（材料学专业论文）磁性纳米微球在体外分离纯化领域的应用研究.pdf

摘要各种生物分子如核酸、蛋白质、多肽和细胞等的分离、纯化和精制是生命科学各研究领域必不可少的组成部分，分离纯化技术的高低对整个生物学的发展具有举足轻重的作用。以磁性材料作为分离载体的磁性分离技术是近年来兴起的一种新型分离技术，它的发展对体外分离纯化领域具有重要意义。本文以超顺磁性纳米材料作为分离介质，对磁分离技术在核酸提取领域的应用、生物分子标记磁性分离载体的制备及其应用可行性进行了研究。本文首先简要介绍了磁分离技术在生物分离纯化领域的应用现状。磁分离技术通过磁性分离载体在外加磁场的定向控制下，利用特异性亲和作用可以一步从复杂的原始生物体系中直接分离出目标生物分子，具有磁性分离的简单方便性和亲和分离的高特异性双重优势。其在生物分离纯化和检测中的应用领域包括：核酸提取、细胞分选、蛋白质分离纯化、酶的固定化、免疫分析与检测等。本文针对二氧化硅表面修饰的磁性纳米微球分离介质，研究了磁分离技术在质粒d n a 与基因组d n a 提取领域的应用，通过对提取流程和试剂体系的设计，建立了快速提取核酸的磁分离技术。此外，针对表面氨基或羧基化的磁性纳米微球，探讨了生物分子诸如抗体、链霉亲和素及p r o t e i n a 磁性分离载体的制备方法及其应用可行性。本文还针对磁分离技术在应用过程中的需求，设计并开发了几种结构简单、使用方便、价格低廉的体外分离纯化用实用新型多功能磁分离架。关键词：磁性纳米微球磁珠磁性分离核酸蛋白质a b s t r a c ts e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fb i o l o g i c a lm o l e c u l e ss u c ha sn u c l e i ca c i d ，p r o t e i n ，p e p t i d ea n dc e l l si sam a j o ra n dn e c e s s a r ys t e pi nt h ef i e l do fl i f es c i e n c e ，t h u s ，t h el e v e lo fs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yp l a y sa ni m p o r t a n ta n dd e c i s i v er o l ei nt h ed e v e l o p m e n to fb i o l o g y m a g n e t i cs e p a r a t i o nt e c h n o l o g yi san e wt y p eo fs e p a r a t i o nt e c h n o l o g yd e v e l o p e di nr e c e n ty e a r s i t sd e v e l o p m e n th a sag r e a ts i g n i f i c e n c ei nt h ef i e l do f nv i t r os e p a r a t i o na n dd e t e c t i o n i nt h i ss t u d y , b yu s i n gs u p e r p a r a m a g n e t i cn a n o m a t e r i a l sa ss e p a r a t i o nm e d i u m ，m a g n e t i cs e p a r a t i o nf o rn u c l e i ca c i de x t r a c t i o n ，p r e p a r a t i o no fm a g n e t i cc a r r i e r sl a b e l e dw i t hb i o l o g i c a lm o l e c u l e sa n dt h e i ra p p l i c a t i o nf e a s i b i l i t yw e r ei n v e s t i g a t e da n dd i s c u s s e d f i r s t ，a p p l i c a t i o ns t a t u so fm a g n e t i cs e p a r a t i o nt e c h n o l o g yi nt h ef i e l do f nv i t r os e p a r a t i o na n dd e t e c t i o nw a sb r i e f l yi n t r o d u c e d m a g n e t i cs e p a r a t i o nt e c h n o l o g yc a nd i r e c t l ya n ds i m p l yi s o l a t et h et a r g e tm o l e c u l ef r o mo r i g i n a lc o m p l e xb i o l o g i c a ls y s t e m sb yu t i l i z i n gas p e c i f i ca f f i n i t yr e a c t i o na n da no r i e n t e dc o n t r o lb a s e do na d d i t i v em a g n e t i cf i e l d ，t h e r e f o r e ，i th a sd o u b l ea d v a n t a g en a m e l yas i m p l ea n dc o n v e n i e n tp r o p e r t yb s e do nm a g n e t i cs e p a r a t i o na n dah i 曲s p e c i f i c i t yb a s e do na f f i n i t ys e p a r a t i o n i t sp o t e n t i a la p p l i c a t i o nf i e l d sf o rs e p a r a t i o na n dd e t e c t i o na r ec o m p o s e do fn u c l e i ca c i de x t r a c t i o n ，c e l ls e p a r a t i o n ，p r o t e i ni s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n ，i m m u n o l o g i c a la n a l y s i sa n dd e t e c t i o na n ds oo n n e x t ，a p p l i c a t i o no fs i l i c a - m o d i f i e ds u p e r p a r a m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sf o re x t r a c t i o no fp l a s m i dd n aa n dg e n o m i cd n aw a ss t u d i e d r a p i de x t r a c t i o nt e c h n o l o g yb a s e do ns i l i c am a g n e t i cm a t e r i a l sw a se s t a b l i s h e db yd e s i g no fe x t r a c t i o np r o t o c o la n db u f f e rs y s t e m s i na d d i t i o n ，f o rt h ec a r b o x y lo ra m i n of u n a c t i o n a l i z e dm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ，p r e p a r t i o no fm a g n e t i cc a r r i e r sm o d i f i e db yb i o l o g i c a lm o l e c u l e ss u c ha sa n t i b o d y ,p r o t e i naa n ds t r e p t a v i d i na n dt h e i ra p p l i c a t i o nf e a s i b i l i t yw e r ed e s c r i b e da n dd i s c u s s e d f i n a l l y , i nt h i ss t u d y , s e v e r a ls i m p l e ，c h e a pa n dm u l t i - f u n c t i o n a lm a g n e t i cs t a n d sw e r ed e s i g n e da n dd e v e l o p e da c c o r d i n gt ot h ea p p l i c a t i o nd e m a n d k e y w o r d sm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sm a g n e t i cs e p a r a t i o nn u c l e i ca c i dp r o t e i ni i第一章绪论1 1引言2 0 世纪9 0 年代以来，随着纳米科技的发展，磁性材料已步入磁性纳米材料的新纪元。从广义上说，纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或由它们作为基本单元构成的材料。当磁性粒子的尺寸小到某个临界尺寸时，粒子的磁学性质将由铁磁性或反铁磁性向超顺磁性转变【1 1 。超顺磁性纳米材料的主要特点是在外加磁场作用下可以被磁化，在磁场的作用下磁性颗粒能够迅速富集分离。当外加磁场撤离后它没有剩磁因而不显出磁性，从而又能分散到溶液中。近年来，磁性纳米材料因其比表面积大、表面官能基团丰富、分散稳定性好等特性使其在生物、医学上的应用成为一个越来越受瞩目的热点。磁性颗粒表面可以通过包覆有机小分子、多糖、聚合物高分子、脂质分子等进行修饰从而得到能够稳定分散的功能化磁性液体。磁性液体的主要特点是在磁场作用下可以被磁化，可以在磁场作用下定向运动，但同时它又是液体，具有液体的流动性。磁性液体中的磁性微球由于粒径小，在室温下呈现超顺磁性。生物活性物质( 如抗体、抗原、受体、酶、核酸等) 可通过磁性微球表面的官能基团结合到磁性颗粒上，这些活性物质被固定后可以在反应介质中进一步识别相应的抗原或抗体、配体、底物、核酸，从而达到分离或检测的目的。因此修饰了生物活性分子的磁性颗粒集载体和分离功能于一身，将许多复杂的操作简单化，在细胞学、免疫学、微生物学、分子生物学以及诊断和治疗等许多领域得到了广泛的应用。下面将着重介绍磁性纳米材料在生物分离检测方面的应用。1 2 在生物分离领域的应用细胞及各种生物大分子如核酸、蛋白质、多肽等的分离、提纯和精制是生命科学各研究领域必不可少的组成部分，分离纯化技术的高低对整个生物学的发展具有举足轻重的作用。随着科技的发展，色谱、超滤、离心等常用的分离技术不断地改进，新分离介质和设备的应用大大提高了分离效率。色谱分离和膜分离技术已经日趋成熟，而以磁性分离为代表的新型分离技术在近年来得到了迅速推广，这是分离技术发展的重要趋势之一。1 2 1磁性分离技术的基本原理及特点磁性分离( 简称磁分离) 技术是一种基于固相载体的综合分离生物分子和细胞的新型分离技术。其原理是利用功能化磁性颗粒的表面配体( 或受体) 与受体( 或配体) 之间的特异性相互作用如：抗体一抗原( a n t i b o d y a n t i g e n ) 相互作用和亲合素一生物素( a v i d i n b i o t i n ) 等体系来实现对靶向生物目标分子的快速分离【2 】。基于流体动力学原理，磁性颗粒可以与待分离目标生物分子迅速接触从而使待分离的目标分子结合到磁性颗粒的表面。然后在一个外加磁场的作用下，快速地富集、分离出靶向生物分子或细胞，而非目标分子或细胞则会滞留在原来的溶液中。这一技术为生物活性物质的分离和免疫检测分析提供了一种新的强有力手段。磁分离法通过磁性分离载体在外加磁场的定向控制下，利用特异性亲和作用可以一步从复杂的原始生物体系中直接分离出目标生物分子，具有磁性分离的简单方便性和亲和分离的高特异性双重优势。与传统的分离方法相比，它具有如下优点：1 ) 磁分离法操作简单，所有的纯化步骤可以在一个试管中完成，从而可以大大减少操作步骤，缩短操作时间；2 ) 它可以从生物样本的粗提液中直接进行分离，不需要预先富集或交换缓冲液体系等过程；3 ) 不需要昂贵的色谱系统和超滤等装置，易于实现自动化控制。1 2 2 生物分离用磁性材料的特征超顺磁性纳米材料已广泛应用于生物分子的分离纯化、免疫诊断、靶向给药与治疗以及生物传感器等诸多生物医学领域。但是，不同的生物医学应用对磁性材料的表面与微观结构、物理化学性质以及微球的粒径大小与分布的要求均有较大差别。通常，应用于生物磁分离与纯化领域的磁性载体应具备以下几个特性：超顺磁性、颗粒或微球尺寸均匀、具有表面功能基团、快速的磁响应特性( 高而且均一的磁性物质含量) 、没有磁性材料泄露以及良好的生物相容性等。磁分离应用中的磁性材料通常是核壳结构，内芯是磁性颗粒，通常有纳米f e 3 0 4 、y f e 2 0 3等，可以直接在内芯上结合功能生物分子，但是由于结合的位点少、结合上去的生物分子会失活，因此通常在磁性颗粒的表面包覆一层多糖( 如葡聚糖) 或聚合2上生物相容性较好的高分子如p m m a 、p s 等，也可以包覆二氧化硅。最后在包覆层的表面偶联上与待分离目标生物分子互补的功能生物分子，从而得到可以应用于磁性分离的磁性纳米微球载体。1 2 3 磁性分离技术在分子生物学领域的应用在分子生物学研究中，经常涉及核酸的分离和纯化，基于磁珠的核酸纯化方法具有高效快速和易于自动化的特点，正在逐步替代传统的溶剂萃取法，广泛地应用于核酸的提取、纯化、序列测定和扩增等过程中。目前磁性分离技术在分子生物学领域的应用主要集中在d n a 或r n a 的制备提纯方面【3 羽。将o l i g o ( d t ) 2 0 - - 一2 5共价偶联于磁性颗粒的表面上，基于m r n a 的p o l y a 尾巴与之相配对原理使m r n a 结合于磁粒上，然后通过外加磁场可将携带有m r n a 的磁粒与体系中的杂质分离。该法可以快速、高率地从真核细胞总r n a 或从动物组织、细胞和植物的粗裂解液中分离纯化m r n a l 7 , 8 j ，甚至还可以从磁粒分选出的细胞或石蜡包埋的组织中得到较纯的m r n a 9 。分离纯化所得m r n a 可应用于c d n a 的合成、n o r t h e r n印迹等分子生物学下游领域的研究。此外，不洗脱直接用磁性颗粒捕获的m r n a还可以进行固相c d n a 文库的构建和r t - p c r 1 0 , 1 1 】。此外，表面修饰有o l i g o ( d t )或修饰有亲和素的磁性微粒可替代硝酸纤维素膜或尼龙膜而用于特殊序列d n a r n a 分子的杂交捕获和分析【1 2 1 。b o s e 等【1 3 】通过将生物素标记的d n a 寡核苷酸探针与含有靶d n a 或寡核苷酸的样品孵育杂交，然后利用外加磁场方便地把目标核酸分离出来。研究显示在生物素亲和素结合状态下不影响d n a 操作，如解链，洗脱，杂交及测序等工作f 1 4 1 。g a b r i e l s e n 等【1 5 】用亲和素磁性微球载体成功地进行了特殊序列d n a r n a 结合蛋白的纯化。e l a s s a r i i l 等利用实验室合成的聚烈异丙基丙烯酞胺) 磁性微球，通过控制溶液的p h 值和盐度来分离纯化溶液中的核酸分子。他们发现，当溶液呈酸性时溶液中的核酸分子可被吸附到微球的表面，调整溶液p h 值到碱性并提高溶液的盐度，吸附在微球表面的核酸分子就可以被重新洗脱下来。受此现象的启发，d a v i e s l l 7 】和t a y l o r 等则发现在高浓度盐溶液中，双链d n a 可以被吸附在硅的表面，在水溶液中吸附在磁性颗粒表面的d n a 又可以重新析出，他们利用硅包覆磁珠进行了质粒d n a 和玉米籽基因组d n a 的提取。雷涵等n 叫研究采用生物功能磁性微球分离质粒，在高浓度的聚乙二醇溶液和一定3盐浓度存在的条件下，能d n a 选择性地结合至表面带羧基的微球上，形成d n a 一磁性微球复合物，经洗脱得到的高纯度d n a 可以直接用于酶切、测序和p c r 反应。以磁性微粒作为固相载体，也可直接用于扩增产物或基因组的测序1 2 0 2 。磁性微粒不会影响测序酶活性，且这种直接采用固定于磁珠表面的d n a 模板进行测序可避免费时的亚克隆、乙醇沉淀、酚萃取和离心等繁琐步骤。u h l e n 等【2 2 1 和r o l l s 等【2 3 】用磁粒作为固相载体对测序工作的半自动和全自动化进行了尝试，r o l l s 的测序系统每周的分析能力可达3 0 0 0 0 - - 4 0 0 0 0 个碱基。另外，人们还将磁性分离、样品处理等连续操作自动化以用于临床检验。血液安全是全球广泛关注的焦点，传统的临床诊断方法都属于血清学检测方法，也就是通过检测抗体抗原( 病毒蛋白质) 确定献血者有没有病毒感染。但采用此种方法的检测窗口期都比较长。常规的核酸提取纯化通常需要1 - - 2 小时，而基于磁性微球的手动分离纯化技术可以把分离时间缩短到2 0 - - - 3 0 分钟。基于磁分离技术的全自动核酸提取仪结合核酸扩增技术( n u c l e i ca c i d 锄p l i f i c a t i o nt e s f i n g ，n a t ) 的新型血液病毒筛检技术可将h i v 、h c v 的窗口期从现有2 2 、7 0 天分别缩短到l l 、1 3天，分别缩短5 0 ( 1 1 天) 及8 0 ( 5 7 天) ，因而可大大提高血液的安全性，降低经输血途径传播病毒的风险【2 4 。2 羽。利用超顺磁性微球分离提取核酸，然后再进行n a t 检测实验显示，初始样品中低至1 0 个拷贝的h b v 病毒核酸可以被检测出来。由于磁性分离技术本身的易操作性、低成本及其易于放大性等特性，基于磁性微球分离技术的全自动核酸磁分离纯化系统目前已经商品化且在核酸分离领域显示出其独特的优势和市场竞争性。据报道，2 0 0 5 年n a t 检测试剂全球销售额达1 5 亿美元，占诊断试剂( i v d ) 市场的8 。目前，美国、日本等国家已经全部采用磁分离法提取核酸进行血液筛查，n a t 技术已经逐步取代e l i s a 法成为诊断最佳方法。1 2 4 磁性分离技术在细胞分离领域的应用细胞分离是生物细胞学研究中一种十分重要的技术，细胞分离技术在医疗临床诊断上有广范的应用，如治疗癌症时需要在辐射治疗前将癌细胞从骨髓液中分离出来。传统的细胞分离技术主要采用离心法，利用密度梯度原理进行分离，时间长、效果差。表面结合有单克隆抗体的磁性微球通常称为免疫磁性微球，免疫磁4性微球主要用于细胞分离等方面。由于它能特异性地与靶物质结合并使之具有磁响应性，因此将免役磁性微球与含有靶物质( 欲分离的物质) 的复杂混合物共同培养。则免疫性微球可以通过抗原抗体反应选择性地与靶物质结合，当此化合物通过一个磁场装置时，与免疫磁性微球结合的靶物质就会被磁场滞留，从而与其他复杂物质分离开来。用于细胞分离的免疫磁性微球须具备以下条件：化学性能稳定，不产生凝聚；不与细胞发生非特异性的结合；磁性微球与抗体的结合牢固；磁性微球的大小均匀，磁响应性好，磁性纳米材料的含量均匀一致；磁性微球大小适当，不易被细胞所吞噬。细胞磁免疫分离技术是基于磁性纳米颗粒表面的抗体与细胞抗原之间的相互作用来实现的，通常可分为直接法和间接法。直接法是指抗体直接连在磁性微球上，然后与靶细胞结合。间接法是指先将细胞与特异抗体混合培养，使特异抗体结合在细胞表面，然后加入预先用抗鼠i g g ( 二抗) 处理的磁性微球，使磁性微球间接地与靶细胞结合。与传统的细胞分离技术如流式细胞仪技术( f a c s )相比，磁性细胞分离技术具有如下优点：( a ) 磁性粒子对细胞的高度特异性通常来自抗体对抗原的特异性识别，因而不会破坏被识别细胞的形态，同时也不影响非识别细胞；( b ) 分离纯度可高达9 5 9 9 9 ；( c ) 分离后不影响细胞的功能和活性；( d ) 分离操作方便、快捷；( e ) 设备简单、费用低廉。m o l d a y 2 9 】等是采用磁性载体技术分离细胞的最初建立者，他将含羧基磁性聚合物微球用荧光染料作了标记，经碳二亚胺活化，在其表面偶联抗体或外源凝集素，对人红血细胞和b 淋巴细胞进行了成功分离。近几十年来，磁性细胞分离技术已广泛应用于细菌，病毒，细胞分离及其相关疾病和癌症的诊断和治疗【3 0 ，3 1 1 ，如从外周血液中去除肿瘤细胞【3 2 1 和视网膜神经节细胞的分离与富集【3 3 1 。f i l e d l 等【3 4 1应用多克隆a n t i f a b 抗体修饰的磁性微球成功地对人c d 4 、c d 8 、c d l 9 和c d 3 4等细胞进行了分离，分离效率达9 9 以上。p a e t i n g t o n l 3 5 】等研究开发了一种磁性微球双参数细胞分离技术，他们先用粒径为5 0 n m 的免疫磁性微球正相分离法在强磁场作用下将样品预纯化，然后用粒径较大的免疫微球在相对较弱的磁场作用下将痕量靶细胞进一步分离出来。由于第一步所用的磁性微球磁相应性弱所以就不影响第二步用弱磁场分离大微球。这种细胞分离技术可以用于分离多种细胞甚至是含量极少的靶细胞，如造血干细胞的分5离。经过近2 0 年的发展，目前在细胞分离与纯化应用领域，德国m e l t e n y i 公司研发的c l i n i m a c s ( 免疫磁性细胞分选) 技术已成为细胞分选的标准方法。m a c s 技术 3 6 1 是一种集合了免疫学、细胞生物学、磁力学等知识于一体的高度特异性细胞分选技术，其主要组成成分为m a c s 微珠、m a c s 分选柱和m a c s 分选器。m a c s微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒。把细胞用m a c s 微珠特异性地标记，磁性标记完后，把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的m a c s分选柱。分选柱里的基质造成一个高梯度磁场。被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，这样就完全可以获得标记和未标记的两个细胞组份，得到的细胞可立即用于后继实验。磁性纳米颗粒在分离癌细胞和正常细胞方面的成功显示出了引人注目的应用前景。单以造血干细胞的分离为例，其主要用于血液和免疫系统的治疗，商业化的分离系统都是采用磁性纳米微球作为分离介质完成的。据统计，每年以两位数快速增长。1 2 5 磁性分离技术在蛋白质分离纯化及固定化酶领域的应用传统的蛋白质分离方法如盐析、有机溶剂沉淀法、膜分离技术和层析技术等，一般是通过改变溶液的p h 值、介电常数、温度或者是离子强度等因素来达到分离蛋白质的目的，操作过程繁琐、耗能、对目的蛋白质的损失很大。以超顺磁性微球为固定相介质对蛋白质进行提纯是一种新兴的蛋白质分离技术，近年来已在免疫分析检测、酶学等领域得到了广泛研究。相较于其他分离手段，磁分离纯化蛋白质技术具有如下优势：1 ) 操作缓和，能确保蛋白质结果的完整性【37 】；可以从蛋白质含量较低的样品中迅速富集浓缩，获得较高浓度的提纯样品 3 8 1 ；纯化步骤简单，甚至可以集细胞裂解与蛋白质分离于一步完成【3 9 1 。免疫磁分离法获得的蛋白质可以不经洗脱直接用于下游生物操作，如e l i s a 、f i a 等【4 0 , 4 1 】。现在，应用磁性颗粒分离蛋白质和多肽的报道日趋增多，如x u 等【4 2 】利用表面修饰有次氮基三乙酸的磁性粒子作为载体，实现了对带有h i s 残基的蛋白质的快速分离。曹宇等1 4 3 j 采用免疫磁性微球成功分离了a 2 b 干扰素，其活性回收率达到8 8 ，纯度大于9 9 。n u s t a d 等人】用甲苯磺酰氯活化的磁性粒子进行l 天冬酰胺酶分离，整个过程只需3 小时，而纯度可达9 9 。菠萝蛋白酶在生物化学、药理学和医药学方面有广6泛的应用，它的分离是人们关注的热点，c h e n 等1 4 5 j 通过p a a 修饰的氧化铁磁性纳米粒子成功地实现了菠萝蛋白酶的分离。d n a r n a 结合蛋白如启动子、基因调控蛋白、转录因子等在正常细胞的控制及疾病( 如癌症) 的研究中起着非常重要的作用。但是这些蛋白在细胞中存活寿命短且含量少，因此，用经典的亲和层析法对其纯化有一定的困难和问题。g a b r i e l s e n 等1 4 6 , 4 7 用亲和素标记的磁性粒子成功地进行了特殊序列d n a 侬n a 结合蛋白的纯化。生物酶是一种非常理想的催化剂，在利用生物酶进行催化反应时往往需要将酶固定化，酶的固定化一方面有助于实现酶与底物以及产物分离，另一方面可以实现酶的重复利用。然而，生物酶因为不能人工合成，其提取过程也非常复杂，故此生物酶的成本非常高，因此，发展新的生物酶的固定和分离技术具有十分重要的应用价值降5 0 1 。g u o 等1 5 1 1 使用c a n d i d a c y l i n d r a c e al i p a s e ( c c l ) 固定的磁性微球载体进行了橄榄油的水解实验，结果发现固定增强了c c l 酶的热稳定性，同时固定后的c c l 酶可重复使用并依然保持其生物活性。r i t t i c h 等【5 2 l 将脱氧核糖核酸酶i固定于h e m a c o e d m a 共聚磁性微球表面，并对其降解质粒d n a 和染色体d n a的作用进行了研究，结果显示被固定的酶可重复使用2 0 次。k o r e c k a i 等【5 3 】则应用磁性颗粒固定水解酶进行了糖蛋白的结构分析。综上所述，应用磁性颗粒固定生物酶具有以下优点：( 1 ) 可快速实现酶与底物和产物的分离，从而提高酶的使用效率；( 2 ) 可提高酶的稳定性并保持其催化活性；( 3 ) 可以改善酶的生物相容性、免疫活性等；( 4 ) 磁性纳米粒子的高比表面积这一特性为同时偶联多种生物酶提供了场所；( 5 ) 适合大规模连续化操作。1 3 在免疫检测领域的应用1 3 1 免疫磁珠技术原理及其特点通常，免疫学检测技术利用抗体一抗原特异性可逆结合原理来测定免疫活性组分的存在和浓度。但是因为检测是在溶液中进行，所以抗原抗体分子彼此的分离比较困难。免疫磁珠技术利用结合有特定单克隆抗体的磁性颗粒在磁力场中的力学移动来分离相应的抗原。该技术具有如下优点：( 1 ) 免疫磁珠在外加磁场的作用下能快速富集、浓缩并分离目标物质；( 2 ) 操作简单并适用于浓度稀的粗提液样品；( 3 ) 特异性强，灵敏度高。71 3 2 免疫磁珠技术的应用现状目前，该技术已在免疫分析与检测领域中得到了广泛的应用。g u e s d o n 等1 5 4 j以磁性聚丙烯酰胺凝胶作载体，表面结合抗兔i g ，对血清中的抗体进行了定量测定。p o u r f a r z a n e h 等【5 5 】则用荧光染料或放射性核素标记的免疫磁性分离载体，非常简单、方便、快速地对标本中的抗原或抗体进行定性和定量检测，使传统的免疫学检测方法得到了革命性发展。p u r u s h o t h a m a 等【5 6 j 将磁性微球与酶联免疫夹心法相结合测定卵清白蛋白，检测限达o 1 n g m l 。陆培芳等【5 7 】将化学发光酶联免疫分析方法与磁性分离技术相结合，提高了实验的准确性、灵敏度和特异性。磁性纳米颗粒的比表面积大，因而可通过表面修饰结合高密度的生物分子，从而提高免疫检测的灵敏度。m a k a r o v s k i y 等【5 8 】用采用免疫磁珠法初步富集后，再结合r t - p c r检测循环血液中前列腺癌细胞，可在8 m l 血中检测到少于1 0 个的前列腺癌细胞。m a l l b u b a i l i 【5 9 】采用免疫磁珠分离，p c r 扩增的方法，检测环境水中污染贾第鞭毛虫包囊d n a ，结果灵敏度为3 x 1 0 0 或3 x 1 0 1 包囊m l 。研究显示基于磁性微球载体的免疫学检测分析具有低特异性和高重复性等优点。沈荣森等【6 0 】将免疫磁珠用于甲状腺素、甲状腺球蛋白等放射性免疫检测分析，结果非特异性结合低，重复性好。s a n t r a 等【6 1 】利用荧光纳米颗粒载体建立了一种新型的荧光标记方法，该方法灵敏度高且稳定性好。免疫磁珠技术也被广泛应用于微生物的检测。如p y l e 等1 6 2 l 采用免疫磁珠法检测食物和水样中的c o l i0 1 5 7 ：h 7 ；t a nw r 6 3 】等用沙门氏菌抗体包被的磁珠对鸡蛋、牛奶和鸡肉食物样品中的沙门氏菌收集后进行选择性培养，结果与标准方法相一致；g a g n e 等m 】采用免疫磁珠分离扁桃体中放线杆菌、胸腺肺炎血清型1 ，结果比直接培育法灵敏度高1 0 0 0 倍。现在，磁分离技术在免疫检测中的应用是比较成熟的一个方面，其检测结果具有很好的线性关系，检测简便，较传统方法这是很突出的优点。经过几十年的发展，磁性免疫检测技术已经逐渐成为免疫分析的重要方法之一，许多免疫检测试剂及自动化免疫检测系统都已经商业化。例如i m m u n i c o n公司发展了基于免疫磁分离和荧光标记法分离、检测人体血液中稀少的癌症细胞的革命性诊断方法。该方法首先用磁性装置和结合了捕获抗体的磁流体分离血液中的上皮细胞，而后用标记了荧光的单抗标记富集的样品，最后通过收集荧光信号和分析得到的图象计算出癌症细胞的数目。美国l e a r y 等【6 5 】的一项研究表明，免8疫荧光磁珠颗粒可有效检测h c v 核心抗原，从而可以显著缩短检测窗口期。该检测方法是用抗h c v 核心蛋白的单克隆抗体捕获血浆或血清中的相应抗原，再用免疫荧光复合物对反应产物进行螯合。结果表明该检测方法的特异性高达9 9 ，与目前市场上的1 6 种h c v 检测试剂盒相比，可使h c v 的窗口期相对缩短2 3 天以上：而对于核酸扩增检测( n a t ) 阴性的患者，窗口期缩短3 4 天以上。此外，对于h c vr n a 阳性但抗体阴性的患者，该方法的检出率 9 7 。m a g n a b i o s c i e n c e 公司( q u a n t u md e s i g n 的子公司) 结合现代物理学与生物学技术研发了磁性分析检测技术( 简称m a r o m ) 。其检测原理是利用超顺磁性纳米颗粒作为标记物，由高灵敏度磁性检测仪测量结合在免疫复合物上磁性颗粒所产生的局部磁场效应而得出所测物质的定量结果。相较于色谱或荧光技术为基础的其他快速诊断法，磁性分析检测技术具有灵敏度高、灵活性大、干扰性低及经济实用等特点，它的一个显著优点是不受有色杂质干扰，可直接用于血液、食品、污水等有色样品的检测【6 6 - 6 8 。把m a r t m 技术平台与l a t e r a lf l o w 快速诊断法及微流体检测( m i c r o f l u i d i c a s s a y ) 等方法兼容整合，可以提供快速准确的得率分析结果。随后，该公司在m a r t m 研发分析系统的基础上又推出了定量免疫测定的新成员：适用于临床床边检测的磁性免疫层析检测系统( m i c t t ms y s t e m ) 。该系统通过检测结合在超顺磁性纳米微粒上的生化物质来提供对生物样品的定量检测数据。通过检测测量磁场强度来表达标记在样品区域的量，采用标记的免疫复合物磁场强度的标准曲线，从而计算出待测生物样品的量。磁性免疫层析检测技术可广泛应用于医药卫生、疾病检测、畜禽检疫、食品安全、环境保护及其它工农业质量检测领域。目前我国的纳米生物技术研究工作还是比较薄弱，许多工作都还是在初期起步阶段，磁性纳米颗粒在生物医学领域的应用也有待于往更宽，更深层次方向发展。从复杂的生物体系中分离，提纯与检测蛋白质，核酸和细胞等生物分子是生命科学和临床医学中一个重要环节。另一方面，高选择性、高纯度，高回收率，尽量少步骤分离且不影响生物分子的生理活性是今后生物分离的重要发展方向之一。磁性分离技术通过磁性分离载体在外加磁场的定向控制下，利用亲和作用，可以一步从复杂的原始生物体系中直接分离出目标生物分子，具有磁性分离的简单方便和亲和分离的高选择性双重优势，因而这一技术为今后生物分子分离和免疫分9析检测提供了一种新的强有力手段。1 4本课题的研究意义及主要研究内容一研究意义各种生物大分子如核酸、蛋白质、多肽等及细胞的分离、提纯和精制是生命科学各研究领域必不可少的组成部分，分离纯化技术的高低对整个生物学的发展具有举足轻重的作用。目前，分离纯化技术向着分离步骤少、耗时短、活性高、成本低及易于实现高通量的方向发展。磁性分离技术适应了这一发展趋势，具有很大的市场潜力。我国目前在磁性纳米或微米材料应用领域的研究尚处于起步和发展阶段，产业化就更在其次了。开展磁性纳米材料在体外分离纯化领域中的应用研究不仅可以促进磁分离技术在应用领域的发展，同时对促进我国纳米材料及其相关应用产品的产业化发展具有重要意义。二主要研究内容由于超顺磁性纳米材料具有超顺磁性、高比表面积和丰富的表面官能基团等特性，而且作者所在实验室在磁性纳米材料的制备方法具有雄厚的研究基础，因而本文针对超顺磁性纳米材料进行了应用研究。首先针对二氧化硅包覆的超顺磁性纳米材料进行了其在核酸提取领域的应用研究。通过分离流程的改进和试剂体系的开发，建立了快速提取质粒d n a 和基因组d n a 的磁分离技术，为促进和发展我国的核酸提取磁分离试剂盒奠定了基础。此外，针对表面氨基或羧基化的磁性纳米材料，通过化学共价交联方法研究了抗体、链霉亲和素及其p r o t e i na 分离载体的制备技术，同时探讨了其在细胞分选和蛋白质分离纯化等领域的应用可行性。另外，本文还针对磁分离应用过程中出现的诸多不便和问题点，设计了价格低廉、小巧实用的配套磁性分离架。本论文共分四章：第一章主要综述磁性材料在生物分离纯化领域的应用现状；第二章为二氧化硅磁性纳米材料在核酸提取领域的应用研究；第三章为生物分离用磁性分离载体的制备及其应用可行性探讨；第四章为体外分离纯化配套用磁性分离装置的设计。l o参考文献【1 】b e a nc pa n dl i v i n g s t o nj d 19 5 9 s u p e r p a r a m a g n e t i s m ja p p lp h y s3 0 ( 4 ) ：s12 0 12 9【2 】s a f a f i ki ，a f a f i k o v , im 19 9 9 u s eo fm a g n e t i ct e c h n i q u e sf o r t h ei s o l a t i o no fc e l l s jc h r o m a t o g rb7 7 2 ：3 3 5 3 3 】g a b r i e l s e noa n dh u e tj 19 9 3 m a g n e t i cd n aa f f i n i t yp u r i f i c a t i o no fy e a s tt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ,m e t h o d si ne n z y m o l o g y2 18 ：5 0 8 - 5 2 5【4 】x i ex ，z h a n gx ，y ub b ，e ta 1 2 0 0 4 p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fs u p e r - p a r a m a g n e t i cn a n o b e a d sf o rd n ai s o l a t i o n c h i n e s ec h e ml e t tl5 ：5 9 7 6 0 0【5 】f a nz h ，m a n g r us ，g r a n z o wre ta 1 19 9 9 d y n a m i cd n ah y b r i d i z a t i o no nac h i pu s i n gp a r a m a g n e t i cb e a d s a n a lc h e m71 ：4 8 51 - 4 8 5 9【6 】p e t e rr l ，s t e p h e ne b ，j o nd ，e ta 1 19 9 8 r e c e n td e v e l o p m e n t so fm a g n e t i cb e a d sf o ru s ei nn u c l e i ca c i dp u r i f i c a t i o n jc h r o m a t o g r a8 1 6 ：1 0 7 111【7 】j a k o b s e nk s ，b r e i v o l de ，h o m e se 19 9 0 p u r i f i c a t i o no fm r n ad i r e c t l yf r o mc r u d ep l a n tt i s s u e si n15m i n u t e su s i n go l i g o ( d t ) m i c r o s p h e r e n u c l e i ca c i d sr e s18 ：3 6 6 9 3 6 7 3【8 】h o m e se ，k o r s n e sl 19 9 0 m a g n e t i cd n ah y b r i d i z a t i o np r o p e r t i e so fo l i g o n u c l e o t i d eo fp o l y ( a )m r n af r o me u k a r y o t i cc e l l s g e n e t a n a lt e c h a p p l7 ：1 4 5 1 5 0【9 】d e a n d r 6 sb ，d e lp o z ovg a l l a r d os ，e ta 1 1 9 9 5 i m p r o v e dm e t h o d sf o rm r n ae x t r a c t i o nf r o mp a r a f f i ne m b e d d e dt i s s u e s b i o t e c h n i q u e s18 ( 1 ) ：4 2 - 4 4【10 】l e ey h ，v a c q u i ev d 19 9 2 r e u s a b l ec d n al i b r a r yc o u pl e dt om a g n e t i cb e a d s a n a lb i o c h e m2 0 6 ：2 0 6 2 0 7【11 】l a m b e r tk na n dw i l l i a m s o nv m 1 9 9 3 e d n al i b r a r yc o n s t r u c t i o nf r o ms m a l la m o u n to f r n au s i n gp a r a m a g n e t i cb e a d sa n dp c r n u c l e i ca c i d sr e s21 ：7 7 5 7 7 6【12 】d a v i dv m ，m a s s i m ol ，j o h nk e 19 8 9 n u c l e i ca c i dh y b r i d i z a t i o na s s a y se m p l o y i n gd a - t a i l e dc a p t u r ep r o b e s a n a lb i o c h e m181 ：3 4 5 3 5 9【1 3 】b o s eaa n ds o n t is v 1 9 9 7 d n ai s o l a t i o nu s i n ga v i d i n - c o a t e dm a g n e t i cn a n o c l u s t e r s ，c o l l o i ds u r f a c eb ：b i o i n t e r f a c e s8 ：19 9 2 0【1 4 】u h l e nm 1 9 8 9 m a g n e t i cs e p a r a t i o no f d n a n a t u r e3 4 0 ：7 3 3 7 3 4 【15 】g a b r i e l s e no s ，h o m e se ，k o r s n e sl 19 8 9 m a g n e t i cd n aa f f i n i t yp u r i f i c a t i o no fy e a s tt r a n s c r i p t i o nf a c t o rt - a n e wp u r i f i c a t i o np r i n c i p l ef o rt h eu l t r ar a p i di s o l a t i o no fn e a r1 1h o m o g e n e o u sf a c t o r n e c l e i cr e s17 ：6 2 5 3 - 6 2 6 7【16 】e l a i s s a r ia ，r o d r i g u em ，m e u n i e rf ，e ta 1 2 0 01 h y d r o p h i l i cm a g n e t i cl a t e xf o rn u c l e i ca c i de x t r a c