（食品科学专业论文）骨骼肌特异性报告基因逆转录病毒载体的构建与验证.pdf

西华大学硕士学位论文 骨骼肌特异性报告基因逆转录病毒载体的构建与验证 食品科学专业 研究生卢胜娟指导教师陈祥贵 中文摘要 目的：卫星细胞( m u s c l es a t e l l i t ec e l l s ) 认为是保留在成年骨骼肌内具有增殖分 化能力的肌源性细胞。建立简便快速的鉴定和筛选骨骼肌卫星细胞的方法对于 卫星细胞培养、研究和应用都具有实际的意义。d e s m i n 是目前知道的表达开始 于骨骼肌卫星细胞并在肌纤维中高表达的标志蛋白。因此以d e s m i n 基因的启动 子元件控制的报告基因可望建立鉴定和筛选骨骼肌卫星细胞的简便方法。本课 题目的是构建逆转录病毒报告基因载体，特异性表达于骨骼肌细胞中，并通过 检测其绿色荧光蛋白表达，验证其在骨骼肌细胞中表达的特异性。并在此基础 上将本实验所构建重组载体制备成逆转录病毒悬液，检测其在分化的p1 9 细胞 中的表达。 方法：( 1 ) 重组载体的构建与鉴定，首先用p c r 法扩增所需要的目的片段， 绿色荧光蛋白和新霉素基因( g f p + n e o ) 和d e s m i n 启动子和增强子( p r o + e n h ) ， 然后利用限制性内切酶和t 4d n a 连接酶，将目的基因连接到经n c oi ， b a m hi ，e e o ri 和s a li 酶切后回收的逆转录病毒载体p s u p e r 线性片段上。 ( 2 ) 重组载体的骨骼肌卫星细胞表达特异性验证：将p s u p e r 和重组载体分别 转染c h o 和c 2 c 1 2 细胞，2 4 h 后，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表 达，采集图片。( 3 ) 逆转录病毒悬液制备及其在分化p 1 9 细胞中的应用，逆 转录病毒悬液转染c 2 c 1 2 和d m s o 诱导分化的p 1 9 细胞，倒置荧光显微镜下 观察绿色荧光蛋白的表达，采集图片。 结果：( 1 ) 通过对构建过程的每一步进行电泳分析，证明了所构建重组载体 是正确的。( 2 ) 重组载体和p s u p e r 转染c h o 和c 2 c 1 2 细胞后，在c 2 c 1 2 细 胞表达水平相当，说明重组载体在c 2 c 1 2 中能够表达，而在c h o 细胞中重组 西华大学硕士学位论文 载体看不到表达，p s u p e r 则具有很高的表达。这就说明了重组载体具有骨骼肌 卫星细胞表达特异性。( 3 ) 制备的逆转录病毒悬液转染c 2 c 1 2 后，绿色荧光 表达效率有所提高但是并不非常明显。在转染了诱导分化的p 1 9 细胞中，发现 了绿色荧光蛋白的表达，据此可以定性判断d m s o 诱导p 1 9 细胞分化为骨骼 肌细胞。 结论：通过电泳分析方法鉴定了所构建载体是正确的，另外在转染c h o 和 c 2 c 1 2 细胞的特异性验证过程中，通过绿色荧光蛋白表达结果分析说明了所构 建载体具有骨骼肌卫星细胞特异性。这为骨骼肌细胞的纯化提供了基础，也为 骨骼肌卫星细胞用于组织工程和基因治疗提供了基础。 关键词：报告基因：绿色荧光蛋白；骨骼肌卫星细胞；d e s m i n n 西华大学硕士学位论文 c o n s t r u c t i o na n dv a l i d a t i o no fs k e l e t a lm u s c l e - s p e c i f i cr e p o r t e r g e n er e t r o v i r a lv e c t o r f o o ds c i e n c e c a n d i d a t el us h e n g - j u a na d v i s o rc h e nx i a n g - g u i a b s t r a c t o b j e c t i v e s ：s k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t e c e l l s a r ec o n s i d e r e da sp r o l i f e r a t i n ga n d d i f f e r e n t i a t i n gm y o g e n i c sc e l l s i na d u l ts k e l e t a lm u s c l e c e l l s e s t a b l i s h i n gt h e s i m p l ea n df a s tm e t h o dt oi d e n t i f ya n df i l t e rs k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t ec e l l sh a st h e p r a c t i c a lm e a n i n gf o r c u l t u r ea n dr e s e a r c ha n da p p l i c a t i o no fs k e l e t a lm u s c l e s a t e l l i t ec e l l s a ss of a r , w ek n o wt h a tt h ee x p r e s s i o no fd e s m i ni si n i t i a t e di n s k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t ec e l l sa n di te x p r e s s e st oh i g hl e v e la sas y m b o lp r o t e i ni n m u s c l em y o b l a s tf i b e r s o ，r e g u l a t i n gr e p o r t e rg e n eb yd e s m i n sp r o m o t e ri sl i k e l y t oe s t a b l i s hs i m p l em e t h o d st oi d e n t i f ya n df i l t e rs k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t ec e l l s a r e p o r t e rg e n ev e c t o rw i t hd e s m i n sp r o m o t e ra n de n h a n c e rw a sc o n s t r u c t e da n d v a l i d a t e dw h e t h e ri te x p r e s s e ds p e c i a l l yi ns k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t ec e l lo rn o tb y c h e c k i n gg r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n s ( g f p ) se x p r e s s i o n a tt h eb a s eo f i t sr i g h t c o n s t r u c t i o n , r e t r o v i r a ls u p e r n a t a n t sw e r ep r e p a r e da n dc h e c k e di t se x p r e s s i o nl e v e l i nd i f f e r e n t i a t e dp 1 9c e l i s m e t h o d s ：( 1 ) t h ec o n s t r u c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n e dv e c t o r ：f i r s t , t h e r e q u i r e dd n as e g m e n t s g f pa n dn e o m y c i ng e n e ( g f p + n e o ) a n d t h ep r o m o t e r a n de n h a n c e r o f d e s m i n ( p r o + e n h ) ，w e r e g o t b y p c r t h e n r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e a n dt 4 a s ew e r eu s e dt om a k et h er e q u i r e dg e n ec o n n e c tt ol i n e a rs e g m e n to f r e t r o v i r a lp s u p e r , w h i c hw a sc u tb yn c o i ，b a m h i ，e c o r ia n ds a li ( 2 ) v a l i d a t i o no ft h er e c o m b i n e dv e c t o r se x p r e s s i o ns p e c i a l i t y ：r e c o m b i n e dv e c t o r a n dp s u p e rw e r et r a n s f e c t e di n t oc h oa n dc 2 c 1 2c e l l s ，a f t e r2 4i l , g f pw a s 1 1 i 西华大学硕士学位论文 o b s e r v e db yc o n v e r t e df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ea n dt h ep i c t u r e sw e r ec a p t u r e d ( 3 ) r e 仃o v i m ls u p e m a t a n t sw e r ep r e p a r e da n dt r a n s f e c t e di n t oc 2 c 1 2a n dp 1 9 c e l l s a f t e r2 4 h ，g f pw e r eo b s e r v e db yc o n v e r t e df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ea n dt h e p i c t u r e sw e r ec a p t u r e d r e s u l t s ：( 1 ) e v e r ys t e po fr e c o m b i n e dv e c t o r sc o n s t r u c t i o nw i t si d e n t i f i e db y t e l e c t r o p h o r e s i s ，a n di tc o n f i r m e dt h a tr e c o m b i n e dv e c t o rw a s c o n s t r u c t e dc o r r e c t l y ( 2 ) a f t e rb e i n gt r a n s f e c t e di n t oc h oa n dc 2 c 1 2c e l l s r e c o m b i n e dv e c t o ra n d p s u p e re x p r e s s e dg f pa t t h es a m el e v e li nc 2 c 1 2c e l l s b u tr e c o m b i n e dv e c t o r d i d n t e x p r e s s i nc h oa n dp s u p e re x p r e s s e da ta h i 【g hl e v e l ( 3 ) r e t r o v i r a l s u p e m a t a n t sw a sp r e p a r e da n db e i n gt r a n s f e c t e di n t oc 2 c 1 2c e l l sa n dp 1 9c e l l s ，t h e e x p r e s s i o no fg f p + n e oi nc 2 c 1 2i sal i t t l eh i g h e rt h a nt h a to fp l a s m i d ，b u tn o t m o r e g f pw a so b s e r v e di nd i f f e r e n t e dp 1 9c e l l s ，w h i c hi n d a c a t e dt h a td m s o c o u l di n d u c ep 1 9c e l l st od i f f e r e n ti n t os k e l e t a lm u s c l ec e l l s c o n c l u s i o n s ：t h et e l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i si d e n t i f i e dt h a tr e c o m b i n e dv e c t o rw a s c o r r e c t t h er e s d t o ft r a n s f e c t i o ns h o w e dt h a tr e c o m b i n e dv e c t o rh a dt h e e x p r e s s i o ns p e c i a l i t y i ns k e l e t a lm u s c l ec e l l sa n dr e t r o v i r a l s u p e m a t a n tw a s p r e p a r e d , w h i c hw e r et h eb a s eo ft h ep u r i f i c a t i o no fs k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t ec e h a n dg a v et h en e wh o p et ot i s s u ee n g i n e e r i n ga n dg e n et h e r a p y k e yw o r d s ：r e p o r t e rg e n e ；g r e e n - f i u o r e s c e n tp r o t e i n ；s k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t e c e l l ；d e s m i n i v 西华大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师陈祥贵教授指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西华大学或 其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 研究生签名： 营耻蛹 时间：沁可年s 月s 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解西华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意西华大学可以用不同方式在不同媒 体上发布、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：1 复帷娟 导师签名阵社 时间：溉7 年多月b 日 蹦躯j 如i 每拜j 孥日 西华大学硕士学位论文 l 前言 1 1 骨骼肌肌卫星细胞的概述 成肌细胞是指胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞，包括心肌、平滑肌及骨 骼肌在内的三种肌组织，其胚胎发育都经历了由间充质细胞分化为成肌细胞， 再进一步分化为成熟肌细胞的过程。成熟个体的心肌组织与平滑肌组织都不含 成肌细胞，而骨骼肌组织中的成肌细胞则是以骨骼肌卫星细胞的形式存在，正 常是参与骨骼肌损伤修复的成肌细胞就是卫星细胞。根据损伤骨骼肌激活肌卫 星细胞的原理，采取刺激成年大鼠及猴骨骼肌的方法，将骨骼肌卫星细胞激活 为成肌细胞。正常情况下，骨骼肌卫星细胞具有一定分裂、增殖能力，卫星细 胞的数目不会随时间增加而增加。因为分裂产生的成肌细胞会融合入邻近的肌 纤维中，使肌纤维细胞核增加，可达数百个，同时使肌纤维增粗、变长，完成 肌纤维的发育。 1 1 1 概念 骨骼肌细胞是单核细胞，由胚胎的生肌节和各处的间充质细胞分化而成， 位于成熟肌肉的基膜与肌原纤维的血浆管之间。他们是有丝分裂般静止的，除 非对骨骼肌组织进行刺激，但是当骨骼肌损伤时，他们激活开始增殖、分化， 然后彼此融合形成多核肌管【1 2 】。 肌卫星细胞( m u s c l es a t e l l i t ec e l l s ) 被认为是保留在成年骨骼肌内具有增 殖分化能力的肌源性下细胞。长期以来，卫星细胞被认为是单潜能干细胞( 即 只具有分化形成成肌细胞系的能力) 。但是近来的研究对此提出了疑问。很多 实验进一步提示卫星细胞与定向成肌细胞不同，它可能是多潜能干细胞，只是 在特定的微环境和调节因子的作用下才分化形成定向成肌细胞。肌卫星细胞在 足月胚胎肌组织中含量最多，新生儿仍保持相当多的卫星细胞。随着个体生长、 发育，卫星细胞不断减少，直至维持一定的基数。个体一生中都有卫星细胞分 裂、增殖，大量的卫星细胞在生长过程中融入到相邻的肌纤维，致肌纤维直径 增大，不断产生新的肌小节而使肌纤维变长，进而肌肉变长。融入的卫星细胞 核也变成了肌细胞核，而使细胞核数目增加，这些都为了肌组织生长提供了有 西华大学硕士学位论文 力的保障。 1 1 2 卫星细胞的起源 有一种假说认为，骨骼肌前体细胞，包括肌卫星细胞群起源于体节的多潜 能的中胚层细胞【3 4 】。但是卫星细胞在肢体发育过程中，是作为一个独立的细胞 系起源于体节，还是起源于已经存在的细胞系( 例如胚胎或胎儿的肌母细胞) ， 现在还不清楚。明确的是，每个肌母细胞的前体细胞( 像胚胎、新生儿的肌母 细胞以及卫星细胞) 都是体节的衍生物。 还有一种假设认为无体节来源的多潜能细胞可能是卫星细胞的前体细胞 1 5 。d ea n g e l i s 等t 6 】的报告指出，从胚胎背部大动脉分离出的细胞与卫星细胞具 有相似的形态学表现和基因表达的特点。而且，将大动脉起源的肌细胞移植到 刚出生的小鼠的实验显示，该细胞群参与出生后肌肉的生长、再生和与卫星细 胞的融合。因此，现在研究者指出卫星细胞可能来源于内皮细胞或者来源于一 种是卫星细胞和内皮细胞共同起源的前体细胞。 卫星细胞体节来源和无体节来源并不相互排斥。两种细胞系可能分别变化 成为生理或是病理状态下的卫星细胞群。这需要进一步实验继续证实和分析存 在于成熟骨骼肌中的所有卫星细胞的细胞系来源。 1 1 3 成肌细胞的发育 1 1 3 1 骨骼肌细胞发育【7 】 骨骼肌细胞发育包括3 个阶段：由胚胎的体节细胞出现细胞决定( 分化 方向) ，并分化为成肌细胞；成肌细胞向胚胎肢芽迁移并保持增殖能力： 成肌细胞停止分裂，彼此融合成多核体细胞( 或肌管) ，伴随细胞融合的出现。 对骨骼肌发育及其功能有关的各种肌细胞特异基因的表达使其分化为成熟的 骨骼肌细胞。己鉴定出4 种控制骨骼肌细胞发育的基因：m y o d 、m y f 5 、m y o g e n i n 及m r f 4 ，分别表达相应的m y o d 、m y f 5 、m y o g e n i n 及m r f 4 蛋白，统称为m y o d 家族蛋白。这些蛋白均具有碱性螺旋环螺旋( b h l h ) 结构，属d n a 结合蛋 白并行使转录因子的功能。m y o d 家族蛋白在形成同源及异源二聚体后可与基 因调控区中的c a n n t g 序列( 又称e 盒) 相结合，通过d n a - p r o t e i n 相互作 西华大学硕士学位论文 用，m y o d 构象改变从而诱导肌细胞特异性的基因转录。 m y o d 家族基因敲除对小鼠骨骼肌细胞分化发育的影响l s l 实验得到如表1 所示结果。结果分析显示，从体节细胞分化为成肌细胞时需m y o d 和m y f 5 两 种蛋白，m y o g e n i n 蛋白对成肌细胞融合并分化为成熟的骨骼肌细胞必不可少。 细胞融合前只有m y o d 及m y f 5 基因表达，m y o g e n i n 基因只有在细胞融合发生 后表达，且受m y o d 及m y f5 表达的诱导。m y o d 及m y f5 基因控制体节细胞 分化为成肌细胞，而从成肌细胞发育为成熟的骨骼肌细胞则依赖于m y o g e n i n 基因。 表hm y o d 家族基因敲除对小鼠骨骼肌细胞分化发育的影响 t a b l el ：t h ei n f l u e n c eo i ld e v e l o p m e n to f m i c es k e l e t a lm u s c l ec e l l sb yk n o c k i n g ! 墨尘! 翌罂里g 竺! ! 独i ! z 基因 室型型巴望窒堕 敲除 存活成肌细胞 肌细胞 蛋白功能 1 1 3 2 成肌细胞融合激活特异性蛋白基因 成肌细胞中，肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、肌钙蛋白( 与肌肉收缩 有关) 、磷酸肌酸激酶及乙酰胆碱受体( 传递神经刺激) 等特异性蛋白的基因 活性处于休止状态。成肌细胞融合后，开始激活表达并使之最终分化为形态及 功能成熟的骨骼肌细胞。 在胚胎形成期，中胚叶细胞通过在体节中表达m r f s 成为骨骼肌细胞， m r f s 是b h l h 转录因子家族通过d n a 结合元件e 盒来调控骨骼肌特异性基 因的表达。m r f s 与转录因家族m e f 2 协调作用。m e f 2 的骨骼肌特异性启动 子中包含m a d s 盒并且结合与m e f 2 位点上。周围组织的诱导作用和信号导 西华大学硕士学位论文 致体节形成肌刀。p a x 3 ，大量的成对转录因子家族在发育中的体节中表达，标 记肌浆蛋白细胞的早期特性，看起来像是作用于m y o d 的上游。很多问题包括 什么控制p a x 3 的表达及p a x 3 如何调控m y o d 仍然没有被回答。 1 1 4 成肌细胞的体外培养及其存在问题 体外培养成肌细胞，观察其增殖与分化过程，即为体内骨骼肌发育或再生 初始阶段的翻版。深入了解体外的分化过程【9 1 ，能更好地调控对应的体内过程。 骨骼肌卫星细胞属于组织干细胞，其体外培养的优点是取材方便，产量大，具 有较强的增殖分化能力，营养条件好，如培养基中加入l o 2 0 的动物血清 ( 即生长培养基) ，成肌细胞以分裂、增殖为主。 1 9 6 1 年m a u r o 首先发现了肌卫星细胞，并推测肌卫星细胞实质上是一种处 于休眠状态下的成肌细胞，是肌细胞核的一种来源。肌卫星细胞作为肌组织工 程技术的种子细胞，它的体外培养、鉴定及生物学特性已有大量实验研究，取 得了显著的成果 1 0 , 1 1 , 1 2 】。并证明体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与 分化能力，适用于组织工程和基因治疗。 1 1 4 1 培养肌卫星细胞的材料来源 目前多取白兔、鼠、犬等的肌肉组织，人体肌卫星细胞的培养已有报道【1 3 】， 培养方法多采用胰酶、胶原酶分步消化，分离出单个成肌细胞，通过差速贴壁 法去除混杂的成纤维细胞，再进行单层细胞培养。基本步骤是【1 4 】：分离出 培养肌卫星细胞所需的肌肉段，用机械及酶消化去除结缔组织等。将肌肉段 离心，提取细胞成分进行差速贴壁法纯化培养。进行传代培养以扩增。关键 是尽可能减少成纤维细胞的污染及保持肌卫星细胞较长时间的生存增殖能力。 1 9 8 1 年b l a u 等发现胚胎来源的成肌细胞每一个都能分裂倍增6 0 - 7 0 次，成熟个 体来源的成肌细胞也能分裂倍增4 5 次。若每次取0 3e m 3 组织进行酶消化培养， 能获得大约5 x 1 0 3 个有分裂能力的卫星细胞，产生5 x 1 0 1 0 个成肌细胞，相当于1g 成肌细胞，足以进行各种细胞移植或组织工程的相关研究。 1 1 4 2 骨骼肌卫星细胞的形态及生长特性【1 5 】 倒置显微镜下，刚分离出的原代骨骼肌卫星细胞呈球形，折光性强培养1 2 小时后，细胞贴壁，仍为圆形；7 2 d , 时后贴壁完全，细胞逐渐延展成梭形或纺 西华大学硕士学位论文 锤形，中间夹杂少量未过滤掉的肌纤维碎片。随着培养时间的延长，细胞增殖、 迁移并逐渐规律性地沿一个方向平行排列。 原代骨骼肌卫星细胞的贴壁能力较差，如使用一般的玻璃或一次性培养 瓶，则细胞不能贴壁而死亡。因此必须使用预先经过l 多聚赖氨酸或i 型胶原等 处理过的培养瓶，以促进骨骼肌卫星细胞的良好贴壁与生长。骨骼肌卫星细胞 所要求的培养条件较高，一般需要2 0 的胎牛血清和0 1 的鸡胚提取液，否则 增殖速度慢且容易老化。当细胞融合到8 0 以上后，不需分化培养基即可自发 性地相互融合，形成肌管。传代细胞3 0 分钟即开始贴壁，1 2 小时贴壁完全，增 殖速度较原代细胞明显加快。培养8 代的细胞，细胞形态较为规则、一致，细 胞增殖速度快。而传至第9 代后，细胞形态逐渐出现多样性，特别是出现大量 扁平而不规则的细胞，胞浆内颗粒增多等改变。说明随着培养时间的延长，杂 质细胞比例逐渐增加，从而影响骨骼肌卫星细胞的增殖。 1 1 4 3 肌卫星细胞原代培养存在的问题 肌卫星细胞原代培养的主要环节是纯化问题，在分离肌肉卫星细胞培养 时，经常混杂有少量纤维细胞和红细胞，而红细胞因为不贴壁会随每次换液而 被除去，成纤维细胞的生长速度快，会严重阻碍肌卫星细胞的生长。以往采用 p e r c o l l 不连续等密度离心来分离非肌源性细胞和卫星细胞，但获得的细胞数量 明显减少。另外国内用的较多的差速贴壁法，其原理是因为混杂的非肌源性细 胞主要是成纤维细胞，其贴壁能力强于肌卫星细胞。但有研究显示，采用此种 疗法细胞纯化率最多仅能达到4 0 ，分析其原因：首先是贴壁时间难以掌握， 不可能使所有成纤维细胞贴壁；其次是较难剔出与卫星细胞贴壁时间类似的非 肌源性细胞。 高纯度的肌卫星细胞需要选择更加高效的纯化方法，主要包括：利用细胞 的体积和密度进行纯化，如密度梯度离心和逆流淘析分离技术；应用选择性的 细胞凝集技术进行纯化；利用细胞表面标志进行分离纯化 1 6 】，如免疫溶解、流 式细胞分选术、平面黏附分离法和免疫磁珠分选技术等。综合这些方法：采用 流式细胞仪筛选方法，所得卫星细胞的纯度虽然很高，但是需要针对某种动物 卫星细胞的单克隆抗体；免疫磁珠分选技术费用昂贵；平面黏附分离法和选择 性的细胞凝集技术纯化效率相对较为低下。 西华大学硕士学位论文 1 1 5 骨骼肌卫星细胞的分化与鉴定 骨骼肌卫星细胞的分化过程【7 】为：首先分化为成肌细胞；随后成肌细胞 逐渐平行排列，相互融合在一起，形成细胞核在中央、肌丝在周边的肌管；随 着分化过程的深入，肌丝不断生长并形成肌原纤维，细胞核则逐渐靠向周边， 从而形成肌纤维。虽然细胞的高密度培养能促进分化，但为便于实验条件的控 制，必须使用客观、易行的促分化培养方法。在体外培养条件下，主要是通过 降低培养基中动物血清含量来实现。研究一般采用马血清作为促进骨骼肌卫星 细胞分化的分化培养基。 一旦成肌细胞长满整个培养瓶，相互接触时，增殖将明显受到抑制，表现 为相邻成肌细胞相互融合，形成肌小管，即表现出分化倾向。降低培养液中营 养条件，如动物血清不超过5 ( 即融合培养基) 能明显促进分化，使单位数 目的成肌细胞形成肌小管的百分比增加。初始形成的肌小管的多个细胞核沿细 胞中心轴线排列形成中心核链，而合成的少量肌原纤维则位于周边。随着分化 的继续，肌原纤维大量生成，逐渐占据细胞中心部位，迫使中心核链的核移向 周边，即形成幼稚肌纤维，此时，经特殊染色可见到横纹。肌管形成是骨骼肌 卫星细胞分化的标志，除形态上的变化外，部分骨骼肌特异性蛋白的合成与表 达也是分化的重要标志，可将此作为骨骼肌卫星细胞的鉴定指a s a r c o m e t r i c a c t i n 和m y o s i n 为骨骼肌的结构蛋白和功能蛋白，也是骨骼肌所特有的蛋白。 1 1 6 卫星细胞的识别 l i l 6 1 解剖上的识别 一般情况下，只有在电镜下才能清楚地看到卫星细胞。从形态学特征上讲， 静息状态下的卫星细胞的细胞器较少，高核质比率，细胞核与相邻的肌管细胞 的核相比较小，与肌细胞核相比其异染色质的量较高。这些形态学上的特征与 卫星细胞相对静止和缺乏转录活性是相一致的。当卫星细胞被激活后，细胞表 现出肿胀，细胞一极或两极形成细胞质突起和延伸。并伴随有丝分裂活动增加、 异染色质量下降、质核比率升高和细胞内细胞器数目增加【1 羽。 1 1 6 2 卫星细胞的标记物 通过对卫星细胞标记物的鉴定，可以明确卫星细胞的起源、细胞的周期调 西华大学硕士学位论文 控以及卫星细胞在生长和再生过程中的分子调节过程。目前几种卫星细胞的标 记物已经确定，并且可以通过这些标记物明确各种静止的、激活的或增殖期的 卫星细胞，或者被更广泛地表达。 1 1 6 2 1 肌钙蛋白 人肌钙蛋白( t r o p o n i n ，t n ) 是参与调节肌肉收缩过程的一种三元复合物 蛋白质，分子量7 6k d 。它由3 种亚基组成，分别为肌钙蛋白t ( 原肌球蛋白结 合亚基，t n t ，m3 7k d ) 、肌钙蛋白i ( 抑制亚基，t n i ，m 2 1k d ) 和肌钙蛋 t i c ( c a 2 结合亚基，t n c ，m1 8 k d ) 。肌钙蛋白在肌肉收缩中的作用已十分 明确：t n t 含有原肌球蛋白的结合部位，能结合到原肌球蛋白上；t n i 为肌动蛋 白a 1 1 p 酶的抑制物，抑制肌动蛋白和肌球蛋白间的相互作用【”捌；t n c 与c a 2 结 合，调节t n t 、i 和收缩系统其它组分间的相互作用。此外，也在其它非肌肉 组织( 包括软骨) 中也发现存在参与肌肉收缩过程中的多种蛋白质如t n c 、1 u 、 肌动蛋白【2 1 捌等，但其作用不清楚。 t n c 是与钙结合的靶分子，是最早发现并明确其生理功能的一种钙调蛋白。 t n c 有两种异构型：慢肌肌钙蛋白c ( n c 1 ) 和快肌肌钙蛋白c ( t n n c 2 ) 。 t n n c l 调控骨骼肌慢肌和心肌的收缩，t n n c 2 调控骨骼肌快肌收缩。 t n n c 2 基因是肌钙蛋白c 的一种，它调控骨骼肌快肌收缩最主要的蛋白。 大量研究发现，t n n c 2 基因蛋白的表达受发育调节或基因转录和转录后调控， 并且t n n c 2 基因在骨骼肌中的表达调控机制是一个极好的研究发育调控模型 系统。t n n c2 基因仅在高纤维型肌肉组织中表达，比如：骨骼肌快肌；而在 骨骼肌慢肌和心肌中不表达【2 3 】。n o r t h e m 杂交表明，t n n c2 基因在成年兔骨骼 肌( 手指、足趾、前胫骨肌肉) 表达而在心脏、肾脏、肝脏、肺脏中不表达刚。 且有研究【2 5 】的r t - p c r 组织表达谱分析发现，t n n c 2 基因仅在猪骨骼肌( 肱二 头肌、股四头肌、背最长肌) 中表达，而在其他组织( 心、肝、脾、肾、胃、 脂肪) 不表达或低表达，以至于r t p c r 方法检测不到。研究结论证实了t n n c 2 基因表达具有较强的组织特异型，并且它仅在高纤维型的肌肉中表达。 1 1 6 2 2 肌球蛋白 肌球蛋白是肌肉中粗肌丝的主要成分【2 6 1 ，为长形不对称分子，形状如叩 字形，是多聚体生物大分子。电镜下观察含有两条相同的长肽链和两对短肽 西华大学硕十学位论文 链，组成两个球状头部和长杆状尾部。长肽链也称重链( m y o s i nh e a v yc h a i n ， m h c ) ，短链也称为轻链( m y o s i nl i g h tc h a i n ，m l c ) 。肌球蛋白的重链构 成多聚体分子的主干，两条重链碳末端相互缠绕形成一螺旋杆状物，氮末端分 离，和轻链一起形成肌球蛋白的头部。肌球蛋白不仅是骨骼肌重要的结构蛋白 和功能蛋白，同时肌球蛋白的头部具有a t p 酶的活性，对肌肉收缩过程中能量 的代谢起着重要的催化作用，也称肌球蛋白a t p 酶。肌肉收缩的特性随不同个 体、肌肉不同的分布位置、机械刺激、神经支配、营养等因素的差异而表现出 不同的收缩性能，显示出极强的多型性的特点，这使得骨骼肌纤维对环境具有 极强的适应性和可塑性。 肌球蛋白广泛存在于真核细胞中，除作为细胞结构的一部分参与细胞骨架 的构建，其主要的功能是为肌肉的收缩提供动力。经典的肌原纤维滑行学说认 为肌肉收缩是由于肌动蛋白组成的细丝和主要由肌球蛋白组成的粗丝相互滑 动的结果。随着分子生物学的发展，需要更进一步从分子水平对这一理论加以 验证。目前的一些研究结果对滑行学说提出了不同的解释，具代表性和影响力 的主要有摆动杆臂模型和线性马达模型。肌球蛋白也广泛存在于非肌细胞中， 为细胞骨架的组成部分，为细胞质流动、物质的转录、细胞器的运动、有丝分 裂、胞质分裂和细胞的顶端生长等提供所需的力，另外还参与细胞的吞噬、运 动、受精和吸收等生理过程，充当非肌细胞间信号的传递介质。 1 1 6 2 3d e s m i n 2 7 d e s m i n 是肌细胞骨架中的一种中间丝蛋白，它是横纹肌和平滑肌中一种特 殊的骨架蛋白。在维持肌原纤维形态以及肌小节之间发生信息传递方面起重要 作用。在生肌过程中，未分化的生肌前体细胞在表达肌原纤维蛋白，如衄i n ， 骨骼肌a c t i n 、m y o s i n 重链和n e b u l i n 等之前先行表达d e s m i n ，因而d e s m i n 能特异 的标记再生骨骼肌中的生肌前体细胞。 d e s m i n 是一个骨骼肌特异性细胞骨架蛋白，属于一类以1 0 n m 直径的细胞 骨架结构为特征的中间细丝( i f ) 家族。在这个家族中有五个主要类型，每个 类型有一个独特的形态并在成熟组织细胞中分布。它们的表达被分步调控并且 表现为组织特异性。v i m e m i n 在间叶细胞样和肌肉、神经系统组织的起源细胞 中表达，k e m t i n 在上皮细胞和上皮细胞起源细胞中表达，神经胶质纤维状酸性 西华大学硕士学位论文 蛋白在神经胶质中表达，神经细丝在神经细胞中表达，d e s m i n 在平滑肌和骨骼 肌中表达。 在肌源性细胞分化期间，多于二十种基因被协同诱导。d e s m i n 的合成不同 于大部分基因，它具有在未分化的增殖成肌细胞内被抑制，而随着成肌细胞融 合而表达的特点，因此它在增殖的成肌细胞中起始，至肌细胞分化时积累至一 个高水平口8 捌。现在研究已表明，位于相对于转录起始位点的9 7 3 暑1 1 6 9 3 b p 之_ 间的区域为骨骼特异性增强子，是d e s m i n 的高水平表达正调控元件。在负区之 后，发现了另一个在- 2 2 8 至u + 7 5 之间的正区，这个正区包含典型的t a l a 盒和转 录起始位点，被称为d e s m i n 启动子。z h e n g l i nl i 研究已表明9 7 3 和6 9 3 b p 之间 的2 8 0 b p 的转录增强子能够以自由的方向、位置和距离激活同源的或非同源的 启动子。一个显著的特征是这个增强子不仅能够在肌管里起作用，而且能在成 肌细胞里面起作用。这个区别于其他骨骼肌特异性增强子，例如鼠骨骼肌肌氨 酸激酶增强子。 1 1 6 2 4 肌细胞核因子( m n f 或f o x k l ) 肌细胞核因子是有翼螺旋转录因子家族中的一个成员，在成熟骨骼肌静止 期的卫星细胞中表达。m n f 有两种同工型：m n f a 和m n f b 【删。这两种亚型 在生肌和肌肉再生中表达情况相反。m n f a 主要表达在静止的卫星细胞中，而 m n f p 主要出现在肌肉损伤后卫星细胞的增殖过程中【3 1 1 。这说明m h i f 这两种亚 型，在肌肉再生或是卫星细胞的更新过程的不同阶段，可能对目的基因产生相 反的作用。m n f 基因位点的裂变，两种亚型的突变，将导致肌组织严重的生长 缺陷，骨骼肌的再生能力明显受到损害，在m n f 突变的成年骨骼肌中的卫星细 胞的数目将降低。 1 1 6 2 5 肝细胞生长因子受体( c - m e t ) c o m e l i s o n 和w o l d 3 3 】利用单细胞r t - p c r 分析，根据细胞基因表达的特征 认为卫星细胞是非均一的细胞系。而且，他们确定c m e t ( 肝细胞生长因子受 体) 是一种静止期卫星细胞的标记物。对卫星细胞来说，h g f 是一种潜在的细 胞有丝分裂素，它在肌前体细胞从体节迁移到发育的肢体的过程中发挥着重要 作用。而且，c - m e t 缺陷的胚胎，由于缺少肌前体细胞而不能形成肢体骨骼肌 跚。 西华大学硕士学位论文 1 1 6 2 6m 钙粘蛋白( m c a d h e r i n ) i r i n t c h e v 和他的同事确定m 钙粘蛋白，一种钙离子依赖型的细胞粘附分 子，是卫星细胞的独特标记物。m 一钙粘蛋白只表达于一个静止细胞池的亚群中， 但当卫星细胞受到刺激被激活后，其表达增加【3 5 1 。近期的研究显示，其它的细 胞粘附分子如神经细胞粘附分子( n c a m ) 、血管粘附分子1 ( v c 妯江1 ) ， 也是静止期卫星细胞潜在的标记物。这些粘附蛋白分子的作用我们还不明确， 但总结起来，它们( n c m a ，v c a m 1 ，m 钙粘蛋白) 可能与卫星细胞粘附到 肌纤维的基底膜有关，并可能参与肌卫星细胞受到刺激后细胞的迁移。n c a m 在肌纤维和卫星细胞中都能表达，而v c a m 1 在胚胎发育期大量表达，但在成 熟的骨骼肌中仅限卫星细胞表达。另外，v c a m 1 也可以介导损伤后卫星细胞 同白细胞之间的相互作用 3 6 1 。 1 1 6 2 7 肌动蛋白 肌动蛋白是肌丝的主要成分，目前发现主要有3 种类型，即a 、p 、t 型。其 中b 、1 ，型大部分存在于非肌肉细胞中，而a 型存在于肌肉细胞中，约占骨骼肌 总蛋白的1 2 【3 刀。a - s a r c o m e d c a c t i n 是横纹肌肌动蛋白，仅存在于骨骼肌和心 肌，不存在于平滑肌。它属于收缩蛋白，是肌细胞舒缩活动的物质基础。 a - s a r c o m c t r i ca c t i n 为骨骼肌的结构蛋白和功能蛋白，也是骨骼肌所特有的蛋白， 蛋白单克隆抗体经常被用于免疫化学染色，来作为骨骼肌及卫星细胞的鉴定指 标。 对其他卫星细胞的标记物的鉴别仍是现今研究的重点，主要有细胞表面抗 原s c a 1 1 3 8 1 ，糖蛋白k u 1 9 3 9 1 ，抗凋亡因子b c l - 2 1 4 0 ，c d 3 4 1 4 1 】和干扰素调节因 子2 ( 介导v c m a 1 在骨骼肌中表达的转录因子) 。 1 1 7 研究进展及研究意义 哺乳动物的骨骼肌卫星细胞大约为2 5l u n x 4i n nx 5 哪，位于肌纤维的肌膜 与基底膜之间。一旦骨骼肌组织受到损伤，卫星细胞就会被激活，大量分裂、 增殖，相互融合形成再生肌纤维。围绕骨骼肌组织的再生过程已进行了大量关 于成肌细胞的研究，主要包括以下四个方面：成肌细胞在骨骼肌组织再生过 程中的重要作用；成肌细胞体内、体外生物学特性；成肌细胞移植作为基 西华大学硕士学位论文 因治疗的研究；成肌细胞与材料复合的组织工程研究。 虽然。至今为止某些物种的卫星细胞的体外初期培养系统已经被介绍，例 如猪、牛、啮齿动物、人、火鸡和马，但是因为在成年组织中他们的相关性不 足而且在初期培养物中有非肌源性细胞的存在 4 2 】，有时候在这些粗略的系统 中，获得关于卫星细胞内在的和外在的调控的详细信息是困难的。为了消除肌 源性细胞和非肌源性细胞之间潜在的p a r a c r i n e 作用，卫星细胞的克隆分析 法已经被提出 4 3 1 ，但是几个因子例如培养基、血清和培养液的最优化仍然是试 验和误差的主要问题。 o k a n o 等 4 4 1 将肌卫星细胞混合于i 型胶原溶液中，并置于3 7 孵箱内，形成 含肌卫星细胞的i 型胶原凝胶，在凝胶过程中，根据不同的模型铸成星状、管 状或片状结构，体外培养发现，肌卫星细胞仍能在凝胶铸形中分化形成肌小管， 但这一技术尚不成熟。目前研究较多的是肌卫星细胞的体外培养及增殖，将该 细胞移植到体内的成肌效应目前研究甚少。因为肌组织工程技术距临床应用还 有很大的差距，所以还需大量的研究工作来完善肌组织工程技术，为临床应用 打下坚实的理论与实验基础。 2 0 0 0 年，日本兽医学博士山内启太郎【4 2 】发表了通过转染a 肌动蛋白启动 的e g f p 鉴定骨骼肌卫星细胞，在该研究中，用含a 肌动蛋白启动子和e g f p 报告基因的质粒转染小鼠细胞，通过免疫组化分析实验，证明了用于启动e g f p 表达的a 肌动蛋白启动子只能在肌源性细胞中被激活，并提出如果和f a c s 混 和使用将成为分离骨骼肌卫星细胞的有用工具，这为现如今存在的难题带来了 新的解决方法。 体外培养的骨骼肌星细胞主要用于组织工程【4 5 】和基因治疗 4 6 1 两个方面。骨 骼肌卫星细胞属于组织干细胞，其体外培养的优点是取材方便、产量大、具有 较强的增殖、分化能力。在适当的条件下可向成肌细胞、成软骨细胞和成骨细 胞等多个方向分化。 近年来随着细胞生物学、分子生物学及材料科学等相关学科的发展，组织 工程研究取得了突飞猛进的发展。组织工程化组织的构建过程包括：种子细胞、 生物材料及两者联合培养后体内植入，其中种子细胞为最基本的环节。而骨骼 肌组织工程的理想种子细胞为骨骼肌卫星细胞。 西华大学硕士学位论文 组织缺损或器官功能障碍是人类保健中发生频繁、危害性大、花费高的问 题之一。多种原因所造成的动力性功能的丧失或缺陷，一直是骨科