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浙江工业大学硕士论文灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 摘要 灵芝( g 册d 如册口觑c f 也聊) ，是一种名贵的食用和药用真菌。 灵芝多糖具有多种重要的药理活性，如抗炎、免疫调节、抗肿瘤、保 肝、降血糖和降血压等，有着良好的应用前景。 本文进行了灵芝多糖的提取工艺优化、灵芝多糖的抗氧化作用、 灵芝几丁质壳聚糖的制备及理化特性的研究。取得的成果如下： 1 灵芝水提多糖的提取工艺条件优化 通过单因素实验的研究，得到最佳的提取工艺条件：超声时间为 2 5m i n ；超声温度为5 5 ；纤维素酶加酶量为2 0 0 0u g ；中性蛋白 酶酶解时间为1 5h ，酶解温度为4 0 ，加酶量为1 4 0 0u g ，在此 条件下灵芝多糖的提取率达4 0 2 。 2 灵芝碱提多糖的提取工艺条件优化 通过单因素试验，得到灵芝碱提多糖提取的最佳条件为：料液比： 1 ：5 0 ；提取温度：8 0 ；提取时间：6h ；氢氧化钠浓度：lm o l l 。 提取次数1 次为宜。在此条件下灵芝碱提多糖的提取率达2 5 3 2 。 3 灵芝多糖的抗氧化作用 将上述提取所得三种灵芝多糖：灵芝水提水溶多糖，灵芝碱提水 溶多糖，灵芝碱提水不溶多糖分别做了三种自由基：d p p h ，o h ，a b t s + 1 灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 的抗氧化实验。结果表明，三种灵芝多糖对三种自由基均有清除效果， 碱提水溶多糖对自由基的清除效果明显优于其他两种。 4 灵芝几丁质壳聚糖的制备及理化特性的研究 以灵芝子实体经提取三萜类及多糖后的残渣，制备几丁质及壳聚 糖，经电镜观察，红外光谱检测，g c 分析，灵芝几丁质的理化性质与 蟹虾壳来源的几丁质一致，并通过正交实验设计制备氨基葡萄糖盐酸 卜 - 吐o 本研究创新点： 1 使用超声波与酶法结合提取多糖，灵芝水提多糖的提取率明显大 于传统热水的提取方法。 2 利用碱法提取灵芝中含量较高且难以提取的多糖，更大程度的提 高了灵芝多糖的提取率。 3 以灵芝子实体经提取三萜类及多糖后废弃的残渣，制备得到在医 学、药物制剂学、化工、食品、化妆品、印染、造纸、农业、环 保以及酶的固定化载体等方面具有广泛的用途的几丁质、壳聚糖 及氨基葡萄糖盐酸盐。 关键词：灵芝，几丁质壳聚糖，红外光谱，气相 浙江工业大学硕士论文灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t ya n d e x t r a c t i o ns t u d i e so ft h ep o i j y s a c c h a i u d e a n dc h i t i nf r o mg a n o d e r m l al u c i d u m a b s t r a c t g 口咒d ( 据厂7 规口觑c 彪玩mi sak i n do fe d i b l ea n dm e d i c i n a l 向n g i ( 勋，z d 出厂m 口 觑c 埘h 历 p o l y s a c c h 撕d e w i t ha v 撕e 够 o f i m p o r t a n t p h a n n a c 0 1 0 9 i c a l a c t i v i t i e s ， s u c ha s a n t i i n f l 锄m a t o r y i n m m n e m o d u l a t o r y a n t i t u m o r 1 i v e r ，l o w e r i n gb l o o ds u g a ra n db l o o dp r e s s u r e ， a n ds oo n ，h a v eag o o dp r o s p e c to f 印p l i c a t i o n 1 1 1 i sa i t i c l ei sa b o u t 渤咒d 比翮以觑c 施优p o l y s a c c h 撕d ee x t r a c t i o n p r o c e s so p t i m i z a t i o n ，( 边玎d 如所磁觑c f d h 聊p o l y s a c c h a r l i d ea n t i o x i d a t i o n ， g 册d 如册口觑c 砌z mc h i t i n c h i t o s a na n dt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a l p r o p e r t i e s t h er e s u l t sa r ea sf 0 1 1 0 w s ： 1 g 以胛d 如册口觑c 云也历p o l y s a c c h 撕d ew a t e re x t r a c to ft h eo p t i m i z a t i o n p r o c e s s s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ，t h eb e s te x t r a c t i o nc o n d i t i o n s ：u l t m s o n i c t i m eo f 2 5m i n ；u l t r a s o n i ct e m p e r a m r e5 5o c ；c e l l u l a s ee n z y m ec a p a c i t y 2 0 0 0 “g ； n e u t r a l p r o t e a s ee n z y m e f o rt h et i m e1 5 h ， d i g e s t i o n 3 浙江工业大学硕士论文灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 t e m p e r a _ t u r e4 0o c ，f o rt l l e 锄o u n to fe n 乃l ，1 1 1 e 14 0 0u 鹰，u n d e r 也e s e c o n d i t i o n s ，t h ep o l y s a c c h 撕d e ( 勋以d d b ，聊口觑c f a k 聊e x t m c tr a t eo f4 0 2 p e r c e n t 2 g 口以d 如册口觑c 施，zp o l y s a c c h 撕d ea l k a l ie x t r a c to ft h eo p t i n l i z a t i o n p r o c e s s s i n g l e - f a c t o rt e s t ，t ob eg 口聆d 比，m 口觑c 云巩f mp o l y s a c c h 撕d eb a s et o e x 仃a c tt 1 1 eb e s tc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：1 i q u i dr a t i o ：l ：5 0 ；e x t r a c t i o n t e m p e r a t u r e ：8 0 。c ；e x 仃- a c t i o nt i m e ：6h ；t h ec o n c e n t r a t i o no fs o d i u m h y d r o x i d e ：1m o l l e x t r a c t i o n o fam l m b e ro ft i m e si s a p p r o p r i a t e u n d e rt b e s ec o n d i t i o n s ，g 口门d 如厂7 咒口z “c f c 玩ma l k a l ie x t i a c tp o l y s a c c h a r i d e c a nb ea c h i e v et h ee x t r a c t i o nr a t eo f2 5 3 2 3 g 口甩d d b ，柳口觑c z 觇f 聊p o l y s a c c h a r i d ea n t i o x i d a t i o n g 以刀d c 跑，7 ”口觑c f c 缸，挖e x t l a c t 舶mt h ea _ b o v e m e n t i o n e dt h r e ek i n d s o fp o l y s a c c h a r i d eg 钮聆d a 切翩口觑c z 巩f m ：( 论挖d 如，扰口砒c z d 聊t ot h ew a t e r s 0 1 u b l e p 0 1 y s a c c h 撕d e ， a l k a l i n ee x t r a c t i o no fw a t e rs 0 1 u b l e p o l y s a c c h 撕d e 国，z d 比朋口觑c 协所，a l k a l i n ee x t r a c t i o no fa l k a l is o l u b l e p 0 1 y s a c c h 撕d e 渤刀。如删口觑c f 也聊w e r em a d e t 1 1 r e e 舶er a d i c a l s ：d p p h ，o h ，a b t s + se x p e 血n e n t a la n t i - o x i d a t i o n t h er e s u l t ss h o w 也a tt h r e e k i n d so fp 0 1 y s a c c h a r i d e ( 近聆o c 七，1 叩2 口觑c f c 觑，咒o nt h et h r e eh a v ec l e a r e 伍c t so f 行e er a d i c a l s ， a l k a l i n ee x t r a c t i o no fw a t e rs 0 1 u b l e p 0 1 y s a c c h a r i d e t or e m o v et h ee 矗e c t so f 丘e er a d i c a l sb e t t e rm a nt h e o t h e r 俩o 4 浙江工业大学硕士论文灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 4 国，z d 如册口觑c 玩聊c h i t i n c h i t o s a na n dt h ep h y s i c a la n dc h e i n i c a l c h a r a 【c t e r i s t i c s b y t h e 舢i t i i l g b o d i e so f国，2 d 如肋口觑c 协mt oe x t r a c t p 0 1 y s a c c h 撕d e sa n dt r i t e 印e n e sa r e rt h er e s i d u e ，a n dm ep r e p a r a t i o no f c h i t i nc h i t o s a n ，e l e c t r o nm i c r o s c o p y ，i n 仔a r e ds p e c t r o s c o p yd e t e c t i o n ，g c a n a l y s i so f 函n d 比册口觑c f 也耽c h i t i np h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e n i e s o ft h ec r i ba n ds h n l ps h e l lt h es o u r c eo fc h i t i n ，a n dt 1 1 r o u g ho r t h o g o n a l e x p e r i m e n t a ld e s i g np r 印a r a t i o ng l u c o s a m i n eh y d r o c l l l o r i d e t h ei n n o v a t i o no ft h i ss t l l d y ： 1 t 1 1 eu s eo fu l t r a s o u n dc o m b i n e dw i t ht h ee n z = 灿ee x t r a c t e d p o l y s a c c h 撕d e ，t h ew a t e re x t r a c to fg 口，z d 如，聊口觑c 五d 厶mp 0 1 y s a c c h 撕d e e x t i a c t i o nr a t et h a nt h et r a d i t i o n a lm e t h o do fe x t r a c t i o n 2 t h eu s eo fa l k a l i n ee x t r a c to fg 口，z d 比7 ，研口觑c 埘幻mw i t hah i g h1 e v e l a n dd i f f i c u l tt oe x t r a c tt h ep o l y s a c c h 撕d e ，ag r e a t e rd e g r e eo ft h e1 u c i d u m p 0 1 y s a c c h a f i d et oi n c r e a s et h ee x t r a c t i o nr a t e 3 b y t h e f i m i t i n g b o d i e so fg 册d 如聊z 口觑c 矗觑mt oe x t r a c t p o l y s a c c h 撕d e sa n dt r i t e 印e n e s a b a n d o n e da r e rt h er e s i d u e ，h a sb e e n p r 印a r e d i nt h em e d i c a l ，p h a r m a c e u t i c a l ， c h 锄i c a l ，f o o d ， c o s m e t i c s ， p r i n t i n ga n dd y e i n g ，p 印e rm a k i n g ，a g r i c u l t u r e ，e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n ， a n de n z y m ei m m o b i l i z a t i o n ，a n do t h e rc 拥e r sh a v ee x t e n s i v eu s eo f c h i t i n ，c h i t o s a na n d9 1 u c o s a m i n eh y ( h o c h l o r i d e k e y w o r d s ：g 口”d 如册口励c 云施所c h i t i n c h i t o s a ni r 5 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江 工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的 法律责任。 作者签名：关7 冉 日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名：差豳 导师签名： 日期：年月日 日期：年 月 日 浙江工业大学硕士论文 灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 第一章绪论 灵芝，又名瑞草，芝草，是我国传统的药食两用的珍贵保健药。 我国医学对灵芝的药效研究源远流长，自古以来被认为有起死回生的功效， 是名贵药材中的极品，远在周朝列子一书中就有“朽壤之上，有南芝者”。 东汉时的神农本草经中载有：“益心气”、“安精魂”、“补肝益气 、“坚筋 骨 、好颜色等功能n 1 。明代李时珍的本草纲目对灵芝做如下描述：“苦、 平、无毒。主治心中结，益心气。补中、增智慧、不忘。久食轻身不老”啦! 。 据神农本草经记载“灵芝有六种，赤芝、青芝、白芝、黄芝、黑芝、 紫芝。赤芝生霍山，青芝生泰山，黄芝生篙山，白芝生华山，黑芝生常山，柴芝 生高山峡谷。凡得芝草，证而食之，无余节度，故皆不云服法也 n 1 。同时记载 “赤芝性平、味苦，治胸中结、益心气、补中，增智慧、不忘、延年益寿等”n 1 。 灵芝是担子纲，多孔菌科，灵芝属真菌口1 。现已知约1 2 0 种，中国有6 3 种， 世界各地均有分布，以热带及亚热带地区较多。一般供药的主要是赤灵芝 ( 锄p 幽黝u c j 锄) 和紫芝( 锄d 幽黝向伽砌) 。研究表明，灵芝的组要 组成成分复杂，具有多种有效成分和广泛的生物学作用，能治疗多种疾病。尤其 近三十年来，随着现代化分析方法，分析手段的大量运用，使得世人对于赤灵芝 功效的分子基础及作用机制有了比较深刻的认识，相关的研究报道每年均以较大 的篇幅出现在内外期刊和书籍中。 1 1 灵芝的化学成分 灵芝的化学成分比较复杂，种类繁多，也是目前常用中草药中化学研究比较 细致的品种，已报道的化学成分约2 0 0 多种，分类介绍如下： 1 1 1 多糖及多糖缀合物 多糖及多糖缀合物是灵芝的重要化学成分，其种类很多，主要有葡聚糖、杂 聚糖、半乳糖、甘露糖、甘露岩藻半乳聚糖、阿拉伯糖、阿拉伯木质聚糖等h 1 。 灵芝中多糖的含量因灵芝品种、提取方法与多糖的纯度等不同而有较大的差异， 1 浙江t 业大学硕士论文灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 大多存在于子实体，菌丝体以及孢子体的细胞内壁，除此之外，也包括液体培养 的发酵液和固体培养基中菌丝体分泌的胞外多糖以及从真菌细胞壁中提取的多 聚含氮黏多糖几丁质和壳聚糖。 对于灵芝的多糖及多糖缀合物的研究始于2 0 世纪8 0 年代初，m i y a s a k i 等首 先报道了子实体中的一个具有抗肿瘤作用的阿拉伯木聚糖畸3 ，随后s o n e 等人采用 不同的提取流程与分级方法从赤灵芝子实体及菌丝培养液中得到1 0 个多糖级 分，发现有热水提取得到的多糖具有较好的抗肿瘤s a r c o m a l 8 0 活性，并且它们 都具有相似的p ( 1 _ 3 ) d 舀u c a i l 的主链结构3 。这以后国内外多个实验室相继开 展对灵芝多糖和多糖缀合物的进一步分离纯化，化学分析及药理研究工作，并取 得了许多进展。 灵芝多糖目前已分离到的有2 0 0 多种，其中大部分为b 型的葡聚糖，少数为 q 型的葡聚糖，多糖链由三股单链构成，以一种螺旋状立体构形物，其立体构形 和d n a 、r n a 相似，螺旋层之间主要以氢键固定定位，分子量从数百到数十万， 除一小部分小分子多糖外，大多不溶于高浓度的酒精中，在热水中溶解，大多存 在于灵芝细胞壁内壁。液体培养的发酵液和固体培养的培养基中有灵芝菌丝分泌 的胞外多糖。胞内多糖胞外多糖都是有效多糖。灵芝多糖大多为异多糖乜4 | ，即除 含有葡萄糖外，大多还含有少量阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、甘露糖等其他单糖。 单糖间糖苷键连接有( 1 3 ) ，( 1 4 ) ，( 1 6 ) 数种。多数有分枝，部分多糖含有 肽链，多糖分枝密度高或含有肽链的其药理活性一般也比较高。灵芝多糖的药理 活性和糖甙键、糖甙键、多糖分子立体结构以及分子量大小有关，这是灵芝多 糖有别于淀粉、纤维素等其它多糖之处。灵芝纤维素可在大肠中脱水，防止便秘， 还可以降低胆固醇，预防动脉粥样硬化等作用。灵芝碳水化合物中除纤维素外的 灵芝多糖是最有效的营养成分之一，灵芝产品深加工时大都注重灵芝多糖的含量 和品质，因此灵芝多糖的含量和品质评价灵芝深加工的产品优劣的一个重要指 标。 1 1 2 三萜类化合物 从灵芝中分离到的另一种具有药理活性的化学成分是三萜类化合物。其中带 有羧基的三萜称为灵芝酸，某些灵芝酸有苦味，如g a n o d e r n j ca c i da 和l u c i d e l l i c 2 浙江工业大学硕士论文灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 a c i da 等。需指出的是，在不同培养基上生长的灵芝子实体及其不同生长阶段， 灵芝酸的含量有所不同，苦昧程度也有差异。一般苦味的灵芝其灵芝酸含量较高。 m i y a s a l ( i 等认为灵芝子实体中灵芝酸的含量是随其成熟度的提高而递增，且集中 于子实体的外周部位哺1 。 目前分离到的三萜类大约有1 3 0 种，多数为高度氧化的羊毛甾烷衍生物。已分 离得到的三萜类化合物包括灵芝酸a 、b 、c 、d 、e 、g 、i 、l 、m a 、胁、m c 、 m d 、m g ；赤芝酸a 、b 、c 、d 、e 、f 、o ；灵芝内酯、灵芝酸d m 3 ，7 一二氧 化一8 ，2 4 一( e ) 一二烯一羊毛甾一2 6 一酸 阳1 、灵芝酸e ( 3 ，7 ，1 l ，1 5 ，2 3 一五氧化一5 q 一羊毛甾一8 一烯一2 6 一酸) n 们、t s u a 鲥ca c i da ( 3 旷乙酰氧基一5 a 一羊毛甾一8 ，2 4 一二 烯一2 卜酸) 、ts u a 鲥ca c i db ( 3 旺一乙酰氧基一1 6 0 l 一羟基一2 4 芎一甲基一5 a 一羊毛甾一8 ， 2 5 一二烯一2 卜酸) n 1 j 、g a n o d e n i l aa c i d 仅( 1 2 p 一乙酰氧基一3 p 、1 5 p 一二羟基一7 、1 1 、 2 3 一三氧化一5 a 一羊毛甾一8 一烯一2 6 一酸) 1 2 3 、1 u c i d e m ca c i do n 3 3 。按分子中碳环的数 目可分为四环三萜和五环三萜二大类；按分子中所含碳原子数可分为c 3 0 、c 2 7 和c 2 4 三类；而根据其所含官能团和侧链不同，又可细分为六种基本骨架 ( f i g 1 1 ) 。 v r 3 、，i 图卜16 种不同的灵芝三萜类化合物基本骨架 f i g 1 1 s 奴s k e l e t o i l so fm et r i t 唧e so fg 1 u c i d m n 3 浙江工业大学硕上论文 灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 1 1 3 甾醇类化合物 灵芝中甾醇含量较高，仅麦角甾醇含量就达千分之三，已知的灵芝甾醇成分 有近二十种，其骨架多为麦角甾醇，少数为胆简醇骨架n 制。其中陈若芸的等人从 孢子粉的脂溶部分得到了多个甾体化合物，分别为麦角甾一7 ，2 2 一二烯一3 p ，5 a ， 6 0 【一三醇、麦角甾一7 ，2 2 一二烯一3 b ，5 q ，6 d 一三醇、麦角甾一7 ，9 ，2 2 一三烯一3 p ，5 0 【， 6 0 l 一三醇、麦角甾醇棕榈酯、麦角甾一4 ，6 ，8 ( 1 4 ) 一四烯一( 3 ) 酮以及麦角甾醇 n5 1 。另外，l i i l 等人从子实体分离到两个具有细胞毒的亚油酸甾醇酯，分别为 e r g o s 协7 ，2 2 - d i 锄一3p - y l1 i n o l e a t e 和5 0 【，8 a - 印i d i o x y e r g o s t a 一6 ，2 2 一d i e n 一3p y l 1 j n o 】e a t e 1 6 1 。 1 1 4 氨基酸及多肽类化合物 灵芝是氨基酸的“贮存库 ，含有赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甘 氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、蛋氨酸等，占 灵芝的1 0 以上。在总的氨基酸中游离态氨基酸占3 0 一3 5 ，人体必需的氨基 酸占总氨基酸3 0 一4 0 ，其余的则和多糖结合形成糖肽链，也就是所谓的复合 蛋白质：灵芝中的氨基酸有种类多、含量高、活性高、易被人体吸收的特点，其 中活性高主要是复合蛋白质起着重要的作用，它和灵芝多糖协同作用具有强烈的 抗肿瘤活性。如果将蛋白质和多糖分开来分别使用，各自的药理活性就会明显地 下降。灵芝氨基酸是人体蛋白质的原材料物质，人体内起催化作用的各种酶，调 节代谢的激素，起免疫作用的抗体等都是由氨基酸组成的具有独特生理活性的蛋 白质，人体内蛋白质要不断地代谢更新，灵芝能补充人体内氨基酸种类和用量的 不足。 研究还发现孢子粉中含有一定量的含硫氨基酸，其结构x 一衍射确定为硫组氨 酸甲基内铵盐口刀。从子实体中还分到四个多肽化合物阳3 ，两个为中性多肽，一个 酸性多肽和一个碱性多肽。碱性多肽经水解得到4 种氨基酸，分析确定氨基酸顺 序为鸟一甘一脯一脯四肽结构。值得一提的是，日本学者n o 等从子实体中纯化得 到一个具有强免疫刺激作用的蛋白质，命名为l z 8 ，并已经完成了基团的克隆和 表达n 8 一们。也有报道，从子实体中分离的到了凝集素类化合物瞳0 l 。 4 浙江工业大学硕士论文 灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 1 1 5 灵芝中的矿物质 灵芝是矿物质的“聚宝盆 ，含有钙、磷、镁、锌、锰、铁、钴、铜、钾、 锗、硒、钒、钠、镍、铬等2 6 种营养元素，这些元素大都形成元素有机高分子化 合物，容易被人体吸收利用。灵芝子实体内的有机锗就是一种倍半氧化物，结构 通式为( g e r ) 2 0 3 ，能与体内污染物、过剩金属( 正离子) 相结合成为锗化合物， 经排泄系统排出体外，起着净化体液的作用，有机锗还具有降压，抗菌，抗癌作 用，活性极高；硒元素与肝功能肌肉代谢有关；铬元素促进葡萄糖的利用，与胰 岛素的作用机制有关；铁是组成血红蛋白的材料。每一种元素都适应于某一特定 的功能，灵芝能防病、治病、增强机体免疫功能和这些矿物质元素密切相关。 1 1 6 其它 除上述主要成分外，灵芝尚含有核苷，生物碱及脂肪酸等其他成分乜1 物。 核苷是一类有广泛生理活性的水溶性成分，已报道从菌丝体分离到5 种核苷 类化合物，分别为尿嘧啶。鸟嘧啶核苷、腺嘌呤、腺嘌呤核苷和灵芝嘌呤，其中 最后一个为新化合物乜羽。 灵芝的生物碱含量较低，已报道的生物碱共有7 种，分别为胆碱、甜菜碱及 其盐酸盐、灵芝碱甲、灵芝碱乙、菸酸和y 一三甲胺基丁酸n 副。 另外，灵芝的子实体和孢子粉还含有大量的脂肪酸类化合物，有甘油酸 ( c 1 6 ) 、硬脂酸( c 1 8 ) 、花生酸( c 2 0 ) 、廿二碳酸( c 2 2 ) 、廿三碳酸( c 2 3 ) 和廿四碳酸( c 2 4 ) 等n 副。孢子粉还含有一定量的d 甘露醇、a ，0 【海藻糖及维生 素e 等化合物乜到。 1 2 灵芝的药理作用 一 灵芝的药理作用研究涉及野生灵芝、人工栽培灵芝子实体和孢子粉、人工深 层发酵培养的菌丝体及发酵液。总体来说，研究证实灵芝具有多种重要的药理活 性，如抗炎、免疫调节、抗肿瘤、保肝、降血糖和降血压等作用，并在作用机制 上作了相当深度的研究，是常用中草药中药理研究比较细致深入的一种。本文以 下内容结合药理筛选及作用机制的研究结果，按其作用的系统不同，分别概括归 5 浙江工业大学硕上论文灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 纳如下： 1 2 1 调节免疫 灵芝多糖具有广泛的免疫调节活性，能提高机体免疫活性。实验证明，大多 数具有生理活性的灵芝多糖是b d 葡聚糖。灵芝多糖提取物能提高癌症晚期病 人的免疫功能。肺癌病人、乳腺癌病人、肝癌病人、前列腺癌患者、膀胱癌患者 和脑癌患者，用灵芝多糖治疗两周后，发现原生质中l 一2 、l 一6 和i f n y 的浓度 有显著提高，nk 细胞活性增强，而l 1 和t nf 0 【的水平明显下降汹3 。灵芝多糖 能增强免疫应答，通过激活磷脂酰肌醇一3 激酶途径抑制嗜中性粒细胞自发性凋亡 而达到抗癌效果；通过促分裂原活化蛋白激酶( m a p k ) 和蛋白激酶c ( p k c ) 途径，灵芝多糖能刺激嗜中性粒细胞的吞噬作用和趋化性1 。研究表明，用灵芝 多糖处理的条件培养液培养的单核细胞能诱导h l 一6 0 和u 9 3 7 白血病细胞程序性 凋亡，灵芝多糖直接刺激人单核巨噬细胞产生l 1 b 、t nf a 和l 6 ，刺激t 淋巴细 胞产生i f n 吖，这些细胞因子能抑制人白血病细胞克隆啪3 。从灵芝子实体中得到 的一种蛋白聚糖( 糖类与蛋白质的比例为1 1 5 ：1 ) ，此组分能刺激b 淋巴细胞增 殖与激活，诱导l 2 因子分泌，增强b 细胞中p k c a 、p k c y 的表达。灵芝多糖能 直接或间接激活t 细胞、b 细胞、巨噬细胞、nk 细胞等免疫细胞，促进未纯化脾 细胞在体外增殖，增强d n a 聚合酶a 的活性及促进白细胞介素分泌从而实现其免 疫功能。p d 葡聚糖通过与补体受体c r 3 、0 【m p 2 整合蛋白、c d ll b c d l 8 结合而 激活免疫效应细胞( 淋巴细胞、巨噬细胞和nk 细胞) ，引起细胞因子按一定顺序 产生。 。 1 2 2 抗肿瘤 j i a n g 等口2 3 在灵芝子实体实验中发现通过修饰a k 价师归信号，灵芝能抑制乳 腺癌细胞m d a m d 2 3 1 的生长，通过抑制n f b 来抑制乳腺癌的浸润，抑制癌细 胞增殖，a h 啊“b 信号的负调节作用抑制脂分子中第4 7 3 位上丝氨酸磷酸化， 对心表达负调节，通过n f 邮对细胞周期蛋白d l 的负调节作用，使肿瘤细胞停 滞在g o g 1 期。 从1 9 7 1 年至1 9 8 9 年，国外学者从灵芝、紫芝、树舌、铁杉灵芝g t s u g a e 及 6 浙江工业大学硕士论文灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 其他几种灵芝属真菌中分离得到1 0 0 多种灵芝多糖，其中有4 种多糖有强烈抗肿瘤 活性，以p ( 1 ，3 ) 糖苷键为主链，其抗癌活性与p ( 1 ，6 ) 为支链的分支度有关。 从灵芝孢子中分离出来的三萜类化合物对小鼠肉瘤m 拙a 和l e w i s 肺癌细胞 有细胞毒活性，提取的化合物l u c i d i i i l o l sa 和b 、灵芝萜酮二醇( g a n o d e n n 锄o n d i 0 1 ) 、灵芝醇( g a i l o d e r 0 1 ) f 和灵芝萜酮三醇( g a l l o d e n i l 锄o n 埘0 1 ) 对这两 种肿瘤细胞都有细胞毒活性，而g a n o d e 肌a l l o l 、灵芝萜烯二醇( g 锄o d 锄a d i 0 1 ) 和a l d e h y d e 、l u c i l a l d e h y d eb 和c 对小鼠l l c m e t l l a 、s 1 8 0 和人乳腺癌细胞t 4 7 d 有细胞毒活性3 。灵芝孢子的乙醇提取物经硅胶层析分离得到的三萜类能抑制 h e l 枷胞生长，使细胞分裂停留在g l 期，这些提取物能明显降低细胞外钙的水 平，三萜类能抑制r a s 癌蛋白并抑制癌细胞的转化嘲1 。灵芝子实体三萜类组分给 小鼠灌胃后，能抑制脾外移植的l e w i s 肺癌细胞的生长，还能阻止转移的肿瘤细 胞浸润到脾和肝脏酗5 1 。灵芝乙醇提取物能抑制人乳腺癌细胞p 2 1 脶雒1 的正调节 作用和细胞周期蛋白d 1 的负调节作用，从而使c d k 4 失活，i 迎去磷酸化，这一系 列变化使转录因子e 2 f 失活，乙醇提取物还能诱导乳腺癌细胞凋亡。h u 等啪1 研究 了灵芝乙醇提取物作用于m c f 7 细胞的抗癌效应，发现在一定剂量和时间下灵 芝乙醇提取物能抑制细胞增殖，凋亡蛋白b a x 的正调节作用能诱导m c f 7 程序性 凋亡。从萌发的灵芝孢子中提取的脂类能抑制鼠肝癌细胞、s 1 8 0 肿瘤细胞和小鼠 网织红细胞中肿瘤细胞的生长 。 1 2 3 抗病毒 实验表明，灵芝中的蛋白多糖有抗病毒活性，与酸结合的灵芝多糖( a p b p ) 有抗疱疹病毒( h s v ) 1 和h s v 2 的活性；灵芝三萜类化合物还能抗h i v ，在m f 一4 细胞中，灵芝醇f 和灵芝萜酮三醇抑制h 1 的致病作用，q m 0 1 u c i d i ca c i d a 、 灵芝萜酮二醇、灵芝萜酮三醇、l u c i d i m 0 1 b 和灵芝酸b 明显抑制h 1 蛋白水解 酶的活性，使h i v 1 增殖受阻翮。 1 2 4 抗衰老、抗氧化 抗衰老是灵芝重要的作用之一。古人认为灵芝具有延年益寿之功效，久服可 使人轻身不老。实验证明：赤芝水提取物能增加果蝇交配次数，明显延长果蝇的 7 浙江t 业大学硕士论文灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 平均寿命、最高寿命和半数寿命。前述灵芝增强( 恢复) 机体免疫功能的作用 是抗衰老的一个方面，另外，灵芝还能使老年鼠显著降低的体液免疫和细胞免 疫多个指标恢复至成年水平。 自由基学说是目前解释机体衰老最重要的学说之一。研究表明，灵芝具有抗 氧化剂的作用m 1 。灵芝的水渗出物在体内对f e 2 + - v t c 系统诱导的脂质过氧化升高 有显著抑制作用。口服灵芝不仅对过量酒精诱发的心脏、肝脏脂质过氧化反应表 现出抑制，同时降低c c l 4 所致小鼠血清和肾皮质脂质过氧化反应。 老年人核酸和蛋白质生物合成能力下降，修复功能低下是衰老的特征之一。 丛舒、关洪昌等研究报道，灵芝多糖能加速肝脏细胞合成血清蛋白质和肝脏蛋白 质，增加小鼠肝匀浆细胞色素p 4 5 0 的含量，也能增加骨髓细胞蛋白质的合成， 促进骨髓细胞的分裂增殖。李荣芷等认为，灵芝多糖促进血清、肝脏和骨髓的核 酸、蛋白质的合成，也可能是其抵抗疾病和预防衰老的重要机制之一h 。 用甲醇萃取灵芝可以得到酚类化合物，其具有抗氧化作用，能抑制脂类的过 氧化，在休h 民的孢子萌发时，该活性大大增强。灵芝氨基多糖g 0 0 9 能抑制活性 氧对d n a 的氧化损伤，抑制铁诱导的脂类过氧化作用。 1 2 5 保肝 在胆汁梗阻引起小鼠肝硬化的实验中，灵芝蛋白多糖能降低血清中天冬氨酸 转移酶、丙氨酸转移酶、碱性磷酸酶和总胆红素的含量，同时能改善胶原蛋白和 肝细胞的组织形态啪1 。另有实验表明，灵芝多糖通过激活解毒酶谷胱甘肽一s 一转 移酶( g s t ) 介导正常小鼠肝细胞的化学防护作用，g s t 的活性可能与灵芝糖蛋 白中蛋白质的含量有关。免疫组织化学研究表明，灵芝多糖抑制一氧化氮合成酶 的表达，通过抑制n o 产生而保护肝脏3 。在体内，用芽孢杆菌、结核菌感染小鼠， 用灵芝多糖治 宁p 能减轻中央静脉周围肝小叶出血和组织坏死，减轻淋巴细胞的炎 症浸润4 4 1 。 1 2 6 对心血管系统的活性作用 灵芝具有对心血管系统广泛的生物活性。除能改善心肌的缺血、缺氧和有益 8 浙江工业大学硕十论文灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 于心脏功能的恢复和提高外，还对改善整个系统的氧代谢、血流动力和血液流变 状态等具有良好的作用。林志彬报道，灵芝有明显的强心作用，对垂体后叶素所 致的家兔实验性急性心肌缺血，灵芝也有一定的对抗作用。其机理与灵芝增加冠 脉流量、降低冠脉阻力和心肌耗氧有关。研究还证实，灵芝的子实体、菌丝体、 发酵液及干粉均能提高实验动物耐缺氧能力，给犬注射灵芝发酵总碱，使其冠脉 血流量明显增加( 达6 2 ) ，冠脉血管阻力下降，证明灵芝能改善冠脉血流动力。 2 ，3 一二磷酸甘油酸( 2 ，3 一d p g ) 是调节血红蛋白与氧亲合力的主要小分子物质h 驯。 陶军等人的临床人群观察和动物实验均证实灵芝具有抗血小板聚集的功能h 制。程 彰华等报道，用灵芝热水提取物制成的灵芝片给高血压伴高血脂、脑血栓后遗症 病人服用，有改善血液流变性、降低全血和血浆粘度的作用h 5 1 。灵芝的这些作用 均有助于心脑血液循环，对防治心脑血管疾患具有积极的意义。 对血压方面的影响，已有报道证明不同种灵芝的提取物均有降压作用。菌丝 体提取的菌丝体素( m e g ) 的降压作用机制可能与交感神经传出阻滞有关h 6 1 。 日本产灵芝的热水提取物对w i s t a r 大鼠及自发性高血压( s h r ) 大鼠均有降压作 用，口服3 h 后降压作用最明显。灵芝7 0 甲醇提取物能明显抑制血管紧张素转化 酶的活力。临床应用也证明了它们的降压作用。此外，研究还证实，灵芝有降血 脂的作用，长期口服灵芝可使实验性动脉粥样硬化斑形成缓慢且程度减轻。临床 用于高血脂患者，可明显降低血胆固醇、d 脂蛋白和甘油三酯h 朝。灵芝提取物注 射给药，也有降低血清胆固醇的作用。 1 2 。7 高机体耐缺氧能力和抗疲劳作用 灵芝提取物能增加红细胞血红蛋白和2 ，3 d p g 的含量，促进氧结合蛋白在 组织中解离，提高机体带氧和供氧能力，提高血浆和心肌组织中c a m p 水平，有 助于组织获得较多的氧，并具有降低耗氧量和改善缺氧动物心肌的代谢作用。同 时灵芝液能加速血乳酸的清除，加强血液中超氧化物歧化酶( s o d ) 和过氧化氢酶 ( c a t ) 的活力，抑制血中过氧化脂质( l p o ) 的提高，从而增强机体抗疲劳能力h 7 | 。 1 2 8 抗突变作用及对细胞的作用 灵芝有延缓细胞增殖周期的作用，使m 1 期细胞比例增高，m 3 期细胞比例减 9 浙江工业大学硕士论文灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 少h 8 。在抗突变方面，灵芝对环磷酰胺诱导的小鼠骨髓多深红细胞的微核反应、 4 一硝基喹啉一n 一氧化物( n q n o ) 诱导的鼠伤寒沙门氏菌组胺酸缺陷型的回复突变 反应、丝裂霉素诱导的人体外周淋巴细胞染色体交换和染色体畸变具有明显的抑 制作用h 引。 1 2 9 改善造血机能的作用 彭华民等报道，长期服用灵芝浸膏( 4 5 d ) 可增加红细胞总数和血红蛋白，同 时血氧含量也有增高趋势嘲1 。日本产灵芝能促进正常小鼠骨懿有核细胞增殖，提 高外周血白细胞和血红蛋白含量，对环磷酰胺造成的血相抑制则有对抗作用。一 定剂量的6 0 c o 吖射线给小鼠全身照射可致使小鼠死亡。在6 0 c o 吖射线照射前后， 口服灵芝液，能显著降低实验动物的死亡率。灵芝能降低放射性损伤所致的动物 死亡，表明它可能有改善骨髓造血功能的作用。灵芝的这一作用在肿瘤放疗与化 疗中具有特别重要的意义。临床上，在实施这些治疗时，常通过配合使用灵芝制 剂使肿瘤治疗取得更好的疗效。 1 2 10 其他药理活性 灵芝子实体多糖能抑制四氧嘧啶诱导的n f 邮的活性，保护胰腺d 细胞免受 伤害畸。灵芝能降低血液黏度，增加心肌收缩力，增加冠状动脉血流量和心输出 量，改善心律。实验证明灵芝酸s 能改变人血小板的信号途径，抑制肌球蛋白轻 链和普列克底物蛋白中钙转移和磷酸化，通过使磷脂酶c 途径失活抑制血小板对 凝血烷a 应答。灵芝还可以抗放射线和有毒化学物质对机体的损害，具有镇 静、镇痛作用，延长睡眠时间、改善睡h 民质量等作用。 1 3 一类特殊多糖几丁质壳聚糖的应用 几丁质，聚乙酰氨基葡萄裙，元多糖，甲冗质。分子结构很像纤维素，由 p 一( 1 ，4 ) 一2 一乙酰氨基一2 一脱氧一d 一葡萄糖残基呈线形连接而成的生物大分子，即在 纤维素吡喃型葡萄糖残基的第二位碳原子上的羟基( 一o h ) 被乙酰氨基( 一n h c o c h 。) 残基所取代而成。白色，无定形粉末，或白色片状物。不溶于通常的有机溶剂、 水、碱和稀酸；溶于浓无机酸如盐酸、硝酸和硫酸等，但同时发生降解作用。实 1 0 浙江工业大学硕士论文灵芝多糖和灵芝几丁质的分离提取及理化性质的研究 际上其溶解度随制备方法、原料来源、分子量大小、乙酰值、比旋度等不同而不 同。几丁质属天然均一多聚含氮黏多糖之一，在自然界中，它广泛存在于节肢动 物中很多动物的外骨骼中，尤其在甲壳纲和昆虫纲中。此外，在微生物的真菌类 ( 如蘑菇，酵母等) 、软体动物( 乌贼等) 和绿藻中也有。在自然界中，几丁质的年 生物合成量高达千亿吨之多，是仅次于纤维素的第二大自然资源。由于几丁质天 然、无毒( l d l 6 9 k g ) 和所具有的良好的生物相溶性、可降解性，以及独特的分 子结构和物理、化学性质，使它在医学、药物制剂学、化工、食品、化妆品、印 染、造纸、农业、环保以及酶的固定化载体等方面具有广泛的用途嘞3 。几丁质经 过化学修饰和改性，如磺化、羧甲基化、酰化等可获得具有特殊性质和用途的甲 壳质系列衍生物。将几丁质分子中c 上的乙酰基脱去，就得到脱乙酰甲壳质，又 名可溶性甲质素或壳聚糖，与甲壳质相比，壳聚糖的溶解性大为改善，因而其应 用范围也更广。 氨基葡萄糖盐酸盐，又称葡萄糖胺盐酸盐( d 西u c o s 锄i n eh y d r o c h l o r i d e ， g a h ) ，是几丁质的深加工产品。在医药上，作为抗菌消炎药物，用于治疗风湿 性关节炎症和治疗胃溃疡疾病，若与抗生素一道使用，可促进抗生素在血液中的 吸收，降低副反应同时也可抑制癌细胞的生长，是合成新型抗癌药氯尿霉素的主 要原料。在食品中是婴儿配方乳中添加的一种重要微量糖类成分，还是合成v b 。 和核黄素中间体的起始原料，此外又可应用于化妆品和饲料添加剂中，用途十分 广泛，国内外需求正日益增加啪 。 1 3 1 几丁质壳聚糖在医学上的应用 1 3 1 1 药理性研究 壳聚糖的化学结构中含有活性自由氨基，溶于酸后糖链上的胺基与h + 结合形 成强大的正电荷离子团，有利于改善酸性体质，强化人体免疫功能，排除体内有 害物质等，维持机体正常p h 值。壳聚糖与人体细胞具有溶合性，使其具有多种 生物活性和生