（化学工程专业论文）植物甾醇的提取研究.pdf

中文摘要 近几十年来，人们对植物甾醇进行了广泛深入的研究，结果表明，植物甾醇 是一类对人体无毒副作用的具有高生理活性的天然物质，被誉为“生命的钥匙”。 植物甾醇能降低血液中胆甾醇含量，具有皮肤保健和美容作用，能促进动物生长， 增进健康。植物甾醇已应用于临床医学、甾体药物原料、化妆品和促进动物生长 等方面。 大豆油脱臭馏出物是油脂精炼过程中得到的副产物，其中含有比较丰富的植 物甾醇。本研究采用高效液相色谱法进行定性和定量分析。流动相：甲醇水= 9 7 3 ： 流速：lm l m i n ；紫外检测波长2 1 0h i l l ；时间：3 5m i n ；进样量：2 0 山；采用外 标法，做标准曲线进行定量。测定原料中甾醇的含量为9 5 5 ，其中菜油甾醇的 含量为2 6 3 ，豆甾醇的含量为2 5 2 ，1 3 - 谷甾醇的含量为4 4 0 ，是提取植物 甾醇较好的原料。 经分析，大豆油脱臭馏出物的主要成分为游离脂肪酸、甘油酯、植物甾醇、 维生素e 。脂肪酸的沸点较高，所以先对脱臭馏出物进行甲酯化预处理，使大部 分的脂肪酸转化为脂肪酸甲酯，提高脂肪酸的分离可行性。通过酯化反应正交实 验，确定最优工艺条件为料液比( 大豆油脱臭馏出物重量：甲醇体积) 为1 ：1 5 、 酯化温度为6 0 。c 、催化剂用量( 与大豆油脱臭馏出物的质量比) 为2 0 。此工 艺条件下，酯化率达到9 8 2 9 ，v e 保留率达到9 5 5 7 。甲酯化处理后，进行 静置分层，取上层溶液冷析结晶，得到粗甾醇晶体。所提取的粗甾醇纯度达到 4 7 8 7 ，回收率达到9 6 9 1 。 采用重结晶法对甾醇进步精制，通过正交实验，确定了甾醇精制的最佳工 艺条件为料液比( 粗甾醇质量：正戊醇体积) 1 ：2 0 ，养晶终止温度一5 ，养晶时间 1 6h 。精制甾醇的纯度可以达到9 6 8 8 ，得率达到9 1 6 8 。 精制甾醇中含有菜油甾醇、豆甾醇和b 一谷甾醇，利用菜油甾醇、豆甾醇和 b 一谷甾醇在环己酮中的溶解度随温度变化的差异，用重结晶法提取p 一谷甾醇， 所得d 一谷甾醇的纯度大于8 6 ；利用菜油甾醇、豆甾醇在正戊醇或环已酮中溶 解度的差异，经过重结晶，豆甾醇的纯度达到9 3 以上。以上数据为从大豆油脱 臭馏出物中提取植物甾醇和甾醇单体分离精制的工业化生产提供了依据。 关键词： 大豆油脱臭馏出物，植物甾醇，酯化，甾醇精制，重结晶 a b s t r a c t p h y t o s t e r o li sb e i n gs t u d i e dw i d e l ya n dd e e p l yb yp e o p l ei nr e c e n t l yy e a r s ，t h e r e s u l ti n d i c a t e sp h y t o s t e r o li sa ni n n o x i o u sn a t u r a ls u b s t a n c ew i t hh i g hp h y s i o l o g i c a l a c t i v i t ya n di sc a l l e d t h ek e yo fl i f e i tc a nd e c r e a s et h ec o n t e n to fc h o l e s t e r o li n b l o o d ，m a k es k i nh e a l t h ya n dl o o kw e l l ，i m p r o v et h ea n i m a l sg r o w t ha n dh e a l t h p h y t o s t e r o lh a sb e e nu s e di nc l i n i c a lm e d i c i n e 、s t e r o i dd r u gm a t e r i a l 、c o s m e t i ca n dt h e a n i m a l sg r o w t he t c t h es o y b e a no i ld e o d o r i z e rd i s t i l l a t e ( s o d d ) i sb y - p r o d u c ti nt h ep r o c e s so fo i l r e f i n i n g ，c o n t a i n i n gp l e n t y o fp h y t o s t e r 0 1 h p l ci su s e da st h eq u a l i t a t i v ea n d q u a n t i t a t i v ea n a l y s i sm e t h o di nt h i sr e s e a r c h m e t h a n o l ：w a t e r ( v ：v ) 9 7 ：3 ；f l o w r a t e ：l m l m i n ；u vd e t e c t i o nw a v e l e n g t h ：210n m ；t i m e ：3 5m i n ；s a m p l i n ga m o u n t ：2 0 “l ， e x t e r n a lr e f e r e n c em e t h o di su s e df o rq u a n t i f y t h i sr e s e a r c hm e a s u r e st h ec o n t e n to f p h y t o s t e r o li nt h er a wm a t e r i a li s9 5 5 ( c a m p e s t e r o l2 6 3 ，s t i g m a s t e r o l2 5 2 ， i - s i t o s t e r o l4 4 0 ) , p r o v i n gt h a ti t i st h ee x c e l l e n tl a wm a t e r i a lf o re x t r a c t i n g p h y t o s t e r 0 1 t h em a i nc o m p o s i t i o n si ns o d da r ef r e ef a t t ya c i d 、g l y c e r i d e 、奶ga n d p h y t o s t e r 0 1 b e c a u s ef r e ef a t t ya c i dh a sh i g hb o i l i n gp o i n t ，t h em e t h y l e s t e r i f i c a t i o nc a n t r a n s f e rf r e ef a t t ya c i di n t oe s t e ra sm u c ha sp o s s i b l e i nt h i sw a yt h es e p a r a t i o no ff r e e f a t t ya c i di sp o s s i b l e t h eo p t i m u mt e c h n i c a lc o n d i t i o n so fe s t e r i f i c a t i o nr e a c t i o n sa r e o b t a i n e db ye s t e r i f i c a t i o no r t h o g o n a le x p e r i m e n ta sf o l l o w e d ：s o d d ：m e t h a n o l ( w t ：v ) l ：1 5 ，e s t e r i f i c a t i o nt e m p e r a t u r e6 0 ，c a t a l y s t ：s o d d ( w t ：w t ) 2 0 t h e e s t e r i f i c a t i o nr a t ei s9 8 2 9 a n dt h ev er e s e r v a t i o nr a t ei s9 5 7 5 a f t e r m e t h y l e s t e r i f i c a t i o n , k e e ps t a t i o n a r yt os t r a t i f ya n dc r y s t a l l i z et h e a b o v el a y e r s o l u t i o n ，t h e nr o u g hs t e r o i sa r eo b t a i n e d t h ep u r i t yo fr o u g hs t e r o li s4 7 8 7 a n d r e c o v e r yr a t ei s9 6 91 p h y t o s t e r o l sa r er e f i n e db yr e c r y s t a l l i z a t i o n ，f u r t h e r m o r e ，t h eo p t i m u mt e c h n i c a l c o n d i t i o n s o fa r eo b t a i n e d b yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a sf o l l o w e d ：r o u g h s t e r o l s ：n - p e n t a n o l ( w t ：v ) 1 ：2 0 ，r e c r y s t a l l i z a t i o nt e m p e r a t u r e - 50 c ，r e c r y s t a l l i z a t i o n t i m e16 h t h ep u r i t yo fr e f i n i n gs t e r o l si s9 6 8 8 ，t h ey i e l dr a t ei sa b o u t91 6 8 p h y t o s t e r o l sa r ec o m p o s e do fc a m p e s t e r o l 、s t i g m a s t e r o l a n d1 3 - s i t o s t e r o l ， i - s i t o s t e r o li so b t a i n e db yr e c r y s t a l l i z a t i o nb e c a u s et h es o l u b i l i t i e so fc a m p e s t e r o l 、 s t i g m a s t e r o l a n di b - s i t o s t e r o l c h a n g ed i f f e r e n t l y w i t ht e m p e r a t u r ec h a n g e si n n - p e n t a n 0 1 , t h ep u r i t yo fp s i t o s t e r o lc a nr e a c h8 6 ；t h ep u r i t yo fs t i g m a s t e r o l c a l l r e a c h9 3 a f t e rr e c r y s t a l l i z a t i o n ，b e c a u s ec a m p e s t e r o la n ds t i g m a s t e r o lh a v ed i f f e r e n t s o l u b i l i t i e si nc y c l o h e x a n o n ea n dn p e n t a n 0 1 t h ea b o v ed a t ap r o v i d eab a s i sf o ri n d u s t r i a l i z a t i o np r o d u c t i o no fe x t r a c t i n g p h y t o s t e r o l sa n ds i n g l es t e r o lr e f i n i n gf r o mt h es o y b e a n o i ld e o d o r i z e rd i s t i l l a t e k e yw o r d s ：t h es o y b e a n o i ld e o d o r i z e r d i s t i l l a t e ，p h y t o s t e r o l ， e s t e r i f i c a t i o n ，r e f i n i n gs t e r o l s ，r e c r y s t a l l i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫鲞盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字同期：为刁年f 月f 罗同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨鲞盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 i 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：亥粥色 导师签名： 签字同期：w 刁年 1 月l 罗同 签字r 期：呻年 月j 3 同 第一章文献综述 1 1 甾醇概述 第一章文献综述 1 1 1 甾醇的结构、种类与性质 甾醇是广泛存在于自然界的一类甾族化合物。甾醇分子的基本骨架是由三个六元环 和一个五元环组成的环戊烷并全氢菲，也叫甾核。c 一3 位上连有一个羟基，c - 1 7 位上连 有由8 1 0 个碳原子构成的侧链，多数甾醇的c 5 位为双键，见图1 1 u j 。 根据其来源，甾醇可以分为植物甾醇、动物甾醇和菌类甾醇三大类。植物甾醇广泛 分布于植物界，它代表了植物代谢的一个终产物，其种类繁多。植物甾醇主要包括p 一 谷甾醇( 1 3 s i t o s t e r 0 1 ) 、豆甾醇( s t i g m a s t e r 0 1 ) 和菜油甾醇( e a m p e s t e r 0 1 ) ，其它还包括燕麦甾醇、 菠菜甾醇、钝叶大戟甾醇、芦竹甾醇、环木菠萝烯醇和2 4 亚甲基环木菠萝醇等。在含 油植物的种子和果实中，甾醇的含量较高；但是在一些可食用的植物的叶子和种子中也 发现了甾醇的存在，例如豆荚和蔬菜；在食品和饮料中，甾醇的存在是非常普遍的，但 其中含量的多少取决于食晶的种类。动物甾醇的主要代表是胆甾醇。茵类甾醇的主要代 表是麦角甾醇。 r l 其中，r t = o h r 2 - 丫卜 7 0 ，总收率 5 0 。盛漪【4 2 j 研 究正丁醇和正己烷混合溶剂富集豆甾醇，方法是溶剂溶解混合植物甾醇，搅拌均匀，超 声震荡处理，加热至6 5 。c 回流至完全溶解，水浴静置，降温，抽滤，结晶，4 至5 次分步 结晶后可得8 0 豆甾醇。 1 4 植物甾醇的分析方法 1 4 1 特殊试剂显色法 甾醇样品【4 3 】溶于氯仿中，沿管壁缓缓加一滴浓硫酸，发现加有浓硫酸的甾醇样品呈 现分层现象，接界面显玫瑰红色；或者将甾醇样品溶于乙酸酐后，滴加一滴浓硫酸，发 现溶液呈现绿色；或者将甾醇乙酸溶液加入三氯化铁一乙酸一浓硫酸溶液，显色。如： 胆甾醇显紫色，p 一谷甾醇显蓝色，再变化为紫罗兰色。 1 4 2 可见光比色法( v s ) 利用有机溶剂溶解植物甾醇，在分光光度计中进行扫描，根据最大吸收峰对植物甾 醇进行定性分析。在定量方面，一般采用l i e b e m a n n b u r c h a r d t 4 q 比色法测定甾醇产品中 总甾醇含量。具体如下： 准确称取甾醇标准品，以乙酸酐为溶剂，配成l1 1 1 l 系列标准溶液，浓度分别为0 0 1 、 0 0 3 、0 0 5 、0 1 、0 1 5 、0 2 、0 2 5m g m l ，溶解温度6 0 ；向溶液中加一滴浓硫酸，颜 色由无色变为红色再变为暗绿色，稳定1 0m i n 后用可见光扫描( 分光光度计) ，测量最 大吸收波长为6 5 0n n l ；在此波长下用各标准溶液的吸光度绘制标准曲线；测定未知样品 的吸光度，根据标准曲线确定其浓度，从而得到样品中总甾醇的含量。 此种方法虽然简单快速，但不能测定混合植物甾醇各组分含量，因此有一定的局限 性。 1 4 3 薄层色谱法( t l c ) 利用薄层色谱分析甾醇已有较长的历史，在硅胶板一i - _ 可以分离游离甾醇、甾醇酯、 游离脂肪酸、脂肪酸甘油酯等不同组分。薄层色谱法主要用于甾醇的定性分析，结合光 密度计则可进行初步定量工作。常用硅胶薄层平板，展开剂系统则有：苯一乙酸乙酯、 苯一乙醇、正己烷一乙醚、正己烷一丙酮、氯仿一乙醚、环己烷一乙酸乙酯等，而显色 第一章文献综述 剂采用：五氯化锑、三氯化锑或磷钼酸，罗丹明6 g 、硫酸，碘蒸气等。 l o c k w o o d 等人1 4 5 】考察了甾醇在1 0c m 硅胶g 平板( o 2 5m m ) 上的分离情况，采用正 己烷：乙醚( 4 ：l ，v ：v ) 为展开剂，室温空气中干燥1 0m i n 后，喷涂饱和三氯化锑一氯仿溶 液，1 0 0 。c 烘箱干燥8m i n ，采用v i t a t r o nm o d e lt l d 光密度计4 7 7n m 波长下，测量斑点相 应样品含量。m o r r i s 4 6 】也研究了t l c 光密度计在分析奶酪中胆甾醇的应用。 采用薄层色谱分析时，大多是将甾醇分解成特定产物后进行，或者是将其衍生化后 进行。此方法手续繁琐，费时较长。 1 4 4 气相色谱法( g c ) 随着高灵敏度、高选择性检测器的研制成功，多种高温固定相的合成和应用，各种 柱制备技术的开发以及样品衍生化技术的发展，为气相色谱法在甾醇分析方面提供了更 为有力的技术条件。由于甾醇分子量较高，分子中含有极性基团，沸点比较高，难以气 化，高温下不稳定，使得游离甾醇难以直接进行气相色谱分析，因此要将甾醇转化为适 当的衍生物，增加其挥发性和稳定性，降低气化点，从而可以改善气相色谱峰的对称性 和其它色谱性能。更重要的是，衍生化的作用在于可以使空间结构相似，差别很小，难 以分离的不同甾醇分离开，从而可以定性定量分析混合甾醇样品中所含甾醇的种类和组 分含量。 化学衍生方法 4 7 - 4 9 】主要有酰化、酯化和烷基化法。对于烷基化法，组分中的活泼氢 被烷基一硅基取代后，可生成极性低、挥发性高和热稳定性好的硅烷化衍生物。三甲基 硅烷化可以使多个功能基在同一步反应内全部衍生。 1 4 5 红外光谱法( i r ) 许文林等【5 0 5 1 】研究了用红外光谱法测定混合植物甾醇中p 谷甾醇和豆甾醇的方法。 利用红外光谱图中代表各组分的独立峰的吸光度，可得到各组分之间相对含量的比例法 分析方法，进行分析测定。采用此方法只需要测定各独立峰之间的吸光度比值与相对含 量的标准曲线，对未知混合物中各组分的相对含量只需测定独立峰之间的吸光度的比 值，就可以从己知的标准曲线得出其相对含量。用红外光谱进行定量分析常以峰面积表 示吸收强度，故用特征峰的面积进行定量分析。采用红外光谱法，不需对样品进行分离， 而且分析前后化合物不被破坏，是一种较简便、快捷的测试方法。 1 4 6 高效液相色谱法( h p l c ) 许多文献【5 2 。蚓已报道了h p l c 对甾醇的分析结果，用此方法甾醇不用衍生化即可直 接进样分析，操作简便，精确度较高，重现性好，若采用其制备色谱还可分离收集到甾 第一章文献综述 醇各组分的标准品。其不足之处是溶剂需要严格纯化以适应检测器的要求：灵敏度低于气 相色谱用检测器，结果易受流动相、样品处理方法等的影响，给分析带来一定的麻烦。 由于操作简便，运用广泛，如今反相柱和极性流动相是高效液相色谱中最常用的。 较早地被用于研究分析游离甾醇和甾醇衍生物 5 5 - 5 7 】，在反相柱上这些物质的保留特性与 分子结构之间的关系得到了研究。h o l e n 等人【5 8 】研究了c 8 和c 1 8 两种反相柱上关于8 种 分子结构相似的常见甾醇的分离优化条件，指出反相柱和极性流动相是更适合和更有效 率的分离分析条件，其中采用紫外检测器( u v ) ，波长2 0 6 n m ，甲醇：水( 9 9 ：1 ) 为 流动相，流速1 2m l m i n ，并考察了温度对分析结果的影响，发现c 1 8 柱分离效果优于 c 8 柱，且各甾醇洗脱顺序也不同。 对于分离每一类脂类物质中各单一脂类，已经有大量报道关于r p h p l c 在各类脂类 物质分离中的应用，比如蜡脂、长链脂肪烃、脂肪酸及其甲酯、甾醇及其酯类、生育酚、 甘油酯、脂肪醇等【5 9 1 。如a n t o n o p o u l o u 等人【删研究了同时分离中性油脂和极性油脂的 h p l c 分析方法，采用c 1 8 柱，紫外检测器( 2 0 6 n m ) ，流动相：a 甲醇：水( 8 0 ：2 0 ) 、 b 乙睛：甲醇( 6 0 ：4 0 ) 、c 乙睛：四氢呋喃( 9 9 5 ：0 5 ) 、d 异丙醇：乙睛( 9 9 1 ) ， 梯度洗脱，5 5 m i n 内可以实现多类脂类及每类中多种脂类物质的分离，从而达到分析的 目的。 h p l c 分析，由于甾醇各组分结构极其相似，所以选择能使各种甾醇达到完全分离 的最佳色谱条件是关键。再加上甾醇是非水溶性物质，所以选择反相液相色谱方法，多 采用甲醇一水作流动相，分离效果较好。 1 5 分子蒸馏( m d ) 1 5 1m d 的工作原理 根据分子运动理论，液体分子受热后运动会加剧，当接受到足够的能量时，就会从 液面逸出成为气体分子。逸出的气体分子在气相中会发生碰撞。气相中一个分子相邻两 次碰撞之间所走的路程称为分子运动自由程。任一分子在运动过程中都在不断变化自由 程，在某时间间隔内分子运动自由程的平均值就叫分子运动平均自由程，以名表示【6 。 所谓分子蒸馏就是蒸馏物料分子在蒸发面挥发直至冷凝面冷凝所走过的行程小于其 分子运动平均自由程的单元操作。其原理见图1 9 。 第一章文献综述 混合液 加热板 1 t 轻 一l ， r i ， 冷凝谩 ， 一， ， ， ， ， ， ， 一冷凝 污一3 子一 ， 加热一 重组份 轻组份 图1 9 分子蒸馏原理图 f i g 1 - 9s c h e m ed i a g r a mo fm o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n 混合液中不同组分的分子运动平均自由程不同，轻分子的平均自由程大，重分子的 平均自由程小。如果冷凝面与蒸发面的间距小于轻分子的平均自由程，而大于重分子的 平均自由程，这样轻分子可以达到冷凝面被冷却收集，从而破坏了轻分子的动态平衡， 使轻分子不断逸出。而重分子因达不到冷凝面，又返回到蒸发面，很快达到动态平衡， 从而实现混合物料的分离。 1 5 2m d 的特点 与普通蒸馏相比，分子蒸馏具有以下特点： ( 1 ) 普通蒸馏是在沸点温度下进行分离，而分子蒸馏是在远低于沸点的温度下进行分 离。 ( 2 ) 普通蒸馏的蒸发与冷凝是可逆过程，液相和气相之间达到了动态平衡；分子蒸馏 中，从加热面逸出的轻分子直接飞射到冷凝面上，理论上没有返回到加热面的可能性， 所以分子蒸馏是不可逆过程。 ( 3 ) 普通蒸馏有鼓泡、沸腾等现象；而分子蒸馏是在液膜表面上的自由蒸发，没有鼓 泡现象，即分子蒸馏是不沸腾状态下的蒸发过程。 ( 4 ) 普通蒸馏分离能力只与组分的蒸汽压之比有关；而分子蒸馏的分离能力与相对分 子量也有关。 ( 5 ) 分子蒸馏分离过程中，物料受热时间短，冷凝迅速，对易挥发、热敏性物质的保 存率高，从而避免了囚受热时间长而造成某些组分分解或聚合的可能。 ( 6 ) 无毒、无害、无污染、无残留，可得到纯净安全的产物。 ( 7 ) 目前分子蒸馏设备的一次性投资较大，适用于高附加值产品的生产。 第一章文献综述 1 。5 3m d 技术在油脂脱臭馏出物中的应用 油脂脱臭馏出物的主要成分是游离脂肪酸和甘油三酸酯，以及由他们的氧化产物分 解得到的挥发性醛、酮和碳氢类化合物。另外，在油脂脱臭馏出物中还含有丰富的植物 甾醇和天然维生素e 。所以通常以油脂脱臭馏出物为原料制取植物甾醇和维生素e 。 许多学者对采用分子蒸馏技术提取植物甾醇和维生素e 进行了研究。崔杨棣等【6 2 1 在 初馏压力为1 0 - 5 0p a 和主馏压力5 1 0p a 条件下，以短程蒸馏处理甾醇含量5 9 1 4 5 的油脂下脚酯交换产物，得到含甾醇2 1 - - - 4 1 的甾醇浓缩物，甾醇收率达7 9 9 4 。赵 国志【6 3 j 采用分子蒸馏技术对大豆脱臭馏出物进行分离，先用甲醇对馏出物进行甲酯化， 分离出甾醇结晶和溶剂后，再于1 3 3 - - 0 1 3 3p a 的高真空下进行多级分子蒸馏，可以得到 纯度在7 0 以上的v e 浓缩物，收率可达5 0 - 6 0 。b a t i s t e l l a l 匕较了离心薄膜式和转子 刮膜式分子蒸馏器对植物甾醇和维生素e 的提取效果。 1 6 立题的依据与意义 近百年来人们对植物甾醇进行了广泛深入的研究，甾体也被誉为“t h ek e yt ol i f e ”。 日本、欧美等一些国家就是采用食用油的脱臭馏出物来提取植物甾醇的，并且在这方面 的研究己有四十多年的工业化生产，目前仍在资源、提取效率( 如成本、收率、纯度) 等 方面深化，而国内对脱臭馏出物的收集利用尚属初级阶段。探索一条合理工艺提取脱臭 馏出物中的植物甾醇，一方面可以得到高附加值的天然制剂，如生育酚、甲酯、甾醇等， 满足人们的生活、医药及日化工业的需求，而且还能增加经济效益；另一方面，对脱臭 馏出物的综合利用可减少由于馏出物的排放所造成的环境污染，因此具有广阔的前景与 经济效益。 我国是生产油脂和消费油脂的大国，油脂资源丰富。目前，年处理油料达5 0 0 0 万吨。 近年来，随着我国引进和吸收国外的连续化精炼设备，使我国油脂精炼工业发生了新的 飞跃，精炼能力达至u 6 0 0 万吨年，脱臭馏出物达到4 0 万吨左右【删随着人们经济文化生活 水平的提高以及油脂工业的发展，连续精炼油规模还会进步扩大。可提取天然生育酚 和甾醇的脱臭馏出物产量随之增加，从脱臭馏出物中提取生育酚和甾醇也得到了国内外 许多学者和企业的关注，并进行了许多有意义的研究开发工作。然而，由于天然生育酚 和甾醇都混溶于脱臭馏出物中，它们都是低挥发性物质，在高温下易氧化、酯化而变质， 因此，提取纯化难度大。至今国内只有少数几家单位先后采用真空蒸馏、分子蒸馏技术 建立了分离植物甾醇的车问。大量的精炼副产物一脱臭馏出物中的植物甾醇的合理利用 已成为亟待解决的课题。因此，研究从廉价的油脂副产品中提取高附加值植物甾醇无疑 具有重要的经济和社会意义。 第一章文献综述 1 7 本课题的主要研究内容 本论文主要进行以下几个方面的研究： 1 植物甾醇的定性及定量分析方法； 2 分子蒸馏浓缩植物甾醇的工艺条件的探索； 3 酯化工艺的反应物和催化剂的选择及其用量、酯化温度、酯化时间等反应参数的确定； 4 重结晶法精制粗植物甾醇的工艺条件的探索； 5 植物甾醇单体的分离精制条件。 第_ 二章植物甾醇分析方法及原料理化性质的研究 第二章植物甾醇分析方法及原料理化性质的研究 了解原料的主要组成和相关指标是提取工艺中必不可少的一环，因此确定一套较为 完善的分析方法是非常必要的。它不但可以准确地分析植物甾醇的性质、客观地评价工 艺过程，而且还可通过每种工艺所获产品的性质差别来根据不同的需要对工艺条件进行 优化，确立符合实际生产的工艺路线。 2 1 植物甾醇分析方法概述 甾醇的定量测定方法主要有：毛地黄皂甙法【6 5 1 、薄层色谱法【6 6 1 、气相色谱法【6 7 i 和高 效液相色谱法f 5 。毛地黄皂甙法这种方法样品处理时间较长，试剂繁多，且受胆固醇氧 化酶和过氧化氢氧化还原酶本身的纯度和活力影响，误差较大。利用薄层色谱分析甾醇 已有较长的历史。在层析板上可以分离游离甾醇、甾醇酯、游离脂肪酸、脂肪酸甘油酯 等不同组分。为了使各组分达到完全分离，国内有些研究者将不皂化物从皂脚或馏出物 中萃取出来，然后再进行衍生化，点样分析，其处理方法手续繁琐，费时较长。自6 0 年代以来气相色谱的应用对甾醇的分析有了很大的推动作用。气相色谱法具有耗时少、 分离效率高、灵敏度高等优点，而且采用气相色谱法可以很好地解决同时对甾醇的含量 与组成进行分析的问题。但因甾醇分子中含有极性羟基，需对样品进行衍生化处理，由 于操作要求高，重现性差，所需时间长，洗脱衍生物的柱温也较高。气相色谱技术建立 后，在其影响下，经过相当时间的研究，在1 9 6 9 年，第5 次色谱进展国际会议上发表 了有关液相色谱的论文，成为近代液相色谱的开端。随着科研的发展，大量有机化合物、 离子型化合物以及易受热分解或失去活性的物质，不能直接或不适合用g c 进行分析， 而使h p l c 的应用领域不断扩大和深入，其中它在甾醇分析上的应用也日渐引起人们的 兴趣。 总结各种分析方法，针对植物甾醇精制过程中不同时期对分析效果的要求，确定一 套适合本实验的分析方案不仅可以提高分析准确度，更能节省时问，减少分析费用，提 高分析效率。考虑到实验室的仪器设备，我们选定高效液相色谱法，对不同纯度的甾醇 产品进行定性定量分析。对于植物甾醇产品的各项物理性质如水分、酸价、皂化值、过 氧化值等的测定均按照有关国家标准进行分析测定。 第二章植物甾醇分析方法及原料理化性质的研究 2 2 仪器与试剂 2 2 1 实验仪器 2 21l 高效液相色谱 实验中使用美国w a t e r s 公司w a t e r s6 0 0 9 9 6 7 1 7 高效液相色谱( h p l c ) ，光电二极管 阵列检测器( p a d ) h p l c 系统由输液泵( 6 0 0 ) 、自动进样器( 7 1 7 ) 、检测器( 9 9 6 ) 、数据记录及处 理装置等组成，其中输液泵、检测器是关键部位。本仪器还有梯度洗脱、在线脱气装置。 l 输液泵 输液泵是h p l c 系统中最重要的部件之一。目前应用最多的是柱塞往复泵。柱塞往 复泵的工作原理：由电动机带动偏心轮转动，再由偏心轮驱动活塞杆做往复运动，通过 单项阀的启动和关闭，定期将贮存在液缸中的流动相以高压连续输出。当改变电动机的 转速，通过调整活塞冲程频率，就可调节输出液体的流量。单位时问输出流量由柱塞杆 的往复运动次数决定。柱塞往复泵的液缸容积小，可至o 1m l ，因此易于清洗和更换流 动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱效 影响；泵压可达4 0 0k g c m 2 。其主要缺点是输出的脉冲性较大。 表2 1w a t e r s6 0 0 技术指标 ! 垒垒：兰：! 型璺! 兰坚垒q qg 竺型i ! ! 生垒2 望i 流速范围流速最高耐压梯度梯度色谱柱应用材质 ( m l m i n ) 精度 ( p s i ) 准度精度 o 0 l 2 00 1 6 0 0 0 0 5 0 1 5 分析柱与制备柱不锈钢 2 自动进样器 h p l c 迸样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。早期使用隔膜 和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通迸样阀或自动进样器。进样装置 要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流 量影响小。用于大量样品的常规分析。 第二章植物甾醇分析方法及原料理化性质的研究 图2 一l 自动进样器结构不意图 f i g 2 1a u t o - i n j e c t o rs t r u c t u r es c h e m a t i cp l a n 3 检测器 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。工作原理：氘灯 光源发出连续光，经过消色差透镜系统，聚焦在检测池。透过光束经过入射狭缝投射到 光栅。经过光栅的表面色散投射到二极管阵列元件上。光照射二极管，产生入射二极管 电流，这样由光信号转换成电信号被仪器检测到。p a d 是8 0 年代发展起来的一种新型 紫外吸收检测器，获得全部紫外波长的色谱信号。二极管阵列检测元件由1 0 2 4 个光电 二极管组成，可同时检测1 8 0 - 6 0 0n l n 的全部紫外光和可见光的波长范围内的信号。能 够获得a 、九、t 信息绘制出三维立体色谱图。是钨灯与氘灯的组合光源。 4 梯度洗脱 h p l c 有等强度( i s o c r a t i c ) 和梯度( g r a d i e n t ) 洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分 析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱 是在一个周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和p h 值等，用于分 析组分数目多、性质差异大的复杂样品。 5 在线脱气 将真空脱气装置串接到贮液罐与高压泵之间，实现溶剂在进入高压泵之前的连续脱 气，脱气效果最优。 2 2 1 2 红外光谱仪 v e c t o r2 2 型傅立叶变换红外光谱仪，布鲁克仪器公司 仪器分辨率：4 c m ；扫描次数：1 6 第二章植物甾醇分析方法及原料理化性质的研究 2 2 2 实验试剂 大豆油脱臭馏出物 乙醚分析纯 无水乙醇分析纯 三氯甲烷分析纯 甲醇色谱纯 水色谱纯 甾醇标准品 9 9 0 2 k b r光谱醇 2 3 实验方法 2 3 1 准备工作 购于某油脂加工厂 天津市光大化学试剂开发中心 天津市光大化学试剂开发中心 天津市光大化学试剂开发中心 天津市光大化学试剂开发中心 自制 购于陕西天维生物制品有限责任公司 天津市光大化学试剂开发中心 ( 1 ) 自制高纯水 采用1 8 1 0 - b 型石英自动双重纯水蒸馏器( 江苏省金坛市医疗仪器厂) ，自制高纯水 ( 2 ) 超声清洗器脱气 流动相在使用前必须进行脱气( 气泡会引起检测器灵敏度降低：如果进去氧气还会 氧化样品，降解固定相) ，采用a s 3 1 2 0 型超声清洗器( a u t o s i c e n c e 公司) ( 3 ) 安装色谱柱 根据待测样品的分析要求，选择合适的色谱柱，本实验选用色谱柱： y m c p a c k o d s - a ，1 5 0m m x 4 6m m ，5l a m 。 ( 4 ) 待分析的样品必须经过超声脱气及0 4 5 岬滤膜过滤，除去溶剂中的机械杂质， 以防堵塞输液罐、进样阀。 2 3 2 实验方法 流动相：甲醇水= 9 7 3 ；流速：1m l m i n ；紫外检测波长2 1 0l l l t i ；时间：3 5m i r a 进 样量：2 0 山；采用外标法，做标准曲线进行定量； 水分的测定采用真空烘箱法，在已恒重的称样皿中( ) 称取当即摇匀的5g 试样， 准确n o 0 0 1g ；把试样放入7 5 l 的烘箱中；开动减压装置的真空泵，使真空压力达 到1 3 3k p a ( 1 0 0m m h g ) 时开始计时，烘干1h ，烘干过程中真空压力保持在1 2 o 1 3 3 第二章植物甾醇分析方法及原料理化性质的研究 k p a ( 9 0 - - - 1 0 0m m h g ) ；真空烘干结束后，取出试样立即放入干燥箱中，充分冷却到室温， 称量烘后的重量( 1 1 1 2 ) ，准确到0 0 0 1g ；重复进行复烘，复烘时间为3 0m i l l ，直到前后 两次重量差值小于0 0 0 1g 为止。具体操作详见g b t 5 5 2 8 1 9 9 5 t 6 明； 酸价的测定，称取均匀试样3 5g ( w ) 注入锥形瓶中，加入混合溶剂5 0m l ，摇动使 试样溶解，再加三滴酚酞指示剂，用0 1n 碱液滴定至出现微红色在3 0 s 不消失，记下消 耗的碱液毫升数( v ) 。油脂酸价的计算公式如公式( 2 1 ) 所示，具体操作详见 g b 5 5 3 0 8 5 t 6 9 】： 酸价( m g k o h g 油) = 学 、 ( 2 - 1 ) 皂化值的测定。称取2 9 试样样品，准确到0 0 0 5g 于锥形瓶中；用移液管将2 5 0m l 氢 氧化钾一乙醇溶液加到试样中，并加入一些助沸物，连接回流冷凝管与锥形瓶，并将锥 形瓶放在加热装置上慢慢煮沸，不时摇动，油脂维持沸腾状态6 0m i n ，难于皂化的需煮 沸两小时；加o 5 1m l 酚酞指示剂于热溶液中，并用标准体积盐酸溶液滴定到指示剂的 粉色刚消失，如果皂化液是深色的，则用0 5 - - l m l 的碱性蓝6 b 溶液；按以上步骤不加试 样，再用2 5 0 m l 的氢氧化钾一乙醇溶液进行空白试验，同一试样进行两次测定。具体操 作详见g b t 5 5 3 4 1 9 9 5 1 7 0 】； 皂化值( i 。) ：篮二兰2 兰! 兰! 鱼：! m ( 2 2 ) 过氧化值的测定。称取试样，用三氯甲烷溶解，加入乙酸和碘化钾饱和溶液迅速盖 好瓶塞，混匀溶液，避光静置；加入蒸馏水，以0 5 淀粉溶液为指示剂，用硫代硫酸钠 标准溶液滴定析出的碘，以同一试样进行平行测定；具体操作详见g b t 5 5 3 8 1 9 9 5 7 1 】 p o v ( ，押叼i k g ) ：c ( k - v o ) 1 0 0 0 ( 2 3 ) m 式中：v l 用于测定的硫代硫酸钠标准溶液的体积，m e ； v r 用于空白的硫代硫酸钠标准溶液的体积，m l ； c 硫代硫酸钠标定浓度m o l l ； 册一式样的质量，g 2 3 3 操作步骤 ( 1 ) 将超声脱气后的流动相甲醇和水与脱气装置连接。 ( 2 ) 依次开启脱气装置、泵和检测器的开关，待其稳定后，逐渐增加甲醇的流量，用 第二章植物警醇分析方法及原料理化性质的研究 1 0 0 的甲醇冲洗系统1 5 r a i n 左右。 ( 3 ) 打开电脑，启动m i l l e n u m 工作站。 ( 4 ) 进入工作站的流量设置页面，设置流动相的流量和比例及进样时间，成功后即可 进样分析。 2 3 4 实验步骤 2 341 溶剂的选择 配制样品的溶剂挥发性不能太大，价格尽量便宜，不能对出峰产生不良影响。对乙 醇、正己烷两种不同极性的溶剂进行比较，发现正己烷会在豆甾醇前形成一个很大的馒 头峰。乙醇的出峰状况良好，重复性也较好。故选用乙醇作配制溶剂。 2 3 4 2 样品的配制 样品配制浓度要参考标样浓度，以保证两者的响应值基本相同。甾醇样品超声振荡 溶解于乙醇后，即可进行液相分析。 ( 1 ) 称取标准品0 0 4g ，溶于乙醇，倒入l om l 容量瓶定容，作为标准溶液，做液相分 析进样量分别为2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 ，1 2 ，1 4 ，1 6 ，1 8 ，2 0l , t l 。 ( 2 ) 原料中甾醇含量的测定：称取原料约0 5g ，溶于2 5l n l 乙醇，进样量为2 0i i l ，做液相 分析。 ( 3 ) 分子蒸馏后重相中甾醇含量的测定：称取重相约0 5g ，溶于2 5m l 乙醇，进样量为2 0 p l ，做液相分析。 ( 4 ) 粗甾醇含量的测定：称取粗甾醇约0 1g ，溶于2 5m 1 7 _ , 醇，进样量为2 0 山，做液相分 析。 ( 5 ) 精制甾醇含量的测定：称取原料约0 0 5g ，溶于2 51 1 1 l 乙醇，进样量为2 0 山，做液相 分析。 2 4 植物甾醇的高效液相色谱分析 2 4 1 原料中甾醇的定性分析 目前f d a 批准使用的植物甾醇是来源于各种植物油的植物甾醇，这些植物甾醇均为 已知的甾醇，如p 一谷甾醇、p 豆甾醇、菜子甾醇、菜油甾醇、p 一谷甾烷醇等。各种 甾醇标样可用于甾醇峰的定性【7 2 1 。 本实验采用甾醇标样定性，标准品和原料的液相图如图2 - 2 和2 3 所示。 第二章植物甾醇分析方法及原料理化性质的研究 图2 - 2 标准品液相色谱图 f i g 2 - 2s t a n d a r ds a m p l eh p l c 图2 3 原料液相色谱图 f i g 2 3r a wm a t e r i a lh p l c 从图2 2 和2 3 可以看出，原料在t r = 2 4 8 5 8 和2 8 3 5 8 和标准品t g = 2 5 2 9 0 和2 9 7 1 3 处的保 留时间一致，为了进一步验证其准确性，分别将标准品o 0 0 1g 和0 0 1g 力 i x , 到原料中， 再做液相分析，结果女n 2 - 4 和2 5 所示。可以看出，原料在原保留时间处的峰明显增高。 综上所述，原料中含有菜油甾醇、豆甾醇和b 谷甾醇。 图2 _ 4 原料加入标准品( o 0 0 1g ) 的液相色谱图 f i g 2 4r a wm a t e r i a la d d i n gs t a n d a r d s a m p l e ( 0 0 01g ) h p l c 螂