（发酵工程专业论文）黑曲霉内切β14葡聚糖酶基因的克隆优化及在毕赤酵母中的表达研究.pdf

华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 内切b 一1 ，4 葡聚糖酶( e c 3 2 1 4 ) 是一种重要的工业用酶，广泛应用于饲料工 业，酿造业等领域。随着生产的发展，b 1 ，4 葡聚糖酶需求量日益增加。本实验的 主要目的就是，从分泌热稳定性的p 1 ，4 葡聚糖酶的黑曲霉高产菌株中，克隆该基 因，利用基因工程手段实现高效表达，满足工业生产的需求。 实验首先是利用r t - p c r 技术，提取黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) l 3 的总r n a 进行反转录，并通过p c r 扩增得到去除天然信号肽的b 1 ，4 葡聚糖酶基因昭i ，将 其插入到毕赤酵母表达载体p p i c 9 k 上，使之位于0 【因子信号肽下游，并与之同框， 构建重组表达质粒p p i c 9 k e gi ，电击转化毕赤酵母g s 11 5 ，经m m 、m d 、c m c n a 和g 4 1 8 平板筛选，得到重组毕赤酵母工程菌1 1 舞和1 5 群，在摇瓶发酵水平上，以 0 5 的p 一葡聚糖为底物检测，酶活分别达到14 5 6u m l 和19 2 8u m l 。重组酶最 适p h 为5 0 ，最适反应温度为7 0 ，在7 0 时保温3 0m i n 后仍然具有9 0 以上 的活力。 为了进一步提高表达量，根据毕赤酵母偏爱的密码子优化来源于a n i g e rl 3 的 内切d 1 ，4 一葡聚糖酶的d n a 序列，共改变1 9 3 个碱基，g + c 由5 4 下降到4 4 2 2 。 设计了1 4 对寡聚核苷酸引物，采用重叠延伸p c r 三步法获得全长基因序列共改变。 将其插入到毕赤酵母表达载体p p i c 9 k 上，构建重组表达质粒p p i c 9 k s y n e gi ，电 击转化毕赤酵母g s l l 5 ，经m m 、m d 、c m c n a 和g 4 1 8 平板以及摇瓶筛选，得到 重组毕赤酵母工程菌2 7 样。摇瓶发酵条件下，以o 5 的葡聚糖和1 的c m c n a 为 底物检测，酶活分别达到36 5 8u m l 和5 9 1 9u m l ；采用5 0l 发酵罐进行发酵， 酶活则分别达到6 56 4 9 6u m l 和3 97 2 8 3 2u m l 。 关键词：黑曲霉，p 1 ，4 葡聚糖酶，毕赤酵母，密码子优化，表达 黑曲霉内切b 1 ，4 葡聚糖酶幕因的克隆，优化及在毕赤酵母中的表达研究 a b s t r a c t e n d o d 一1 ，4 一g l u c a n a s e ( e c 3 2 1 4 ) ，a s a l li m p o r t a n ti n d u s t r i a le n z y m e ，h a sb e e n w i d e l yu s e di nt h em a n yf i e l d ss u c ha sb r e w i n ga n da n i m a lf e e di n d u s t r y w i t ht h e d e v e l o p i n go fp r o d u c t i o n ，t h en e e df o ri ti si n c r e a s i n gd a ya n dd a y t h ep u r p o s eo ft h i s r e s e a r c hi st oc l o n et h e r m o s t a b l ee n d o b 1 ，4 一g l u c a n a s ef r o mas t r a i no fa s p e r g i l l u sn i g e r , w h i c he f f e c t i v e l ys e c r e t e de gi ，t oi m p r o v et h ee x p r e s s i o nl e v e lw i t ht h em e t h o d so f m o l e c u l a rb i o l o g ya n dg e n ee n g i n e e r i n ga n dm e e tt h en e e di ni n d u s t r i a lp r o d u c t i o n t h eg e n ee n c o d i n ge n d o p 一1 ，4 一g l u c a n a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e rl 3w a si s o l a t e d w i t hr t - p c rm e t h o d e g1w a se l i m i n a t e di t sn a t i v es i g n a lp e p t i d eb yp c ra n di n s e r t e d i n t ot h ep p i c 9 kv e c t o ro fp i c h i ap a s t o r i si nr e a d i n gf r a m ew i t hq f a c t o rs e c r e t i n gs i g n a l p e p t i d es e q u e n c et oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c 9 k e gi t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp p i c 9 k - e g1w a st r a n s f o r m e di n t oep a s t o r i sg s l1 5w i t he l e c t r o p o r a t i o n t w o o fr e c o m b i n a n tp p a s t o r i ss t a i n s1 1 挣a n d1 5 # w e r eo b t a i n e db ys c r e e n i n gw i t hm m ，m d ， c m c - n aa n dg 418p l a t e sa n dt h ea c t i v i t yo fr e c o m b i n a n te gic o u l dr e a c ht o14 5 6 u m la n d19 2 8 u m lr e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ef o rt h er e c o m b i n a n t e g1w a s7 0 a n dt h eo p t i m a lp hw a s5 0 t oi m p r o v ee x p r e s s i o ne f f i c i e n c yi nr e c o m b i n a n t1 3 - 1 ，4 - g l u c a n a s ei np p a s t o r i s ，t h e e gig e n ef r o man i g e rl 3w a sm o d i f i e dw i t hc o d o no p t i m i z a t i o n at o t a lo f1 9 3 n u c l e o t i d e sa r ec h a n g e d ，t h eg + cr a t i ow a sd e c r e a s e df r o m5 4 t o4 4 2 2 1 4p a i r so f o l i g o n u c l e o t i d e sw i t h15b po v e r l a pw e r ed e s i g n e da n dt h ef u l l l e n g t hs y n - e gig e n ew a s s y n t h e s i z e du s i n gp c r b a s i ct h r e e - s t e pd n as y n t h e s i sm e t h o d t h em o d i f i e ds y n e gi g e n ew a si n s e r t e d i n t ot h ep p i c 9 kv e c t o rt oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p p i c 9 k - s y n e gi t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c 9 k - s y n - e g1w a st r a n s f o r m e di n t op p a s t o r i sg s ii5w i t he l e c t r o p o r a t i o n ar e c o m b i n a n tp p a s t o r i ss t a i n s2 7 群w a so b t a i n e d b ys c r e e n i n gw i t hm m ，m d ，c m c - n aa n dg 4 18p l a t e s t h ea c t i v i t yo fr e c o m b i n a n t e gia ts h a k i n gf l a s kl e v e lc o u l dr e a c ht o36 5 8u m la n d5 91 9u m lw i t ho 5 b a r l e y i b - g l u c a na n d1 c m c n aa ss u b s t r a t e ，r e s p e c t i v e l y a t5 0l f e r m e n t o rl e v e l ，t h ep 一1 ， 4 一g l u c a n a s ea c t i v i t yw a s6 56 4 9 6a n d3 97 2 8 3 2u m lw i t h0 5 b a r l e y l 3 一g l u c a na n d1 c m c n aa ss u b s t r a t e k e yw o r d s ：a s p e r g i l l u sn i g e r ；p 一1 ，4 - g l u c a n a s e ；p i c h i ap a s t o r i s ；c o d o no p t i m i z a t i o n ； e x p r e s s i o n h 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 舀 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：黄名 时间：7 卯f 年占月，。日 糊嫦撕：靠君。撇名：碧垒：圻 签名日期：硼g 年占月t o 日 签名日瓤7 g 年 舌月f o 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 1p 一葡聚糖概述 第一章引言 b 一葡聚糖属于植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，它富含在大麦、黑麦、高粱、 稻和小麦等作物的胚乳细胞壁中。p 葡聚糖由1 2 0 0 多个p d 葡萄糖基通过1 3 i ，3 键和 b 1 ，4 键按1 ：2 5 的比例连接而成的链状高分子化合物。将大麦中分离出的水溶性的1 3 葡聚糖用专一性p 一1 ，3 1 ，4 葡聚糖酶水解，经凝胶过滤层析和甲基化方法确定结构发 现，近9 0 的多糖是由p 1 ，3 糖苷键所分隔的纤维三糖和纤维四糖单元组成，5 1 1 个 连续的p 一1 ，4 糖苷键相连的寡糖单元也占有较高的比例( b e e r ，1 9 9 7 ) 。b 葡聚糖的溶 解性受其结构中p 1 ，3 糖苷键的含量和聚合度的影响。分为水溶性和非水溶性两种， 其中水溶性占大多数。水溶性1 3 葡聚糖中p 一1 ，3 糖苷键与p 1 ，4 糖苷键含量之比为 1 ：2 5 2 6 ，而非水溶性b 一葡聚糖中相应糖苷键含量之比为1 ：4 2 。 d 葡聚糖有许多独特的物理化学特性。 粘稠性：大麦b 葡聚糖在水中溶解会变成有粘性的溶液。单胃动物食用该类物 质后，由于其自身不能产生降解p 葡聚糖的酶类，无法消化p 葡聚糖，从而产生了 高粘性的消化道环境。这样会直接阻碍淀粉酶、蛋白酶等同底物的接触，从而影响 单胃动物对各种养分的消化吸收。 高亲水性：高亲水性的d 葡聚糖与肠粘膜表面的脂类微团和多糖的蛋白复合物 相互作用，导致粘膜表面水层厚度增加，降低养分吸收。表面水层厚度是养分吸收 的限制因素。 高吸水膨胀力和持水性：b 葡聚糖具有持水活性，像海绵一样可通过网状结构 吸收超过自身重量数倍的水分，从根本上改变其物理特性，抑制肠道的蠕动。 吸附离子：d 葡聚糖能吸附c a 2 , 、z n 2 + 、n a + 等离子和有机质，从而影响这些物 质的代谢。 这些特殊的物化特性，使得p 一葡聚糖不仅在动物饲养中，影响营养物质在动物 体内的代谢，从而降低动物对营养物质的吸收效率，在啤酒酿造中也造成负面影响。 由于大麦中富含b 一葡聚糖，在制造麦芽汁过程中，致使麦芽汁粘度增大，过滤困难； 在发酵过程中过量的b 一葡聚糖与蛋白质结合，使酵母过早沉淀；同时会降低啤酒的 澄清度，影响啤酒的感官品质。 1 2 纤维素概述 纤维素是植物纤维的主要成分，约占其干重的3 0 5 0 ，是目前分布最广的天然 黑曲霉内切b 1 ，4 葡聚糖酶基闪的克隆，优化及在毕赤酵母中的表达研究 碳水化合物，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。随着世界人口的激增、粮 食和能源的短缺将日趋严重，可再生纤维素资源的开发利用己引起全世界的普遍关 注。例如，作为世界上最丰富的可再生资源植物纤维素资源生产乙醇是目前研 究重点与热点。 纤维素是由d 葡萄糖通过b 1 ，4 糖苷键连接而成的长链葡聚糖分子，这些分子彼 此顺着长链走向通过氢键结合而聚集成丝状纤维。纤维素分子的聚合度变化很大， 一般为80 0 0 1 00 0 0 个葡萄糖残基大量丝状纤维交错排列构成纤维束，纤维之间还充 填果胶、半纤维素和木质素( 孟雷等，2 0 0 2 ) 。丝状纤维内部的葡聚糖分子之间可以 形成氢键，在一定空间范围内，氢键达到一定数量级，形成一个极为紧密有序的结 构区域，称为结晶区，也称不可及区。而其余相对松散的区域，可及度较高，称为 非结晶区或无定形区( b e g u i na n da u b e r t ，1 9 9 4 ) 。 纤维素的降解需要纤维素酶系的协同作用。纤维素酶包括：( 1 ) 内切葡聚糖酶 ( e n d o 一1 ，4 b d g l u c a n a s e ，e c3 2 1 4 ，来自真菌的简称e g ，来自细菌的简称 c e n ) ，( 2 ) 外切葡聚糖酶( e x o 1 ，4 p d g l u c a n a s e ，e c3 2 1 1 9 ，来自真菌的简称 c b h ，来自细菌的简称c e x ) 和( 3 ) 葡萄糖苷酶( p 1 ，4 g l u c o s i d a s e ，e c3 2 1 2 1 ， 简称b g ) 。纤维素酶降解纤维素的机制尚未完全研究清楚，一般认为，先由内切葡 聚糖酶水解纤维素可及度较高的非结晶区，产生大量还原性末端和非还原性末端； 再由外切葡聚糖酶从这些葡聚糖末端起始，逐步水解切割葡聚糖长链；外切葡聚糖 酶的水解产物通常为纤维二糖，而较高浓度的纤维二糖会对外切葡聚糖酶产生产物 抑制作用，因此需要d 葡萄糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖以解除这种抑制作用 ( w o o d ，1 9 7 1 ) 。 正是由于纤维素自身结构，其降解机制以及纤维素酶系的的复杂性，限制了它 的开发和应用。 1 31 3 - 1 ，4 葡聚糖酶 1 3 1 性质与分布 内切b 1 ，4 葡聚糖酶 e c 3 2 1 4 ，e n d o p 一1 ，4 一g l u c a n a s e 是一种可特异地作用于p 一1 ， 4 葡萄糖苷键的水解酶，由于可以降解羧甲基纤维素( c m c ) ，因此又称为c m c a s e 。 这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解p 一1 ，4 葡萄糖苷键，将长链纤 维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。可以与外切葡聚糖酶， 以及葡萄糖苷酶协同作用降解纤维素。同时，内切b 1 4 葡聚糖酶也是b 葡聚糖酶 系家族成员之一，与b 1 ，3 葡聚糖酶，d 一1 ，3 1 ，4 葡聚糖酶，b 1 ，2 1 ，4 葡聚糖酶， b 1 ，3 1 ，6 一葡聚糖酶等，常被用以催化水解p 葡聚糖。 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 在自然界中，存在众多能产生纤维素酶的生物，包括某些低等动植物、真菌、 细菌和放线菌。目前，数据库中共有纤维素酶蛋白4 7 0 多个，其中e c3 2 1 4 ( 内切 酶) 有1 5 5 个，占总数的3 3 ，e c 3 2 1 1 9 ( 外切酶) 有5 5 个，占总数的1 2 ， e c3 2 1 2 1 ( 糖苷酶) 有1 5 5 个，占总数的3 2 ，还有1 5 5 个酶的分类尚未清楚 ( h t t p ：w w w b r e n d a u n i - k o e l n d e ；h t t p ：w w w e x p a s y o r g e n z y m e ) 。在众多的纤维素 酶中，动植物内源性纤维素酶比较少，主要来源于微生物。己发现的具有降解纤维 素能力的微生物有近2 0 0 种，其中丝状真菌是研究最多的纤维素降解类群，它们在 降解纤维素底物时，菌丝穿过次生壁进入胞腔，由内向外降解纤维素，使纤维逐步 被破坏( 孟雷等，2 0 0 2 ) 。木霉属( t r i c h o d e r m a ) 的真菌是目前研究最多的纤维素 降解菌，如7 = r e e s e i ，zv i r i d e ，zk o n i n g i i 和zp s e u d o k o n r i n g i i 都是比较著名的菌种。 尽管内切p 1 ，4 一葡聚糖酶广泛分布于动，植物和微生物中，但不同来源的p 1 ，4 葡聚糖酶性质相差甚远。例如来源于桑粒肩天牛幼虫的内切p 一1 ，4 葡聚糖酶，其分 子量为2 6k d ，最适反应温度为4 5 ，最适p h 为5 2 ( 殷幼平等，2 0 0 0 ) ；大麦本 身含有b 葡聚糖酶，但对热敏感，在高温下不稳定，萌发种子6 0 以上的p 葡聚 糖酶在干燥中失活，而存余的活性大多很快在5 5 糖化时丧失。而来源于丝状真菌 的b 1 ，4 葡聚糖酶则一般具有较好的热稳定性。h o n g 所报道的黑曲霉的内切b 1 ，4 一 葡聚糖酶分子量为4 3k d ，最适作用温度为7 0 ，最适p h 为6 并且对多种酶抑制 剂不敏感( h o n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 3 2 结构特征 对纤维素酶分子结构和功能的研究是始于2 0 世纪8 0 年代。t i l b e u r g h 用木瓜蛋 白酶有限酶切里氏木霉的外切酶分子，得到两个具有独立活性的结构域：一个具有 催化功能的结构域( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) ，另一个是具有结合纤维素功能的结构 域( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) ，两者之间由一段高度糖基化的l i n k e r 相连。大 多数纤维素酶都是这样，但少数微生物和高等植物产生的纤维素酶不具有这类结构 域，如t r e e s e i 的c b h i 在没有c b d 的情况下仍具有水解纤维素的活性，在t r e e s e i 的e g l 的酶解过程中也观察到同样的现象。此外h u m i c o l ai n s o l e n s 的e g 5 和 c e l l u l o m o n n a s l i m i 的c e n e g 都并未发现具有c b d 结构，但仍然具有水解酶活性。 这些实验证明，在有些外切和内切酶中c b d 对酶的催化活力是非必需的。 催化域体现了催化活性及对特定水溶性底物的特异性，尽管不同来源纤维素酶 的分子量大小差别很大，但它们催化区的大小却基本一致。现在对纤维素和半纤维 素催化结构域的分类是按照其折叠方式，归属于碳水化合物催化结构的分类之中 【h t t p ：w w w a f m b e l l i s m r s f r p e d r o c a z y d b h t m l 】。这种分类系统依据的是结构域氨 基酸序列保守性，并体现在空间结构上具有相似性以及催化机理雷同等特征。结晶 结构的证据表明：同一族的酶分子遵循相同的机制；这些酶水解葡萄糖苷键通过一 3 黑曲霉内切b 1 , 4 葡聚糖酶慕凶的克隆，优化及袖j 毕赤酵母中的表达研究 般的酸催化机制：与此相反，不同族的酶分子可能有不同的机制，并且可能有不同 的折叠模型( d o m i n g u e ze ta 1 ，1 9 9 5 ) 。人们将它们分成九个族( s u l z e n b a c h e r ，1 9 9 6 ) 。 其中最大的一族为a 族，它包括1 5 个糖苷水解酶家族，即第1 ， 2 ，5 ，1 0 ，1 7 ，2 6 ， 3 0 ，3 5 ， 3 9 ，4 2 ，5 0 ，5 3 ，5 9 ，7 2 ，8 6 等。其中c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m 的内切 酶c e l c 为该族的代表，其催化域的结构已得到解析( 图1 1 ) 。这个分子折叠成一个 ( 吖p ) 8 的桶状结构，在水解底物的催化反应中，g l u 2 2 8 ，g l u 2 1 4 分别作亲核体和质 子供体，a r 9 4 6 ，a s n l 3 9 ，h i s 9 0 ，h i s l 9 8 ，t y r 2 0 0 和t r p 3 1 3 参与底物结合( o r e n g o ， 】9 9 4 ) 。 图1 1c c e l l u l o l y t i c u m 的( a p ) 8 的折叠桶结构 f i 9 1 1 ( a p ) 8b a r r e lf o l do fc c e l l u l o l y t i e u m 在催化域功能的研究方面，1 9 9 0 年s i n n o t t 从化学机制的角度出发论述了酶催 化糖基转移的机制。他认为糖苷配基的离去是涉及到两个氨基酸残基的酸碱催化的 双置换反应，与溶菌酶的作用机制相似。1 9 8 8 年至1 9 9 4 年采用定点突变技术和酶 专一性抑制剂做了大量研究，终于证明g l u 位于细菌、真菌的内切酶、外切酶、葡 萄糖苷酶的活性位点；在异头碳原子位通过构型的保留或构型的转化完成催化反应， 其中两个保守的羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核体( 阎伯旭等，1 9 9 9 ) 。 来自于a n i g e r 的e n d o b 1 ，4 g l u c a n a s e ( e g i ) 属于糖苷酶的第5 家族，纤维素 酶的a 族。它的序列中存在糖苷酶第5 家族的保守残基：a r g 7 6 ，h i s 1 2 0 ，a s n 1 5 9 ， g l u 1 6 0 ，h i s 一2 2 5 ，t y r - 2 2 7 ，和g l u 2 6 7 ( h o n ge ta 1 。2 0 0 1 ) 。第5 家族的纤维素酶 都属于内切葡萄糖苷酶，其催化域的三维构象是一个( a p ) 8 的折叠桶，在异头碳原 子位通过构型保留来完成催化反应。据推测，其中的g l u 2 7 0 ，g l u l 6 0 在催化反应中 分别作亲核体和质子供体。 1 3 3 基因工程研究 z u r b r i g g e n 等( 1 9 9 1 ) 就尝试着利用重组酵母来生产p 一1 ，4 一葡聚糖酶。w o o d 等 在大肠杆菌e c o l ik o l l 中表达了欧氏菌( e r w i n i ac h r y s a n t h e m ip 8 6 0 2 1 ) 的葡聚糖内切 4 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 酶基因，最终得到的重组纤维素酶在培养基中可产生高达32 0 0 肌( w o o d ，1 9 9 7 ) 。 h o n g 等利用酿酒酵母表达来自于黑曲霉中的内切葡聚糖酶，获得5 7 4 u l 的产量 ( h o n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。p a l o m e r 等将草莓中的p 1 ，4 - 葡聚糖酶克隆出来并成功地在毕 赤酵母中表达( p a l o m e re ta 1 ，2 0 0 4 ) ，n k i t a m o t o 矗m 等 火a s p e r g i l l u so r y z a e 中克隆 出两个d 1 ，4 葡聚糖酶c e l a 和c e l b ，a o r y z a et a a 启动子和a o r y z a en i a d 基因为筛 选标记的载体，转似o r y z a e d o 表达，以获得更高的产量( nk i t a m o t om e ta 1 ，1 9 9 6 ) 苜蓿根瘤菌( s i n o r h i z o b i u mm e l i l o tm 5 n i c s ) 的p 一1 ，4 一葡聚糖酶在大肠杆菌和毕赤酵母 中表达( 许善峰，2 0 0 6 ) 。 虽然许多纤维素酶基因都以得到了克隆，但表达和分泌能力有限。因此众多学 者尝试应用基因工程方法提高酶的产量，并取得了明显的效果。a h o 等在体外构建 了多拷贝d 1 ，4 葡聚糖酶基因的表达载体p a l k 2 2 2 ，转化酿酒酵母，得到的转化子 表达量为1 0 1 0 4g l ，然后将不同配型的两个转化子经行杂交诱变，获得了重组子 的酶活提高了4 5 倍( a h oe ta 1 ，1 9 9 6 ) 。l a m 等构建了一个高效的表达载体p m z r e g 在枯草芽孢杆菌表达了粪肥纤维单孢菌( c e l l u l o m o n a s f i m i ) 的内切p 一1 ，4 一葡聚糖酶 基因，获得的转化子表达该酶的产量是此前利用其它体系表达的4 倍( l a me ta 1 ， 1 9 9 8 ) 。h o n g 和w a n g 等，将分离到的热稳定的内切d 1 ，4 葡聚糖酶，纤维二糖水 解酶和葡萄糖苷酶整合到耐热酵母k l u v e r o m y c e sm a r x i a n u sn b r c l 7 7 7 的染色体上， 在强启动子的作用下，实现了共表达。他们成功构建的这一株分解纤维素的工程菌 可以在以纤维二糖或羧甲基纤维素为唯一碳源的合成培养基上生长，并且可以利用 1 0 的纤维二糖产生4 3 4 的乙醇( h o n g e ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 定点突变及定向进化等手段，也被应用于这个领域。在t r e e s e i 中，需要产生至 少1 4 种酶协同作用才能水解未经化学处理过的植物干物质。有报道，为了降低纤维 素酶的复杂性，将t r e e s e i 的c b h1 、嗜酸耐热 箝a c i d o t h e r m u sc e l l u l o l y t i c u s 的葡聚糖 内切酶e g i 以及黑曲霉a n i g e r 的f j 葡萄糖苷酶以9 0 ：9 ：l ( 质量比) 混合形成一个三元 复合物，此三元复合物在1 2 0h 内水解预处理过的纤维素的能力与t r e e s e i 中纤维素酶 体的水解能力相当。为了提高此三元复合物水解纤维素的活力，利用定点突变的方 法对葡聚糖内切酶e g i 的活性位点进行修饰，结果与突变前的三元复合物相比，其 水解纤维素的活性提高了1 2 ( h i m m e le ta 1 ，1 9 9 9 ) 。o l s e 等为了更为有效的降解大 麦葡聚糖，将来自于e r w i n i ac a r o t o r o r a 葡聚糖酶的催化结构域与芽孢杆菌h ( a 1 2 m ) 6y 1 3 的热稳定的葡聚糖酶融合在一起，在毕赤酵母中得到了表达。经检测，融合 的重组酶对c m c 和大麦葡聚糖，都具有更高的底物亲和力。( o l s ee ta 1 ，1 9 9 1 ) ，海 栖热袍菌( t h e r m o t o g am a r i t i m a ) 内切葡聚糖酶c e l l 2 b 是极耐热胞外酶，氨基酸序 列分析表明不含有纤维素结合结构域( c b d ) ，对结晶纤维素无活性，但同样菌种来 源的木聚糖酶x y n a 有催化结构域和纤维素结合结构城。用t m a r i t i m a 的x y n a 的 连接区和c b d 区域融合至l j c e l l 2 b 的c 端，构建了融合基因，构建重组质粒p e t 2 2 0 b c e l l 2 b c b d ，经诱导表达后，对结晶纤维素有活性( 李相前和邵蔚蓝，2 0 0 6 ) 。 5 黑曲霉内切8 1 , 4 葡聚糖酶幕闲的克隆，优化及存毕赤酵母中的表达研究 1 3 4 应用 在啤酒工业中，国外一些国家已经采用d 一葡聚糖酶作为主要酶制剂之一。过量 的b 葡聚糖是造成啤酒不稳定的重要原因，引起啤酒雾状浑浊和凝胶沉淀。麦芽糖 化时加入p 1 ，4 葡聚糖酶可分解其中的b 葡聚糖凝胶，糖化麦芽汁，降低粘度，减 少啤酒中凝胶状沉淀物，提高啤酒制造中麦汁的滤速及得率，从而有利于改善啤酒 风味，提高啤酒质量。 在饲料方面，在以麦类为饲料原料的动物养殖中b 1 4 葡聚糖酶通过降解p 葡 聚糖，降低其亲水性和粘性，即降低肠道内容物的粘度，有效改善胃肠道环境及动 物对营养物质的吸收效率，提高饲料利用率，去除抗营养因子的作用。b 1 ，4 葡聚糖 酶可以与细菌细胞壁上的受体结合，从而阻止细菌与动物肠黏膜上的糖基结合，保 护肠黏膜的结构和功能的完整性，具有抑制有害微生物和维护动物肠道微生态平衡 的作用，并减少传统抗生素的使用量。 1 4 毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 表达系统 早在二十世纪七十年代，k o i c h io g a t a 等描述了能够利用甲醇作为唯一碳源的酵 母菌种pp a s t o r i s 。随后，p h i l l i p sp e t r o l e u mc o m p a n y 研究了一系列针对pp a s t o r i s 进行高密度连续培养的操作方案，并于将p p a s t o r i s 研究开发成为表达外源蛋白的表 达系统，并于1 9 9 3 年将其出售给r e s e a r c hc o r p o r a t i o nt e c h n o l o g i e s ( c e r e g h i n oa n d c r e g g ，2 0 0 0 ) 。ep a s t o r i s 的商品化使其迅速发展成为一种普遍使用的高效表达外源 蛋白的真核表达系统。目前美国f d a 已经评价了来自该系统的某些基因工程产品并 且获得了批准，认为该系统是安全的。该系统与其他系统比，具有以下优点： 1 表达产量高：该表达系统利用乙醇氧化酶启动子a o x l ，受甲醇严格诱导调 控，在其诱导下，有力驱动目标蛋白的分泌。即使分泌的外源蛋白对细胞本身有毒 害作用，也可以获得较高的产量。到目前为止，已经成功地表达了包括h b s a g ，t n f ， e g f ，破伤风毒素c 片段，基因工程抗体等多种外源蛋白。 2 分泌效率高：外源蛋白既可以在胞内又可以在胞外进行表达，由于特有的信 号肽如酿酒酵母a f a c t o r ，p p a s t o r i s 的p h 0 1 信号肽，或目的蛋白本身天然信号肽 的作用，外源蛋白可以有效地高通量地分泌到培养基中。 3 稳定性好：ep a s t o r i s 本身没有质粒，插入了外源蛋白的表达载体是整合到酵 母染色体上，随染色体一起复制、遗传，因此构建的重组菌株十分稳定，不易丢失， 并且允许表达组建串联重复。 4 具有翻译后修饰功能：有一些来自真核生物的蛋白在细菌中表达后只能成为 包涵体，或者是要求进行翻译后修饰，否则没有活性。在ep a s t o r i s 表达体系中， 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 能够对所分泌的蛋白进行折叠，( n 一，0 一) 糖基化修饰及信号肽加工等，从而使所 分泌的蛋白具有了生物学活性。 5 糖基化程度低：p p a s t o r i s 产生的糖蛋白糖链只是s c e r e v i s i a e 糖蛋白的2 0 。并 且其糖基化形式更接近于哺乳动物，一般只有8 1 4 个n 结合的甘露糖，可适于医用 用途。 6 可实现高密度发酵：可以满足工业生产的需要。 1 4 1 表达载体 毕赤酵母表达系统中所有的表达载体都是穿梭载体，通用的整合载体含有： a o x l 启动子，有一个外源基因表达框、多克隆位点( m c s ) 和一个从a o x l 基因 上拷贝下来的终止序列( ，兀) ，作为筛选标记的h i s 4 基因，在细菌中进行复制起始 点o r i 序列，选择标记a m p 基因以及a o x l 的3 的非编码区序列，使外源基因能以 同源重组的方式整合到染色体的a o x l 部位( 王清路等，2 0 0 6 ) 。 表达载体分为表内表达和胞外表达两类。表内表达载体：p p i c 3 ，p p i c 3 k ， p p i c 3 5 k ，p h i l d 2 ，p p i c z a ，p p i c z a b ，p p i c z a c ；表外表达载体：p p i c 9 ，p p i c 9 k ， pa c 0 8 1 5 ，p p i c z x z a ，p p i c z a b ，p p i c z a c ，p h i l s 2 等。对于载体的改进包括建 立可在插入多个目的基因拷贝的载体，如p a 0 8 1 5 系列和p p i c 9 k 系列，依靠g 4 1 8 抗性筛选。另一类可进行多拷贝表达的载体如p p t c z a ，不需要营养缺陷筛选、不 需要氨苄西林抗性筛选，且载体小，易操作。但是筛选标记为零霉素( z e o c i n ) ，它 是很强的诱变剂，可使外源蛋白突变。 1 4 2 宿主菌株 大多毕赤酵母表达宿主菌是通过野生型石油酵母y 1 1 4 3 0 进行突变改造而来的， 宿主菌在组氨酸脱氢酶基因h i s 4 处有一突变，用于转化后筛选重组菌株( g e l l i s s e n ， 2 0 0 0 ) 。此外为增加分泌蛋白稳定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷 型菌株，s m d1 1 6 8 ( h i s 4 ，p e p 4 ) ，s m d l1 6 5 ( h i s 4 ，p r b d ，s m d l l 6 3 ( h i s 4 ，p e p 4 ，p 而j ) 。 p e p 4 和p r b l 分别表示编码蛋白酶a 和蛋白酶b 的基因有缺陷。 1 4 3 优化表达的策略 1 4 3 1 启动子 目前最常用的是a o x l 启动子，虽然其启动效率高而使得许多外源蛋白得以大 量表达，但也存在不容忽视的缺点。例如需利用甲醇作为诱导剂，不适合用于食品 7 黑曲霉内切b 1 4 葡聚糖酶基凶的克隆，优化及拒毕赤酵母中的表达研究 生产等，另外在大规模的发酵过程中也有火灾隐患。因此，近年来一些非甲醇诱导 的启动子，如g a p ，f l d i ，i c l l 等在一些基因的表达中逐渐得到应用。其中g a p ( 3 一磷酸甘油醛脱氢酶) 启动子在以葡萄糖为碳源时，蛋白的表达水平与a o x l 表达 水平相当，且在发酵的过程中不用更换碳源，有望成a o x l 启动子的一个最有潜力 的替代物。据文献报道，使用g a p 启动子分泌人重组粒细胞巨细胞刺激因子( h o m c s f ) ，目的蛋白表达量为9 0m g ，l ( w ue ta 1 ，2 0 0 3 ) ，而使用g a p a o x l 组合启动子 时，产量提高了一倍，达到了1 8 0m g l 。使用i c l l 启动子表达葡萄糖聚酶时发现， 在培养基中含低浓度葡萄糖或者使用乙醇诱导都可以获得高产量。f l d l ( 依赖于谷 胱甘肽的甲醛脱氢酶基因) 启动子则具有于a o x l 启动子相同或更高的强度，能在 甲醇为唯一碳源或以甲胺为唯一氮源( 葡萄糖、甘油等为碳源) 情况下表达，用不 易挥发的甲胺代替甲醇为诱导剂扩大了毕赤酵母的应用范围( o r i o lc o se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 而另一方面，在a o x l ，g a p ，f l d l 这些强启动子的驱动下，某些外源蛋白的表 达水平过高，超过了宿主细胞翻译后处理加工能力所能承担的最大负荷，引起了蛋 白的错误折叠、不加工或错误定位，此时需要选择较温和的启动子，如p e x 8 ( 一种 过氧化物酶体基质蛋白启动子) 和y p t l ( 一种g t p 酶启动子) ，以获得具有生物活 性的目的蛋白( b r i e r l e y ，1 9 9 8 ) 。 1 4 3 2mi 斟a 5 和3 非翻译区u r r m r n a 5 非翻译区u t r 对蛋白表达的影响主要表现在m r n a 的翻译水平上。 a o x l 的m r n a 的5 u t r 长1 1 4 n t ，富含a + u 。目的蛋白m r n a 应尽可能具有与 a o x l 的m r n a 相近最好是相同的5 u t r 。一般地，目的基因编码序列的第一个a t g 应尽可能接近，最好处于a o x la t g 的位置，此位置对应于大多数载体多克隆位点 的第一个限制酶切点处。s r e e l a k r i s h n a 等通过调整人血清白蛋白m r n a 与a o x l m r n a 的5 u t r 相同后表达水平提高5 0 倍以上( k o t i s r e e k r i s h n a ，1 9 9 7 ) 。 1 4 3 3 信号肽 每一个需要运输的多肽都含有一段氨基酸序列信号肽序列，引导多肽至不 同的转运系统。信号肽序列通常在被转运多肽链的n 端，这些序列在1 0 - 4 0 个氨基 酸残基范围，氨基酸端至少含有一个带正电荷的氨基酸，在中部有一段长度为1 旺1 5 个氨基酸残基的由高度疏水性的氨基酸组成的肽链，常见的为丙氨酸，亮氨酸，异 亮氨酸和苯丙氨酸。信号肽没有严格的专一性，一般而言，外源信号肽序列可以引 导蛋白分泌，但效率较低。因此，在一定程度上，需要依赖酵母本身的分泌信号肽 来指导外源基因表达产物的分泌。 酿酒酵母a 交配因子( m f - a ) 信号肽在酵母表达外源蛋白质中广泛使用，k j e l d s e n 等研究显示在m 阮中间插入毕赤酵母a o x l 蛋白质的n 端e e a e a e a e p k 共1 0 个 氨基酸的新信号肽序列可使胰岛素在毕赤酵母中的分泌效率提高了2 倍以上 ( k j e l d s e ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。c h u n g 等研究发现将酿酒酵母中的0 【因子信号肽替换为菊 8 华中农业大学2 0 0 8 屈硕士学位论文 粉酶信号肽之后，能够促进多种外源蛋白分泌到胞外，还可以提高分泌效率( c h u n g ， e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。k o z a k 详细研究过起始密码子a t g 周边碱基定点突变后对转录和翻译 所造成的影响，并总结出在真核生物中，其实密码子周边序列为a c c a t g g 时转录 和翻译的效率最高，特别是3 位的a 对翻译效率非常重要。韦宇拓、甘凤琼将来源 于克鲁维酵母的菊粉酶基因信号肽序列( i s p ) 连接到胞内表达载体p p i c 3 5k 上构 建分泌表达载体p h c 矾u ，表达实验结果表明，带有分泌表达载体的葡聚糖酶基因 重组菌，具有与带有表达载体p p i c 9 k 带有a 因子信号肽的葡聚糖酶基因重组菌相 同的分泌效率( 韦宇拓和甘凤琼，2 0 0 3 ) 。熊爱生、彭日荷等首先按毕赤酵母的偏爱 密码合成了酿酒酵母的a 因子信号肽序列m f 4 i 。随后在的m f 4 i 信号肽序列的n 端 分别引入k j e l d s e n 等提及的e e a e a e a e p k 中1 1 0 个氨基酸，构成1 0 种不同的分 泌信号肽序列，其中以n 端增加a ，i ，p 三个氨基酸的信号肽序列引起的提高最大； 和野生型的酿酒酵母a 因子信号肽序列相比，使植酸酶分泌表达量增加5 倍，此外 在m = 4 i 信号肽的引导序列和内切蛋白酶间增加了e e a e a