（生物医学工程专业论文）酶生物传感器的研究及其在糖尿病检测中的应用.pdf

浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h el e v e lo fb l o o dg l u c o s ei st h em o s ti m p o r t a n tm a r kd u r i n gt h ep r o c e s so fd i a g n o s i s a n dt h e r a p yo fd i a b e t e s a l t h o u g ht h e r ea lec o m m e r c i a l i z e dg l u c o s es e n s o r si nt h e m a r k e t s ，t h e i rp e r f o r m a n c ea n df a b r i c a t i n gt e c h n i c sn e e dt ob ei m p r o v e d f o r s a t i s f y i n gt h i sd e m a n d ，w ed e v e l o p e dan e wt y p eo fg l u c o s ee n z y m ee l e c t r o d e ，i ti s b a s e do nas c r e e n - p r i n t e dc a r b o ne l e c t r o d ea n dt h eb a s i ce l e c t r o d ei sc o v e r e dw i t h p o l y p y r r o l ef i l mb ye l e c t r o c h e m i c a lp o l y m e r i z a t i o n ，a tt h es a m et i m eg l u c o s eo x i d a s e i si m m o b i l i z e di nt h ef i l mb ye l e e t r o v a l e n tb o n d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a t u n d e ro p t i m a lp o l y m e r i z e dc o n d i t i o n ，t h er e s p o n s ec u r r e n to ft h ee n z y m ee l e c t r o d e r e a c h e si t sm a x i m u mv a l u e w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ei si nt h er a n g eo f0 - 3 0 m i v i ，t h er e s p o n s ec u r r e n t sm e a s u r e db yt h i se n z y m ee l e c t r o d eh a v eag o o dl i n e a r r e l a t i o n s h i p 、v i mg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n ，a n dt h es e n s i t i v i t yi so 0 6 5u a m m a m o n gt h ec o m p l i c a t i o n so fd i a b e t e s ，k e t o a c i d o s i si sv e r yh a r m f u lf o rd i a b e t i c s m o r e o v e ri t i si m p o r t a n tt od e t e r m i n et h ec o n c e n t r a t i o no fb l o o dk e t o n e sf o re a r l y d i a b e t e sd i a g n o s i s ，s ot h eq u a n t i t a t i v em e t h o df o rm o o dk e t o n e sd e t e r m i n a f i o ni s i m m i n e n t l yr e q u i r e d w ed e v e l o p e dac o m m e r c i a l i z e db l o o dk e t o n e sb i o s e n s o lt h e d e t e c t i o nl i m i to ft h i sb i o s e n s o ri s 1 5 m g l w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fb e t a - h y d r o x y b u t y r a t ei si nt h er a n g eo f1 5 5 5 0 m g - l 1 t h er e s p o n s ec u r r e n t sm e a s u r e db y t h i sb i o s e n s o rh a v eag o o dl i n e a r r e l a t i o n s h i p w i t h b e t a h y d r o x y b u _ t y r a t e c o n c e n t r a t i o n ，a n dt h es e n s i t i v i t yi so 叭1 “a ( m g l 1 ) f u r t h e r m o r e i tc a nw o r k w i t h o u tp r e t r e a t m e n to fb l o o ds a m p l e sa n do n l y2m i c r o l i t r ew h o l eb l o o do rs e r u mi s n e e d e df o ro n et e s t t h e s ef e a t u r e sa r es i g n i f i c a n tf o rc l i n i c a lu s e k e y w o r d s ：d i a b e t e s ，p o l y p y r r o l e ，e n z y m ee l e c t r o d e ，b i o s e n s o r i v 浙江大学硕士学位论文 第一章糖尿病检测技术的研究进展 1 1 糖尿病概述 1 1 1 糖尿病的定义及分类 随着生活水平的提高、饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多坐 的生活方式等诸多因素，全球糖尿病发病率增长迅速，糖尿病已经成为继肿瘤、 心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。目前全球糖尿病患者己超 过1 2 亿人，我国患者人数居世界第二，已突破2 0 0 0 万。据世界卫生组织预计， 到2 0 2 5 年，全球成人糖尿病患者人数将增至3 亿，而中国糖尿病患者人数将达 到4 0 0 0 万，未来几十年内糖尿病仍将是中国一个严重的公共卫生问题。 糖尿病是由于体内胰岛素缺乏或者胰岛素在靶细胞不能发挥正常生理作用 而引起的糖、蛋白质及脂肪代谢紊乱的一种综合病症。糖尿病的基本特征是长期 的高血糖。随着糖尿病病程延长，体内糖、蛋白质及脂肪代谢的紊乱可导致眼、 肾、神经、血管及心脏等组织器官的慢性进行性病变；若得不到及时的、恰当的 治疗，则会发生双目失明、下肢坏疽、尿毒症、脑血管病变或心脏病变，以致危 及生命。 糖尿病通常分为两大类：i 型糖尿病和i i 型糖尿病。 i 型糖尿病又叫青年发病型糖尿病，这是因为它常常在3 5 岁以前发病，占 糖尿病的1 0 以下。i 型糖尿病患者体内胰腺产生胰岛素的细胞已经彻底损坏， 从而完全失去了产生胰岛素的功能。在体内胰岛素绝对缺乏的情况下，就会引起 血糖水平持续升高，出现糖尿病。i 型糖尿病是依赖胰岛素治疗的，也就是说患 者从发病开始就需使用胰岛素治疗，并且终身使用。 i i 型糖尿病也叫成人发病型糖尿病，多在3 5 4 0 岁之后发病，占糖尿病患 者9 0 以上。i i 型糖尿病患者体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体 内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果却大打折扣，因此患者体内的胰岛 素是一种相对缺乏。可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌。但到后期仍 有部分病人需要像i 型糖尿病那样进行胰岛素治疗。 浙江大学硕士学位论文 1 1 2 糖尿病的临床表现及其并发症 糖尿病在临床上最显著的表现是血糖明显升高。正常人血糖浓度相对稳定， 饭后血糖可以暂时升高，但不超过1 8 0 m g d l ，空腹血糖浓度比较恒定，正常为 7 0 一l l o m g d l ( 3 9 6 i m m o l l ) 。血糖主要来源于：( i ) 食物，米、面、玉米、 薯类、砂糖( 蔗糖) 、水果( 果糖) 、乳类( 乳糖) 等，经胃肠道的消化作用转变 成葡萄糖，经肠道吸收入血液成为血糖。( 2 ) 储存于肝脏中的肝糖原和储存于肌 肉的肌糖原分解成葡萄糖入血；( 3 ) 非糖物质即饮食中蛋白质、脂肪分解氨基酸、 乳酸、甘油等通过糖异生作用而转化成葡萄糖。血糖的去路主要有四条途径：( 1 ) 葡萄糖在组织器官中氧化分解供应能量；( 2 ) 在剧烈活动时或机体缺氧时，葡萄 糖进行无氧酵解，产生乳酸及少量能量以补充身体的急需；( 3 ) 葡萄糖可以合成 肝糖元和肌糖元储存起来：多余的葡萄糖可以在肝脏转变为脂肪等。 在正常情况下，人体内的葡萄糖通过上述途径在体内进行转化，并达到动态 平衡。当人体内所产生的胰岛素分量不足或是质地无效时，葡萄糖代谢平衡被破 坏，摄入体内的葡萄糖在提供人体必需的能量后，剩余的葡萄糖无法合成肝糖元 和肌糖元储存起来，而是存留在血液中，在全身各个器官中循环流动。这时，临 床上就表现为血糖的升高。 因为糖尿病是慢性全身性疾病，病情若控制不好易引发急、慢性并发症。慢 性并发症是由于血糖长期控制不好，日积月累而引起的一种改变，包括大血管、 微血管和神经病变，可使人们健康水平和劳动能力大大下降，甚至造成残废或过 早死亡。慢性并发症包括：糖尿病肾病、糖尿病眼病、糖尿病神经病变、糖尿病 足、糖尿病心、脑大血管病变。急性并发症危害更大，一旦发生，有时是可以危 及患者生命的。糖尿病的急性并发症有：酮症酸中毒、非酮症高渗性昏迷、低血 糖反应。 l _ 1 3 糖尿病的诊断标准 一般情况下，当患者出现明显的糖尿病典型症状或糖尿病不典型症状时，就 应该考虑可能患有糖尿病，但单凭口渴、喝水多、尿多等症状不能珍断自己患有 糖尿病，因为糖尿病的诊断是以血糖水平为标准的。另外尿糖阳性也不是糖尿病 的诊断标准，因为尿糖出现加号，有时在正常人中也会出现。所以要诊断糖尿病 2 浙江大学硕上学位论文 必须是以静脉抽血检查出的血糖浓度为准。 根据1 9 9 7 年美国糖尿病协会( a d a ) 对糖尿病的最新诊断标准，简单的讲，如 果血糖升高达到下列两条标准中的任意项时，就可诊断息有糖尿病。 空腹血糖7 0 n 1 n o l l 或者餐后2 小时血糖1 1 i m m o l l 这里的餐后2 小时，常常是以进餐二两馒头为标准，因为进餐的多少也会影 响血糖的高低。 ( e t t 试验，又称口服葡萄糖耐量试验，是在当血糖升高的程度未达到糖尿 病诊断标准，使诊断摸棱两可时，而进行的一种进一步确诊糖尿病的检验措施。 让患者在空腹情况下口服7 5 克葡萄糖，于2 小时后抽血检查血糖水平，如果要 诊断糖尿病则： 服糖后2 小时血糖1 1 i m m o l l 上述检查结果需要在另外一天进行重复测定，以对糖尿病诊断进行核实。 此外，糖耐量异常( i g t ) 和空腹葡萄糖受损( i f g ) 也是需要引起高度警惕的两 种异常情况。糖耐量异常( i g t ) 是指o g t t 试验2 小时后的血糖水平升高，超过正 常的7 8 n u n o l l ，但仍未达到1 i i m m o l l 的糖尿病诊断标准。这些患者称为葡 萄糖耐量异常。空腹葡萄糖受损( i f g ) 相应的就是指空腹血糖升高，也未达到糖 尿病的诊断标准，即空腹血糖在6 2 7 0 m m o l l 之间。 i g t 和i f g 可以说是一种正常人向糖尿病的过渡状态，这部分人虽然现在还 不是糖尿病，但是将来发生i i 型糖尿病危险性非常高，可以说是糖尿病的后各 军。据有关研究报道，每年5 8 的i g t 者将发展成为i i 型糖尿病。此外i g t 者发生心血管病变，如心肌梗塞、心绞痛的危险性也大大提高。 i 2 糖尿病检测技术的发展 i 2 i 糖尿病检测的主要指标 用于检测及诊断糖尿病的主要参数指标包括： ( 【) 空腹血糖( f b s ) 、餐后2 小时血糖( p b s ) ：反映取血当时的血糖水平。 ( 2 ) 糖化血红蛋白( h b a l c ) ：反映抽血前2 3 月的平均血糖水平。 ( 3 ) 果糖胺：反映抽血前2 3 周的平均血糖水平。 浙江大学硕士学位论文 ( 4 ) 葡萄糖耐量试验( o g t t ) ：反映空腹及食7 5 克糖后1 小时、2 小时、3 小时的血糖水平。 ( 5 ) 胰岛素( s ) 及c 肽( c p ) 释放试验：以确定糖尿病的分型、制定治 疗方案及对疾病的预测。 ( 6 ) 尿糖、2 4 小时尿糖定量：间接地反应血糖水平。 ( 7 ) 血清胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白：以了解血脂的情况。 ( 8 ) 尿酮体和血酮体：以及时了解有无酮症的发生。 此外，为早期发现并发症、了解给药和治疗的效果，还需定期检测一些其它 的生化指标。例如为预防糖尿病乳酸酸中毒，需要检测血液乳酸浓度：为了解有 无糖尿病性肾病变的发生与肾功能的损害，需要检测血清尿素氮( b u n ) 、肌酐( c r ) 及尿蛋白等。 1 2 2 糖尿病检测技术的发展现状 对与糖尿病相关的各项参数检测方法的研究主要沿着三个方向在进行：基于 显色反应的光学方法、酶生物传感器法、无损检测技术。 ( 一) 基于显色反应的光学方法 这种方法基于如下的显色反应： 待测物+ 0 2 + h 2 0 堕_ 产物+ h 2 0 2 h 2 0 2 + 显色底物垄墨些塑显色产物+ h 2 0 或：待测物+ n a d ! 篁+ 产物+ n a d h n a d h + 显色底物i i - - 显色产物+ n a d 在酶的催化下待测物被氧化生成h 2 0 2 ( 或n a d h ) ，h 2 0 2 ( 或n a d h ) 再 与显色底物反应生成显色产物，通过对显色物质颜色的变化进行观察，或对其吸 光度的变化进行测定，即可实现对待测参数进行定性或定量的检测。 这种方法的检测效果关键在于显色底物的选择，要求最终生成的显色产物必 须稳定，解离常数小，使颜色在一定时问范围内不会发生褪色，以避免测试精度 受到影响。目前常用的显色试剂【1 1 主要包括邻联茴香胺、2 - 2 连氮基二( 3 ，乙 基苯噻唑啉) 一5 - 磺酸盐、n ，n 二乙基苯胺偶联4 一氨基比林、2 ，6 一二氯靛青酚、 浙江大学硕士学位论文 联苯胺、4 甲氧基1 萘酚、邻甲氧基苯酚等。在实际应用的过程中，要根据具体 的待测参数和反应选择颜色或吸光度变化大、分辨率高的恰当试剂。 在早期人们制作出葡萄糖、酮体、胆固醇等参数的试纸条，将待检样品滴到 试纸条上一段时间后，与比色卡相对照得出结果，以对待测参数进行半定量的分 析。随着光学技术的发展和分光光度计的出现，大型生化分析仪现在已经成为医 院里进行分析测试的主要设备，它通过吸光度的变化，根据所使用的试剂盒种类 的不同，可以定量地检测几百种生化参数。 ( 二) 酶生物传感器法 生物传感器是利用生物化学反应所特有的专一性，选择地识别特定的待测物 质，并将其生化反应转换成电信号的一种装置。它通常由一个高选择性的生物元 件和一个物理换能器组成，根据制作传感器所使用的敏感生物材料的不同，分为 酶传感器、免疫传感器、组织传感器、微生物传感器等几种类型。 目前用于糖尿病检测的主要是酶生物传感器，本研究的目的即是开发能够快 速检测血糖和血酮的新型酶传感器。酶生物传感器也称酶电极，是一种将对待测 底物具有选择性响应的酶固定在电极表面上而制成的传感器。当酶电极浸入被测 溶液时，待测底物进入酶层的内部，并参加反应，大部分酶反应都会产生或者消 耗一种电极可测定的物质，这种酶反应的结果是使反应物和产物的浓度都发生变 化。经过一段时间后，产物的生成速度和反应物的消耗速度趋于平衡，反应达到 稳态。电活性物质的浓度可以通过电位法和电流法进行测定，所得电化学信号与 待测底物的浓度有一定关系，酶电极的响应可以通过达到稳态时的电信号值进行 测量，也可以将其转变为时间函数进行测量。 1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s 提出把酶和电极结合在一起的思想，此后，对于各 种酶电极的研究便层出不穷。u p d i k e 和h i c k s 最先报道了测定生物组织和溶液 中葡萄糖的第一支酶电极，在他们的工作中，葡萄糖氧化酶固定在极谱氧电极上 的一层丙烯酰胺胶体中，电极的电流输出是由氧在铂电极上还原而产生的。另外， 在第一代酶电极中，也有一些是检测酶反应的产物过氧化氢，通过过氧化氢在铂 电极上氧化而产生输出电流，其反应原理如下： 酶层中 电极上 葡萄糖+ 0 2 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸内酯十h 2 0 2 h 2 0 2 一0 2 + 2 r + 2 e 浙江大学硕士学位论文 这种检测酶反应过程中氧的消耗或过氧化氢的产生的方法容易受到氧浓度 的影响，得到的结果不够稳定。因此，研究人员逐渐尝试以氧化还原中间体作为 电子传递剂，代替氧在酶与电极之间传递电子，并在此基础上发展了第二代酶生 物传感器，其反应原理如下： 酶层中： 葡萄糖+ m 。x 塑望塑墨些萱，葡萄糖酸内酯+ m 咖 电极上：m 亿d + m o x + e 在这个催化反应中，电子传递剂首先与还原态酶发生反应，然后扩散出酶层， 在电极表面进行快速电子转移反应。常用的氧化还原中间体有二茂铁及其衍生 物、有机染料、导电有机盐、高分子媒介体等 2 1 。与第代酶电极相比，电子传 递剂的使用带来了很多好处，例如，检测结果对氧浓度不敏感，可以在无氧环境 中操作；测定浓度线性范围加宽：降低酶促反应产生的过氧化氢的浓度，防止酶 的去活化；降低电极的工作电位，从而减少其它电活性物质的干扰等。 尽管用电子传递剂来修饰酶电极使传感器的性能得到了极大的改善，但研制 非媒介体的酶传感器，即实现酶的氧化还原活性中心和电极表面直接进行电子转 移一直是科研人员努力的方向。但由于涉及蛋白质包络结构这一固有的困难，除 了细胞色素b 。和过氧化物酶有机金属电极外，很少有成功的报道。而且要精确 认定电极的反应机理，判断酶是否直接在电极上进行氧化或还原目前还很困难， 所以迄今为止，还没有实用化的生物传感器是采用直接电子转移的方法构造的。 近年来，国内外有许多将酶电极应用于糖尿病相关参数检测的报道。c a s s 等f 3 】采用媒介体吸附的方法，制备了二茂铁修饰的葡萄糖氧化酶电极。他们将石 墨电极在空气中加热至1 0 0 达4 h ，待冷却后，将二甲基二茂铁溶液滴涂在电极 表面，并于空气中干燥，再将葡萄糖氧化酶经碳化二亚胺共价键和到氧化的石墨 表面，并用聚磷酸酯膜覆盖，在+ 0 1 6 v ( v s s c e ) 的电位下可对0 - 3 0 n n 的葡萄糖 进行检测。章咏华等【4 采用玻碳电极为基体，以热处理方法制备四苯基钴卟啉化 学修饰电极作为换能器，用戊二醛与葡萄糖氧化酶交联，制成一种酶电极，其寿 命几乎不受测量次数的影响，抗干扰能力强，线性响应范围为( 9 1 0 一1 2 x1 0 。3 ) m 。 o r t o n 等 5 1 报道通过采用含二茂铁的硅烷聚合物可解决媒介体的 稳定性问题。将聚合物与酶一起混进碳糊电极中，再在电极表面涂上一层 e a s t m a na q 一2 9 d 以增加选择性，排除抗坏血酸和尿酸等可能的干扰物，并防止 浙江大学硕士学位论文 由b s a 及尿中存在的生物物质引起的污染，在三周使用期间，该涂层电极可保持 对葡萄糖的起始电流响应。 除葡萄糖外，对胆固醇、乳酸等参数进行检测的酶生物传感器也已见渚报道。 于鹏光等【6 】以过氧化氢电极为基体，将胆固醇氧化酶与戊二醛、牛血清蛋白固化 形成平面固态膜，制得的电极对游离胆固醇浓度线性响应范围为( 1 1 0 一1 1 0 1 ) m ，响应时间为1 5 s 。邓青等 7 】研制了基于钴原卟啉修饰电极的胆固醇氧 化酶传感器，并以电聚合邻苯二胺膜抗干扰、抗毒化，该酶电极在+ o 6 v ( v s s c e ) 的电位下可灵敏地检测胆固醇，响应时间在3 0 s 内，线性范围( 1 l o 一2 1 0 1 ) m 。 h a r t 等【8 通过电化学沉积的方法将铂均匀的覆盖在丝网印刷碳电极表面，然后将 乳酸氧化酶、碳粉及羟乙基纤维素混合，印刷在铂的表面，最后覆盖n a f i o n 膜 和乙酸纤维素膜，制得的酶电极可对0 - 2 m m 的乳酸进行检测。d o r o t h e a 等 9 】发展 了用于实时乳酸检测的电流型乳酸传感器，他们利用薄膜技术在二氧化硅基底上 制作工作电极，用聚亚胺酯将乳酸氧化酶固定在工作电极上，该传感器的线性范 围为0 5 - 2 0 m m ，测量时间小于2 m i n 。 在传统酶电极的基础上，流动注射式酶电极系统在最近几年得到了飞速发 展。它的优势在于可以在很小的空间内设计出复杂、完整的检测系统，由于电极 和样品腔可以通过微细加工技术制作得非常微小，所以整个系统也能够设计的很 小。r a z u m i e n e 等【1 哪将葡萄糖脱氢酶用戊二醛交联固定在碳糊电极上，再在形成 的酶膜上覆盖一层涤纶膜，将制作好的电极作为工作电极放置在流动注射单元的 底部。检测时，样品溶液以一定的流速从入口进入检测室，到达底部的工作电极 时与电极上的酶反应，得到响应电流，反应后的样品溶液从出口流出后回收。该 系统的线性范围达到1 0 m m ，与光学方法检测得到的结果具有良好的相关性。 随着导电高分子薄膜材料技术的发展，人们从上世纪八十年代丌始探讨活性 酶的导电高分子固定化技术，有关这方面的具体情况将在下一章中论述。 ( 三) 无损检测技术 无损检测技术包括以下几种方法：测定血液代替物及与微渗透技术相结合的 方法；光学传感器法；谱学方法：直接动态血糖检测。 最简单的方法是测血液代替物( 唾液、汗液、尿液等) 中的葡萄糖浓度，但研 究表明所测得的葡萄糖浓度与血糖浓度无明显相关性。另一种方法是通过皮肤轻 浙江大学硕士学位论文 度腐蚀，去除表皮障碍，加负压连续抽取的方法测组织间隙液的葡萄糖浓度与血 糖浓度的相关关系，从而得血糖浓度【1 1 】，但这仍是一种有损的检测方法。利用与 体外测量相结合的微渗透技术，测组织间隙液的葡萄糖浓度，所测葡萄糖浓度与 血糖浓度相关性好，是一种有发展前途的血糖无损检测技术 i ”。 光学传感器法分为光一光传感器、光一热传感器和光一声传感器。光一光传感器 主要组成部件为探头，包括光源光纤和光监测光纤，其工作原理分为光吸收、光 反射和光散射三种。例如，光散射的方法是测量皮肤光散射系数，用散射系数来 反映血糖浓度的变化，血糖浓度每升高5 5 m m ，散射系数降低1 【13 1 。光一热传感 器工作原理是测量由光信号产生的热信号，而光一声传感器是测量由光信号产生 的声信号。但由于光学传感器受组织或血浆中的其他成分、皮肤层水化情况、组 织结构重组、传感器和皮肤的界面情况以及皮肤温度的影响，传感器测量值一般 小于静脉血糖值 1 3 ，而且光源的高能量辐射可能导致分子水平的细胞受损，所 以光学传感器的方法还没有用于临床。 谱学方法依赖于不同谱学区域的特征吸收，是一种公认的进行液体中溶质定 量测定的方法。通过口服一定量的“c 标记葡萄糖，在外加磁场下测其声共振或 磁共振谱，可对血糖进行定量的检测。近年来，国际上研究最多的是用f o u r i e r 变换近红外光谱( f t n i r ) 的方法【1 4 , 1 5 】。它的原理是用外部光源发射的近红外光照 射人体的某部分( 如舌、唇、食指、前臂等) ，光线射八人的体内组织，通过对 透射谱或反射谱的测量得到葡萄糖在某一谱区的吸收峰，进而计算出人体内的血 糖水平。为了解决近红外光谱容易受到溶液中其他成分和变化的影响这一问题， f o u r i e r 变换中红外光谱( f t i r ) 也同时被应用到血糖检测中来 1 6 , 1 7 】。与f t n i r 相比，f t i r 有明显的测量优势：光谱信息含量高、分子选择性好。尤其将f t i r 与衰减全反射( a t r ) 技术相结合1 8 】，能够有效地实现血糖的无损测定，有着很好 的应用前景。 直接动态血糖检测是一种新型的糖尿病监控技术，特别适用于微重糖尿病 人。其原理与电化学传感器类似，将一根非常细的金属电极插入腹部的皮下脂肪 层中，在电极上固定了葡萄糖氧化酶和特殊的电子传递剂，这些成分在体内环境 中不会失活和流失，当皮下脂肪层的组织间隙液中的葡萄糖浓度发生变化时，电 极上就反应出电流的波动。电流变化的各种数据被佩带在病人腰间的记录盒所接 浙江大学硕士学位论文 收并储存起来。由于组织间隙液中的葡萄糖浓度与血糖水平密切相关，可以将组 织间隙液中的葡萄糖水平对应换算成血糖浓度。这种方法的检测精度比较高，而 且一根电极插入皮下后最长可以连续工作7 2 小时，极大地减轻了病人的痛苦。 这是一种非常有发展前途的方法，如果与胰岛素注射泵联合使用，可以非常灵活 及时地调节和控制病人的血糖。 1 3 总结与讨论 目前，为了实现对糖尿病的准确诊断和对糖尿病人治疗情况的有效监控，人 们仍然把血糖水平作为最主要的检测参数。尽管市场上已经有商品化的葡萄糖传 感器，但其性能和生产工艺均有待改进，针对这一需要，我们研制了一种新型葡 萄糖酶电极，它以丝网e p s t j 碳电极作为基底电极，通过电聚合聚吡咯膜来修饰基 底电极，同时实现葡萄糖氧化酶的固定。实验结果表明，新方法的使用不仅改善 了电极的重复性，而且降低了酶电极的生产成本，提高了生产效率，非常具有实 用价值。 由于糖尿病能导致多种并发症，因此在临床上，单检测血糖一个参数是远远 不够的。在糖尿病的各种并发症中，酮症酸中毒危害大、死亡率高，而且酮体浓 度的测定对于糖尿病的早期预警很有意义，因此迫切需要能够对人体内酮体水平 进行定量检测的方法和仪器。我们研制了一种商品化血酮传感器，它的测量范围 宽、灵敏度高，而且响应时间短，用血量小，完全能够满足临床及家庭的需要。 9 浙江大学硕士学位论文 第二章导电聚毗咯的研究进展 2 1 导电聚合物研究概述 导电高分子聚合物自二十世纪七十年代末出现以来，由于其具有特殊的结构 和优异的物理化学性能而倍受各领域科学工作者的关注。各国科学家对其合成、 结构、导电机理、性能、应用等方面经过多年的研究，已使其成为一门相对独立 的学科 1 9 】。 从广义上讲，导电高分子大致可分为两大类：第一类是复合型导电高分子材 料，它是在普通的聚合物中加入各种导电性填料而制成的。这些导电性填料可以 是银、镍、铝等金属的微细粉末，导电性碳黑，石墨及各种导电金属盐等。此类 导电高分子材料在国内外已得到广泛的应用，尤其在抗静电、电磁波屏蔽、微波 吸收、电子元件中的电极、校键开关、电子摄影法的记录材料以及面状发热体等 方面。第二类是结构型导电高分子材料，也即我们通常所说的导电聚合物，它是 由一些具有共轭n 键的聚合物经化学或电化学掺杂后形成的、导电率可从绝缘体 延伸到导体范围的一类高分子材料。导电聚合物不同于复合型导电高分子材料， 它除了具有聚合物结构外，还含有由掺杂引入的一价对阴离子( p 一型掺杂) 或对阳 离子( n 一型掺杂) ，所以，通常导电聚合物的结构分为聚合物链和与链非键合的一 价对阴离子或对阳离子两部分 2 0 1 。而它之所以能将导电率从绝缘体延伸到导体 范围，也是由它的内在结构所决定的。导电有两个不可或缺的条件：电荷的自由 流动和流动的通道。在导电聚合物中，长的共轭链提供了电荷流通的通道，而化 学或电化学掺杂则是促迸电荷自由流动的推动力，这样在外加掺杂的推动下，一 定结构的聚合物就突破了绝缘区，成为导体的一员。 正因为导电聚合物具有上述的结构特征和独特的掺杂机制，使其具有优异的 物理化学性能和广阔的技术应用前景。首先，它的导电率覆盖范围广：1 0 4 s c m 一1 0 i s c m ，这一区域跨越了绝缘体一半导体一金属态。如此宽的范围，是目前任何 种类的材料都无法比拟的，也使它在技术应用上具有很大的潜力。例如，具有高 电导的导电聚合物可用于电磁屏蔽，防静电、分子导线等，而具有半导体性能的 导电高聚物可用于光电子器件( 晶体管、整流管) 和发光二极管等， 浙江大学硕士学位论文 导电聚合物的另一个特点是它不仅可以掺杂，还可以脱掺杂，而且掺杂一脱 掺杂的过程完全可逆。这一特性若与高的室温电导率相结合，则导电聚合物将成 为二次电池的理想电极材料，从而可能使全塑固体电池的设想得以实现。另外， 掺杂一脱掺杂的可逆性若与导电聚合物的可吸收雷达波的特性相结合，则导电聚 合物又将是目前快速切换隐身技术的首选材料【2 0 i 。 导电聚合物的掺杂实质是氧化还原反应，而且氧化还原过程完全可逆，在 掺杂脱掺杂的过程中伴随着完全可逆的颜色变化。它的这一独特性能可能实现 电致变色或光致变色，这不仅在信息存贮、显示上有应用前景，而且也可用于军 事目标的伪装和隐身技术上。日本丰田公司试制的p a n w o 。复合智能窗响应时间 约1 秒，循环次数达1 0 4 次，光线透过率范围为3 1 - 8 0 【2 1 l 。导电聚合物具有 n 一共轭的结构，具有超快速的非线性光学响应和高的三阶非线性光学系数，可 作为三阶非线性材料用于信息存贮、调频、光开关和光计算机等方面。 此外，导电聚合物还保留了聚合物的结构多样化、可加工性和比重轻等性质， 而这些正好满足了现代信息科技中器件尺寸的微型化要求。近年来，随着研究的 不断深入，科研人员越来越深刻地体会到导电聚合物在能源、光电子器件、信息、 传感器、分子导线和分子器件以及电磁屏蔽、金属防腐和隐身技术上均有着广泛、 诱人的应用前景【2 0 , 2 2 。将导电聚合物应用于传感器的研究始于八十年代末，以聚 吡咯、聚苯胺、聚噻吩为代表的导电聚合物，由于具有较低的成本、较好的导电 性、光电性、热电性、可以方便地沉积在各种基片上、可与其他功能材料共聚或 复合、可在常温或低温使用等优点，而受到传感器研究者的青睐。用导电聚合物 作为传感器的基体材料或选择性包覆材料可制作生物传感器、离子传感器、气体 传感器、湿敏传感器等。 2 2 聚吡咯的结构及导电性 2 2 1 聚吡咯的结构 在众多的导电聚合物中，聚吡咯( p p y ) 是研究最多和应用最广的一类。这 主要是由其特性决定的，它具有较高的导电性、环境无毒性和可逆的氧化还原特 浙江大学硕士学位论文 性，而且它的合成十分方便，不需要强酸强碱环境，聚合电位低，可以在水溶液 或有机溶液中聚合，空气稳定性好。 聚吡咯不溶不熔，因此其链结构的研究和分子量的测定非常困难。一般认为 聚吡咯的链结构是毗略单元以n a 键和一些a b ，口一b 交联键合起来的平面 阵列形式，每3 4 个毗咯单元掺杂一个对阴离子，其聚合反应如图2 - 1 所示： n h 吡咯单体 氧化剂 h 聚吡咯 4 一a 。 n 圈2 1 吡咯的聚合反应 但实际上只有不到三分之二的吡咯单元是以这样理想的形式存在的，结构上 的缺陷限制了电荷在聚合物链上的离域程度。随聚合条件的不同，聚吡咯膜可能 非常平滑，也可能非常粗糙。在高浓度的电解质存在下制得的膜有更开放的结构， 水中制得的膜比乙腈中制得的膜表面积要小得多【2 3 1 。实验表明，对离子对聚吡 咯的表面形态有很大影响。 李永舫等利用现场光谱电化学方法，测定出不同对阴离子掺杂的聚毗咯还原 态吸收光谱的吸收峰位置在4 0 5 4 1 5 纳米，从吡咯低聚物的吸收谱峰波数，得到 还原态聚吡咯吸收峰波数与分子链共轭长度间的关系，进而推算出聚吡咯共轭链 长度为4 5 个吡咯单元，而且很可能聚毗咯的链结构，是共轭聚吡咯刚性链段与 两个吡咯单元之间连接单键可旋转的聚毗咯柔性链段共同组成的嵌段聚合物。红 外光谱表明，氧化掺杂态聚吡咯的部分吡咯环中存在c h ：结构。掺杂态的聚吡咯 的链结构可表示为c 。h ，n x 。，其中x 为掺杂的对离子，z 为掺杂度。掺杂度为聚毗 咯本身所特有的性质，一般总保持在0 2 5 0 3 3 之间，即每三个或四个吡咯环上 带有一个阴离子( 只对带一个负电荷的阴离子而言) 。 2 2 2 聚吡咯的导电性 聚吡咯是借载流子沿着聚合物链的运动而进行导电的，存在于聚吡咯中可能 的载流子有两种：极化子和双极化子【。极化子可视为阳离子自由基，双极化 子是相应的双价阳离子。极化子有一个未成对电子，可用e s r 检测出来；而双极 浙江大学硕士学位论文 化子无未成对电子，在e s r 谱无信号。k a u f m a n n 等【2 5 】在实验中发现当聚吡咯膜 氧化或还原时有e s r 信号出现，经过1 0 3 1 0 4 秒后即消失，这是由于极化子复合 成双极化子的缘故，由此说明双极化子是掺杂态聚吡咯膜的主要载流子，极化子 和双极化子可以相互转换： p p v “皇! p p v + + e p p v + 皇! p p v 弘+ e 式中，e 。和e 2 分别代表形成极化子和双极化子的准“标准电位”。极化子与 双极化子在聚吡咯膜的电荷传递过程中共同起作用，在低掺杂度时，极化子起主 要作用，在高掺杂度时，双极化子起主要作用。聚吡咯中的极化子、双极化子及 其能带情况如图2 2 所示。 一钟 麓袋子孥錾裴能级 于雕辙 孥甏嚣口 子能带一 一 口 未经掺杂 轻徽掺杂 高度掺杂 图2 2 聚吡咯中的极化子、双极化子及其能带情况示意图 聚吡咯的室温电导率在半导体范围，与聚合条件包括聚合电位、支持电解质 性质及浓度、溶剂性质、反应温度等密切相关，依据不同的聚合条件，其电导率 在i 0 - - 31 0 2 s c m 之间。电化学法制备的导电聚吡咯膜，经x 射线衍射实验证明膜 中高分子凝聚态的结构有各向异性，这可能是由于共轭分子链平面易于按膜的平 面层叠，因而膜面平行的方向与膜面法向的结构不同。所以，可以预期导电聚吡 咯膜的电导率也呈现各向异性。实验证明膜面法向的电导率要比平行于膜面的电 导率小约四个数量级。无论平行于膜面方向或膜面法向，其电导率均在不太大的 浙江大学硕士学位论文 电场下，呈现类似于有机半导体的非欧姆性。 影响聚吡咯电导率的因素有很多，其中对阴离子掺杂度是表征其氧化掺杂程 度的一个重要参数，一般掺杂度越大，聚吡咯的电导率越高，并且其电化学活性 也越高。可见一近红外吸收光谱是研究聚吡咯掺杂状态的重要手段，氧化掺杂态 聚吡咯膜吸收光谱的特点是在可见区和近红外区各有一个较强的吸收峰。可见区 的吸收峰在4 7 0 纳米左右，近红外是一个很宽的吸收峰，峰位置随制备条件的不 同在1 2 0 0 1 7 0 0 纳米之间有所变化。这一近红外吸收对应于聚吡咯中的载流子极 化子和双极化子的吸收，吸收越强，则表明载流子浓度越高，电导率也越高。另 外，近红外吸收峰位波长越长，表明聚吡咯的共轭链越长电导率也越大。 电解质阴离子对聚吡咯膜结构也有影响。电解质中阴离子所带负电荷越多， 对聚合物链上正电荷的吸引越强，则电荷在链上的离域程度降低，电导率自然下 降。如以含磺酸基的芳香化合物作为对离子时，磺酸基数目增多，聚吡咯膜的电 导率下降。另外，对离子的碱性越强，聚吡咯膜的电导率越低。 此外，聚合反应温度低有利于生成高电导率的聚吡咯膜【2 “，这是因为低温 降低了副反应发生的可能性。支持电解液的p h 值越小，在其中合成的聚吡咯膜 的电导率就越高。有文献报道了一种制备纤维状聚吡咯的方法，其电导率高达 2 0 0 0 s e m 以上【2 ”，而胡须状聚毗咯电导率高达3 0 0 0 s c m 以上。 2 3 聚吡咯及其复合物的合成 2 3 1 聚吡咯的合成 早在一百多年前，就已经观察到吡咯加稀盐酸( 或硫酸) 后放置( 或加热) 可以生成橘红色的不溶物，称为吡咯红，其化学组成不稳定，在空气中逐渐变成 棕黑色，称为吡咯黑，实际土就是聚吡咯及其氧化产物。后来知道，毗咯氧化生 成吡咯黑只能在强酸溶液中才能进行。吡咯黑的生成并非氧化聚合，而是酸催 化聚合的氧化产物。1 9 6 8 年d a l l o li o 等在硫酸水溶液中用电化学氧化的方法制 备出了导电聚吡咯膜，其电导率为8 s c m ，但这一发现当时并未引起重视。直到 1 9 7 9 年，d i a z 等在乙腈电解液中制备出电导率达l o o s c m 的稳定聚吡咯膜，才 浙江大学硕士学位论文 受到广泛关注，随即激发了世界范围内导电聚吡咯的研究热潮。 目前较常用的聚吡咯合成方法有电化学聚合法和化学氧化合成法。电化学聚 合法具有操作简单、条件易于控制、合成的导电聚吡咯的导电性和力学性能都比 较好等特点，但电化学聚合法一般在电极上进行，只能少量制备。化学合成法虽 然在很多方面都不如电化学聚合法，但它可以进行大规模生产。 ( 一) 电化学聚合法 电化学聚合法是目前最普遍使用的聚吡咯制备方法，当在电极上施加一适当 电位后，溶液中的毗咯单体就会在电极表面氧化聚合，形成聚吡咯薄膜。s a t o h 等用对甲基苯磺酸为电解液制得聚吡咯膜，其电导率为5 0 0 s c m 2 8 1 ；在丙烯酸甲 酯溶液中加入四乙基高氯酸铵盐，可得到伸直聚吡咯膜，电导率为1 0 0 5 s c m 。 由吡咯单体电聚合的过程一般公认的历程属于e ( c e ) n 2 9 ，如图2 - 3 所示 ( a _ 代表掺杂阴离子) 。第一步是单体电氧化成离域的自由基阳离子，其在。一位 上有很高的自旋密度。第二步是单体自由基通过n 一位的自由基耦连形成二聚体， 然后放出2 个质子，产生中性二聚体。接着二聚体氧化为二聚体自由基，与其他 单体自由基或二聚体自由基、低聚物自由基反应，使聚合物链增长。耦连电化 学氧化过程就这样重复下去，直到链增长被终止。可见聚吡咯中吡咯环是通过0 一a 联结的。 在水溶液中进行电聚合的过程为在电聚合反应的同时伴随着p p y 与o + 和h 。o 的作用，一方面是氧的亲核进攻形成羰基和羟基，另一方面氧和聚合链作用可能 形成电荷转移复合物，后者有顺磁性。用e s r 现场法对电聚合吡咯过程观测，得 到了不对称的d y s o n i a n 信号，证明由水溶液制出的p p y 膜其链上具有未成对电 子特性的某种载流子，恰好说明了这一点。整个的吡咯聚合反应可以表示如下( z 代表掺杂度) ： z n c 4 h 2 n h + n a 一 ( c 4 h 2 n h ) z a 一 。+ 2 z ( n 1 ) h 十+ 2 z ( n 一1 ) e 一十n e 在吡咯电化学聚合过程中，通过定量滴定，证实聚合时每一吡咯单元释放出 两个质子。在聚合电解液中加入质子捕捉剂2 ，4 一二叔丁基吡啶或是在p h 大于7 的缓冲溶液中聚合，即在聚合反应进行时如果立刻消除质子，聚合反应立即被抑 止，表明吡咯电化学聚合前必先经过一步质子化反应。 浙江大学硕士学位论文 2 h f ”芒卜一 。弋i 卜母 ， ! 犷铲弋! 犷9 囊! 犷9 m + a 。 拿o矗nj t t 7n 【气h ! 游y ( a ) y jn r + - 图2 - 3 吡咯的电聚合过程机制 ( 引自文献 2 9 ) 导电聚吡咯膜的形成涉及成核生长过程，类似于金属在电极表面的沉积3 0 】。 在水溶液中电聚合毗咯时，开始先成核并垂直于电极表面进行一维生长，然后是 二维扩展给出完整的膜，最后是整个膜的三维生长。与此同时，在乙腈中电聚合 吡咯时起始于可溶性中间体在电极表面成核而形成稀薄的膜，随后继续成核而无 链增长，直到某一临界电荷密度形成的膜发生变形，以后膜则均匀的生长。 ( 二) 化学氧化合成法 吡咯单体在适当的氧化剂和介质的作用下，会在溶液中氧化聚合形成聚吡 咯。由于吡咯的氧化势较低，所以许多氧化剂都可以用于制各聚毗咯，如表2 一l 所示。例如，以最常用的f e c i ；为氧化剂，吡咯就可以进行聚合，聚合反f 娅如、： 6 黪 誊 浙江大学硕士学位论文 n + 一概m 妒2 一h 2 n f e c 3 r a p i 等发现以水为介质，酰胺或间位取代苯酚为添加剂，在0 。c 下进行化学 氧化聚合，反应时间较短，便可得到高电导率的聚吡咯。分别以f e ( c 1 0 。) ；9 h ：0 及m 一羟基苯甲酸为氧化剂和添加剂，在水中进行氧化聚合，所得聚吡咯的电导 率最高可达8 3 s c m 。m a c h i d a 等用无水f e c i 。及c h 。o h 分别为氧化剂及介质，可 使聚吡咯的电导率高达1 9 0 s c m ，在c h ，o h 介质中加入f e c l ：以控制f e c i 。的氧化 势，可以提高聚吡咯的电导率到2 2 0 s c m 。 表2 1 吡咯的化学氧化聚合 在实际应用中，若要合成大量聚吡咯，相应的要消耗大量金属盐类。这样不 仅在氧化剂上要消耗大量成本，而且还要考虑使用后的废水处理问题。采用新的 催化体系c u c l a i c i 。一0 ：可以有效降低聚吡咯的生产成本川，该体系中催化剂 c u c l ：a i c i 。：吡咯= l ：i ：5 ，在室温下反应1 2 小时，所得到的聚吡咯电导率为 i 0 s c m 。 2 3 2 聚吡咯复合物的合成 尽管聚吡咯具有容易合成、电导率高等优点，但其难溶难熔的缺陷使得它难 以加工成型，也限制了它的应用。为了改善聚吡咯的加工性能，聚吡咯复合物得 到了广泛的研究。制各聚毗咯复合物有以下几种方法：机械共混法、