 个生理小种，甜瓜专化型有8 个生理小种( 许 勇等，2 0 0 0 ) 。 瓜类枯萎病菌的厚垣孢子在土壤中可以存活1 0 年以上，离开寄丰的情况 下也能存活5 8 年。在长期静植感病植物的情况下病原菌大量累积，重病田 连续种植非寄主作物辣椒、茄子、玉米、大豆等能使病原菌数量下降。病菌 主要存在于瓜类作物根表及根围土壤中，从根尖或根部伤口处侵入植株，可 与土壤中的根结线虫发生复合侵染，加重病害的发生。由于瓜类枯萎病菌的 上述特性，对该病的防治造成了很大的困难。 二瓜类枯萎病综合防治 ( 一) 农业防治 1 选用抗病品种 高抗西瓜枯萎病的品种有西农8 号、京抗l 号和美国的s u m m i , 、c h a r l e s t o n g r a y 等；甜瓜抗枯萎瘸的品种有美国的u c p m r 4 s 和法国的m 1 7 1 8 等；黄 瓜抗桔萎病品种有长春密剌、津杂4 号、津研6 号、中农5 号等。由于一般 抗枯萎病品种较感霜霉病，生产上常选用抗霜霉病的品种，因此，选用抗病 品种这一措施在生产上的应用存在一定的局限性。 2 嫁接防病 由于瓜类枯萎病菌具有明显的寄主专化性，根据这一特性，采用嫁接的 方法是防治枯萎病的一项极其有效的手段。我国常以瓠瓜作为西瓜的最适嫁 接砧木，黄瓜砧木以黑籽南瓜为主，甜瓜以南瓜为主。 3 轮作 与非瓜类作物的轮作能减轻瓜类枯萎病的发生。金扬秀等( 2 0 0 3 ) 报道， 以大蒜与甜瓜轮作加适时土地休闲的效果最好，发病率最低，原因是降低了 土壤中厚垣孢子的数量，同时也抑制了病原萄菌丝的生长，但有关大蒜与病 沈阳农业大学顶士学位论文 菌的互作机理有待进一步明确。 4 改良土壤理化性状 马利平等利用家畜沤肥浸渍液防治黄瓜枯萎病，其中猪类沤肥浸渍液防 效可达9 25 。在日本，希腊都有用利用太阳能暴晒土壤结合高温处理来防 治瓜类枯萎病的成功事例( 郝秀娟等，2 0 0 0 ) 。 ( 二) 化学防治 1 种子消毒： 用多菌灵盐酸加平平加或高锰酸钾溶液浸种处理，或按每下克种子用绿 亨一号l 1 5 9 或绿亨二号3 4 9 干拌或湿拌。干拌，将药剂加少量过筛细土 混合后与种子拌匀：湿拌，用少量水将种子湿润，然后加所需药量拌匀。拌 种最好用拌种桶正反转动5 0 转充分拌匀，拌后随即播种，不要闷种。 2 土壤消毒、熏蒸等： 土壤的消毒，对防治重茬地瓜类枯萎病非常必要。用多菌灵、绿字一号、 敌克松等进行苗床土消毒或利用溴甲烷、棉隆等进行上壤熏蒸处理，能彻底 杀灭土壤中的病菌。用绿亨一号按1 0 9 m 2 ，兑水3 0 0 0 倍，均匀喷洒于床内， 或将药荆加细土5 2 0 k ，将三分之一撒在床内，余卜的二分之- 播种后盖土。 3 喷淋或灌根： 当开始发现枯萎病苗或初见死苗时，可用多菌灵或甲基托布津，绿亨一 号等药剂喷洒发病植株或灌根。绿亨一号2 0 0 0 倍或绿亨二号6 0 0 倍液能有效 防止死苗的蔓延，促进生根，对发病初期病苗具有明显的恢复作用。 由于化学防治缺乏高效、低毒、无环境污染的杀菌剂，易造成农药残留， 对人畜有伤害，而且化学杀菌剂在杀死病菌的同时，也杀死了土壤中大量的 有益菌，同时由于枯萎病为土传病害，难以实行大面积的土壤药剂处理，因 此以农业可持续发展为宗旨的生物防治方法在农业生产中的地位变得越来越 重要。 ( 三) 生物防治 随着社会的发展，人们越来越认识到使用化学农药是以牺牲生态环境和 人类健康为代价的，而以农业可持续发展为宗旨的生物防治在农业生产中起 着越来越重要的作用。尤其是搐抗微生物在植痫生防中的应用越来越受到人 们的关注。 目前常采用非致病性尖孢镰刀菌、木霉菌等拮抗微生物来降低病原菌种 群密度或削弱病原菌的致病力从而达到控制病害的目的。p a r k 等从健康黄瓜 第一章文献综述 根中分离非致病性f u s a r i u mo x y s p o r u m 菌株c 4 和c 5 ，当与p s e u d o m o n a s p u t i d a 一起加入土壤时，可以有效的抑制黄瓜枯萎病菌在根围或根表的定殖； r o b e n 等( 1 9 9 6 ) 从西瓜根际分离的非致病性fo x y s p o r u m 在大r 玎土壤处理 中能降低病害发生率3 5 一7 5 。s u n gs e o ky a n g ( 1 9 9 4 ) 从各种作物健康组织和 根围土壤筛选出非致病菌，诱导接种黄瓜幼苗，可有效保护黄瓜不受枯萎病 菌的侵染。我国吴营昌( 1 9 9 1 ) ，利用从黄瓜枯萎病植株上分离到的尖孢镰j 菌非致病株系，诱导了黄瓜对枯萎病的抗性。赵国其( 1 9 9 8 ) 研究了绿色木 霉对西瓜枯萎病的控制作用，表明木霉菌能抑制病菌生长，保护瓜苗。王慧 中，田连生等( 2 0 0 0 ) 利用木霉t 5 为拮抗体防治大棚草莓灰霉病取得了明显 的防治效果，并初步探索了其防病的机制。生防真菌研究较多的有 t r i c h o d e r m ah a r z i a n u m 、t v m d e 及g l i o c l a d i h mv i r e n s 等。 除真菌外，生防细菌p s e u d o m o n a sf l u o r e n c e n s 、p s e u d o m o n a sp u t i d a 、 & r r a t i am a r c e s c e n s 和爿，腑m 6 d 船rs p 等也是比较好的拮抗微生物，它们能很 好地定殖在作物根际，通过产生荧光嗜铁素或凡丁质酶等细胞壁降解酶阻碍 病原菌在寄主体内的增殖和扩展。s i n g h 等( 1 9 9 8 ) 利用几丁质裂解细菌 p a e n i b a c i l l u s s p 3 0 0 和s t r e p t o m y c e s s p 3 8 5 单独或者混合旌用很好地控带黄瓜 枯萎病。许煜泉( 1 9 9 9 ) 利用假单孢杆菌m 1 8 菌株浸种或定殖后根际土壤浇 灌，黄瓜枯萎病发病率比对照降低了7 0 8 0 。国内生物防治的研究多是筛选 在根部有定殖能力且无致病性或弱致病性的株系，中国科学院研制的农抗1 2 0 抗菌素对两瓜枯萎病具有较好的防治效果。 三、木霉菌在病害生物防治中的作用 ( 一) 木霉菌应用的主要进展 木霉广泛分布于世界各地不同生境中，尤其在富含有机质的土壤中分布 更多，也呵以在土壤、木材和其它有机质中分离到。木霉菌极易培养，可以 在许多基质上迅速生长，对多种病原真菌和细菌都有抑制作用，是理想的生 肪菌。 目前应用拮抗微生物防治各种作物土传病害和气传病害的研究报道很 多，其中拮抗木霉菌( t r i c h o d e r m as p p ) 是应用最早、研究较为深入的生防 因子。早在1 9 3 2 年，w e i n d l i n g 首次发现木霉菌对植物瘸原真菌有拮抗作用。 多年来，人们重点开展了木霉菌菌株遗传改良、抗逆性机理、剂型开发和生 防机制等方面研究。利用木霉菌防治立枯丝核菌( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 、齐整 沈阳农业人学硕士学位论文 小核菌( s c l e r o t i u mr o t f s i i ) 等引起的植物立枯病和自绢病在温室和离间试验 中取得了令人鼓舞的成果，而且围外已有商品化的木霉制剂问世( b h u y a n ， 1 9 9 4 ) ，如美国l e w i s 和l u m s d e n ( 1 9 9 6 ) 博士曾用绿粘帚霉( g l i o c l a d i u mv i r e n s ) 成功研制出生物农药专利产品s o i l g a r d ，用于防治温室中的p y t h i u m “l t i m u m 和r h i z o c t o n i as o l a n i 引起的蔬菜苗病，是在美国第一个被制备成褐藻酸盐颗 粒剂并在美国环保局注册的生物农药。此外美国的t o p s h i e l d ( 哈菠木霉t - 2 2 ) 和以色列的t f i c h o d e x ( 哈茨木霉t 3 9 菌株) 也已取得了登记注册( h a r m a n ，2 0 0 0 z i m m l d ，1 9 9 6 ) 。随着现代生物技术的不断发展，木霉的生防效果和稳定性有 了显著的提高，由于其生防效果好，对环境安全而具有广阔的应用前景。 木霉是种广谱性拮抗菌，能够拮抗多种病原真菌，尤其对土传真菌有 显著的拮抗效果。现在已知木霉菌的9 个种中，有5 种具有生防潜力，分别 是哈茨木霉( t r i c h o d e r m ah a r z i a n u m ) 、绿色木霉( t v i r i d e ) 、康氏木霉 ( t k o n i n g i i ) 、长枝木霉( t l o n g i b r a c h i a t u m ) 和钩木霉( t h a m a t u m ) 。当前 使用最多的是哈茨木霉。利用木霉防治由立秸丝核菌( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 、 腐霉菌( p p 腑i u ms p p ) 、齐整小核菌( s c l e r o t i u mm 帕i i ) 、镰刀菌( f u s a r u ms p p ) 等引起的棉花、杜仲、人参、三七等幼苗立稿瘸，以及荣莉、辣椒的白绢病、 番茄的猝倒病等在各种小型试验中已获得了较好的防效( 陈文瑞，1 9 9 0 ) 。体 外捡测到木霉对黑益霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 引起的落花生种子腐烂和茎腐均 有抑制作用。国内外许多学者还将其用于防治水稻纹枯病。此外木霉还可用 于地上、地下及叶匾、花嚣和果实的保护，在葡萄园内用绿色木霉的孢子悬 浮液于始花期至收获期喷施，可以降低灰霉引起的藤蔓腐烂以及果实在储藏 期的腐烂，有效地防治灰霉病，在杨树烂皮瘸的生防研究中，发现木霉对烂 皮病菌也有较好的防效，林问防治杨树烂皮病治愈率达9 2 4 ，效果达8 2 4 。 ( 项存悌，1 9 9 1 ) 。茆振川( 1 9 9 6 ) 报道了木霉菌对苹果轮纹病的抑制作用。 据不完全资料统计，木霉菌至少对1 8 个属2 9 种病原真菌在体外或体内表现 有拮抗作用( 扬合同，1 9 9 9 ：b u l a t 1 9 9 8 乔宏萍，2 0 0 2 ) 。 ( 二) 木霉菌的生防机制 关于木霉菌的生防机制，国内大多数都集中在竞争作用、抗生作用及重 寄生作用3 个方面。赵蕾( 1 9 9 8 ) 研究了木霉对灰霉病菌的拮抗枕制，包括竞争 作用，重寄生作用，抗生素产生及诱导抗性等。李博强( 2 0 0 3 ) 较系统地研 究了木霉菌t r 一8 的生防机制，认为木霉菌防治黄瓜枯萎病的机制具有多样 性。木霉菌不仅对病菌具有营养竞争、重寄生作用和抗生作用，而且t r 培对 第章文献综述 植株的举丙氨酸解氨酶( p a l ) 、过氧化物酶( p o ) 和多酚氧化酶( p p o ) 等防 御酶系有明显的激活作用。并测定了木霉菌发酵液中0 1 ，3 - 葡聚糖酶活性， 及胞外几丁质酶活性，从另一个角度说明了木霉拮抗机制的多样性。国外对 木霉菌生防机制的研究较为深入，h o w e l l ( 2 0 0 3 ) 报道了木霉菌重寄生作用、 抗生作用、竞争作用和诱导抗性对病害防治效果。 1 、重寄生 重寄生是一种真菌对另一种真菌的寄生作用，是微生物问三种主要拮抗 性作用( 抗生、竞争、重寄生) 之一。重寄生主要包括四个过程：趋化性生 长一识别一吸附和缠绕一菌丝裂解。早在1 9 8 1 年，c h e t 等( 1 9 8 3 ) 证明了木 霉菌可在一定距离外探测到它的寄主，木霉菌对真菌的重寄生具有一定范围 的寄主专化性，这也暗示着识别作用的发生。在木霉菌与病原菌互作的过程 中，寄主菌丝分泌一些物质使木霉趋向寄手真菌生长，一日- 寄主被木霉寄生 物所识别，就会建立寄生关系。e l a d ( 1 9 8 3 ) 已证明了寄主真菌细胞表面特 定的外源凝结素在识别中的作用。木霉对寄主真菌识别之后，通过吸器吸附 ( h o w e l l ，2 0 0 3 ) ，进而缠绕、穿透寄主菌丝，吸取营养，从而达到瓦解病菌 菌丝目的( w e i n d l i n g ，1 9 3 2 ) 。e l a d 的实验证实了这种重寄牛作用，同时发现 移除寄生菌丝后，在病原菌丝上有溶解位点和穿入孔。据分析，木霉菌在重 寄生过程中产生了一系列降解病原菌细胞壁的水解酶，如几丁质酶、葡聚糖 酶等。 木霉菌不仅能寄生植物病原真菌菌丝，也能寄生菌核，使之软腐，并失 去萌发能力( 徐同，2 0 0 2 ) 。h e n i s 等( 1 9 8 3 ) 观察到木霉能穿透并侵染齐整 小核菌表层和中层细胞，并溶解内层菌核组织，形成厚垣孢子和分生孢子。 2 、抗生和溶菌作用 木霉在代谢过程中可以产生拮抗性化学物质抑制植物病原真菌生长，这 些物质包括抗生索和一些酶类。l i f s h i t z 的实验表明，木霉对豌豆上的腐霉菌 的措抗作用可能与重寄生作用和竞争作用无关，而与木霉菌产生毒素凶子有 关，是毒素因子限制了病原菌菌丝的生长。l u m s d e n 等( 1 9 9 2 ) 也发现木霉 菌的抑菌活性与其产生的毒素有关。w i l h i t e 和h o w e l l 等( 1 9 9 4 ) 利用7 7 v i r e n s 的木霉菌毒素缺失突变株证明了缺少这种毒素物质木霉菌不能有效地防治猝 倒病。h o w e l l ( 2 0 0 2 ) 在研究用木霉菌t r i c h o d e r m av i r e n s ( g 6 ，g 6 5 ) 防治由腐霉 菌( p y t h i u mu l t i m u m ) 和立枯丝核菌( r h i z o p u so r y z a e ) 引起的棉花幼苗猝 倒病时发现：木霉菌释放出某种物质能抑制病菌孢子萌发，病菌孢子一旦萌 沈阳农业大学硕十学位论文 发，就尚失了抑病效果。接种木霉菌( 7 7 v i r e n s ) 后，棉花枯萎病病菌的孢子 萌发数量明显降低。同时发现，用死的木霉菌( t v i r e n s ) 接种棉花则刺激孢 子萌发，而用活的木霉菌( t v i r e n s ) 接种则抑制孢子萌发，说明不产生该物 质的木霉菌则对病原菌孢子萌发没有抑制作用。 存对木霉菌生防机制的研究中，研究最多的是几丁质酶、葡聚糖酶等细 胞壁降解酶，这些酶可以降解病原真菌的细胞壁。m e t c a l f 和w i l s o n ( 2 0 0 1 ) 在研究z k o n i n g i i ( t r 5 ) 防治s c l e r o t i u mc e p i v p r u m 引起的病害时，系统地描述了 木霉菌的定殖过程，t r 5 在定殖中几丁质酶和葡聚糖酶瓦解了病菌菌丝，而对 未受病组织则没有影响。同时他们还描述了内源和外源几丁质酶的变化。b a e k 等在用木霉菌防治棉花枯萎病时，将外源编码的几丁质酶基因导入到木霉菌 ( t v i r e n s ) 中，提高了该木霉菌的活性。 3 、竞争作用 竞争作用是生物防治的重要机理，如果一个生防因子不能与病原菌竞争 营养和空间，那么它将不能在根围或叶表生存。在生防因子与病菌的竞争中 如果抑制病菌种群增长，那么竞争将产生对病害的控制。另方面，土壤内 国有微生物区系的排斥作用也能给引入微生物的长期定殖带来了尉难。田连 生等( 2 0 0 1 ) 研究发现竞争作用是木霉菌拮抗失镰孢菌的主要作用机制。木 霉菌作为土壤腐生菌，无论是直接添加到土壤中，还是进行种子处理，都能 在土壤中快速定殖，同时刺激植物的根系快速地生长( h a m l a n ，2 0 0 0 ；h o w e l l ， 2 0 0 0 ) 。 4 、诱导抗性 以往对木霉菌生防机制的研究大多集中于与微生物蚓的互作，而忽视了 寄主植物的参与。b a i l e y 和l t t m s d e n ( 1 9 9 8 ) 的研究揭示了木霉菌的木聚糖 酶或其它的激发子能够诱导植物的抗病性。e l a d 等( 1 9 9 8 ) 利用哈茨木霉t 3 9 接种根部或叶子后控制了灰葡萄孢引起的病害，认为诱导抗性是重要机制之 一。h o w e l l 等( 1 9 9 9 ) 用生防菌株绿色木霉菌处理棉花种子后发现：绿色木 霉能穿透并定殖在裉表的外皮层组织中，刺激过氧化物酶活性升高和萜类化 合物积累。y e d i d i a 等( 1 9 9 9 ) 也证实了哈茨木霉株1 - 2 0 3 穿透到黄瓜根部外 皮层，产生了一种类似的诱导抗性，并且穿入区的细胞机械强度增大，与未 经1 - 2 0 3 处理的植株相比，几丁质酶和过氧化酶活性的升高提前了4 8 7 2 h ， 并且叶部也出现了这两种酶活性的升高，表明产生了s a r ( 系统获得抗性) 。 木霉菌能产生诱导植物保卫反应的激发子( c a l d e r o n ，1 9 9 3 ) 。绿色木霉 第- 章文献综述 ( r v i r i d e ) 的2 2 k d a 的木聚糖酶可诱导植物产生保卫反应。这种2 2 k d a 木聚 糖酶诱导的植物保卫反应包括k + 、h + 、c a 2 + 通道的形成( b a i l e y ，1 9 9 2 ) 、p r 蛋白的合成( l o t a n 和f l u h 】9 9 0 ) 、乙稀的合成( f u c h s ，1 9 8 9 ) 和糖基化作用 及植物甾醇的脂肪酰化作用( m o r e a u ，1 9 9 4 ) 。目前研究表明防卫反应并不是 术聚糖酶本身作用的结果( s h a r o n ，1 9 9 3 ) ，而与木聚糖酶直接作用的膜受体作 为媒介有关。 木霉菌能产生许多同植物相同或类似的酶，它们同植物样能降解病菌 的细胞壁和细胞膜。这些酶被认为具有释放激发物质能力( b o l l e r , 1 9 8 9 ) 。研 究还表明木霉菌产生的胞壁降解酶能释放来自病原真菌、植物细胞壁及土壤 或根部有机质的激发予活性物质，由此诱导相关植物组织的抗性。如果的确 如此，那么诱导抗性真菌及植物生物、土壤环境、病菌和生防因子种群、作 用时间密切相关。木霉菌诱导抗性功能及其在植物根部的根际和皮层组织定 殖的能力使木霉菌成为具有广阔应用前景的优良生防因子。 5 、协同掊抗 木霉的拮抗作用可能是两种或三种机制同时或顺序作用的综合。b a k e r ( 1 9 9 9 ) 的研究资料表明，用木霉菌处理菜豆种子后，木霉菌对腐霉菌 ( p y t h i u ms p p ) 的作用包括产生抗生素及重寄生作用两种机制。木霉在产，；j 三 抗牛素的同时，也产生各种降解细胞壁的胞外酶以抑制土传植物病原菌的菌 丝生长和孢子萌发。d ip i e t r o ( 1 9 9 3 ) 等从绿色木霉和终极腐霉( p y t h i u m u l t i m u m ) 的相互作用的培养液中提取出具有防病作用的胶霉毒素，研究后发 现，如果向每升培养液中增加7 5 r a g 几丁质酶，可以减少5 0 的胶霉毒索用 量仍能达到同样的效果。j o n e s ( 1 9 8 8 3 等提出了胶霉毒索与细胞壁降解酶协 同效应模型，认为细胞壁降解酶的作用在于使毒素快速传递并在原生质膜上 定位，起到增效作用。另外，不同的细胞壁降解酶之间也存在协同作用。 6 、促生作用 燕嗣皇等( 1 9 9 9 ) 研究发现用木霉菌沾根处理能明显促进根系的生长， 较正常处理有明显的增加。李卫平等( 2 0 0 0 ) 也证实了绿色木霉对蔬菜苗期 病害的促生作用。焦琮等( 1 9 9 5 ) 报道，康氏木霉( t , k o n i n g i i ) 不仅有效地 防治了棉苗立枯瘸和菜豆炭疽瘸，而且可明显促进棉花和菜豆的生长发育。 a l t o m a r e 等( 1 9 9 9 ) 发现哈茨木霉菌株t 2 2 具有溶解可溶性或微矿物质的能 力，通过螯合或降解来溶解金属氧化物，促进植物对矿物质的吸收，提高植 物的生长量。已有的证据充分证明木霉菌能促进植物的生长，但关于木霉菌 沈阳农业大学硕士学位论文 如何促进生长以及如何利用这一作用还处于研究中。 由此可见生防因子防治植物病害的机制足复杂多样的，而且其中还包括 了各种生防因子、病原菌的寄主植物之间的互作。同时生防效果还要受士壤 类型、温度、p h 值和湿度以及些微生物区系的影晌。我们所观察和定义的 生防，有可能是各种不同机制共同作用的结果。由于我们的认识能力有限 对这一复杂体系的了解仍然很少，为了进一步了解这方面的知识，我们还应 该深入地开展大量的工作，结合其他学科在生防机制过程方面的观点，去开 发新的利用生防因予的方法。 ( 三) 木霉菌一病菌寄主植物互作机理 1 、木霉菌与其它微生物的互作 在用木霉菌进行生防时，由于种内和种间的差异，木霉菌与其它微生物 间发生了种种互作。木霉菌可以专化作用于附加种病原菌，这种专化作用与 抗生素和细胞壁降解酶有关。z h u ( 2 0 0 4 ) 利用绿荧光蛋白基因标记f u s a r i u m m o n i l i f o r m e ，并通过荧光显微镜观察木霉菌降解镰孢菌胞壁的过程。l u ( 2 0 0 4 ) 利用g f p 转导系统和立体荧光显微观察示踪了共培养或在黄瓜种子表面生防 菌za t r o v i r i d e 与病原腐霉菌( p y t h i u mu t t i m u m ) 重寄生性互作过程。 2 、与植物的互作 植物与木霉菌之间存在相当复杂的关系。木霉菌对于作物生长、产量、 抗性的促进作用以及重寄生作用均与互作的植物的摹因型有着密切的关系。 焦琮等( 1 9 9 5 ) 报道，康氏木霉( t k o n i n g i i ) 不仅有效地防治了棉苗立桔病 和莱豆炭疽病，而且可明显促进棉花和菜豆的生艮发育，提高作物对立枯病 的抗性。m a r r ( 2 0 0 4 ) 研究了植物( 番茄、烟草、菜豆、马铃薯) 病菌( b o t r y t i s c i n e r e a 、r h i z o c t i o n i as o l a n i 和p y t h i u mu l t i m u m ) 一铬抗菌( t a t r o v i r i d ep i 菌 株或t h a r z i a n u m t 2 2 菌株) 微生物三者关系，在木霉菌和病菌存在条件下植 物蛋白质图谱发生了很大变化，诱导产生了病程相关蛋白，该蛋白与诱导抗 件有关。 木霉菌除具有生防效应外，也可对植物可以产生致病作用，如由木霉菌 ( t r i c h o d e r m as p p ) 引起的红薯、柑桔、苹果等3 2 属植物的腐烂病，m e n z i e s 将从健康番茄中分离到的木霉菹( t v i r i d e ) 在温室内接种幼苗，发现其对黄 瓜、辣椒、番茄幼苗有致病作用。m c f a d d e n 和s u t t o n ( 1 9 7 5 ) 发现了木霉 ( z k o n i n g i i 、t h a r z i a n u ma n dt h a m a t u m ) 对玉米的致病作用。 第一章文献综述 ( 四) 木霉菌在病害生防中的应用技术 目前生产卜常用的木霉菌剂多为孢子制剂，孢子制荆在蹦问主要是用于 种子处型和t 壤处理。根据具体情况将孢了制剂按定比例与种子混合或添 加于土壤中，可起到保护种子、根系及幼苗免受病原菌侵染的作用。 1 、土壤处理 b l i s s ( 1 9 5 1 ) _ jc s 2 熏蒸土壤，控制了密环菌( a r m i l l a r i am e l l e a ) 引起的 柑桔根腐病，认为是土壤中原有木霉菌迅速定殖和繁殖的结果，但没有得到 直接的证据。后来o h r 等( 1 9 7 3 ) 提供了令人信服的证据。木霉菌有寄生植 物病原菌的能力，在实验室和在自然的土壤中都被证明了。那么，土壤中原 有木霉在生防中的地位如何呢? 在哥伦比亚原始苗圃丝核菌( r h i z o c t o n i a s o i a n i ) 的抑制土壤中，存在着大量的钩木霉，用加热或y 射线处理上壤，能 消除土壤对丝核菌的抑制性，重新引入哈茨木霉又恢复了这种抑制性，这就 进一步提供了木霉菌作用的证据( c h e t ，1 9 8 0 ；1 9 8 1 ) 。腐菌病的抑制性土壤， 主要应归功于七壤中原有木霉菌的作用。 人为地向土壤中引入木霉菌防治植物病害已有较多报道。w e l l s 等( 1 9 7 2 ) 用固体培养基质培养哈茨木霉，已广泛应用于田间防治番茄的门绢病 ( s l e r o t i u mr o 册i i ) ；b a c k m a n 等( 1 9 7 5 ) 用一种糖渍硅藻土培养哈茨木霉防治花 生n 绢病，可以连续三年增产，而且施用量较少。用固体培养基培养的木霉 菌，特别是哈茨木霉，对洋葱白腐病( s c e r o t i u mc e p o v o r u m ) 、棉花和黄瓜黄 萎病( v e r t i c i l l i u md a h l i a e ) 及多种作物的猝倒病和疫病等有防效。徐同等 ( 1 9 9 6 ) 用0 6 ( w w ) t 8 2 麸皮培养物处理土壤，人工接种白绢病菌。黄瓜发 病率大大降低。杨雨环( 1 9 9 6 ) 用木霉防治辣椒白绢病试验中发现，当菌剂 在发病前施用，可大大减少发病株率，其防效相当于粉锈宁4 0 0 0 倍液。固体 培养物的生防效果主要与温度、接种体的类型、加入土壤中的时间、接种强 度及病菌密度有关。但应该注意，过于丰富的木霉菌培养基，可能会因为剩 余营养而刺激了病菌的生长，反过来加重了病害。 存许多实验中( 李良，1 9 8 3 ；张硕成，1 9 9 1 ；陈文瑞，1 9 9 0 ) ，分生孢子 的生防效果是令人满意的，但是，深罐发酵生产纯分生孢子的商业化产品可 能是比较困难的。j o r d a n 等( 1 9 7 4 ) 用纯的分生孢子防治草莓黄萎病效果很 好，而且能刺激植株生长。把木霉菌的生物发酵制品加入土壤，不仅繁殖迅 速，而且比纯分生孢子或厚垣孢子的防病效果好。钩木霉、哈茨木霉和绿色 4 沈阳农业大学硕士学位论文 木霉发酵粒制剂，在土壤中可以减少丝核菌的存活和生长，也能减轻其引起 的番茄果腐病。 2 、种子处理 大面积上壤处理需要大量的木霉制剂，限制了术霉制剂的推广应用，所 以用木霉菌处理种子足一项经济有效的生防措施。用钩本霉分生孢子处理豌 豆和萝h 种子，对其病有良好防效( c h e t ，1 9 8 1 ) ；用哈茨木霉紫外诱变株的分 生孢子处理种子，也获得了同样效果：用拟哑木霉处理大豆种子和哈茨木霉 处理玉米种子都可提高出苗率，并能刺激植株生长。据李宏科( 1 9 9 8 ) 报道， 播种前1 k g 种子用1 0 9 菌粉拌种，防治温室黄瓜根腐病，防效达5 0 。另外， 用木霉菌作种子包衣，对于防治茁木出土前和出土后的猝倒病有特效。将木 霉菌粉或i m l 5 亿个分生孢子制成包农剂( 可用甲基纤维索作粘着嗣) 拌种， 可以有效地防治菜豆、番茄、辣椒和棉花等作物的猝倒病。种子防病效果取 决于菌系、菌龄、温度、土壤种类及其微生物区系、接种体的营养状况和强 度、土壤中病原菌密度和播种时间，而且木霉菌必须具有与病菌竞争和寄生 病菌的能力，具有对产生螯合作用的细菌和其它微生物的不敏感性。 3 、木霉菌在地上部分的应用 在美国用哈茨木霉夏季接种红枫树，可以保证其在2 1 个月内不受层担子 菌危害；g r o s c l a u d e ( 1 9 7 0 ) 用锯刀修剪洋梨的同时，把绿色木霉接种于伤口， 能有效地防治梨树银叶病( s t e r e u m p u r p u r e u m ) ；r i c h a r d ( 1 9 7 7 ) 把喜凉的多 孢木霉和绿色木霉，分别用于防治洋梨银叶病和蘑菇上的轮枝菌，在法国已 经被注册。t r o n o s o n 等( 】9 7 7 ) 在苹果花期喷撒喜凉的哈茨木霉分生孢子， 成功地防治了眼斑病。以色列的m a k h t e s h i m a g a n 公司开发的以哈茨木霉t 3 9 菌株为发酵液的生防制剂( t r i c h o d e x ) ，为2 5 可湿性粉荆，可以用于防治灰 霉病、茁桔病、霜霉病和白粉病等叶部病害及果实在储藏期的腐烂( h a r m a n ， 2 0 0 0 ) 。总之，地上部分应用木霉菌值得进一步开发。 4 、木霉菌和其它措施结合应用 为了提高生防木霉的防效及稳定性，国内外很多研究将施用木霉菌制剂 与其它防病措施相结合。如利用耕作措施结合使用哈茨木霉，能有效地控制 黄瓜果腐病；日晒与哈茨木霉结合使用，可减轻苹果白纹羽病( r o s e l l i n i a n e c a l r i x ) ( f r e e m a n ，1 9 8 7 ) ：溴甲烷与木霉菌结合应片j ，可有效地控制多种 作物根腐病( a r m i l l a r i a m e l l e a ) 提高了对立枯丝核菌和白绢菌的防治效果( 鲁 素芸1 9 9 3 ) 。赵培洁( 2 0 0 0 ) 制备的含有哈茨木霉的有机菌肥，对白菜的生 第章文献综述 长，产量和质量都有较大的提高。本霉和其它措施结合使用开辟了木霉菌应 用的新途径。 四存在的问题与展望 随着持续农业和持续植物保护观念的不断深入，运用生物防治手段控制 植物病害已越来越受到髓界各国的重视。植物病害生物防治强调生态系统的 良性循环和环境保护，由于其社会效益、生态效益、长远利益而愈来愈引起 人们的重视。利用生物防治方法防治蔬菜病害通常是将拮抗菌引进病害生态 系统。但由于土壤微生物问的相互竞争，影响拮抗菌产生抗生素和酶，或使 失去活性。使在实验室和温室成功的拮抗菌剂在大田应用时遭到失败( j a c k ， 1 9 9 1 ) 。向一个生态系统引入外源微牛物非常困难，要求这种菌具备在该系统 中高效定殖的能力，被利用的微生物最好选自要应用的生态环境，以利用引 用生防菌的快速有效定殖，更好发挥生防活性。此外，用菌量人、费用高也 是牛防菌剂走向生产应用的限制因素之一。因此，如何开发利用生防因子， 如何调控影响其抑菌活性的因素，以及如何提高防效并减少用量等都是值得 深入探讨的问题。 ( 一) 菌株改良，提高防效和稳定陛 现代生物技术的出现，尤其是基因工程技术的高度发展，为彻底改造野 生型菌株提供的有力工具，使我们有可能按照需要构建广谱、多功能的生物 防治工程菌。对某些生防菌，如果在大田应用时难以提供适宜的生存环境， 可以从开发其代谢，“物出发，利用基因工程、酶工程、发醇工程、细胞工程 生产生防菌产品，研制新的生物制剂，同时利用现代分子生物学方法对宜接 从自然界获得的生防菌进行遗传改造( t y l e r ，2 0 0 0 ) ，以提高生防菌的竞争生 存能力和痫害控制效果，c r o s s 等( 1 9 9 6 ) 已研制出商效的生防菌；p m a n i 等 ( 1 9 9 9 ) 利用原生质体融合技术改良了钩木霉菌株，新菌株在抗菌潜能，抗 杀菌剂，抗生素和水解酶的产生上都优于原菌株；l i m o n 等( 1 9 9 9 ) 用c h i t 3 3 基因转化7 1 h a r z i a n u mc e c t 2 4 3 1 ，获得了过量表达3 3 一k d a 几丁质酶的哈茨木 霉转化予，与野生型相比，对立枯丝核菌的生防效果明显提高。 将自然的生防菌株进行人工诱变改良，筛选出特定的抗药菌株，使其能 够与低剂量的杀菌荆混合使用。这不仅是提高生防菌在自然中的竞争生存能 力，促进其对靶标菌寄生定殖效率的重要措施，也是生物防治与物理、化学 等防病措施结合应用提高防病效果的主要途径之一( z o n gz h a o f e n g 等， 6 沈阳农业夫学硕士学位论文 1 9 9 9 ) 。 ( 二) 创造有利的环境条件 使土壤有益微生物充分发挥作用的关键点在于如何创造。个适合其生存 繁殖的环境，否则即使将有益微生物导入土壤也不能在土壤中定殖而发展成 为利丁植物生长的微生态结构。创造有益微生物定居繁殖环境的方法有： 使用粘土矿物质、草木灰( 稻草等秸杆) 、有机质( 堆肥) ，丰富土壤微生物 种群；有益微生物制剂粒化；混植。如结合大葱种植将放线菌、螃蟹壳 粉混入土壤对防治p s e u d o m o