（食品科学专业论文）副溶血性弧菌溶血毒素基因的克隆表达及应用研究.pdf

上海海洋大学硕士学位论文 副溶血性弧菌溶血毒素基因的克隆表达及应用研究 摘要 副溶血性弧菌( 玢6 ，面p a r a h a e m o l y t i c u s ，v p ) 为一种嗜盐性弧菌，能导致人类 食物中毒和旅游者腹泻，还能导致反应性关节炎、心脏疾病等。目前研究认为副 溶血弧菌的主要致病因子是其产生的多种溶血毒素，而临床上检测到的致病菌大 多具有溶血现象( 亦称神奈川现象) ，基因水平研究发现该类病原体都携带t d h 基 因，编码t d h ( t h e r m o s t a b l ed i r e c th e m o l y s i n ，t d h ) 。不耐热溶血毒素( t h e r m o l a b i l e h e m o l y s i n ，t l h ) 也是其产生的毒素之一，研究表明副溶血弧菌无论是临床分离 株，还是环境分离株都含有t l h 基因，且具有种属特异性。 本研究应用基因工程技术克隆了t d h a 、t d h s 和t m 基因，并实现在原核融合 表达载体p g e x 4 1 上经i p t g 诱导得到高效表达，并获得纯化蛋白。同时制备 了抗t d h 兔血清，期望为下一步研究奠定基础。 根据g e n b a n k 上已有的副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素的基因序列，设计 并人工合成引物，并在5 端与3 端分别增加b a m hi 和e c o ri 酶切位点，应 用p c r 技术从致病性副溶血弧v pa t c c3 3 8 4 6 ，v pa t c c3 3 8 4 7 株扩增了t d h 基因，p c r 产物经b a m hi ，e c o ri 双酶切回收后定向插入p g e x - 4 t - 1 表达载体， 测序分析结果表明t d h 基因的开放阅读框( o r f ) y g5 7 0 n t ，编码由1 8 9 个氨基酸组 成、分子量为2 3 k d a 的耐热直接溶血素。 应用c l u s t a l w b i o e d i t a l i g n xa p p l i c a t i o n 等分子生物学软件分析，显示获得 的v pa t c c3 3 8 4 6 、a t c c3 3 8 4 7t d h s 基因测序结果与g e n b a n k 中的副溶血弧菌 t d h s 基因序列( g i2 8 8 9 9 8 5 5 ：1 4 5 0 7 2 8 1 4 5 1 4 9 7 ) 具有1 0 0 的同源性。获得的v p a t c c3 3 8 4 6t d h a 基因测序结果与g e n b a n k 中的副溶血弧菌t d k a 基因序列 ( g i _ 2 8 8 9 9 8 5 5 ：1 3 9 1 8 1 0 1 3 9 2 6 7 9 ) 具有9 8 9 5 的同源性。在第5 7 位( a g ) ，第 7 8 、7 9 、8 0 位( g c m ) ，第9 7 、9 8 位( c c - t a ) 有碱基差别，但它们所编 码的蛋白质序列是相同的。获得的v pa t c c3 3 8 4 7t d h a 基因测序结果与 g e n b a n k 中的副溶血弧菌t d h a 基因序列( g i 具有 1 0 0 的同源性。 _ 2 8 8 9 9 8 5 5 ：1 3 9 1 8 1 01 3 9 2 6 7 9 ) 将p c r 产物与p g e x 4 t - 1 构建的重组质粒成功的转化了e c o l it g l 与b l 2 1 ( d e ) 工程菌株，s d s - p a g e 分析表明经i p t g 诱导后重组菌在迁移率为4 9 k d 位 置上出现一条明显的蛋白带，而其载体自身带有2 6 k d g s t 蛋白带消失，由此推 断，4 9 k d 蛋白是由t d h 基因编码的2 3 k d 蛋白与g s t 基因编码的2 6 k d 蛋白连 i 上海海洋大学硕士学位论文 接后形成的融合蛋白。通过g l u t a t h i o n es e p h r o s e4 b 亲和柱层析纯化t d h 融合 蛋白。 用同样的方法构建了t l h p g e x - 4 t - 1 并经鉴定后转化、诱导表达。获得的v p a t c c3 3 8 4 6 、a t c c3 3 8 4 7t l h 基因测序结果与o c n b a n k 中的副溶血弧菌w p l 标 准株t l h 基因序列具有1 0 0 的同源性。他们所编码的蛋白质序列也是相同的。 以纯化的t d h 为抗原，背部皮下注射免疫大白兔，制各抗t d h 多抗。免 疫学分析证实纯化的表达产物能被t d h 特异性抗血清所识别，当包被的t d h 为l u g m l 时，抗血清的e l i s a 效价达到4 0 x 1 0 5 ，获得效价较高的抗体。d n a 序列分析和免疫学分析证明所克隆的基因是副溶血弧菌的t d h 基因，且重组菌表 达的t d h 与原始菌株产生的t d h 抗原性一致。副溶血弧菌t d l l 基因克隆与表达。 为在单因子水平上研究副溶血弧菌t d h 的毒力、致病机理以及诱导宿主免疫应 答方面的作用打下了基础。同时为建立基于溶血毒素检测副溶血弧菌的方法奠定 了基础。 关键词副溶血性弧菌( v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s ) ，耐热直接溶血毒素( t d h ) ， 不耐热溶血毒素( f l h ) ，克隆，纯化蛋白 2 上海海洋大学硕士学位论文 s t u d i e so nc l o n i n ga n de x p r e s s i n go fh e m o l y s i ng e n e so f h b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s , s t u d yo nf u n c t i o n so fi t se x p r e s s i o n p r o t e i n a bs t r a c t v i b r i op a r a h a e m o l y t i c u si sam a j o rc a u s eo fa c u t eg a s t r o e n t e r i t i sa n de s p e c i a l l y a s s o c i a t e dw i t hs e a f o o d c o n s u m p t i o n a n dt r a v l e r s d i a r r h o e a i t m a yc a u s e o t h e r d i s e a s e ss u c ha sr e a c t i v ea r t h r i t i sa n dh e a r td i s e a s e s s e v e r a lk i n d so fh e m o l y s i n p r o d u c e db yv pa r eb e l i e v e dt h em a j o rv i r u l e n c ef a c t o r s i ti sc l a s s i f i e di n t o t w og r o u p s b y t h ek a n a g a w ap h e n o m e n o n ( k p ) ，w h i c hi sah e m o l y t i ct e s t o n w a g a t s u m ab l o o da g a r m o r es t u d i e sr e v e a l e dt h a tt h e r ew e r em o s to fg a s e so fv p g a s t r o e m e f i t i sc a u s e db yk p - p o s i t i v es t r a i n t h em o l e c u l a rb i o l o g i c a ls t u d i e ss h o w e d t h a ts u c hv pp o s s e s s e st d hg e n ew h i c he n c o d e dap r o t e i nc a l l e dt h e r m o s t a b l ed i r e c t h a e m o l y s i n ( t d h ) h o w e v e rd e t a i l e dm e c h a n i s m s b yw h i c ht d hd i s p l a y t h e b i o l o g i c a la c t i v i t i e sr e m a i nu n c l e a r a m o n gt h e s eh e m o l y s i n st h et h e r m o l a b i l e h e m o l y s i ni sp r o d u c e db yv p s t u d i e s 。f o u n dn o to n l ye n v i r o n m e n ti s o l a t e ds t r a i n sb u t - a l s oc l i n i c a li s o l a t e ds t r a i n sh a v et h et l h g e n e t h a th a ss p e c i a l t y t h ef o r e i g n r e s e a r c h e r su s et h et l hg e n et od e t e c ta n dm o n i t o rv p o u rs t u d yi st oc l o n et d h a ，t d h s a n dt mg e n e sa n dt oi n d u c et h ee x p r e s s i n go f t h e m p u r ep r o t e i n sa r eo b t a i n e da n dt h i s m a k e sa g o o db a s e m e mf o rf t l r t h e rs t u d y i nt h i sp a p e r , t h ec l o n i n ga n de x p r e s s i n go ft h e r m o s t a b l ed i r e c th e m o l y s i n ( t d h ) o fv i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s ( v p ) w e r ed i s c u s s e d ap a i ro fp r i m e r sw i t hr e s t r i c t i o n e n z y m ec u t t i n gs i t e sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ep u b l i s h e dn u c l e o t i d es e q u e n c eo f ap u t a t i v et d ho fv pw i t ht h es p e c i f i cp r i m e r s ，at a r g e tf f a g e m e ma b o u t5 7 0 b pw a s a m p l i f i e df r o mv p a t c c3 3 8 4 6 ，v p a t c c3 3 8 4 7 s t r a i n w i t ht h ec l e a v a g eo f b a m h i a n de c o r i ，t h et a r g e tf r a g m e n tw a si n s e r t e do r i e n t l yi n t op g e x 4 t 1v e c t o r a f t e re n z y m er e s t r i c t i o na n ds e q u e n c ea n a l y s i s ，t h en u c l e o t i d ed a t ah a db e e n f l l r t h e r a n a l y z e db yc l u s t a l w b i o e d i t a l i g n xa p p l i c a t i o ns o r w a r e s t h ea n a l y si s r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec l o n e dd n a f r a g e m e mh a dao p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) o f 3 上海海洋大学硕士学位论文 57 0 n t ，i tp r e d i c t e dt ob ee n c o d e da18 9 a sp r o t e i nw a sh i g h l yh y d r o p h i l i c ，e s p e c i a l l y t h ef i r s t2 4a m i n o a c i da tnt e r m i n a l ，t h i sr e g i o nc o u l db ef u n c t i o n a la ss i g n a lp e p t i d e t h eh o m o l o g i o u sc o m p a r i s o np r o v e dt h et d h ag e n eh a d9 8 9 5 h o m o l o g yt ot h e s e q u e n c eo ft h et d h ag e n e ，a n dt h ea l i g n m e n to ft h ea m i n oa c i ds e q u e n c ew a s10 0 t h et d h sg e n eh a d10 0 h o m o l o g yt ot h es e q u e n c eo ft h et d h ag e n e ，a n dt h e a l i g n m e n to ft h ea m i n oa c i ds e q u e n c ew a s10 0 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c e l lb l 2 1 ( d e ) t h ef u s i o n p r o t e i nw a se x p r e s s e du n d e rt h ei p t gi n d u c i n gc o n d i t i o n ，a n de x h i b i t e dap r o t e i n b a n dw i t h4 9 k d ai ns i z eo ns d s - p a g eg e l ，t h es i z eo ft h ei n d u c i n gp e p t i d ei sa l m o s t m a t c ht ot h e p r e d i c t e d m o l e c u l a rw e i g h to fg s t - t d hf u s i o np r o t e i n w i t l l g l u t a t h i o n es e p h r o s ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , t h eg s t - t d hw a sp u r i f i e d i nt h es e c o n dp a r to ft h i ss t u d y , w ed e s i g na n o t h e rp a i ro fp r i m e r sa n db u i l d t l h p g e x 4 t - 1p l a s m i db yt h es a m em e t h o da sb e f o r e t h eh o m o l o g i o u sc o m p a r i s o n p r o v e dt h et l hg e n eh a d10 0 h o m o l o g yt ot h es e q u e n c eo ft h e u hg e n e ，a n dt h e a l i g n m e n to ft h ea m i n oa c i ds e q u e n c ew a s10 0 t h ep r o t e i ni sp u r i f i e da n dt h er a b b i t sa r ei m m u n i z e db yi t f u r t h e r m o r e ，t h e t d hp r o t e i nw a ss p e c i f i c a l l yr e c o g n i z e db ya n t i - t d h m a k ea l lt o g e t h e r , i tp r o v e d t h a tt h ec l o n e dg e n er e p r e s e n t e dt h ev pa t c c3 38 4 6 、a t c c3 38 4 7t d ，hg e n e ，a n dt h e e x p r e s s e dg e n ep r o d u c t ss h a r e di n d e n f i c a la n t i g e n i c i t yw i t ht h en a t u r a lt d h t h e s t u d i e so np r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no ft d hp r o v i d e dan e wa p p r o a c ht of i s h v a c c i n o l o g y t h es u c c e s s f u lc l o n i n ga n de x p r e s s i n gt h et d hg e n em a d ei tp o s s i b l et o d e s c r i b et h i sg e n e sf u n c t i o nu n d e ras i n g l ef a c t o rl e v e l ，a n da l s op r o v i d e dt e c h n i c a l s u p p o r t f o rd e v e l o p f n ga na d v a n c e dg e n ee n g i n e e r i n gv a c c i n ea g a i n s tv i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s k e yw o r d sv i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s ，t h e r m o s t a b l ed i r e c th e m o l y s i n ，t h e r m o l a b i l e h e m o l y s i n ，c l o n e ，p u r i t yp r o t e i n 4 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：丁i 秀 日期：9 罗年上月f ，。日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密口 学位论文作者签名：了棼 日期：o 夕年三月，d 日 指导教师签名：熟碇 i t 期：d 呷年月io 日 上海海洋大学硕士论文 1 研究背景 引言 1 9 5 3 年，日本学者f u j i n o 从一个食物中毒患者分离得到一种弧菌，当时他 将其命名为溶血巴斯德氏菌。直至1 9 6 3 年s a k a z a k i ，1 w a n a m i 等将该菌定名为副溶 血性弧菌【i 】。它的发现成为了研究副溶血性弧菌的起点。至今，在世界许多国家均 报道过副溶血弧菌的暴发和零星病例。 副溶血弧菌( v i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s ，v p ) 为革兰氏阴性菌，隶属于弧菌科弧 菌属，是一种嗜盐性细菌。形态呈球杆状、杆状、弧状、丝状等多形性，分散排 列，常两端浓染，无芽抱，菌体一端有单鞭毛，运动活泼，为嗜盐性细菌。存在 于近海岸的海水、海底沉积物和鱼类、贝类等海产品中，是海洋水体及海洋生物 的致病菌之一【2 】。 具有致病性的菌株能引起食物中毒，尤以日本、东南亚、美国等国家多见， 也是我国沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌网。该菌是发展中国家急性腹泻 病的主要病原体之一，占2 0 以上 4 1 。该菌引起的食物中毒通常是以急性突发性水 泻起病，常伴有轻度到严重的痉挛性腹痛，腹泻常伴有低热、轻度寒战，约半数 患者伴有头痛。腹泻严重者可致电解质丧失，引起脱水或体位性低血压，但很少 引起死亡。感染较严重者可引起败血症，在婴幼儿和有基础疾病的老年患者中可 引起死亡。其它组织偶尔会产生病变，如皮肤大疙性损害、反应性关节炎和类风 湿性关节炎，原因是该菌能产生h s p 6 0 样蛋白质【5 l 。潜伏期5 - 7 2 小时，通常在进 食污染的海产品之后2 4 小时内发病。 目前研究认为副溶血性弧菌的主要致病因子是其产生的多种溶血毒素，主要 有耐热直接溶血毒素( t h e r m o s t a b l ed i r e c th e m o l y s i n ，t d 两，不耐热溶血毒素 ( t h e r m o l a b i l eh e m o l y s i n ，t l h ) 和相对耐热直接溶血毒素( t d h - r e l a t e d h e m o l y s i n ，t r h ) 1 6 1 。 1 9 6 8 年，日本学者w a g a t s u m a 发现副溶血弧菌能在一种特殊的血平板上产生明 显的溶血区，他将这种b 溶血特性命名为k a n a g a w ap h e n o m e n o n ，简称k p 7 】。后 来以此作为副溶血弧菌的分类依据，将副溶血弧菌分为k a n a g a w ap h e n o m e n o n l j 日性 菌株( 简称k p + 菌株) 和k a n a g a w ap h e n o m e n o n 阴性菌株( 简称k p 菌株) 。同年， s a k a z a k i 开展了副溶血弧菌的流行病学调查，发现9 6 的临床分离株为k p + 菌株， 上海海洋大学硕士论文 9 9 的环境分离株为k p 菌株【8 】。因此k p 现象成为了判定副溶血弧菌是否具有致病 力的依据。 1 9 7 3 年s a l c u r a i ，j 提出了k p 现象是由该菌产生的溶血毒素所导致的。他还发 现这种毒素在1 0 0 ( 2 处理l o m i n s 后，生物学活性不会丧失。同时该毒素是直接作用 于红血球，添加卵磷脂不会增强该毒素的溶血活性。基于以上两原因，而将其命 名为耐热直接溶血毒素【9 j 。 1 9 8 4 年。美国学者m i t s u a k in i s h i b u c h i 发现了用t d h 制备的抗血清能抑制副溶 血弧菌的k p 作用，因此t d h 被认为是副溶血弧菌的一个重要毒力因子，与该菌的 致病力密切相关。常规的k p 实验容易出现假阳性的结果，导致副溶血弧菌致病力 判定的错误，因此t d h 替代了k p ，成为判定副溶血弧菌致病力新的依据【l 们。 1 9 8 5 年n i s h i b u c h i 等【】通过纯化t d h 并利用p c v d 5 0 3 载体克隆了相应基因， 对t d h 基因进行了核苷酸序列的测定发现t d h 由两条相同的氨基酸链组成，每条氨 基酸由5 6 7 个碱基编码成18 9 个氨基酸，其中前2 4 个氨基酸为信号肽，后1 6 5 个氨基 酸为功能区；其开放阅读框长为5 7 0 b p 在随后的研究中，学者们发现编码t d h 的基因 可能由于种系进化和传播过程中基因突变等因素，造成了不同副溶血弧菌的t d h 基 因存在轻微差异，形成了一个t d h 基因家族目前已知该基因家族有 t d h l ，t d h 2 ，t d h 3 ，t d h 4 ，t d h s , v m t d h , v h - t d h , n a g - t d h 等t 1 2 1 t t s l t l 4 1 。 近年来的研究发现，副溶血弧菌除了产生t d h 和t r h 溶血毒素外，还可产生另 一种溶血毒素，即不耐热溶血毒素( t h e r m o l a b i l eh e r m o l y s i n ，t l h ) 。研究表明副溶血 性弧菌无论是临床分离株，还是环境分离株都含有t l h 基因，且具有种属特异性。 生化试验表明t l h 不但溶解人的红细胞，而且溶解马的红细胞，t l h 是一种非典型 的磷脂酶，但其功能和致病性仍不十分清楚【1 5 1 。t l h 由t l h 基因编码，国外已报道了 m 蝙码t l h 的基因序列，u h 位于小染色体上，长约1 3 k b 。国内李志峰等【1 7 】对t l l l 基 因进行克隆和序列分析，结果显示t l h 作为特异性诊断靶抗原可能具有潜在的应 用价值。 2 研究目的及意义 民以食为天，食以安为先，食品安全，事关重大。不仅是实现2 0 1 0 年上海世 博会城市，让生活更美好主题的基础，更是上海乃至整个国家长治久安的重要保 证。从1 9 9 0 年起，我国水产品总产量跃居世界第一，连续1 4 年保持世界第一渔 业大国的地位，年均增长率达1 3 。6 。水产品安全检疫体系的建立，是保证水产品 高质量，食品安全的重要一环。在水产品中经常存在一些“风险微生物”，常见的致 上海海洋大学硕士论文 病菌有副溶血性弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核 细胞增生李斯特菌、肉毒梭菌、变形杆菌、产气荚膜梭菌、蜡状芽孢杆菌、致病 性大肠杆菌和溶血性链球菌等【l 钔。据卫生部门的统计结果，2 0 0 2 至2 0 0 5 年，上海 市发生的微生物性食物中毒事件中，副溶血性弧菌占了起数和人数的7 2 9 3 和 7 2 2 7 。副溶血性弧菌也因此成为我国的首要食源性致病菌，特别是在一些沿海 城市。 传统的水产品致病菌诊断方法通常包括细菌的分离培养、染色、生化鉴定和 血清学检测等步骤，操作繁琐，检验时间较长，一般需要几天的时间才可获得较 确切的结果。因此，建立快速的检测和诊断方法及开展疫苗研究具有深远的现实 意义。构建两毒素基因的克隆株将为制备检测基于溶血毒素的副溶血弧菌快速检 测方法奠定了基础，从而为现场快速检测副溶血性弧菌提供良好的手段。 t d h 是副溶血性弧菌重要的毒力因子，与该菌致病性关系最为密切。t l h 在 副溶血性弧菌中具有存在的广泛性和种属特异性。因此，本研究着力于利用现代 生物工程技术，克隆副溶血弧菌耐热直接溶血毒素基因和不耐热溶血毒素基因， 实现t d h ，t l h 基因在原核细胞中的表达，纯化获得具有生物活性功能的t d h 、t l h ， 对其功能和免疫原性等方面进行研究。为在单因子水平上探讨副溶血弧菌t d h 、 t l h 的毒力、致病机理及其在诱导宿主免疫应答方面的作用奠定基础。在生产上。 将为建立快速检测副溶血弧菌的免疫学方法，快速诊断试剂以及基因工程疫苗的 研制提供技术储备。 上海海洋大学硕士论文 第一章文献综述 副溶血性弧菌的研究进展 副溶血性弧菌是一种嗜盐性弧菌，为海洋类常见菌，存在于近海岸的海水、 海底沉积物和鱼类、贝类等海产品中。具有致病性的菌株能引起食物中毒，尤以 日本、东南亚、美国等国家及中国台北地区多见，也是我国沿海地区食物中毒中 最常见的一种病原菌。在日本，由此菌引起的疾病占食物源性病例的2 4 ，在美 国，多为食物中毒暴发，散发病例较少见。台北地区曾开展食物中毒的监测，起 止时间为1 9 8 6 1 9 9 5 年，共发生食物中毒8 5 2 起，导致2 6 1 7 3 人患病，2 0 人死亡， 高峰季节分布在4 月一1 0 月，5 5 5 ( 6 5 ) 起由细菌性病原体所致，其中最普遍的 是副溶血性弧菌( 1 9 7 起，占3 5 ) 、金葡菌( 1 6 9 起，占3 0 ) 、蜡状芽胞杆菌( 1 0 4 起，占1 8 】。该菌是发展中国家急性腹泻病的主要病原体之一，占2 0 以上。 1 1 病原学 1 i 1 生物学特性 副溶血性弧菌为革兰阴性，呈杆状、丝状或稍弯曲弧状等多形性菌。菌体一 端有鞭毛，运动活泼。在无盐蛋自陈水中不能生长。在含3 - 4 氯化钠( p h 7 5 8 5 ) 或牛磺胆酸盐一亚硝酸盐培养基中3 7 0 c 生长最为适宜。但氯化钠浓度大于8 时 就不生长。该菌所有菌株都有相同的h 抗原，但0 抗原不同，据此可分为许多不 同韵血清型。有1 2 种不同的“0 抗原群和约6 0 种不同的“k ”抗原型，在日本 分布最广、最优势的血清型是0 4 ：k 8 t 1 9 1 。对酸敏感，食醋中5 m i n 即死亡。不耐热， 5 6 0 c ，3 0 m i n 死亡。淡水中存活不超过2 天，但在海水中能存活4 7 天以上。 1 1 2 铁摄取系统 铁是一些致病性细菌生长不可缺少的因素。副溶血性弧菌具有铁调节系统， 当细菌在低铁环境中生长时，毒力盒( v i r u l e n c ec a s s e t t e ) 会被诱导表达几种新的外膜 蛋白，这些蛋白在富铁环境中不表达。还有几种蛋白质在低铁环境中可以被诱导。 副溶血性弧菌至少有两个高效获得铁离子的系统。一是通过利用血红蛋白获得铁 离子。二是低铁环境中产生的弧菌素( 如v i b d o f e r r i n ) 。弧菌素可以大量结合铁离子， 并通过细胞特异性受体将其转运入细胞。副溶血性弧菌在铁饥饿的条件下，产生 4 上海海洋大学硕士论文 一些称作铁载体或铁鳌合剂的低分子量成份，所形成的铁一铁载体复合物通过铁 载体受体转运到细胞里面，进行铁的同化作用口0 1 。 副溶血性弧菌的铁摄取系统由两部分组成，即三价铁离子鳌合物( 含铁血黄素 巨噬细胞) 和铁离子抑制性外膜蛋白( 受体) ，后者有7 8 k d a 和8 3 k d a 两种蛋白的参 纠2 1 j 。副溶血性弧菌的铁摄取系统的调控基n ( f e r r i cu p t a k er e g u l a t i o ng e n e ，f u r ) 编 码的f u r 蛋白与大肠杆菌的f u r 蛋白和其它弧菌的f u r 蛋白的同源性分别为8 1 ， 9 0 f 1 9 1 。 铁摄取系统对副溶血性弧菌的繁殖、溶血毒素的产生都很重要，在不含铁离 子的培养基中加入枸椽酸三价铁胺盐能促进细菌的繁殖，增强细菌对小鼠的致死 性：但是在铁缺乏培养基中培养的细菌比铁丰富的培养基中培养的细菌产生更多的 溶血毒素。不论在何种培养基中培养的细菌产生溶血毒素时，都会被培养基中过 量的铁离子所抑制，表明细菌受铁载体调控，增强繁殖来实现对环境的适应 2 2 1 。 w o n g 等【2 3 】用副溶血性弧菌铁摄取系统自发突变株进行其对成年鼠和乳鼠的毒力 试验，自发突变株的粘附鼠红细胞的能力降低，溶血毒力也降低，甚至连铁调控 的细菌外膜蛋白也发生改变。 1 1 3 膜离子转运系统 1 n a + h + 反向转运系统 副溶血性弧菌的特点为嗜盐性，在培养基中以3 5 n a c l 最为适宜，当n a c i 浓度高于8 时不能生长，在无盐蛋白脉水中生长很差、甚至不生长。其嗜盐性的 机制与n a + i - i + 反向转运系统有关。n o z a k i 等【2 4 1 克隆一编码n “f 矿反向转运系统的 基因，转化质粒p b r 3 2 2 后在大肠杆菌中表达，未转化此质粒的大肠杆菌在0 2m n a c l 的培养基中不能生长，转化后的大肠杆菌由于获得n r 矿反向转运能力，可 在0 2 mn a c l 的培养基中生长。现已克隆的编码n a + h + 反向转运系统的基因 有：n h a a ，n h a b ，套m a d ，实验还发现氨氛毗嚓眯( 利尿剂) 能阻断n “霄，反向转运系 统的正常运转阻断后的细菌在0 2 mn a c i 的培养基中不能生长。 2 n a + g l u c o s e 同向转运系统 编码n a + g l u c o s e 同向转运系统的基因也位于染色体上，具有四个开放阅读框 ( o r f s ) ，o r f l 编码疏水性的肽聚糖，o r f 2 o r f 4 编码亲水性的肽聚糖。n 矿能调 控此系统的运转，根皮苷能阻断该系统的运转瞄】。 1 2 致病机理 目前研究认为副溶血性弧菌的致病力包括细菌产生的溶血毒素、尿素酶和侵 上海海洋大学硕士论文 袭力。 1 2 。1 溶血毒素与致病性的关系 溶血是该菌致病性的一个标志。致病性副溶血性弧菌能使人或家兔的红细胞 产生溶血，而非致病性副溶血性弧茵则为阴性。用d n a 探针检查表明，非溶血性 菌株实际上是缺乏产生溶血素所必需的遗传序列。迄今己发现4 个溶血成份，其 中热稳定溶血毒素研究得最详细，其蛋白m r 为4 2 x 1 0 4 ，等电点( p d 为4 2 ，由两 个相同的亚单位构成二聚体结构。将1 2 5 2 0 0 u g t d h 注入小鼠体内可致其死亡。 现己发现副溶血性弧菌能产生三种类型的溶血素，即耐热的直接溶血毒素 ( t d h ) 和两种不耐热的溶血相关毒素( t r h i ，t r h 2 ) 。通过测序了解三类毒素的序 列，这为副溶血弧菌的快速检测提供了理论基础。更为重要的是，不耐热的溶血 相关毒素的存在能阻遏耐热的直接溶血毒素的表达，其机制在基因的水平尚未明 了 2 6 1 。体外试验表明胆汁酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸能增强致病性的副溶血性弧菌 的溶血能力，原因是胆汁酸能增强副溶血性弧菌的繁殖能力，甚至激活休眠状态 的副溶血性弧菌，从而导致溶血毒素的高表达。此过程中细菌胞内的钙离子减少， 消胆胺能阻断胆汁酸的作用 2 7 l 。 溶血素的溶血过程分为两步：( 1 ) 溶血素与宿主的红细胞膜结合，呈温度非依赖 性，并且有受体介导，主要是神经节昔脂2 ( g m 2 ) ，g m l 也参与介导；( 2 ) 溶血素 致细胞溶解，呈温度依赖性。g 【2 6 】等运用单克隆抗体对耐热的直接溶血素的功 能结构域进行了研究，发现直接溶血毒素与红细胞结合的部位在其氨基端，而其 梭基端与结合后的过程( 包括蛋白磷酸化、溶血) 有关。s u z u k i 等【2 8 l 检测1 3 1 9 株副 溶血性弧茵的神奈川试验、直接溶血毒素( t d h ) 和溶血相关毒素( t r h ) ，发现神奈 川试验与t d h 的相关性大于其与t r h 的相关性。 1 2 2 尿素酶与致病性的关系 尿素酶( u r e a s e ) 降t 性的副溶血性弧菌是近年来研究的热点。大量研究发现尿素 酶与细菌的致病性之间存在一定关系，尿素酶能引起鼠回肠段的肠液积聚。许多 实验证实尿素酶与溶血相关毒素之间存在正向联系。s u t h i e n k u l 等【2 9 】检测4 8 9 株副 溶血性弧菌，发现t d h 单一阳性占8 1 ，t d h 和t r h 双阳性占6 ，t r h 单一阳 性占2 ；尿素酶阳性株占8 ，尿素酶阳性株都呈t r h 阳性，尿素酶阴性株的t r h 也呈阴性。i i d a 等【3 0 】提供了尿素酶与溶血相关毒素之间正向联系的分子生物学证据： 编码它仃 的基因序列位于染色体d n a 上相邻的编码区。很多学者据此认为，尿素 酶可以作为快速检测副溶血性弧菌，尤其是神奈川试验阴性菌的一个生物学标志。 1 2 3 侵袭性 由于临床上可观察到痢疾样表现和动物实验中溶血性菌株能穿入幼兔的肠上 6 上海海洋大学硕士论文 皮，说明该菌具有侵袭性，并且证实侵袭性是其毒力的一部分，但其组织学变化 要比志贺菌引起的轻。a k e d a 等【3 i l 对两者之间的关系进行了探讨，发现细胞松弛 素d 、诺考达哇( 抗肿瘤药) 能阻断副溶血性弧菌对c a e o 2 的侵袭力，同时发现酪 氨酸蛋白激酶、鞭毛和细胞骨架在侵袭过程中发挥一定作用。 1 3 副溶血弧菌的检测 目前，国内副溶血性弧菌的主要检测标准方法是按照g b t 4 7 8 9 7 2 0 0 3 1 3 引，该 方法准确性高，但检测周期通常需要3 , - - , 5 天，操作过程复杂，且工作量大。随着 现代分子生物学理论和技术的发展，为副溶血性弧菌的快速诊断创造了有利的条 件。 o b a t a 等1 3 3 1 1 9 9 6 年从旅游者腹泻中分离得至j j 4 7 8 株副溶血弧菌用反向被动乳胶 凝集试验检测其溶血性，该方法的灵敏度和特异性分别为9 8 和9 5 ，目前该方法已 有商品化试剂盒用来检测t d h ，同时也能用于检测1 r i m ，检出量为1 0 n g m l 。c h c n h c 等【3 4 1 9 9 7 年以副溶血弧菌外膜蛋白免疫兔获得的抗血清和异硫氰酸盐荧光素 标记的鼠抗兔i g g 做一抗和二抗，检测8 5 株副溶血弧菌，在显微镜下观察都产生强 荧光；而6 3 株非副溶血弧菌只有6 株产生弱或中等荧光。该方法的灵敏度和特异性分 别为1 0 0 和9 0 5 ，检测最低值为1 7 c f u g 牡蜗匀浆组织。该方法既可以克服培养 法时间过长的缺点，准确性又大大高于镜检法；同时还是研究病原菌在宿主体内各 组织分布情况的有效方法。目前，运用p c 瞄行副溶血弧菌的快速诊断主要是利用 t d h 或t r h 基因的保守序列设计引物，检测该菌的t d h 或t r h 基因，p c r 技术灵敏度高、 特异性好，受到普遍采用。如b e ja k 等【3 5 】采用套式p c r 检测副溶血弧菌的t d l l 或缸- h 基因，检测最低值为1 0 l - 1 0 2 c f u 1 0 9 牡蜗匀浆组织。彭宣宪等【3 6 】采用- j u p p c r s s c p 技术快速鉴定水产养殖动物病原性弧菌( 副溶血弧菌、溶藻弧菌、费尼氏弧菌、鳗 弧菌、哈维氏弧菌) ，结果发现s s c p 技术能较好的鉴定细菌的不同种，但对同种细 菌不同株的区分较困难。 目前已经有人提出有些细菌，如副溶血性弧菌大肠杆菌等在不良环境( 如低 温贫营养) 下，细胞缩小成球形，进入“活的非可培养状态 ( v i a b l eb u tn o n e u l t u r a b l e s t a t e ，v b n co rv n c ) 。所谓v n c 菌是指活的、具有生长繁殖潜力，且现有的培养 方法和培养条件无法使其恢复生命活性，处于休眠状态的一类菌f 3 7 , 3 8 】，它们在适 当的条件下还可以复苏，仍具有致病力。常规的培养法无法检测到处于这种状态 的细菌，造成漏检，从而形成危害。许多研究结果证实，进入v n c 的细菌仍然保 持着和正常细菌一样的表面抗原【3 7 1 ，因此可以利用免疫学技术进行检测，姚斐、 7 上海海洋大学硕士论文 寇运同【3 9 】等用间接e l i s a 在3h 左右的时间内检测出进入v n c 的副溶血弧菌1 2 1i u 株，其菌体变小，并缩成球形。 本研究采用聚合酶链反应口c r ) 技术扩增t d h a 、t d h s 和t l l l 基因全长，克隆至 融合表达载体p g e x - 4 t - 1 上。实现t d h a 、t d h s 和t l l l 基因在原核细胞中的可溶性、 融合性表达，并制备了抗t d h 的多克隆抗体，为建立一种基于溶血毒素的副溶血弧 菌检测技术，检测v n c 菌打下了基础。 8 上海海洋大学硕士论文 第一部分 副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素基因的 克隆表达及应用研究 第一章 副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆表达 副溶血弧菌( v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s ，w e ) 是一种嗜盐性细菌，隶属弧菌科中的 弧菌属，v p 主要存在于近海岸的海水、海水沉积物和鱼类、贝类等海产品中可引 起食物中毒，反应性关节炎( 该菌能产生h s p 6 0 ) 和心脏疾病。目前研究认为v p 的 主要致病因子是其产生的多种溶血毒素，主要有耐热的直接溶血毒素( t h e r m o s t a b l c d i r e c th e m o l y t i c u s ，t d h ) ，相对耐热的