（发酵工程专业论文）柑橘酒酿造工艺研究.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 本文主要立足于利用湖北省柑橘资源进行加工，以期获得高品质的柑橘酒。通 过对最适宜酿造酵母的筛选，柑橘汁澄清工艺参数，主发酵工艺参数，原酒澄清 技术，产品稳定性实验等方面进行系统的研究，结果表明： ( 1 ) 从柑橘自然发酵液中分离1 7 株酵母，首先进行试管发酵初筛，结合菌株 的起酵时间、发酵速度以及发酵结束后产香情况，初步筛选出产酒精能力较强和 产香较好的酵母菌4 株。进一步通过三角瓶发酵复筛，得到起酵早、发酵能力强、 产生酒度较高、残糖较低、感官评价较好的酵母菌g j _ 1 7 。特性研究实验表明该酵 母能适应的生长温度和p h 值范围广，耐酒精能力高。 ( 2 ) 果胶酶对柑橘汁处理的单因素试验研究表明，果胶酶用量为0 0 8 9 l 以 上、温度为3 0 c 4 0 c 、p h 为3 o 4 0 时，果胶酶对柑橘汁澄清处理的效果较 好。进行单因素基础上的正交实验，确定果胶酶处理柑橘汁的最佳澄清条件为 p h 3 0 、果胶酶用量0 1 0 9 l 、温度4 0 c 。在此果胶酶澄清工艺条件下对柑橘汁进 行澄清，不需要预先对柑橘汁进行过滤离心，就能得到较好的澄清效果。 ( 3 ) 通过对柑橘酒发酵工艺的单因素试验和正交实验研究，确定柑橘酒前发 酵最佳工艺条件为：酵母接种量7 、装液量8 0 、p h 3 6 、s o 。添加量为l o o m g 1 ， 发酵温度为1 5 c 2 0 。c 。前发酵酒静置在1 0 1 5 下密封存放2 3 个月的后 发酵，能使酒质更加醇厚完整，稳定性更好。 ( 4 ) 通过各种澄清实验，发现皂土和壳聚糖的澄清速度快，澄清效果好，是 比较理想的澄清剂，但考虑到成本的因素，选择皂土来作为柑橘酒的澄清剂，最 佳添加量为0 3 ，澄清时间2 4 h r 以上。 ( 5 ) 发酵酒的稳定性实验表明，柑橘发酵酒存在蛋白质的不稳定性，向发酵 酒中添加0 3 0 9 l 的皂土可以消除蛋白质的不稳定性。 ( 6 ) 最终确定的柑橘酒加工工艺为：柑橘一分选、去皮、去核一破碎一榨汁 一果胶酶澄清一前发酵一后发酵一澄清一过滤分离一调配一装瓶。 关键词：柑橘酒，酵母筛选，澄清，发酵工艺 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t t l l i sp a p e rm a i n l yf o c u s e so np r o c e s s i n gh i g h - q u a l i t yo r a n g ew i n eb yt h eu s eo f o r a n g er e s o u r c e si nh u b e ip r o v i a c e ，m a i n l yd e a l sw i t ht h es e l e c t i o no ft h ee x c e l l e n t b r e w i n gy e a s t ，m a k i n gc e r t a i nt h eo r a n g ej u i c ec l a r i f i c a t i o np a r a m e t e ra n dd o m i n a n t f e r m e n t a t i o np r o c e s s i n gp a r a m e t e r , c l a r i f i c a t i o nm e t h o d so fr a ww i n e ，p r o d u c ts t a b i l i t y e x p e r i m e ma n ds oo n t h er e s e a r c hr e s u l t sa r es h o w e da sf o l l o w i n g ： ( 1 ) w es e p a r a t e d1 7y e a s t sf r o mt h en a t u r a lo r a n g e f i r s tt i l r o u g ht h ep r e l i m i n a r y s c r e e n i n g ，w ec h o s et h ey e a s t sw h i c hh a dh i g ha b i l i t yi nt h ef e r m e n t a t i o n , t h e nt h e s e c o n ds c r e e n i n g ，w ec h o s et h ey e a s tg j 一1 7 ，w h i c hh a dm a n ya d v a n t a g e si no r a n g e f e r m e n t a t i o n ，s u c ha sh i g ha b i l i t yo ff e r m e n t a t i o n , h i 曲a l c o h o lp r o d u c t i o n ，l o wr e s i d u a l s u g a r , b 毗t e rf l a v o r t h ec h a r a c t e r i s t i ce x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h ey e a s tc o u l da d a p tt o b r o a d e rg r o w t ht e m p e r a t u r ea n dp hr a n g e 1 6 a l c o h o le n d u r a n c ec a p a b i l i t y , i tc o u l d b eu s e da sa ni n d e p e n d e n tz y m o g e n ( 2 ) t h r o u g ht h er e s e a r c ho fs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t ，w h e nt h ep e e t i n a s eu s a g ew a s o v e r0 0 8g i l 、t h et e m p e r a t u r eo fo r a n g ei u i c ew a s3 0 4 0 a n dt h ep hw a s3 o 4 0 ，t h eo r a n g ej u i c eh a dh i 咖c l a r i f i c a t i o n t h e nt h r o u g ht h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ， t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so f p e c t i n a s ec l a r i f i c a t i o nw e r e ：p h3 0 ，s o l u t i o na d d i n g0 1 0 9 l ， 4 0 w ec o u l dg a i np r e f e r a b l ec l a r i f l e de 岱 c tu n d e rt h eo p t i m u mc l a r i f i c a t i o n c o n d i t i o n sw i t h o u tf i l t r a t i n ga n dc e n t r i f u g i n gt ot h eo r a n g ei u i c eb e f o r e h a n d ( 3 ) t h r o u g ht h er e s e a r c ho fs i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e m s ，t h eo p t i m u m c o n d i t i o n so fd o m i n a n tf e r m e n t a t i o nw e r e ：i n o c u l a c i o nv o l u m e7 ，v o l u m e - l o a d i n g 8 0 ，p h3 6 ，5 0 2l o o m g l ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e1 5 。c 2 0 。c t h r o u g ht h e2 - 3 m o n t h sa f t e rf e r m e n t a t i o na t1 0 1 5 t h ew i n ec o u l db em o r em e l l o wa n dh a v e b e t t e rs t a b i l i t y ( 4 ) t h r o u g hs o m ek i n d so fc l a r i f i c a t i o ne x p e r i m e n t , t h eb e n t o n i t ea n dt h ec h i t o s a n h a dh i g hc l a r i f i c a t i o n b u tc o n s i d e r i n gt h ef a c t o ro fc o s t ，w ec h o s et h eb e n t o n i t ea st h e o p t i m u mm o d e a d d i n go - 3 a n dd e a l i n g 喇t h2 4h o u r s ( 5 ) w ef o u n dt h a tt h ew i n ew a si n s t a b l ei np m m i na tt h es t a b i l i t ye x p e r i m e n t i tc a n e l i m i n a t eb ya d d i n go 3 0 9 lb e n t o n i t e ( 6 ) t b ep r o c e s s i n gt e c h n o l o g yo fo r a n g ew i n ew e r e o r a n g e s e l e e t i o n ，w a s h i n g ， c l e a v a g e b r e a k a g e s q u e c z i n gj u i c e p e c t i n a s ec l a r i f i c a t i o n - - d o m i n a n tf e r m e n t a t i o n a f l e rf e r m e n t a t i o n r c l a r i f i c a t i o n f i l t r a t i o n s e p e r a t i o na n dd i s g o r g i n g4 a d j u s t m e n t b o t t l e k e y w o r d s ：o r a n g ew i n e ，y e a s ts c r e e n i n g ，c l a r i f i c a t i o n , f e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g y i i 佩嘉童工繁火港 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：名再卑日期：0 7 年占月铲日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名：彳百牟 日期：叼年，月争日 指导教师签名： 日期：0 年 泌，瓤彬 占月毕日 湖北工业大学硕士学位论文 1 1 果酒的起源及历史 第1 章引言 果酒是以各种水果为原料，经破碎，压榨取汁，发酵或浸泡等工艺精心调配 酿制而成的各式各样的低度饮料酒。因水果的种类繁多，所以果酒的风味各异， 其中葡萄酒是最大宗的品种，属于国际型的饮料酒。 据历史学家考证，在里海地区，7 0 0 0 年以前生活在欧亚大陆的原始人在没有 学会种植葡萄之前，就喜欢喝野生水果的发酵汁，这可能是人类饮用的最原始果 酒。在世界范围内，用葡萄酿酒，学者们认为最早源于5 0 0 0 年的古埃及，2 0 0 0 年 前传到希腊，成为欧洲第一个酿造葡萄酒的国家，后来又传至罗马、法国、西班 牙、德国等，这些国家具有葡萄酒的悠久历史，在不断的发展中，逐渐成为世界 闻名的葡萄酒生产国。 据说早在原始社会，我们的祖先从长期的采集活动中，发现水果经腐败而发 酵成酒。到了汉朝，开始人工栽培葡萄，据史书记载公元前九年张骞出使西域时， 从大宛等国引入很多优良葡萄品种，带来了酿酒艺人，大大促进了我国葡萄栽培 和果酒酿造业的发展，酒的质量也有了提高。果酒酿造业在历经魏晋南北朝的恢 复，唐代的发展后，达到极盛时期，并且在元代进一步发展繁荣，据折津志 等书记载，葡萄酒，枣酒都是元代果酒中常见之品。到了明代果酒在品种和产量 上均大超前世，谢肇制撰写的五杂俎中记载“北方有葡萄酒、梨酒、枣酒、 马奶酒，南方有蜜酒、树汁酒，椰浆酒”，可见果酒种类的大大丰富。 1 2 果酒的营养价值和保健作用 果酒是用植物的果实酿制而成的，不管是野生还是人工栽培的植物果实，都 有极其丰富的营养成分，其中氨基酸种类齐全，常量元素有硫、磷、钠、钾、钙、 镁、铁；微量元素有锌、铜、氟、碘、铬、硒，钴、锰、铝等，并含有维生素 ，g d ，e 、 b 、b ：、b s 、b 。叶酸等，这些营养成分在发酵过程中大部分均被保留下来，能调 节人体的机能，维持人体正常的生理活动，与人体健康有着密切的关系。 果酒能调节人体新陈代谢，促进血液循环，防止胆固醇增加，同时还能起到 利尿、激发肝功能和防止衰老的作用，长期饮用可防止坏血病、贫血、眼角膜炎， 软化血管，促进消化。国外医药研究机构研究发现，爱喝干型葡萄酒的人心脏病 湖北工业大学硕士学位论文 的发病率较低，同时，适时地饮用干葡萄酒对预防癌症都是有益的。 果酒的营养价值和保健作用，主要可概括为”1 ： ( 1 ) 有利于身体的滋补 果酒具有多种营养成分，合理适度的饮用能调节人体的神经中枢系统，给人 以舒适、欣快感，我国古代医学早已认识到葡萄酒的滋补、强身、美容等作用。 ( 2 ) 有利于消化系统 在饮用果酒后，人体的胃液形成量提高，有利于消化，同时有利于蛋白质的 同化，起到促进新陈代谢的作用。 ( 3 ) 有利于心血管病的防治 在果酒中含有大量的不饱和脂肪酸，能减少沉积于血管壁内的胆固醇，提高 血液中高密度脂蛋白的浓度，而高密度脂蛋白可以将血液中的胆固醇运入肝内， 并在那里进行胆固醇一胆酸的转化，防止胆固醇沉积于血管内膜，从而防止血管 硬化。有些果酒中所含的原花色素成分，对人体心血管病的防治也起着重要作用。 ( 4 ) 有利于人体预防疾病 果酒具有较强杀菌作用，能及时的预防感冒，并且能治疗感冒，其杀菌作用 与它所含的多酚类物质有关瓯”。 1 3 果酒酿制新工艺 人们普遍爱好果酒，是因为它营养丰富，滋味柔美，香气怡人。然而，就像 人们对美的追求不断发展变化一样，人们对果酒的要求，也在发展变化。为了满 足消费者的新要求，国内外果酒酿造工艺在诸多方面有了新的发展和突破。现将 现代果酒酿造新工艺的特点综述如下0 1 ： ( 1 ) 加抗氧化剂，迅速分离 果酒的现代发酵工艺要求果实破碎后要尽快分离，以减少果汁与果渣接触的 时间。因为皮渣中含有较多的单宁和色素，如果破碎后不及时分离，势必会有更 多的单宁、色素转入果汁，这不仅会影响产品的口味，而且对产品的颜色也有影 响。并且在果实破碎时，加入一定的抗氧化剂二氧化硫，对防止氧化起重要作用。 这是新工艺的一个重要特征。 ( 2 ) 先澄清果汁，后进行发酵 我国果酒酿造目前的工艺是，压榨果汁不经特殊的澄清处理，就直接发酵。 未经澄清处理的果汁中，必然含有一定数量的果渣或果肉等悬浮物，还含有相当 数量的果胶、蛋白质等物质，它们以溶解的胶体状态存在于果汁中。 湖北工业大学硕士学位论文 按新的工艺酿造果酒，都强调先对压榨果汁进行澄清处理，而后将澄清透亮 的果汁进行发酵。为使果汁澄清，需要往果汁中加入一定数量的皂土和果胶酶， 皂土可以吸附果汁中溶解的蛋白质，果胶酶能分解难过滤的果胶。果胶酶作用的 速度与温度有关，温度低，使澄清处理的果汁难以发酵，但延长了果胶酶作用的 时间，而澄清的时间太长也可能会引起果汁发酵。通常可添加适量的二氧化硫， 抑制果汁中野生酵母，使其在澄清处理期间难以发酵，把果汁处理得清澈透亮后， 再泵入发酵罐，接入酵母菌进行发酵。 ( 3 ) 人工筛选得到酵母 在发酵前加入经过人工筛选培养的纯酵母菌是果酒生产新工艺的另一特点。 方法有两种：一是先杀毒灭菌，然后人工加入酵母。这种方法能使纯种酵母充分 发挥作用，排除野生酵母的干扰。另一种方法是不经杀菌，在保留野生酵母的情 况下，加入人工培养的纯种酵母。由于人工培养的酵母菌是经过特殊筛选和特殊 驯化的，是耐低温、耐二氧化硫的菌种，而野生酵母对低温，特别是对二氧化硫 的适应性差，因此，在发酵过程中，虽然野生酵母和人工酵母共存，但起主导作 用、占压倒优势的，还是人工培养的纯种酵母。这种方法操作简便，被广泛地应 用于生产。 ( 4 ) 低温发酵贮藏 新的果酒酿造工艺为了保持果酒的果香，增加酒的新鲜感常采用低温发酵， 低温贮藏。一般控制温度在1 5 。c 2 5 。c 低温发酵，发酵时间长，果香保持得好。 缓慢的发酵过程，使得酵母菌种的产香作用得以充分的发挥，因而对产品质量有 很重要的影响。发酵结束后，有的果酒生产厂家要求继续降低温度，进行低温贮 藏。并且在果酒酿造中，从果实破碎、发酵到成品酒装瓶，都要尽量避免与空气 的接触，防止酒的氧化，尽量缩短贮藏期。以往的果酒酿造，特别是高档产品的 酿造，需要较长的贮存时间，一般要两年或两年以上的贮存期，按新的工艺酿造 果酒，贮存时间显著缩短。 湖北工业大学硕士学位论文 1 4 我国果酒业发展的现状与展望 我国的果酒业，尤其是葡萄酒工业在新中国成立后获得了新生。国家针对目 前果酒业的特点，采取了适当的扶助发展的措施。从国外葡萄酒先进国家引入了 酿酒葡萄品种，同时在国内新建葡萄园和葡萄酒生产基地，使之不断发展壮大。 经过一段时间的发展，我国葡萄酒产量大增，1 9 8 6 年产量5 5 万吨是1 9 4 9 年产量的 1 2 7 1 7 倍，而且不断有名优产品涌现州。近期以来，国家重点抓了优质干白、半干 白及干红葡萄酒的研制开发，特别是九十年代以来，干红、干白葡萄酒发展更为 迅猛，使葡萄酒的品种结构发生了较大的变化，并且各地研制开发了一大批以优 质野生水果为原料生产的各种果酒，深受消费者欢迎。 近几年来苹果酒、猕猴桃酒、桃酒、沙棘酒等果酒新品种日益发展起来了， 它们是果酒家族中的新热点，也正适应了国家提出的酿酒行业生产的“四个转变” 的要求，即：从高度酒向低度酒转变，蒸馏酒向酿造酒转变，粮食酒向果酒转变， 一般酒向优质酒转变。当前果酒的开发正朝着营养保健、品种多样化的方向发展。 “十五”期间，我国饮料酒工业发展的指导方针应是：在社会主义经济条件 下，从市场的需求出发，适当增加总量，加大结构调整力度：依靠技术创新提升 现代化水平，提高产品质量；降低原材料的能源消耗，节约用水，搞好综合利用 和“三废”治理：提高经济效益和社会效益，积极、主动的做好营销工作，不断 满足国内外市场的需求。1 。发展目标和重点是：全国饮料酒行业应继续贯彻执行“优 质、低度、低消耗、多品种”的方针，重点发展节粮型啤酒、黄酒、葡萄酒、果 露酒和低度白酒，适当发展各类名优酒。在确保国内外市场供应的前提下，要下 大力气抓好品种结构调整，适当发展一批优质葡萄品种为原料的高档干红( 白) 、 半干红( 白) 葡萄酒，以及白兰地、威士忌、香槟酒等。 随着近年来果酒的逐渐热销，我国的入世及全球化经济进程的加快，为了迎 接果酒业的机遇和挑战，必须采取措施，寻求发展道路： ( 1 ) 大力发展水果资源，丰富果酒品种 ( 2 ) 走科技创新之路，不断提高果酒质量 ( 3 ) 探求满足消费者需要的服务方式 4 湖北工业大学硕士学位论文 1 5 我国柑橘的种类及分布 柑橘属芸香科柑橘亚科，是热带、亚热带常绿果树( 除枳以外) ，用作经济栽 培的有3 个属：枳属、柑橘属和金柑属。我国和世界其他国家栽培的柑橘主要是柑 橘属。 我国柑橘分布在北纬1 6 。3 7 。之间，南起海南省的三亚市，北至陕、甘、 豫，东起台湾省，西到西藏的雅鲁藏布江河谷。但我国柑橘的经济栽培区主要集 中在北纬2 0 。3 3 。之间，海拔7 0 0 1 0 0 0 米以下。全国生产柑橘包括台湾省在内 有1 9 个省( 市、自治区) 。其中主产柑橘的有浙江、福建、湖南、四川、广西、湖 北、广东、江西、重庆和台湾等1 0 个省( 市，区) ，其次是上海、贵州、云南、江 苏等省( 市) ，陕西、河南、海南、安徽和甘肃等省也有种植。全国种植柑橘的县( 市、 区) 有9 8 5 个。 1 6 湖北省的柑橘业现状以及开发柑橘酒的必要性 中国是柑橘的主要原产国之一，有文字记载的栽培历史达4 0 0 0 多年。新中国 成立以来，柑橘产业迅猛发展，己成为中国柑橘主产区农业经济的一大支柱产业， 为促进农民增收、扩大城乡居民就业和改善生态环境做出了积极贡献。2 0 0 4 年， 中国柑橘的生产面积居世界第一位；产量为1 4 9 5 8 万吨，仅次于巴西( 2 0 5 9 4 万 吨) ，首次超过美国( 1 4 9 0 8 万吨) 成为世界第二大柑橘生产国“。 湖北省是柑橘生产大省，2 0 0 3 年湖北省柑橘种植面积为1 0 2 6 6 7 h m 2 ，产量达到 1 2 3 万吨，成为湖北最大的水果产业“，柑橘产业现状面积稳步增长，产量波动增 加。湖北省柑橘产业一直受到各级各地党委政府的大力支持，发展相当迅速，1 9 7 8 年湖北省柑橘种植面积仅为1 4 6 7 3 h m 2 ，随着十一届三中全会的召开和党的各项富民 政策的贯彻落实，果农种植柑橘的积极性空前高涨，到1 9 9 0 年种植面积达到 8 5 6 4 5 b j n 。2 ，是1 9 7 8 年的5 8 倍，到2 0 0 2 年又稳中有增，湖北省柑橘产业将进入一个 健康有序的发展阶段。同时湖北省柑橘产量逐步增长，由1 9 7 8 年的3 8 6 1 吨增加到 1 9 8 7 年的1 7 1 6 9 0 吨，平均每年增：自1 1 1 8 6 5 0 吨。1 9 8 8 年至1 9 9 2 年柑橘产量1 3 万吨2 8 万吨，1 9 9 3 年至1 9 9 7 年进入快速增产阶段，五年时间柑橘产量增加了5 7 7 7 吨， 平均每年增产1 1 5 万吨，2 0 0 3 年柑橘产量实现新的突破，达1 2 4 万吨。 柑橘业已成为湖北省农业生产的支柱产业，已成为湖北省农民增收、财政增 税的重要支柱产业n “。 经过多年的发展，柑橘加工业已初具规模，基本上能满足市场需要，但大多 湖北工业大学硕士学位论文 数加工技术比较落后，加工水平不高，主要的加工产品还是为柑橘罐头、柑橘果 汁等，因此就需要改变传统的水果消费观念，改变柑橘等水果的食用途径和模式， 而开发果酒正是它理想的选择目标。 利用柑橘进行柑橘酒酿造着很好的发展前景，以柑橘为原料酿造的果酒，酒 度低，酒质温和爽口，果香味浓，营养价值高，基本保持了柑橘中的天然营养成 分，并且富含人体所需的各种氨基酸，多种维生素及矿物质。大力提倡发展柑橘 果酒生产，不仅可减少粮食消耗，改善酒类消费结构、满足消费者需求、有益于 国民健康，而且可充分的促进柑橘资源的开发利用，增加我省柑橘产区人民的收 入而使其脱贫致富，避免出现果农卖果难的状况。并且响应了我国酿酒行业“四 大转变”的产业政策，即高度酒向低度酒转变、粮食酒向果酒转变、蒸馏酒向酿 制酒转变，普通酒向优质酒转变“。 因此充分利用我省的柑橘资源，发展以我省种植面广、产量大、营养丰富的 柑橘来酿造果酒，发展本民族、本省自己的果酒工业，创出自己的水果产品品牌， 不仅得到当地政府的大力支持，而且受到广大果农的欢迎和拥护，具有广阔的市 场前景。 6 湖北工业大学硕士学位论文 1 7 柑橘酒生产中影响柑橘酒发酵和质量的因素 ( 1 ) 原料状况 原料组分、成熟度、品种特性与柑橘酒质量有很大关系。未成熟，则果汁偏 酸偏涩，出汁率低，糖度低；过熟，易腐烂，出汁率也低，酒体“不丰满”，因此 原料的质量是决定酒品质的主要因素。 ( 2 ) 柑橘中的苦味物质 柑橘类水果加工过程中的苦味一直是世界难题。这是由于柑橘果实中存在两 大类苦味物质。一类是黄烷酮类化合物，黄烷酮类是一类广泛存在于柑橘类物质 中的化合物，最重要的黄烷酮类化合物是柠檬苦素，其含量低至6 1 0 “仍可产生 令人难以接受的苦味，在柑橘籽中和柑橘皮中含量最高；另一类是类黄酮化合物， 其中最重要的是柚皮苷，它由黄酮基与二糖结合形成。在柑橘果酒加工过程中， 柑橘中苦味物质的存在会严重影响果酒质量，因此有必要对现有的脱苦方法进行 深入研究，同时寻找新的脱苦方法，以解决柑橘果酒的苦味问题。 ( 3 ) 压榨速度 一般来说压榨速度对果汁中果胶含量有显著影响，快速压榨比缓慢压榨的果 汁中果胶含量要低很多。而且发酵完成后的生物稳定性增强，质量受影响小。 ( 4 ) 果汁处理 柑橘果汁处理包括亚硫酸处理、果胶酶处理、膨润土处理。d u e v n a s 等研究发 现，这3 种处理都可延缓酒精发酵，三者连用时效果最强。s o 。处理则会在酒精发酵 后延迟m l f ( 苹果酸乳酸发酵) ，并且无论单独进行还是与其它措施联用都对挥发酸 有明显的抑制作用。 ( 5 ) 酵母菌 通过合适的菌种筛选方法，扩大选育范围，得到适合特定柑橘品种酿酒的酵 母菌种，对柑橘酒发酵和品质有着十分重要的作用。 ( 6 ) 发酵温度 优质柑橘果酒的酿造宜采用控温发酵在低温下平稳发酵。发酵期较长，可使 柑橘中许多构成果酒特有香味的挥发性物质最大限度地溶解在酒液中，不致因高 温发酵而挥发损失“”。 湖北工业大学硕士学位论文 第2 章柑橘酒酿造酵母的分离筛选及特性研究 2 1 酵母筛选的意义及优良酵母的特点 果酒是一种营养丰富的低酒精度发酵饮料，是新鲜水果或果汁的发酵产品。 果酒发酵可以采用自然发酵，也可采用纯种发酵。由于自然发酵是将水果破碎后， 不另添加酵母，任其自然发酵，存在许多弊端。为了提高果酒的品质，通常采用 纯种发酵，即加入纯粹培养的发酵性能强的果酒酵母。果酒酵母细胞透明，呈圆 形或椭圆形，形体比较大，含有转化酶能将果汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和 其它代谢产物。真正优良的果酒酵母可以获得很高的发酵度，对乙醇和二氧化硫 的抵抗力大，很容易长期储存。酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大，要获 得优良的果酒酵母，必须对其进行分离筛选。 适合果酒发酵的优良酵母应该具有以下特点“3 “”1 ： ( 1 ) 除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香； ( 2 ) 发酵启动快，生长速度快，具有较高的发酵能力，能将糖全部发酵完； ( 3 ) 具有较高的抗s 0 2 能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度； ( 4 ) 具有良好的乙醇耐受能力； ( 5 ) 能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。 本实验从果园的泥土中和柑橘的自然发酵液中分离得到酵母，首先进行柑橘 汁的试管发酵，定时观察发酵情况和c 0 ：失重，初步筛选得到发酵性能较好的4 株酵 母菌。接着进行三角瓶发酵复筛，每隔4 8 h r 取发酵液测残糖，酒精度，固形物含 量，停止发酵后进行风味品评，综合对照酵母的发酵情况，选出发酵性能最好、 产香较好的一株酵母菌，并对其进行形态的观察和生物特性的研究。 2 2 酵母筛选及特性研究 2 2 1 材料与方法 2 2 1 1 材料 2 2 1 1 1 菌种及来源 菌种分离源：湖北武汉南湖某柑橘园土壤 对照菌株d v i o ：上海杰兔工贸有限公司 8 湖北工业大学硕士学位论文 2 2 1 1 2 培养基 活化培养基：完全培养基( 琼脂2 蔗糖2 酵母1 蛋白胨1 ，自然 d h ) “”。 增殖培养基：将成熟柑橘去皮除核榨汁，装入无菌三角瓶中，添加按3 0 i ig m 1 和1 0 0 单位m 1 添加链霉素，青霉素，加入9 5 7 , 醇使培养基酒精含量达到4 ( v v ) ， 用柠檬酸调节p h 值到3 2 3 8 2 _ 间“”。 分离平板培养基：完全培养基( 琼脂2 蔗糖2 酵母1 蛋白胨1 ，自 然p h ) 。 种子培养基：柑橘汁( 一般可溶固性物含量t s s 为8 l o ) ，加蔗糖调t s s 为 1 5 ，调p h 值为3 2 3 8 ，于1 1 5 、1 5 m i n 蒸汽灭菌备用。 发酵培养基：柑橘汁( 一般可溶固性物含量t s s 为8 1 0 9 6 ) ，加蔗糖调t s s 为 1 5 ，调p h 值为3 2 3 8 ，添加有效量为5 0 的n 赴s 。0 5 使s 0 2 含量为l o o m g l ，于1 1 5 、1 5 m i n 蒸汽灭菌备用。 酵母菌性能测定培养基：完全液体培养基( 蔗糖2 酵母l 蛋白胨l ，自 然p h ) 。 2 2 1 1 3 试剂 蔗糖食用级 柠檬酸分析纯 9 5 乙醇分析纯 偏重亚硫酸钾分柝纯 青霉素医用 链霉素医用 2 2 1 1 4 仪器及设备 y x 2 8 0 a 手提蒸汽灭菌锅 a r l l 4 0 电子分析天平 h r 7 6 4 1 飞利浦食品加工机 d e l t a 3 2 0 数字酸度计 手持糖量计 7 2 2 s 型分光光度计 x s 一2 1 2 2 0 2 型双目光学显微镜 2 0 2 2 型电热烘箱 电热培养箱 9 市购 上海试剂一厂 上海虹光化工厂 上海化学试剂厂生产 华北制药股份有限公司 华北制药股份有限公司 上海三申医疗器械有限公司 奥克斯国际贸易有限公司 飞利浦电器有限公司 m e t r e r _ _ t o l e d o 工贸有限公司 永州光学仪器厂 上海精密科学仪器有限公司 南京江南兴电有限公司 重庆银河实验仪器有限公司 上海浦东跃欣科学仪器厂 湖北工业大学硕士学位论文 s w c j 一2 f 型净化工作台江苏净化有限公司 2 2 1 1 5 测定方法 酒精度 酸度1 总糖和还原糖“” 可溶性固形物 p h 值测定 菌株发酵能力 发酵液o d 值埘 2 2 1 2 试验方法 蒸馏法 酸碱滴定法 斐林试剂滴定法 手持糖量仪测定 数字酸度计进行测定 c 0 ：失重法 6 6 0 h m 下分光光度计测定 2 2 1 2 1 柑橘汁中酵母的增殖培养及分离 将成熟柑橘去皮除核榨汁，装入2 个无菌三角瓶中，其中一瓶加入少量的柑橘 皮，添加链霉素，青霉素，加入9 5 7 , 醇使柑橘汁中的酒度达至i j 4 ，调节p h 值，2 8 让其自然发酵直至终了。 将增殖发酵液适当稀释后，在完全平板培养基上进行梯度稀释分离。倒置于 2 8 。c 恒温培养箱中培养，待培养基表面长出单菌落，再根据其颜色、透明度、直 径大小、厚薄程度、生长快慢，挑选典型菌落，接入试管培养基斜面，待长出后 进行镜检确定是否为酵母，观察菌落特征、编号命名1 。 2 2 1 2 2 土壤中野生酵母菌的分离 取分离源距地表1 5 c m 2 0 c m 湿土壤1 9 ，加入到增殖培养基中，在磁力搅拌器 上混匀。添加链霉素，青霉素，加入9 5 l 醇使柑橘汁中的酒度达到4 ，调节p h 值，2 8 c 让其自然发酵直至终了。 将增殖发酵液适当稀释后，在完全平板培养基上进行梯度稀释分离。倒置于 2 8 c 恒温培养箱中培养，待培养基表面长出单菌落，再根据其颜色、透明度、直 径大小、厚薄程度、生长快慢，挑选典型菌落，接入试管培养基斜面，待长出后 进行镜检确定是否为酵母，观察菌落特征、编号命名咖。 1 0 湖北工业大学硕士学位论文 2 2 1 2 3 试管发酵初筛 将柑橘汁调糖，调酸后分装于无菌大试管，接入分离得到的纯种酵母菌，置 于室温中发酵。观察起始发酵时间、发酵速率，每隔1 2 h r 观察产起泡状况、凝聚 性等，培养5 天后，品评风味。根据试验结果，初步筛选出产酒精能力较强和产 香较好的酵母菌4 株。 2 2 1 2 4 三角瓶发酵复筛 将发酵培养基分装入三角瓶中，蒸汽灭菌后。将初筛得到的菌株及对照菌株 d v i o 接入种子培养基中，于2 8 ，1 1 5 r m i n 的摇床上培养2 0 小时后，接入三角 瓶发酵培养基中，于室温下发酵，每隔4 8 h r 测发酵液液酒精度，固形物含量，停 止发酵后进行风味品评，综合对照酵母的发酵情况，选出发酵性能最好、产香较 好的一株酵母菌。 2 2 1 2 5 选育酵母形态特征观察 采用水浸法“”，在显微镜下观察选育酵母的外形、出芽情况、测量其大小。 菌落形态观察：采用平板稀释分离法，将选育酵母制成1 0 、1 0 。5 、1 0 6 三种 稀释浓度的平板培养基，2 8 c 恒温培养3 天，观察菌落特征。 2 2 1 2 6 选育酵母最适生长温度的测定 将选育酵母接入完全培养基中，分别在2 4 4 0 c 的不同温度下恒温培养1 0 小时，于6 6 0 n m 定培养液的o d 值大小，确定其最适生长温度“。 2 2 1 2 7 选育酵母对高温、低温的耐性测定 将选育酵母接入完全培养基中，分别于低温和高温培养1 0 天，观察有无菌体 生长。 2 2 1 2 8 选育酵母最适生长p h 值的测定 将选育酵母接入不同p h 值的完全培养基中于最适生长温度恒温培养1 0 小时， 在6 6 0 n m 下测定0 d 值，依据o d 值大小确定其最适p h 。 2 2 1 2 9 选育酵母耐酸、碱能力的测定 将完全培养基按设定p h 分别加入柠檬酸或n a o h 调匀后接入选育酵母，在最 适温度下培养7 天，检查是否有菌体生长。 湖北工业大学硕士学位论文 2 2 1 2 1 0 选育酵母耐酒精能力的测定 将完全培养基按设定的浓度分别加7 , 9 5 乙醇，摇匀后接入选育酵母，2 8 。c 恒温培养一周，检查是否有菌体生长。 2 2 1 2 1 1 选育酵母生长曲线的测定 将选育酵母接入完全培养基中。以选育酵母的最适p h ，最适生长温度在 1 5 0 r m i n 的摇床上振荡培养，每隔4 小时取培养液在6 6 0 n m 下测定o d 值“”。 2 2 2 结果与分析 2 2 2 1 酵母试管发酵初筛 表2 - 1 酵母初筛表 t a b l e2 - 1p r e l i m i n a r ys c r e e n i n go f t h ey e a s t 1 2 h r 2 4 h r3 6 h r4 8 h r6 0 h r 7 2 h r8 4 h r9 6 h r1 0 8 h r1 2 0 h r g j 1 +卅卅卅+ 卅 - 。 g j 2 卅 g j 3 - g j 4 g j 5 一 g j 6 g j 7 - g j 8 g j 9 g j 1 0 g j 一1 1 - g j 1 2 卅 g j 1 3 - g j 1 4 - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 抖+ + + + + +十+十+ + + + - 6 d - k g j - 1 5 十h 斗卅+卅 g j 一1 6 十h 斗十h 斗 + + - h - - k q - h - + + + + + - h - - + + - h - 士- 卅+ 卅+ 一 - + + + + + + + + + + + 卅+ + + + + + 抖 + + +十+ + + + + + + h + + + + - 4 - 4 - 1 - + + + + - i - 4 - g j 1 7 卅+ + + + + + +十十 。 。 。 表示发酵越剧烈。 根据上表的发酵情况，并结合菌株的起酵时间，发酵速度以及发酵结束后产 香情况，初步筛选出产酒精能力较强和产香较好的编号为：g j 一1 l 、g j 一1 3 、g j 1 5 、 g j 一1 7 的酵母菌4 株。 湖北工业大学硕士学位论文 2 2 2 2 酵母三角瓶发酵复筛 图2 1 不同菌种发酵过程中酒精度的变化 f i g 2 1t h ea l c o h o lc o n c e n t r a t i o nv a r i a t i o no f d i f f e r e n ts t r a i n sd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o n 图2 2 不同菌种发酵过程中t s s 的变化 f 适2 - 2t h et s s v a r i a t i o no f d i f f e r e n ts t r a i n sd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o n 用于三角瓶发酵的柑橘汁含糖量为1 5 9 6 ，含有效s 0 2 为1 0 0 r a g 1 ，对酵母的耐 s 0 2 性能有一定的要求。采用室温发酵，温度波动范围在1 7 2 0 c ，相对较低。 三角瓶发酵复筛将初筛的4 株菌及对照菌株一起接入三角瓶发酵，但只有 g j 一1 5 、g j 1 7 和对照菌株d v l o 能进行发酵，而编号为g j l l 、g j - 1 3 的菌株没有 任何发酵迹象，推断是由于在发酵培养基中添加了s 0 。抑制了它的生长发酵。 1 4 湖北工业大学硕士学位论文 从图2 一l 、图2 - 2 可以看出，g j 1 7 的起酵早、发酵能力强、产生酒度较高、 残糖较低。进行感官评价，产香较好，因此选择g j - 1 7 作为柑橘酒发酵菌株。 2 2 2 3 选育酵母形态特征观察 通过镜检，观察到选育酵母的形态特征：细胞圆形、卵形、椭圆形，单个、 成双、个别呈短链，以出芽繁殖为主。 选育酵母的菌落形态：菌落大小为6 m m 7 m ，形状规则，白色，不透明，丝 状边缘，中心凸起。 2 2 2 4 选育酵母最适生长温度的测定 果酒酵母的生长繁殖的适宜温度为2 2 3 0 ，发酵的最适温度根据菌株的 不同而不同，一般为1 5 3 0 。 将选育酵母菌从斜面接入完全培养基中分别置于2 4 、2 8 、3 2 、3 7 、 4 0 的培养箱中静止培养。于6 6 0 n m 处测定培养液光密度值( 0 d 值) ，依据0 d 值大小， 确定其最适生长温度，选育酵母g j 1 7 在完全培养基中的生长温度曲线见图2 3 。 智 图2 3 选育酵母的生长温度曲线 f i g 2 3t h et e m p e r a t u r ec u r v eo f g r o w t h t ot h es c r e e n e dy e a s t 由图2 3 可知，选育酵母g j - 1 7 在2 8 c 的o d 值最大，即酵母g j - 1 7 在2 8 c 生长最旺盛，因此最适生长温度为2 8 。 湖北工业大学硕士学位论文 2 2 2 5 选育酵母对高温、低温的耐性测定 任何一种微生物在环境温度超过其各自的最高和最低生长温度时，不但停止 生长，而且会因酶的变性失活而导致衰亡，果酒酵母也一样。在实际发酵中，选 择在低温条件下生长性状良好的酵母菌株是很重要的。选育酵母对高温、低温的 耐性实验结果见表2 2 。 表2 2 选育酵母对高温、低温的耐性测定结果 t a b l e2 - 2t h ee n d u r a n c er e s u l to f t h es c r e e n e dy e a s tt oh i g ha n dl o wt e m p e r a t u r e 表中“”表示不生长，“+ ”表示能生长，“+ ”越多表示生长越好。 由表2 2 可知，酵母g j 一1 7 的最低生长温度为8 c ，最高生长温度为4 0 c ， 能适应的生长温度较广。 2 2 2 6 选育酵母最适生长p h 值测定 将选育酵母菌从斜面接入不同p h 值的完全培养基中置于2 8 c 的培养箱中静止 培养。于6 6 0 n m 处测定培养液光密度值( o d 值) ，依据0 d 值大小，确定其最适生长 温度，其生长曲线见图2 4 。 2 73 23 74 2 4 75 25 7 p h 值 图2 4 选育酵母的生长p h 曲线 f i g 2 - 4t h ep hc u r v eo f g r o w t h t ot h es c r e e n e dy e a s t 由图2 - 4 可以看出，酵母g j 一1 7 在培养基p h 值为：3 2 4 2 时0 d 值最大， 生长最旺盛，因此酵母g j - 1 7 的最适生长p h 值范围为：3 2 4 2 。 1 6 5 5 4 5 3 5 2 5 1 5 o 4 3 2 1 oooo0o o o o 0 理o o 湖北工业大学硕士学位论文 2 2 2 7 选育酵母耐酸碱能力的测