外源性DNA检测方法介绍PPT课件.ppt

外源性DNA检测方法介绍,IntroductionofexogenousDNAdetection,汇报人：李爽,日期：2016年5月6日,目录,外源性DNA检测的意义,国内外残留DNA的标准规定,常用检测方法,总结,外源性DNA检测意义,重组蛋白药抗体药疫苗,工程菌,动物细胞株,传染性风险,致瘤性风险,生物代谢,外源性DNA,国外残留DNA标准的规定,非口服的生物制品DNA残留量为10ng每人份剂量,生物制品DNA残留量不高于100pg大剂量制品放宽到10ng每人份剂量,对于残余DNA的限度规定为不超过10ng每人份剂量，但针对个别疫苗会有不同,WHO,FDA,欧洲药典,01,02,03,我国残留DNA标准的规定,我国部分疫苗及治疗用生物制品残余DNA标准,常用检测方法,01,02,03,04,定量PCR法,荧光染料法,阈值法,分子杂交法,定量PCR法（实时荧光定量核酸扩增检测系统）,基于PCR扩增时,在加入引物的同时加入特异性的荧光探针，当引物引导DNA聚合酶沿着模板序列复制合成另一条对应序列时，DNA聚合酶切断结合在目标DNA上的探针染料端，释放到反应液里的染料信号被仪器测量。通过实时监控PCR体系中的荧光信号,对样本中初始模板进行定量分析。优点：时间短、特异性强、灵敏度高缺点：成本高、设计引物、特定目标,Taqman探针法,阈值法,基于两种DNA序列非特异性蛋白,生物素标记的单链DNA结合蛋白,结合尿素酶的抗单链DNA的抗体,阈值法,膜放入含有尿素溶液的检测仪器中尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2，导致溶液pH值发生变化并被仪器记录,DNA变性成单链,单链DNA、DNA结合蛋白、DNA抗体共同形成序列非特异的复合物,通过生物素标记的膜，亲和素-生物素结合把DNA复合物固定在膜上,优点：时间短、灵敏度高缺点：非特异性、成本高,荧光染料法,原理：荧光染料分子直接与双链DNA结合，在波长为480nm激发下产生超强荧光信号，可用荧光酶标仪在波长520nm处进行检测,优点：操作方便、时间短缺点：不能检出单链DNA、荧光信号易受干扰,分子杂交法,INSERTTEXT,01,02,杂交双链DNA变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下与特异性、地高辛标记的探针重新结合成为双链DNA,基本原理：双链DNA变性后吸附在固相膜上与标记好的DNA探针杂交结合，并在膜上对应位置显现斑点。,免疫检测使用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫反应，然后与显色底物NBT/BCIP发生显色反应,分子杂交法,DNA探针是被生物素、放射性同位素、地高辛和荧光等随机掺入标记的与目的基因互补的DNA片段,地高辛(Digoxigenin,DIG)又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子,DIG通过一个含有11个碳原子的空间臂与尿嘧啶核苷酸相连，形成DIG-11-dUTP，它可以通过随机引物标记，缺口平移，PCR等掺入到DNA探针中,分子杂交法,DNA模板变性之后与随机引物杂交，在klenowDNA聚合酶的作用下DIG-11-dUTP掺入新链中,随机引物法标记DNA探针,分子杂交法,供试品处理,杂交,免疫检测,*蛋白酶K预处理*Tris-饱和酚抽提*沉淀DNA,*变性*点膜*预杂交*杂交,*抗体结合*