（生物医学工程专业论文）声波刺激对拟南芥生长影响的分子生物学初步研究.pdf

重庆大学硕士学位论文 英文摘要 a j e i s t r a c t t h ee f f e c to fe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e so np l a n tg r o w t hi so n eo fi m p o r t a n tf i e l d s f o c u s e do ns c i e n t i s t s i th a db e e nf o u n dt h a te n v i r o n m e n t a 】s t r e s s e sc o u l dh a v eb e e na p o s i t i v eo rn e g a t i v ei n f l u e n c eo np l a n tg r o w t h 7 9 1 n o wt h es t u d i e sa b o u tt h ee f f e c to f s o u n ds t i m u l a t i o no n p l a n ti nm o l e c u l eb i o l o g y a r er a r ec o m p a r e dw i t ht h er e s e a r c h e s o ni n d i v i d u a l ，t i s s u ea n dc e l l w ep r i m a r i l ys t u d i e dt h ed i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n so f a r a b i d o p s i st h a l i a n as e e d l i n g su n d e rs o u n ds t i m u l a t i o nb ym r n a r e v e r s et r a n s c r i p t i o n d i f f e r e n t i a ld i s p l a y p c r ( d d r t p c r ) w i t h s i l v e rs t a i n i n gi nt h i st h e s i s i nt h i st h e s i s ，a f t e r a r a b i d d p s i st h a l i a n as e e d l i n g sw e r es t i m u l a t e db ys o u n dw a v e ， t h et o t a lr n aw a se x t r a c t e d t h e nt h et o t a lr n aa st e m p l a t ew a s r e v e r s e l yt r a n s c r i b e d i n t oe d n a a n d a g a i n ，t h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o ng e n ef r a g m e n t si n d u c e db y t h es o u n d w a v ew e r es c r e e n e dw i t hd d r t p c ra n di d e n t i f i e dt h r o u g hn o r t h e r nd o t t h e p r i m a r y c o n c l u s i o n so f t k st h e s i sa r ea sf o l l o w s ： f i r s t l y ，a r a b i d o p s i st h a l i a n as e e d l i n g sw e r es t i m u l a t e db ys o u n dw a v ew i t hac e r t a i n i n t e n s i t y ( 1 0 0d b ) a n df r e q u e n c y ( 1 0 0 0h z ) f o r 9d a y sa n de a c hd a yf o r6 0r a i n r e s p e c t i v e l yr e f e r r e dt ot h e r e l a t i v er e s e a r c h 【2 8 t h et o t a lr n ao f t h et r e a t e dg r o u pa n d t h ec o n t r o lg r o u pw a se x t r a c t e d b y r n a s ep l a n tm i n ik i t t h eq u a l i t yo f t h et o t a lr n a c o u l da s s u r et h en e e do f t h es u b s e q u e n t t e s t s ，a n dt h ey i e l d r a t eo f t o t a lr n a i nt h e t r e a t e dg r o u pw a s l a r g e rt h a n i nt h ec o n t r o lg r o u p s e c o n d l y ，t h r o u g hs e p a r a t i n gt h e s ep c rp r o d u c t so i lp o l y p r o p y l e n ea c y lg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，6d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e de d n af r a g m e n t sw e r eo b t a i n e d ，w h i c hw e r e s a 3 ，c a 2 ，s g 2 1 ，s g 2 2 ，s g 7 1 ，s g 7 2 m o l e c u l a r w e i g h to f f r a g m e n t sw a sb e t w e e n 2 0 0 b p t o6 0 0 b p r e s p e c t i v e l y a f t e rb e i n gr e - a m p l i f i e d ，t h es g 2 2 b a n d h a dn o to u t c o m e ， o t h e r sh a dt h es i m i l a rm o l e c u l a r w e i g h tb e t w e e n o nt h e a g a r o s eg e la n d o nt h e p o l y p r o p y l e n ea c y lg e l s g 2 - 2w a s f a k e p o s i t i v ea n d d i s c a r d e d t h i r d l y ，t oi d e n t i f yt h et r u t ho f t h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dc d n af r a g m e n t s ， n o r t h e md o tw a s p e r f o r m e d a m o n gd i f f e r e n t i a lf r a g m e n t sa c q u i r e d ，t h r e ew a sf o u n dt o b e p o s i t i v ef r a g m e n t s ，s a 3 ，s g 7 1a n dc a 2 ，w h o s e m o l e c u l a r w e i g h ta r e2 7 0 b p ，5 8 0 b p a n d3 7 0 b pr e s p e c t i v e l y s a 3w a s d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e da n d s g 7 1w a sa d v a n t a g e d e x p r e s s e d ，w h i l ec a 2 w a sr e s t r a i n e db yt h es o u n dw a v e t h e p o s i t i v ef r a g m e n t sw i l lb e c l o n e da n ds e q u e n c e d ，a n dt h e na n a l y z e dt h e i rf u n c t i o n sf u r t h e r t h ef a c tt h a tt h r e e d i f f e r e n tt y p e so f d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e de d n a f r a g m e n t sh a db e e nf o u n di n d i c a t e d i i 重庆大学硕士学位论文英文摘要 t h a te x p r e s s i o no f s o m eg e n e sw e r et u r n e do n ，m e a n w h i l et h es t r e s sr e s t r a i n e ds o m e g e n e sf r o me x p r e s s i o nu n d e r t h i sm o d eo fs o u n ds t r e s s f o u r t h l y , w i t ha n a l y z i n gs a 3a n dt h ed i f f e r e n t i a lg e n ef r a g m e n t ss a 5 2 【6 5 j i tw a s o b s e r v e dt h a tt h i st w oe d n af r a g m e n t sh a dc l o s em o l e c u l a rw e i g h ta b o u t2 7 0 b pa n d 2 9 0 b pa n dw e r ea m p l i f i e dw i t ht h es a m ea n c h o r e dp f i m e r ( o l i g o d ( t ) 10 a ) a n ds i m i l a r r a n d o m p r i m e r i tw a sp o s s i b l et h a ts a 3 a n ds a 5 2h a v et h es a m eb a s es e q u e n c e s k e y w o r d s ：s o u n ds t i m u l a t i o n ，a r a b i d o p s i s 抽a b a n a ，m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a y s i l v e rs t a i n i n g i i i 重庆大学硕十学位论文 1 绪论 1 绪论 植物的生长环境既是多种多样的，又是千变万化的。不同的环境因子以截然 不同的方式甚至不同的时闯、部位、强度施加于植物。植物也以完全不同的方式 感受和识别它们，从而作出相应的反应。生物与环境的关系是非常密切和统一的。 在某一地区特定生态因素的长期影响下，植物形成了适应于该环境的形态、内部 结构和生理特征，由此体现出植物的高度适应性 1 。2 。植物生活在自然环境之中， 不可避免地会受到各种外界环境因子的刺激。生长在特定生态环境下的植物往往 能够对环境作出反应，形成适应于该环境的形态、内部结构和生理特征。通常认 为，植物的生长是通过细胞的分裂和生长完成体积的增大的过程，而植物的发育 是指植物体的构造和机能从简单到复杂的变化过程，表现为细胞、组织和器官的 分化。生长发育是基因在一定时间和空闻上顺序表达的过程，基因的表达要受到 周围环境的调控【3 。也就是说，植物的生长既要受到自身遗传物质或者说是基因的 调控，又要受到植物所生长的周围环境的影响与调控。环境因子的变化，影响眷 基因的表达，从而使植物体在不同的生长发育阶段及不同的环境中有着不同的基 因表达产物，这些产物或者是形成植物结构的基本成分，或者是具有不同功能的 生长调节物质、酶、信号传递物质等。由于这些产物的差异性，导致植物生长的 时间、空间的特异性。因此，可以认为，环境因子在影响植物生长方面与植物自 身遗传物质有着同样的重要作用。研究这些环境因子的作用效果及其机理也就成 了科学工作者们期待解决的课题之一，尤其在过去十多年来，环境应激与植物生 长关系已经成为物理学家、生物学家、工程专家共同关注的问题之一。 1 1 环境应力与植物生长的关系 人们最早研究的刺激方式是触摸和风的作用，触摸效应取决于局部剪切或施 加的机械应力引起的不同形变，由此产生的拉伸和压缩也造成局部剪切和不同形 变。 在本世纪初，人类对影响生物的环境生态因子有了基本的认识。一般将环境 定义为在任何方面影响有机体的外界任何动力、物质和情况，即有机体外部周围 条件的总和。早期的环境生物研究者单纯从光照、温度、水分、矿物质养分、有 机养分等来研究植物的应力效应，而随着研究的不断深入，人们发现除这几种因 素外，外界的许多自然和人为的因素都会对植物造成影响，都是植物的应力源。 于是，人们把所有这些应力源作了一个划分，提出了环境应力的概念。环境应力 是指一切自然的或人为施加于植物体的应力，它包括自然和人为两大应力源。 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 表1 1 环境应力的来源及分类 t a b l e1 1t h ee n v i r o n m e n t a ls t r e s s e st y p ea n dr e s o u r c e 自然应力源人为应力源 _ 驭l 高辐射( 光抑制、光氧化) 热量( 温度的升高) 突然的低温 突降的霜冻或晚霜冻 缺水( 脱水问题) 自然矿物质的缺乏 长时间的降雨 昆虫、瘸毒、真菌和细菌原体 机械应力( 振动、拉压、强声波等) 电刺激、化学刺激 空气污染( 如s 0 2 、n o 、n 0 2n o x ) 臭氧( 0 3 ) 和光化学因素 高活性氧的形成 重金属污染( 铅、镉等) 紫外线辐射增强 c 0 2 含量增高、气温升高 氯过量 在1 8 8 1 年，d a r w i n 就曾经指出机械应力对植物的生长存在明显的作用。近年 来环境与植物关系性研究尤其是植物如何对应激作出反应引起了广泛关注，d a n i e l 研究了植物细胞生长与应力刺激之间的关系 4 。l y n c h 和l i n t i t h a c 在植物发育过 程中对单个细胞进行应力加载实验，并对细胞内应力信号的转导进行了初步探索 5 1 。k n i g h t 等人发现触摸、伤害能使胞内的c a ”升高【。”。k n i g h t 还和t r e w a v e s 运用转水母发光蛋白基因的烟草植株研究发现植株受到机械刺激引起的c a ”的变 化一j 。l u i t 等人运用了转核质蛋白和水母发光蛋白融合基因的烟草植株和转水母 发光蛋白基因的烟草植株发现风和冷应激在胞质和核中引起不同的信号变化 ” 。 作为环境应力的一种，声波可以说是无处不在，物理学上按其频率不同而人 为的分为声波、强声波和超声波。与其它环境应力一样，声波作为交变应力的一 种作用形式，对植物的影响很大，因而研究它对植物的作用效应意义也很大。 1 2 强声波( 或超声波) 刺激对植物的作用 超声波或强声波也是交变应力的一种作用形式，是一种弹性机械波。随着功 率超声设备的普及和发展，以及多学科间互相渗透和融合的科研大趋势，超声波 逐渐开始在生物工程领域、包括植物学的研究中得到应用和发展。超声波能在物 质介质中形成介质粒子的机械振动，这种含有能量的超声振动在亚微观范围内引 起的机械作用主要有：机械传质作用、力的热作用和空化作用。其作用的强弱与超 声波的频率和强度有关 。 近年来，在强声波刺激下从对植物生长变化的宏观观察到对植物生理生化的 变化研究，从对植物细胞( 组织) 分裂生长的影响研究到对声波刺激对植物作用 机理的探讨，都取得了一定的成果。清华大学孙克利等人研究了强声波发生装置 2 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 产生的交变应力对烟草愈伤组织细胞的影响 1 2 】。李涛等人研究了强声波对植物细 胞的细胞周期的影响，他还应用流式细胞技术分析了烟草细胞在不同频率和强度 的声波作用下细胞周期的变化 。沈子威等人采用傅里叶红外仪研究了强声波 对植物细胞壁蛋白质二级结构的影响【1 5 】。 1 3 模式植物拟南芥的研究 1 3 1 模式植物拟南芥的生物学特点 模式植物拟南芥属于十字花科( c r u c if e r ) 拟南芥属，与甘蓝、花椰菜、辣根 等经济作物同科，广泛分布于欧洲、亚洲、非洲、澳洲和北美洲，具有显花植物 的全部特征和成为植物遗传研究模式物种的所有特点【l “” 。 拟南芥生育期短，常为4 2 5 6 d 是所有显花植物中最短的，每年最少可繁殖6 代， 为其生物学和遗传研究提供了充足的时间。植株矮小，株高一般为1 5 3 0 c m ，占地 小，容易操作，适于在室内开展工作。繁殖系数高，每株可产籽3 0 0 0 粒以上，多 者可达万粒，种子极小，重0 0 2 9 ，这些特点有利于各世代各遗传特性的充分表达 并进行大量的遗传研究。 拟南芥的基因组小，有5 对染色体，是高等植物中基因组最小的物种之一。其 二倍体基因组约为7 0 0 0 0k b ，d n a 重组分析和随机选择基因克隆表明，模式植物 拟南芥叶绿体基因组有非常低的重复序列，仅有1 0 一1 4 是高度重复或回纹重复序 列；2 3 一2 7 为中度重复序列；5 0 - 5 5 为单拷贝序列。核基因组中的单拷贝序列 比例高，其基因易于被诱导、克隆和文库筛选，非常适用于分子水平上的研究。 1 3 2 模式植物拟南芥的研究历史 模式植物拟南芥的遗传学研究始于1 9 0 7 年，l a i b a c h 借助光学显微镜观察到模 式植物拟南芥体细胞中仅有5 对染色体。二十世纪4 0 年代，对模式植物拟南芥的研 究进入细胞遗传学阶段，并成功地做了第一个诱导试验，认为不同的诱变剂诱变 频率不同，同一诱变剂对不同的基因诱变频率亦不同。6 0 一7 0 年代，通过化学诱变 和辐射诱变等手段，创造出数百个模式植物拟南芥突变体，并研究其非整倍体的 细胞遗传，在此基础上绘制出模式植物拟南芥的遗传连锁图谱。以上研究为8 0 年 代以后的分子生物学研究奠定了基础。大量研究表明，模式植物拟南芥的生物学 特点使得它成为植物中的“果蝇”、分子生物学研究的模式物种；对其不断的深 化研究，为植物遗传育种的理论和应用研究提供了良好的材料，因此它在植物基 因工程和作物遗传改良上的重要地位也愈来愈多地受到人们的重视。 1 3 3 模式植物拟南芥的分子生物学研究 在目前的植物科学研究中，为模式植物的拟南芥，具有两个显著的特点，植 物科学研究中不能被其它任何植物所代替： 3 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 非常利于遗传学和分子生物学的研究和操作。模式植物拟南芥的基因组非 常小，只有1 3 0 m b ，仅比单细胞酵母的基因组大七倍左右：体型小，可在实验室中 种植，也可在培养基上生长，且生长周期短，每一个世代仅需要6 7 周时间；另 外，这种植物很容易进行诱变和遗传转化，这就保证了模式植物拟南芥的研究有 丰富的遗传分析资源，并能方便地在活体条件下检测基因的功能。 模式植物拟南芥在植物进化中处于相当高的位置。在植物进化中，很多具 有重要功能的基因都比较保守( 否则物种会在漫长的进化过程中被淘汰) ，在模式 植物拟南芥中发现的一些重要的调节基因都能在其它植物中找到它们的同源基 因。 因此，从比较容易的模式植物拟南芥入手，不仅在理论上有助于揭示物种的 进化、植物的发育、基因的表达和调控等，在实践中还可能将模式植物拟南芥的 一些基因分离出来，再通过转基因技术转入到其它作物中，以获取重要的遗传信 息，从而产生更大的经济效益。 自从1 9 7 9 年获得光合碳氧化途径( p c o ) 缺陷型以来，在模式植物拟南芥中发现 了7 种p c o 及其相关的缺陷型。经过对它们的研究，澄清了p c o 碳氧代谢中气体交 换特性、中间产物的作用、生理恶化等一些悬而未决的问题。这对合理地利用、 有效地调控光呼吸、提高光合效率、增加作物产量等研究起了促进作用。以上突 变体的研究，揭示了多细胞真核生物中存在一类调控基因，其产物可以调控一系 列细胞专性的表达，从丽控制发育过程这一奥秘，为回答基因是否控制着诸如 形态发育等这样一种复杂过程的问题提供了理论依据，从而为形态发生与生长发 育的分子生物学研究及作物遗传改良提供了大量良好的基础材料。s o l a n o 在模式 植物拟南芥细胞中，发现r a f l 激酶、m e k 和m a p k 与乙烯信号传导有直接关系8 。模 式植物拟南芥基因组小，且许多基因是单拷贝的，较易从其中克隆出所需基因并 易于对所分离出的基因进行序列分析，进而研究基因的表达和调控等。如用大麦 乙醇脱氢酶基因片段与模式植物拟南芥的d n a 杂交，分离获得了a d h 基因克隆 ” ， 且证明模式植物拟南芥中只有一个a d h 基因即单拷贝基因，该基因具有6 个内含 子，总长度5 6 7 b p ，而其它植物至少有2 3 个。v i s i o l i 等【2 0 将模式植物拟南芥置于 4 5 培养段时间诱导抗热基因表达，然后利用差异显示技术得到一一些差异条带， 将其作为探针筛选基因文库，得到低分子量抗热休克蛋白基因。b r a a m 通过对模 式植物拟南芥的研究发现了5 个与机械刺激相关的基因，它们分别是t c h l0 0 “c h g e n e ) 、t c h 2 ，t c h 3 ，t c h 4 、t c h 5 。亿日是在区别不同基因表达的实验中偶然 发现的。大量的比较实验发现，接触、风、喷水等不造成表面损伤的机械刺激均 对兀：磋因的表达产生正调控作用。随着研究的不断深入，b r a a m 发现“w 还可以 被黑暗和温度变化等非机械性刺激诱导表达。触摸模式植物拟南芥l o m i n 后可引 重庆人学硕士学位论文 1 绪论 起五个基因( t c h l 5 ) 高效表达，其o p m r n a 水平可增加1 0 0 倍。r l c h 基因一般在受到 诱导后较短时间表达且表达量较大，且这种诱导表达是短暂的。b r a a m 认为r c h 基 因编码的是c a n 或c a u t h 关基因，c a m 是c a “很重要的一种受体且胞质内c a ”可使t c h 基因表达，所以很可能c a 2 + 作为第二信使调节t c h 基n n n a e 2 1 - 2 3 1 。 1 4 课题简介 1 4 1 研究基础 本实验室多年以应力与植物生长的关系为切入点，重点研究了声波等优化物 理参数对植物个体、组织、细胞三个层次的影响 2 4 - 2 8 o 在个体层次上研究了植物幼苗对声波刺激的响应。研究发现应力刺激可以 促进苗的生长和分化，采用强度为l o o d b 、频率为1 0 0 0 i l z 的声波刺激菊花幼苗1 5 d 后发现，刺激组比对照组的鲜重增加1 2 5 ，干重增加9 8 ，株高增加5 6 ，同 时发现在一定条件的声波刺激条件下能促进了植物组织的分裂生长，增强了根的 活力及吸收作用。 在组织层次上研究了植物愈伤组织的生长、分化( 不同生长阶段) 规律等 内容；采用声波这种交变应力作用于菊花愈伤组织，通过刺激组与对照组的实验 研究发现，声波刺激对菊花愈伤组织的生长具有生长和抑制的双重效应。随着声 强和频率的增加，s o d 的活性、可溶性蛋白质含量、组织中钙元素的吸收率、a t p 含量、超氧化物歧化酶( s o d ) ，过氧化物酶( p o d ) 及过氧化氢酶( c a t ) 即保护 酶系统活性增强均有所升高，但当超过l o o d b 和1 0 0 0 h z 后，又呈下降趋势，而i a a 氧化酶活性的变化趋势则相反。得到了促进菊花愈伤组织生长分裂的声波刺激的 最佳声强和频率分别为l o o d b 和1 0 0 0 h z ，在此条件下，声波能显著地促进菊花愈 伤组织的生长，对猕猴桃的研究也有相似的结果。 在细胞层次上研究了声波刺激对植物细胞的结构、形态、功能和细胞的生 长发育的影响；声波对细胞膜的作用及其跨膜传递机制。首先探索了p mh + 一a t p a s e 活性的调控机理，声波刺激可以提高p mh - a t p a s e 的活性，通过在体和离体分析 表明声波刺激影响p mh + - a t p a s e 的活性依赖于c a ”，并且与磷酸化作用有关。这 提示p m 1 一a t p a s e 响应声波刺激也可能是通过依赖c a ”的蛋白质激酶来实现。应 用膜片钳技术对离子通道研究的结果显示，在菊花愈伤组织质膜上存在对应力敏 感的k + 通道。声波作用使钾通道开放频率明显增加，表明k + 通道在响应声波刺激 中发挥着非常重要的作用。还研究了声波对质膜可变形性的影响，用微吸管技术 研究了在某一声强一f 不同频率的交变刺激作用后菊花愈伤组织细胞膜可变形性的 变化规律，研究结果表明，质膜的可变形性与频率密切相关。随着刺激频率的升 高，质膜的弹性模量( u ) 和粘性系数( r t ) 增加，说明了质膜的可变形性降低。 5 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 从遗传角度研究了声波对染色体的影响。分别测定了d n a 、r n a 和可溶蛋白 质的含量，发现声波处理组的d n a 含量变化不明显，而r n a 和可溶蛋白质的含量 都有所升高，且以刺激9 d 的实验组最为突出。 以上的研究成果为本次实验在分子水平上研究环境应力对植物基因差异表达 的影响提供了基础。 1 4 2 课题来源 本次研究是“中国国家自然科学基金委员会”与“日本学术振兴会”联合资 助合作研究项目“声波应力下植物差异表达基因筛选及其表达研究”课题的一部 分，也是重庆邮电学院科研基金资助项目，本文的实验在重庆邮电学院生物信息 学院完成。 1 4 3 研究意义 查阅文献了解到，相对于其它环境应力的研究，有关声波刺激对植物生长发 育的影响在分子生物学层次上还很少有报道，还没有研究向应声波作用的相关基 因的表达及机制。我们应用分子生物学技术通过对模式植物拟南芥的研究，筛选 出响应声波应力的差异表达基因，通过n o r t h e r n 杂交鉴定出阳性片段。为后续差 异表达基因的测序、克隆、功能分析以及基因转导等后续工作做好准备，为最终 通过对模式植物拟南芥的研究揭示植物在声波应力下基因调控表达的普遍机制作 出了有意义的尝试和探索。 1 4 4 研究思路与技术路线 在本次实验中，以模式植物拟南芥组培幼苗为实验材料，对其进行声波加载。 加载实验完毕后，提取材料总r n a 。然后以总r n a 为模板，通过m r n a 逆转录差异 显示技术筛选出受声波诱导的差异片段，并用n o r t h e r n 点杂交验证真假阳性，本 文的技术路线图见图1 1 。 1 4 5 本文的主要工作 对实验材料模式植物拟南芥的声波加载 本文以通过组织培养培育的拟南芥无菌苗作为实验材料，培育的拟南芥，要 确保基因型上的一致性。在声波加载过程中，刺激组和对照组的生长环境也要求 一致。 提取拟南芥的总r n a 在声波刺激周期结束后，提取刺激组和对照组拟南芥的总r n a ，未降解的总 r n a 的提取是其首要条件。对提取到的总r n a 进行纯度和完整性检测，确保总 r n a 的质量满足后面的实验的要求。 分离受声波诱导的差异表达片段 运用银染差异显示技术分离出差异表达片段，筛选出来的差异片段应具有较 6 重丛查堂堡主堂垡堡茎三! ! 坠 好的重复性，以便减少假阳性片段。 验证差异表达片段 逆转录差异显示技术分离出来的差异表达片段往往具有较高的假阳性，因此 需要对得到的差异条带进行鉴定，我们采用n o r t h e r n 杂交鉴定出阳性差异基因片 段，对结果进行分析。为测序、克隆、功能分析以及基因转导等后续工作做好准 各。 1 4 6 本文的创新之处 有关环境应力对植物生长影响的研究已有不少，但对声波刺激的生物学效应 研究起步较晚，研究也较少，以前相关的研究在个体、组织、细胞三个层次得到 了一定的研究成果，但是对其在分子生物学层次的机理并不清楚。本文以模式植 物拟南芥为实验材料开展研究，运用m r n a 逆转录差异显示技术初步了解声波应力 作用对植物基因表达的影响，研究内容未见国内外相关报道。 重庆大学硕十学位论文1 绪论 图1 1 本文技术路线 f i 9 1 1t h e t e c h n i c a lr o u t ei nt h i st h e s i s 8 重庆大学硕士学位论文2 实验方法与材料 2 实验方法与材料 2 1 m r n a 逆转录差异显示技术 1 9 9 2 年，l i a n g 等 2 9 】根据高等生物成熟的m r n a 带有p o l y a 的特性，用特异的 锚定引物反转录后，进 j t p c r 扩增，建立t m r n a 逆转录差片显示技术怖r n a d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p c r ，d d r t p c r ) 。差异显示技术带来了 方法学上的重要突破，为揭示生理过程的分子机制，提供了强有力的工具。凭借 此方法可以了解生物不同发育阶段或不同环境下细胞之间基因表达的差异，在对 基因克隆、抗逆性机制的研究、激素调控的分子机理、生物体对外因刺激的反应 等方面发挥越来越大的作用。 2 1 1 r n r n a 差异显示技术原理 不管是哪一种基因，它们在表达之前必须先将d n a 上贮存的遗传信息转录加 工成m r n a ，再通过核糖体将m r n a 上携带的遗传信息翻译成基冈编码的产物， 蛋白质或多肽。因此，m r n a 是连接基因及其表达产物之间的纽带。绝大多数真 核生物基因转录后加工成熟的m r n a 3 端有一个p o l y ( a ) 的尾巴，p o l y ( a ) 上游的 两个碱基最后2 位是a 。d d r t - p c r 正是利用真核生物m r n a 的这一特性，在反 转录酶的作用下，用3 端含有p o l y ( t ) 的锚定引物对来自两种或两种以上对比材 料的m r n a 进行反转录。在这个锚定引物中，与p o l y ( t ) 紧密相连的碱基分别是 c 、g 及a ，而四种碱基与这三个碱基又有十二种组合( 即形成两个碱基锚定的 o l i g o d t 引物，也即双碱基锚定引物) ，这样就可以将某一时间某一组织提取出来 的所有m r n a 反转录形成的c d n a 分成十二个亚群。由于这些e d n a 中代表某 一特定细胞类型或发育阶段的m r n a 种的含量是相当低的，故需通过p c r 进行 扩增。在p c r 的扩增过程中除锚定引物外，还需要能与c d n a5 端进行退火反 应的随机引物。这样，用一定数量的锚定引物与随机引物组成的引物对就可以使 不同长度的基因片段得以扩增。扩增以后就可利用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电 泳，对p c r 扩增产物进行分离，并就基因表达的差异进行比较。最后将差异显示 的基因片段从测序胶上切割下来，用相同的锚定引物随机引物对分离的片段进行 二次扩增，再进行测序，并作进一步的深入研究。差异显示技术路线如图2 i 。 2 1 2 差异显示技术的优点及存在的问题 d d r t - p c r 将几个样品的比较与p c r 的敏感性相结合，具有起始r n a 用量 少、简便快速、准确、灵敏度高、重复性好、结果可靠、可同时比较多个样品、 可进行多基因家族的表达分析等优点，并可恢复序列信息，开发用于c d n a 分离 的探针，深化分子及功能特性的研究，已广泛用于分子生物学的研究。 9 重庆大学硕士学位论文 2 实验方法与材料 i提取a 细胞r n a 提取b 细胞( 对照组) r n a jj 同一锚定引物对两种r n a 备白进行反转录 i 同一对引物组合分别对两种c b m 模板进行p c r 扩增 i 相邻泳道聚丙烯酰胺凝胶电泳 图2 1m p “n a 逆转录差异显示技术( d d r t ) 基本流程图 f i 9 2 1t h ep r o c e s so f d d r t o p c r 但是，和其它方法一样，d d r t p c r 也有其不足之处【3 0 。3 1 。一是假阳性 很高， 有时假阳性的比例高达5 0 一7 5 ，这造成人力、物力、财力等不必要的 浪费，使探针筛选十分费时，增加了后续工作的难度。二是由于p c r 自身对反应 条件的敏感性，m r n a 差异显示技术重复性较差。三是扩增片段小，不能代表真 正差异表达的基因，进而影响真正差异表达的目的基因的检测。四是由于只能扩 增靠近p o l y ( a ) m r n a3 端不大于6 0 0b p 的区域，使上游的差异表达信息量得 不到检测。 2 1 3 差异显示技术的改进 m r n a 差异显示技术问世以来得到广泛的应用，人们在利用差异显示技术的同 时，也不断对该技术进行改进： 1 0 罕 罕 重庆大学硕士学位论文 2 实验方法与材料 得到的r n a 必须经过脱氧核糖核酸酶i ( d n a s e i ) 充分消化，去除染色体 d n a 污染。m r n a 转录时浓度不应小于0 t p g ，以免丢失稀有m r n a 而使结果错误。 1 9 9 4 年，l i a n g 3 4 在前面研究的基础上，又设计出单碱基锚定的 o l i g o d ( t ) i o m ( m = g ，a ，c 1 引物，每种单碱基引物参与三分之一的m r n a 亚群的 反转录：这样不仅可减少反转录反应的次数，而且可以降低由于引物降解而造成 的假阳性结果的频率。 在锚锭引物的3 端和随机引物的5 端加上e c o ri 等酶切位点，使结果的 重复性与敏感性大大提高。 对p e r 扩增条件与参数进行优化，这里包括d n t p 浓度、m g ”离子浓度、退 火温度、同位素的掺入和缓冲溶液及聚合酶的选择与使用等。 差异基因的最终确认是用n o r t h e r n 杂交，如果选取了十几或几十条差异条 带，用n o r t h e m 杂交工作量太大，若用反向n o r t h e m 杂交则比较简便。 应用t a r g e t e dd d 方法，基本原理是将5 一端引物延长，增加扩增片段的特异 性”：或者用s t o n e 和w h a r t o n 3 6 报道的 t a r g e t e dr n af i n g e r - p r i n t i n g ”方法。这样 有可能使扩增片段特异性高，减少假阳性率，同时可能在g e n eb a n k 数据库中得 到更多结构与功能方面的信息。 2 1 4 差异显示技术在植物中的应用 在植物的发育分化方面 差异显示技术由于充分利用p c r 技术和逆转录，因此利用该技术能够观察细 胞中m r n a 的组成，了解植物不同发育阶段或不同环境条件下的细胞之间的差异 表达，克隆目的基因，研究其对植物个体生长和发育的影响。 b r i g h a m 等 3 7 利用差异显示技术研究了豌豆根尖和界面细胞的m r n a 和蛋白 质的差异表达，发现两种细胞的m r n a 差异与蛋白质差异具有高度的相似性，界 面细胞的分化与蛋白表达的变化有关。h e c k 等口即应用该方法研究了欧洲油菜的胚 发育，并经n o r t h e r n 杂交和原位杂交证明一个重要的基因a g l l 5 调控胚的发育过 程。w i l k i n s o n 等【”】分析了成熟的草毒与不成熟的草毒之间的差异表达，发现3 个 特异表达的m r n a 片段与果实发育有密切的关系，c d n a 片段序列推测的氨基酸 序列与已知的蛋白有同源关系。c a l l a r d 等【4 0 j 通过研究拟南芥细胞悬浮培养后期的 m r n a 差异表达，发现3 个基 ( s r 9 1 、s r 9 2 、s r g s ) 的转录产物m r n a 在器官衰老 时大量积累，如果改变这3 个基因，则有利于延缓器官衰老。o r s a m 等 4 1 1 发现， 玉米胚特定区域才能表达的基因一z m e s r ，在开花前4 7 d 内表达，之后表达量逐渐 减少。程宁辉等 4 2 以大豆和玉米的黄化苗与绿苗为材料，研究了光照和黑暗条件 下大豆和玉米基因表达的差异。关和新等 4 3 】分析了水稻粤泰不育系及保持系单核、 二核及三核期的m r n a 表达差异，并经总r n a 斑点杂交对部分差异带初步筛选。 重庆大学硕士学位论文 2 实验方法与材料 在植物激素调控方面 激素在植物的生长发育过程中，起着非常重要的作用，因而研究其调控机理 有重要意义。k n a a p , 等f 州以深水水稻为材料，分别用水和赤霉素处理水稻植株的茎 部节段，用m r n a 差异显示技术研究了赤霉素诱导基因表达的效果。引物组合 t 1 2 m g 和o p a 0 4 扩增出了l 条命名为9 b 的产物，引物组合t 1 2 m gj i i o p a 0 7 扩 增出了1 条命名为d 的产物。研究表明在细胞周期组氨酸是受到转录水平调控的， 它可作为深水水稻g a 3 诱导细胞分化的标记。p e t e r s 等【45 1 发现，用玉米素处理红叶 黎的细胞时，m r n a 表达量迅速增加，从而使细胞分裂加快。c h e l a 等【46 】用赤霉素 处理水稻幼苗，发现处理过的幼苗中m r n a 有特异的差异带。克隆该条带，发现该 条带影响基因调控过程中的某些蛋白。瞬时表达分析证明，该序列位于启动子转 录起始位点上游2 3 l 一1 5 9 碱基位置，还发现u c b 基因可促进q 淀粉酶基因表达，从 而调节水稻幼苗发育。e s t h e r 等 4 7 1 还对深水条件下g a 诱导产生的节间伸长而使水 稻叶片上浮的机理进行了研究，证明赤霉素作用的主要目标组织是节间的中间分 生组织，分离得到中间分生组织中赤霉素调控的基因。娄沂春等 4 8 分离和鉴定了 水稻叶绿体a t p 合成酶受赤霉素诱导的差别表达基因，证明赤霉素诱导水稻产生生 理反应过程涉及了叶绿体基因表达。 在植物抗逆性研究方面 利用差示p c r 技术可以筛选抗逆新基因，其基本程序是先将植株置于恶劣环 境中生陡一段时间，然后将其与对照组植株( 正常生长) 起作为一组实验对象进行 m r n a 的差异显示，由于恶劣环境诱导了植株的抗逆性基因，因此所得差异往往 与抗逆基因相关。 张弛等 49 用差异显示技术分析了在盐胁迫下水稻耐盐突变体中特异表达的基 因，共获得1 3 个c d n a 片段( s a l t i n d u c e d g e n ei nr i c e ，s i g r l 1 3 ) 。王振英等 利用该方法分析黑麦盐胁迫条件下应答基因c d n a 片段的表达特性，得到3 个差 异表达c d n a 片段，证明与盐胁迫直接有关，其中s 1 8 0 0 可能是一个盐胁迫应答 基因片段。k d a y r z h a n o v a 等 5 u 用d d p c r 和筛选c d n a 文库的方法从西红柿中 克隆了一个与热诱导冷耐受相关的新基因。张立平等 52 i 比较了对铝极敏感水稻品 种( p p 2 4 6 2 11 ) 和极抗品种( p e d e l ) 在铝胁迫条件下苗期m r n a 的差异，共发现2 5 个 差异c d n a 片断，他们推测抗性品种特异表达的片段可能与合成抗性蛋白有关， 敏感品种基因的特异表达可能产生一些毒害蛋白，抑制水稻根的生长。l e r s 等【5 3 1 用d d - p c r 技术在经过u v - c 处理的葡萄柚的果皮中克隆出编码异黄酮还原酶类 似物( i r l ) 的基因。b r o s c h e 等m 3 从u v - b 辐射处理的豌豆叶片总r n a 中分离出 d n a 片段m b 3 。周建明等 55 应用d d - p c r 分离得到水分胁迫诱导表达的小麦基 因d i l 的c d n a 片段，并通过n o r t h e r n 点杂交研究了d i l 基因与水分胁迫时间的关 1 2 重庆大学硕士学位论文2 实验方法与材料 系。 在植物抗病研究的方面 该项技术在植物抗病性中主要表现于2 个方面： 1 ) 抗病基因介导的抗性反应。r e u b e r 等首次用该法从拟南芥中分离了2 个由 抗性基因r p s 2 介导的抗性反应基因a i g l 和a i g 2 5 们。董海涛 5 75 8 】应用此技术对 水稻抗稻瘟病近等基因系月职和船进行了分析，在约1 2 0 个引物组合的反应 中总计获得了3 3 个c d n a 差异片段，并将它们归为抗病相关r 兄r ) 、感病相关( s r ) 和致病性诱导c p d 相关3 类群。此外，利用己知植物蛋白激酶及抗病基因氨基酸序 列，殴计含激酶保守功能域的筒并引物，运用m r n a 差异显示技术显示对抗性品 系( m 2 6 ) 及感病品系( 金刚3 0 ) 愈伤组织m p u n a 的表达差异，并对差异片段分子克 隆。 2 ) 抗病性相关基因的c d n a 片段的克隆。周建明”1 、黄旭利用m r n a