（生理学专业论文）海马ca1区中间神经元在体放电模式.pdf

华东师范大学硕士学位论史 中文摘要 海马c a l 区中间神经元在体放电模式 摘要 大脑神经元网络在复杂信息处理过程中涉及到群体神经元问的协同活动，而 这种协同活动的主要表现之一就是不同行为意识状态下脑区场电位的不同节律 振荡。已有研究表明，中间神经元对调节神经元网络的各种振荡活动具有重要作 用。运用多通道在体记录技术，我们考察了海马c a l 区中间神经元在体放电模 式与其所在位置场电位节律振荡之间的关系。研究发现，海马c a l 区的不同中 间神经元对应不同行为模式下的不同场电位振荡具有不同的放电模式，其中两类 与t h e t a 节律相关，两类与r i p p l e 节律相关，还有一类虽与t h e t a 节律和t i p p l e 节 律均无相关性，但在慢波睡眠期具有典型的b u r s t 放电特征。 在与t h e t a 节律相关的两类中间神经元中，其中一类为b u r s t t h e t a 细胞，它 的典型放电特征是与t h e t a 节律有严格的相位锁定关系，因此放电频率变化也呈 现t h e t a 节律波动。在每个t h e t a 循环周期，这类神经元均呈簇状放电，每一簇大 约有3 1 0 个电冲动，且放电的最大概率趋向于在t h e t a 节律的波峰放电。另一类 为s i n g l e t h e t a 细胞，这类神经元只在动物清醒和快速眼动睡眠阶段时活动，在 慢波睡眠时几乎没有任何放电活动。在活动时，这类神经元基本维持一与t h e t a 节律相近的放电频率( 1 0 9 4 7 _ + 0 6 5 8h z ) ，在每一个t h e t a 循环周期里一般只有一 个放电，但放电与t h e t a 节律问却没有相位锁定关系。 放电模式与t i p p l e 节律相关的两类中间神经元我们称之为t i p p l e 类型i 与类 型1 i 细胞，他们最典型的放电特征是与慢波睡眠时海马特征场电位“r i p p l e ” 高频振荡( 1 5 0 - 2 5 0 h z ) 在时间上具有高度同步性，对应每个t i p p l e 振荡波，它 们都有一串高频放电，其中类型i 在一个r i p p l e 振荡波的每个子振荡周期基本有 一个放电，类型i i 则有一到二个放电。在r i p p l e 振荡波时段，这两类中间神经元 的峰值放电频率可分别高达3 1 0 3 3 1 7h z ( 类型i ) 和4 1 0 4 7 6 1 比( 类型i i ) 。 b u r s t 放电模式中间神经元在慢波睡眠时期有簇状放电，每一簇里约有3 5 个电冲动，并且在r i p p l e 发生的时候基本不放电，放电频率在清醒探索活动时期 最高，快速眼动睡眠次之，慢波睡眠最慢。 研究结果提示，不同的中间神经元可能以独特的放电模式参与海马神经元网 络活动的调节。 关键词：海马c a l 区，中间神经元，t h e t a , r i p p l e ，b u r s t , 放电模式 1 华东师范大学硕士学位论文 英z 摘要 f i r i n gp a t t e r n s o f h i p p o c a m p a lc a l i n t e r n e u r o n s a b s t r a c t w h e np r o c e s s i n gc o m p l e xi n f o r m a t i o n , n e u r a ln e t w o r ki nt h eb r a i nw i l li n v o k e c o o p e r a t i v ea c t i v i t i e so fe n s e m b l en e u r o n s o n eo ft h em a i nr e p r e s e n t a t i o n s i s d i f f e r e n tr h y t h mo s c i l l a t i o n so ff i e l dp o t e n t i a l si nd i f f e r e n tb c h a v i o u r sa n db r a i ns t a t e s i th a sb e e ni n d i c a t e di nf d ) m er e s e a r c ht h a ti n t e m e n r o n sp l a yav e r yi m p o r t a n tr o l ei n m o d u l a t i n gd i f f e r e n to s c i l l a t i o n si nn e u r a ln e t w o r k t h r o u g hm u l t i - c h a n n e lr e c o r d i n g t e c h n i q u e s ，w er e v i e w e dt h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nf i r i n gp a t t e r n so fm p p o c a m p a lc a l i n t e m e u r o n sa n dr h y t h mo s c i l l a t i o n so ff i e l dp o t e n t i a l sw h e r et h e yl o c a t e d w ef o u n d t h a th i p p o c a m p a lc a li n t e m e u r o n sh a dd i f f e r e n tf i r i n gp a t t e r n sc o r r e l a t e dw i t h d i f f e r e n tf i e l dp o t e n t i a l si nd i f f e r e n tb e h a v i o u r s t h e r e i n t ot w ot y p e so fi n t e r n e n r o n s w e r ec o r r e l a t e dw i t ht h e t ao s c i l l a t i o na n dt w ow i t hr i p p l eo s c i l l a t i o n a n o t h e rt y p eo f i n t e m e u r o nh a dn or e l a t i o n s h i pw i t ht h e t ao rr i p p l eo s c i l l a t i o n , b u tt h e i rf i r i n g s d i s p l a y e dt y p i c a lb u r s t sd a t i n gs l o ww a v es l e e p o n et y p eo fi n t e r n e u r o n sc o r r e l a t e dw i t ht h e t ao s c i l l a t i o nw e r ec a l l e db u r s t - t h e t a c e l l s ，w h o s ef i r i n g sw e r es t r i c t l yp h a s e l o c k e dt ot h e t ao s c i l l a t i o n a n dt h e i rf i r i n g r a t e sa l s of l u c t u a t e dw i t ht h e t ao s c i l l a t i o n i ne v e r yt h e t ac y c l et h i st y p eo fi n t e r n e u r o n f i r e di nb u r s tw i t h3 1 0s p i k e s t h e i rf i r i n g si n c l i n et ot h ep o s i t i v ep c a l 【o ft h e t a o s c i l l a t i o n a n o t h e rt y p ew e r ec a l l e ds i n 掣e - t h e t ac e l l s ，w h i c hw e r ea c t i v eo n l yd u r i n g e x p l o r a t i o na n dr a p i de y em o v e m e n ts l e e pa n dk e p ts i l e n td u r i n gs l o ww a v es l e e p t h i s t y p e o fi n t e m e u r o ns h o w e ds i m i l a r f i r i n g r a t e sw i t ht h e t ao s c i l l a t i o n ( 1 0 9 4 7 _ + 0 6 5 8h z ) w h e n t h e yw e r ea c t i v e i ne v e r yt h e t ac y c l et h e r ew a so n l yo n e s p i k ea n dt h e i rf i r i n g sw e r en o tp h a s e - l o c k e dt ot h e t ao s c i l l a t i o n w ec a l l e di n t e r n e n r o n sc o r r e l a t e dw i t hr i p p l eo s c i l l a t i o nr i p p l et y p eic e l l sa n d r i p p l et y p ei ic e l l s t h e ya s s o c i a t e dt h e kf i r i n g sw i t hh i g h - f r e q u e n c yr i p p l eo s c i l l a t i o n ( 1 5 0 - 2 5 0i - i z ) ，ac h a r a c t e r i s t i cf i e l dp o t e n t i a li nh i p p o c a m p u sd u r i n gs l o ww a v es l e e p t h ef i r i n g so ft h e s et w ot y p e so fi n t e m e u r o n sh i 【g h l ys y n c h r o n i z e dw i t hr i p p l e o s c i l l a t i o n ，t h a ti s , t h e yf i r e da tah i g hf r e q u e n c y c o r r e s p o n d i n gt oe a c hc y c l eo fr i p p l e o s c i l l a t i o n t y p eic e l l sh a do n es p i k ei ne a c hs u b - c y c l eo fr i p p l eo s c i l l a t i o n ，w h e r e a s ， t y p ei ic e l l sh a do n eo rt w os p i k e s t h ep e a kf i r i n gr a t e so f t h e s et w ot y p e so fn e u r o n s w e r e 叩t o3 1 0 3 3 1 7 h z ( t y p e i ) a n d 4 1 04 - 4 7 6 1 h z ( t y p e i i ) ，r e s p e c t i v e l y b u r s tc e l l ss h o w e dn op h a s e l o c k e dr e l a t i o n s h i pw i t hb o t l lt h e t aa n dr i p p l e o s c i l l a t i o n sa l t h o u 【g hf i r e di nb u r s t sw i t h3 - 5s p i k e sd u r i n gs l o ww a v es l e e p t h e 2 兰奎堑翌盔堂堡主兰竺堡苎 茎壅塑至 f i d n gr a t e s o fb u r s tc e l l si na c t i v ee x p l o r a t i o nw e r et h eh g h e s t ，t h e ni nr a p i de y e m o v e m e n ts l e e pa n dt h ef i l i n gr a t e si ns l o ww a v es l e e pw e r et h es l o w e s t t h er e s u l t sm a ys u g g e s tt h a td i f f e r e n ti n t e m e u m n sp a r t i c i p a t ei n m o d u l a t i n g e n s e m b l ea c t i v i t yo f n e u r a ln e t w o r ki nh i p p o c a m p u sw i t ht h e i r s p e c i f i cf i r i n gp a t t e r n s k e y w o r d s ：h i p p o c a m p a lc a lr e g i o n , i n t e m e u m n s , t h c t a , r i p p l e ，b u r s t , f i r i n gp a t t e r n s 3 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意 作者签名：至堑日期：型：生尘 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在 解密后适用本规定 学位论文作者签名：王虽 日期：型：! ：! 兰 导师签名：丰幸车 日期： ! 二：! ：! ：多 华东师范大学硕士学位论文第一章文献综述海马c a t 区中间神经元 第一章文献综述海马c a l 区中间神经元 1 1 概述 对海马内主细胞的联系以及其主要的分子和通道属性现在已经研究的比较 全面了【1 2 1 ，但是研究人员也越来越清楚地认识到在真实大脑中主细胞的网络互 动是离不开与它们相联系的抑制性神经元的控制。传统的观念认为抑制性中间神 经元只在皮层局部的区域和其他神经元联系，而不像主细胞一样将轴突投射到大 脑远端区域 3 1 。然而，近来的研究工作表明，海马中确实存在特殊的抑制性的中 间神经元，它们具有不同的神经环路，生理和生物化学属性，以及特殊的功能。 中间神经元接受不同的局部和外部输入，拥有各种内在的分子和功能属性，并且 以主细胞不同的胞体，树突或者轴突部分为靶点。尽管海马内的中间神经元在数 量上只占很少的一部分，但是它们可以通过自己广泛的联系和独特的放电模式来 调节主细胞的工作h 。 1 2 海马c a l 区中间神经元形态功能学研究 海马c a l 区内大约5 8 到1 1 的神经元被称为中间神经元，也被称为非锥 体细胞，其余的就是锥体细胞，或者叫做主细胞。中间神经元在海马网络的正常 功能以及药理变化中都起到了重要的作用。它们具有一些共同的特质，包括神经 联系，内在的生理属性和神经生化属性【5 6 1 。它们的树突通常都是光滑的，珠状 的，或者很少有棘的，其局部轴突树分布广泛，末端毫无例外地形成对称的突触。 中间神经元发放动作电位的持续时间很短，大部分的中间神经元都以t 氨基丁酸 ( o a b a ) 作为神经递质。尽管具有这些相似点，中间神经元在轴突和树突分布， 某些神经化学属性和功能作用上也是多种多样的。 运用高尔基染色法，中间神经元在形态学上的最初分类是基于胞体的形状以 及树突和部分轴突的分布。在s c h a f f e r 对几种中间神经元进行描述后，r a m o n c a n ( 1 8 9 3 ) 和他的学生l o r c n t cd e 卜0 报道了一些胞体在始层的神经元，其轴 突广泛地分布在锥体细胞层，它们的末端轴突分技围绕在锥体细胞胞体周围。 l o r e n t ed en o 在啮齿类动物的阿蒙氏角一共鉴定出1 3 种中间神经元，六种的胞 体处在或邻近锥体细胞层，而这其中的三种主要支配锥体细胞层，另外三种支配 放射层，他将支配锥体细胞层的三种细胞称为篮细胞( b a s k e tc e l l s ) 。通过电子 显微镜对锥体细胞胞体的观察，b l a c k s t a d 和f l o o d 报道，来源于篮细胞的突触属 1 华东师范大学硕士学位论文 第一章文献综述海马c a l 区中间神经元 于对称类型，被认为是抑制性电位的特性。实际上，a n d e r s e ne t a l 早先的实验已 经表明有一个很强的抑制性输入到达海马锥体细胞的胞体区域。最近的电子显微 镜的观察确定了胞体处在或者临近锥体细胞层的篮细胞，它们的突触有很大一部 分是作用在海马锥体细胞的胞体和近端树突上的，并且诱发g a b a a 受体调节的 抑制性突触后电位( 1 p s p s ) 7 1 。 轴突- 轴突细胞( a x o a x o n l cc e l l s ) 也叫做灯形细胞( c h a n d e l i e rc e l l s ) ，其最明显 的特征是轴突末端在锥体细胞层，始层和门区( h i l u s ) 形成一排一排2 3 0 个突 触小结( b o u t o n s ) 。这些成排的突触小结沿着锥体细胞的轴突起始段平行排列。 轴突- 轴突细胞的胞体位于或者接近锥体细胞层，并且其树突呈放射状投射到各 个层，树突是光滑的，晶体状，只有很少一些分枝上有棘。电子显微镜的观察显 示轴突轴突细胞对于锥体细胞的轴突起始段有很强的选择性嘲。 直到最近，大部分胞体在锥体细胞层的g a b a 能细胞被认为终止在胞体， 并被叫做篮细胞。然而越来越多的研究显示，在锥体细胞层这样一个严格的亚区 域，中间神经元显示出独特的性质。比如轴突一轴突细胞与锥体细胞轴突起始段 有多突触的联系。没有电子显微镜的观察，轴突轴突细胞和篮细胞并不容易区 分，某些在锥体细胞层并有很多末端的神经元就被认为是篮细胞，因此采用定量 的标准来区分篮细胞和其它中间神经元还是有用的。 此外还有一些神经元控制锥体细胞的树突区域，比如双尖细胞( b i s t r a t i f i e d c e l l s ) 和水平三层细胞( h o r i z o n t a lt r i l a m i n a rc e l l s ) 。这些神经元的胞体位于或接 近锥体细胞层，或者在始层和室床的边界，双尖细胞的树突树是没有棘的，并且 这些树突里放射状分布，但是通常也会有水平的分枝，与篮细胞的树突树不一样， 双尖细胞的垂直分枝不会到达分子馅窝层【6 】。水平三层细胞的树突沿着始层室床 的边界水平延伸几百微米。这种细胞的胞体很大，有明显的主树突，在远端树突 上通常有棘。双尖细胞的轴突晶体状的侧枝在锥体细胞层的上方和下方形成紧密 的分布，一般占据了始层的整个宽度以及近放射层的2 0 0 3 0 0 微米的区域1 9 】。水 平三层细胞有类似的轴突分布，与双尖细胞不同的是其大量的晶体状侧枝也分布 在锥体细胞层内。此外，水平三层细胞的轴突分布更倾向于近放射层。电子显微 镜的观察显示，双尖细胞的轴突末端与锥体细胞的近端树突和树突棘形成对称的 突触。而水平三层细胞则和未知区域的树突分枝形成对称的突触1 4 】。 还有一种水平方向的细胞类型，即始层分子层细胞 ( o r i e n s - l a c u n o s u m - m o l e c u l a r e ( 0 - l m ) c e l l s ) ，它们的胞体和树突主要集中在 始层和室床，其中它们的轴突侧枝广泛分布，并且在分子馅窝层毫无例外的含有 突触小结，偶尔会有一些侧枝伸入始层，还有一些纤维会进入下托( s u b i c u l u m ) 。 0 l m 细胞的树突来自于始层的胞体，并儿沿着室床可以延伸几百微米【1 0 ，l l 】。电 2 华东师范大学硕士学位论业第一章文献综述海马c a l 区中间神经元 子显微镜的研究显示这种细胞类型的轴突术端和锥体细胞的远端树突以及树突 棘形成的是对称型的突触【切。除此之外，0 l m 细胞的突触小结内充满了晶体状 密度很大的囊泡。 神经递质内容物是用来对神经元进行功能分类的最基本的化学特性。某种神 经元对它的靶细胞产生的是抑制性还是兴奋性的效应取决于它突触末端释放的 物质的属性，最早g a b a 被认为是脑内主要的抑制性神经递质，特别是在大脑 皮层f 1 ”，通过不同的方法，大量的研究已经能够以g a b a 作为神经递质来鉴别细 胞类型。接下来发现兴奋性的氨基酸递质存在于大脑皮层的主细胞中【1 4 1 。之后在 大多数g a b a 能神经元中发现神经肽( s o m ，c c k ，v i p ，n p y ，c n k c p h a l i n s s u b s t a n c ep ) 作为可能的协同转录物质以及调节物质的选择性表达也可以进一步 将抑制性神经元进行分类【坷，同时也促进了对这些细胞形态和输入输出相关性的 研究。大脑皮层区域的钙调蛋白p v ，c b ，c r 也被发现主要与g a b a 能神经元 有关【临埔】，它们在中间神经元分类中独特的位置为进一步分析和研究这些神经元 间的联系提供了一个理想的工具。无论是合成的还是累积的神经营养因子的出 现，以及中间神经元中的一氧化氮合成酶( n i t r i co x i d e s y n t h a s e ) 的活动暗示中 间神经元除了参与突触联系，也具有特殊的功能，比如突触可塑性的调节，局部 血流穿过可扩散信使，营养因子等。 1 3 海马c a l 区中间神经元离体放电模式 海马中的中间神经元尽管数目远远没有锥体细胞多，但是却表现出很大的多 样性，除了分子标记物的表达，树突和轴突树的分布不同外，它们离体的生理学 属性差别也很大。由于在海马内不同的通路是在特定的层次里，对于一个既定的 细胞，树突树的片层分布就暗示了它可能的突触传入。相反地，海马网络里某种 细胞类型的功能输出主要依赖于轴突的靶点：只和树突区域有突触联系的中间神 经元调节锥体细胞的整合属性，而那些以胞体和近胞体为靶点的中间神经元则调 节锥体细胞的放电模式 对于中间神经元离体放电模式的研究，s o m o g y i 做了很多的工作。他们分析 了海马c a l 区树突水平分布在始层的轴突轴突细胞，这些细胞树突和轴突树分 布的片层结构可能提示了它们是如何在c a l 网络中起作用的。水平轴突轴突细 胞的放电有两个特色。首先，单个动作电位之后通常跟随三相位的后电位 ( t r i p h a s i ca f t e r p o t e n t i a l s ) 1 9 1 。第二，动作电位串有时会表现出特征性的瞬时结构， 即带有显著的早期放电频率适应( s p i k ef r e q u e n c ya d a p t a t i o n ) ，其后跟随一个相当 持久稳定状态的发放，这种早期放电频率适应与去极化波适应。这蝗特征并不总 是很明显的，在长时间的记录过程中会消失l 捌。 3 华东师范大学硕士学位论文 第一章文献综述海马c a l 区中间神经元 对于篮细胞和双尖细胞来说，前者的静息膜电位( - 6 4 2 + 7 2 m v ) 要比后者 ( 6 9 2 + 4 6 m v ) 的去极化程度高，同样的，篮细胞的细胞膜时间常数( 9 9 4 6 m s ) 也比双尖细胞( 1 8 6 8 1 m s ) 快，平均的输入阻抗也比双尖细胞低。这两种细胞都 没有过辐射的动作电位，两种细胞的动作电位分别为6 3 6 1 2 7 m v 和6 9 8 4 - 5 0 m v 由于快速的下降，它们的动作电位都很短，并且篮细胞的动作电位快很 多。对于去极化电脉冲的反应，两类细胞也是表现出很大的不同，比如它f i 、 有不 同的放电频率适应性。但是有部分的篮细胞和双尖细胞对于去极化的电流脉冲会 表现出簇状的放电模式。除此之外，在持续的去极化电流脉冲注入的情况下，篮 细胞和双尖细胞的放电频率都会显著降低，但是适应的模式都是统一的。在动 作电位之后，这两类细胞都会有一个短潜伏期的后电位，其中篮细胞的平均后电 位要比双尖细胞显著【2 ”。 还有报道记录到一种r l v i 中间神经元( s t r a t u mr a d i a t m n - - s t r a t u m l a c u n o s u m m o l e c u l a r ei n t e m e u r o n s ) ，平均的静息膜电位为5 6 7 3 6 m v ，膜时间 常数为1 2 9 4 - 7 7 m s 。其动作电位的持续时间很短，并跟随一个后电位。去极化 的电脉冲通常会产生过辐射的动作电位( 7 0 8 6 9 m v ) ，注入延长的去极化电流 脉冲后，所有的r l m 中间神经元会表现出放电频率适应性，只不过程度不同【篮】。 如果激活这种细胞的话大约有三分之一的细胞会诱发出小幅度的，短潜伏期的单 个i p s p 。 1 4 海马c a l 区中间神经元在体放电模式 海马c a l 区大量神经元短暂的同步活动引起的网络振荡可能对于神经整 合，协同探测，非关联信息的区别以及将无关物体或事件的不同方面结合都是必 需的，而这些不同频率的网络振荡与特定的行为状态是密切相关的。 中间神经元的在体记录显示它们的放电和各种各样的网络振荡有着密切的 相关性。很多中间神经元接受由内隔传来的g a b a 能t h e t a 调节的输入，并且它 们的放电与t h e t a 节律有相位锁定关系，因此用自由活动动物单细胞记录方法可 以称之为t h c t a 细胞。有趣的是，有报道即使在一种网络状态中中间神经元也有 不同的放电模式；比如，曾经有发现未知的中间神经元在t h c l a 振荡特定的相位 放电而在与锐波相关的r i p p l e 事件中又呈现出不同的放电模式。这些结果表明了 这样一种可能性，即中间神经元不同的放电模式可能与它们控制锥体细胞特定区 域的空间选择性有关。 k l a u s b e r g e r 和p e t e rs o m o g y i 在中间神经元的分类与在体放电模式方面做了 很多工作。他们使用麻醉的大鼠在两种网络活动状态( t h e t ao s c i l l a t i o n 和r i p p l e o s c i l l a t i o n ) 中记录到四种类型中问神经元的电冲动( s p i k e ) ，这四种类型的中间 4 华东师范丈学硕士学位论文第一章文献综述海马c a l 区中间神经元 神经元表现出独特的，状态依赖性的活动模式。利用在体单细胞染色的方法 ( j u x t a c e l l u l a rm e t h o d ) 能够选择性的标记记录的神经元，从而在组织形态学上 进一步鉴别为：p v 篮细胞( p a r v a l b u m i n e x p r e s s i n gb a s k c tc e l l ) ，轴突轴突细胞 ( a x o 缸o n i cc e l l ) ，始层分子层细胞( o r i e n s 1 a c u n o s u m - m o l e c u l a r e ( 0 l m ) c e l l s ) ，双尖细胞( b i s t r a t i f i e dc e l l s ) 。海马c a l 区锥体细胞层胞外记录在t h e t a 振荡的时候轴突轴突细胞在t h e m 波峰放电概率最高，而此时大部分的锥体细胞 是超极化状态。锥体细胞层记录到的p v 篮细胞在t h e t a 节律的下降相放电，而 单个细胞间平均的t h e t a 相位有很大的差异性。位于放射层和始层的双尖细胞在 t h e t a 的波谷放电，与内嗅皮层输入联接并且作用于远端树突的0 l m 细胞也在 t h c t a 的波谷放电i 驯。 在与锐波相关的t i p p l e 事件时期，p v 篮细胞和双尖细胞放电频率增加，但 是两者间却有着细微但很重要的不同 2 4 , 2 j 。一般来说，篮细胞偏向于在r i p p i e 的 最大幅度处放电，双尖细胞在整个t i p p l e 事件过程中都有高频放电。与篮细胞不 同的是，双尖细胞即使在t i p p l e 发生之前放电频率也会增加。轴突轴突细胞在 r i p p l e 开始时放电活动增加，但是在r i p p l e 事件最大幅度之后不放电，而且在r i p p l e 事件结束后也表现为抑制状态。相对的，0 。l m 细胞的发放在整个r i p p l e 事件过 程中却特异性地处于抑制状态，这点是很奇怪的，因为0 l m 细胞主要是接受 c a l 区域锥体细胞传来的谷氨酸输入，而锥体细胞在t i p p l e 发生时作为一个群体 是处于活动状态的。0 l m 细胞在r i p p l e 事件发放受到抑制的后果仍然未知，有 人推测，超极化和分流的消失可能促使动作电位向后传播到最远端顶树突，导致 在r i p p l e 事件中处于活动状态的从内嗅皮层来的少量突触联系增吲冽。轴突轴 突细胞双相位的发放可能抑制r i p p l e 事件开始时锥体细胞的发放，但是允许它们 在振荡幅度最大的时候放电，将高度同步化发放集中在很短的时间内。 由于双尖细胞是通过g a b a 能的突触来支配锥体细胞的树突，而在这个位 置上s c h a f f e r 侧枝合缝处的输入激活的谷氨酸能输入会终止和引发t i p p l e 振荡， 因此双尖细胞在r i p p l e 事件的高频放电更令人奇怪。对于单个t i p p l e 事件内电冲 动发放的分析发现，双尖细胞和p v 篮细胞均在t i p p l e 循环的下降相放电1 2 5 , 2 7 1 ， 一般来说在锥体细胞放电后的1 - 2 m s 。这种特异性的电冲动发放表明r i p p l e 事件 中中间神经元的作用不是动作电位的分流，而更可能的是给去非激活的电压依赖 性离子通道提供精确的超极化，从而促进锥体细胞接下来的发放。除此之外，双 尖细胞和p v 篮细胞的高频放电以及特异性的电冲动发放表明在慢波睡眠时期它 们对于海马c a l 区t i p p l e 振荡的产生具有突出的作用。这两类细胞在r i p p l e 循环 下降相的同步放电会导致锥体细胞群体的抑制型突触后电流( i p s c ) ，这点由胞 内记录的超极化和胞外记录的r i p p l e 循环的正偏差反映出来。 5 华东师范火学硕士学位论文第一章文献综述海马c a 】区中间神经元 这些发现表明具有相同联系的中间神经元在既定的网络振荡中呈现出相似 的放电模式。除此之外，在代表两种独特大脑状态的不同的网络振荡中，具有相 同联系的中间神经元表现出不同的放电活动，因此它们以一种大脑状态依赖性的 方式来调节特异性的突触后靶点区域。中间神经元类型特异性的放电模式指出它 们可以通过各自的靶点区域，精确的电冲动发放以及同步化锥体细胞的放电来控 制锥体细胞的活动，而不仅仅是提供抑制作用。具有不同联系的中间神经元在特 定的振荡内也会倾向于在独特的时间点放电。这是因为不同的中间神经元支配锥 体细胞独特的区域，这些不同的部分也会及时地接受不同的g a b a 能的输入。 这种动态的g a b a 能的时空分布，包含了不同大脑状态下独特的模式，对于调 节单个锥体细胞的输入整合是非常理想的，并且对于海马内细胞信息的组装和代 表也作出了贡献田j 。 1 5 问题的提出 形态学研究表明，海马中间神经元在结构上具有多种类型；离体脑片研究也 显示，不同的中间神经元有不同的电学特性；但对于在体状态下，不同中间神经 元是否具有不同的放电模式? 以及它们的放电和场电位振荡之间是否有相关 性? 我们目前还知之甚少，只有为数不多的研究，报道了麻醉状态下，大鼠海马 某些中间神经元类型的在体放电模式。因此，本研究利用在体多通道记录技术的 优势，在清醒、自由活动的小鼠上，重点考察海马c a l 区中间神经元的在体放 电模式，并着重研究它们的放电模式与场电位节律振荡之间的相关性，以进一步 了解中间神经元在神经元网络活动调节中的作用，从而更好地理解神经元网络活 动的基本规则。 6 华东师范大学硕士学位论文第一二章海马c a l 区中间神经元 体放电模式 第二章海马c a l 区中间神经元在体放电模式 2 1 前言 构成大脑神经网络的神经元按形态和功能一般可分为谷氨酸能的锥体细胞 和t 氨基丁酸能的中间神经元阴。其中锥体细胞主要提供了不同功能脑区之间的 长投射联系，而中间神经元则主要分布在局部脑区内部，对局部脑区的神经网络 活动进行调节郾】。大量研究表明，中间神经元对大脑网络振荡模式的产生，以及 与这些网络振荡模式相关的功能，比如知觉整合、睡眠以及记忆等过程都具有重 要的作用i 刎。 海马是大脑中与学习记忆功能密切相关的一个重要脑区，海马中的信息整合 对记忆的编码，巩固和回忆均具有重要的作用p o j 。在动物处于不同行为意识状态 时，海马神经元网络的活动也具有不同模式，体现在场电位上，就是动物在清醒 探索状态( a c t i v ee x p l o r a t i o n ) 或快速眼动睡眠( r a p i d e y e - m o v e m e n ts l e e p ，r e m s l e e p ) 状态下海马脑区的t h e t a 节律( 4 1 2 h z ) ，认知行为过程中的g a m m a 节律 ( 3 0 8 0 h z ) ，以及慢波睡眠( s l o ww a v es l e e p 。s w s ) 中的不规则电位和r i p p l e 高 频振荡( 1 5 0 2 5 0 h z ) 等【3 1 】。这些节律性的场电位活动反映了海马神经元网络在 信息处理过程中群体神经元活动的不同模式。一般认为海马c a l 区的场电位直接 来自于c a l 区排列整齐的锥体细胞的突触后电位总和，它反映了c a l 区锥体细胞 群的活动状况。但越来越多的实验证据显示，仅占c a l 区总神经元数量约1 0 的 中间神经元，在调节海马c a l 区的场电位活动中具有非常重要的作用【3 2 】。形态学 研究显示，与c a l 区锥体细胞基本单一的形态结构不同，c a l 区的中间神经元在 形态结构上有多种类型j 这种形态结构特征主要表现为，不同的中间神经元具有 非常不同的树突和轴突分布特点，如轴突末梢只分布在锥体细胞胞体层的篮细胞 ( b a s t e kc e l l ) 、轴突末梢只分布在锥体细胞轴丘区域的轴突一轴突细胞 ( a x o a x o n i cc e l l ) 、以及轴突末梢只分布在锥体细胞远端树突区的0 l m 细胞 ( o f i e n s 1 a c u n o s u m - m o l e c u l a r ec e l l ) 等【1 1 】。不同中间神经元的特殊形态结构特征， 提示中间神经元在调控海马c a l 区神经元网络活动中可能具有重要的作用。因 此，在整体动物上，这些中间神经元的在体放电模式，以及与整体神经元网络活 动之间的关系，越来越引起研究者的兴趣。但由于研究手段的限制，目前仅有为 数不多的研究，报道了在麻醉动物上，海马某些类型中间神经元的在体放电模式 【3 3 l 。 本研究运用多通道( 9 6 通道) 在体记录技术，研究小鼠海马c a l 区中间神经 7 华东师范大学硕上学位论文第二章海马c a i 区中间神经元右：体放屯模式 元的在体放电模式，并着重考察它们的放电模式与c a l 区不同节律场电位活动之 自j 的相关性，以探讨中间神经元在神经元网络活动中的调控作用及可能的信息编 码机制。 2 2 材料与方法 2 2 19 6 通道微驱动记录电极的制作 9 6 通道微电极是由两束独立的可分别移动的1 2 根四电极( t c 仃o d e ) 组成( 每 侧海马为4 8 个通道) 。微驱动电极的基架为三个平行排列的3 6 针连接器，其中两 个连接器用环氧树脂胶粘在电极架的两侧，第三个连接器通过一个矩形的塑料间 隔装置与中间的连接器分开。两束1 2 根p o l y h n i d e 管( 内径为7 5 微米，外径为1 5 0 微米) 分别粘在两个独立移动的螺帽上，环氧树脂胶干后，调整p o l y i m i d e 管的长 度，以确保在移动微电极的过程中至少有1 2 m m 的末端可以突出。 每根四电极都是由四根1 3 u m 的镍铬合金丝( c a l i f o r n i af i n ew i r e g r o v e r b e a c h , c a ) 在低热源下缠绕而成，并在火焰中去掉尖端的绝缘漆。每个四电极 分别插入一个p o l y i m i d e 管中，所有的电极丝插完后，缠绕端剪短至超过p o l y i m i d e 管末端3 - 4 m m , 并用胶与p o l y i m i d e 管粘在一起。四电极的自由末端分别缠绕在临 近连接器的接头上，除此之外，每个被绕上电极丝的连接点分别用银漆涂抹以加 强电导。微驱动电极制作的最后一步就是将多余的电极丝粘在电极架上，防止手 术后的意外破坏。必要的时候，可以将四电极的尖端进行镀金使阻抗维持在 5 0 0 8 0 0 千欧。参考电极最后焊接在每个连接器最外面的四个接点上，并用指甲 油涂抹连接器达到绝缘目的。 2 2 2 电极植入手术过程 野生型小鼠饲养在提供食物和水的笼子里，在手术前几天需要预处理 ( h a n d l e ) 4 、鼠以减少对人接触的应激反应。野生型成年( 6 1 0 个月) 雄性c 5 7 b l 6 j 小鼠( 2 5 3 3 9 ) 用戊巴比妥钠( p e n t o b a r b i t a ls o d i u m ，1 ) 溶液，腹腔注射麻 醉( 8 0 m g k g ) 。将动物固定于立体定位仪，眼睛涂上眼部润滑剂。切开皮肤，暴 露顶部头骨，使中线和前囟( b r e g m a ) 可见，除去上面的肌肉和结缔组织，根据 小鼠脑图谱，在背侧海马上方颅骨( 前囟向后2 3 m m , 左右两侧各2 o m m ) 标记 电极插入位晨。用微型牙科手钻在两束电极丝所处的矩形位置中打四个洞，每个 涮用牙科水泥将小号螺丝固定其中。在电极插入位置打洞并剪开脑膜，使用立体 8 华东师范大学硕士学位论文 第二牵海马c a l 区中间神经元在佛坡电模式 定位仪将电极下降插入洞中到达小鼠皮层。用蜡和石蜡油的混合物封闭颅骨手术 野，用牙科水泥将电极帽固定于小鼠颅骨。将连接器上的参考电极与前脑头骨两 颗螺丝上的参考电极相连，铜网包裹整个微驱动电极以防损坏。动物清醒后，恢 复4 8 4 时之后再进行观察记录1 3 q ( 图1 ) 。 2 2 3 单个中间神经元放电与海马特征场电位的记录与甄别 运用美国p l e x o n 公司的9 6 通道在体记录系统，通过延长线将微驱动电极上 的连接器与其前端放大器连接，充满氦气的气球拴在延长线上以减轻重量，使小 鼠可以自由活动。手术后的4 5 天我们就可以移动电极丝，每根电极记录到的神 经电信号经微电极放大器放大后分为两路，一路用来记录单个神经元的放电活 动，另一路用来记录海马脑区的场电位。通过调节电极帽上的微型螺杆，可以缓 慢推进电极的记录位置。微型螺杆转一圈，电极可以前进2 8 0 u m ，一般每天调节 微型螺杆四分之一至二分之一圈，可使记录电极前进7 0 - - 1 4 0 z m 。根据场电位的 波形特征可推测记录电极是否到达海马c a l 区域实验结束后，再对鼠脑进行 尼氏染色组织学检查，以确定记录电极的位置。 由p l e x o n 公司9 6 通道在体记录系统实时采集、记录每根记录电极上的神经 元放电波形和场电位，然后运用o f f l i n es o r t e r2 0 软件( h t t p ：w w w p l e x o n c o m 。 d a l l a s ，t x ) 对每组四电极上记录到的所有放电波形进行聚类( c l u s t e r ) 分析，即 通过复杂的数学算法将记录到的波形数据转化为几组特征量的数据，可选取其中 的三组在三维空间描点( 主要成分分析，p r i n c i p a lc o m p o n e n t st a n a l y s i s ，p c a ) 。 由于同一神经放电特征也相同，表现在三维空间中为神经元各自的放电相互靠近 聚成一团，将较为清晰的团分离出来，区分出单个海马神经元的放电。 为了从场电位信号中提取r i p p l e 高频振荡，我们先将原始场电位信号进行 1 5 0 2 5 0 i - i z