（细胞生物学专业论文）耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究.pdf

耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究 摘要高盐医药废水种类很多，并且成分复杂，某些废水含有许多难以降解的杂 环芳烃等有机物。目前研究表明杂环芳烃如喹啉及其衍生物具有致癌、致畸、致 突变性，对自然界生物安全和人类健康构成巨大威胁，因而杂环芳烃等有机物降 解菌的筛选一直是国内外微生物降解的一个重要方面。这些废水中不仅含高浓度 有机污染物，还含大量的盐分( 如n a + ，c 1 ，c a 2 + ，m g + 等离子) ，是废水处理 领域中的技术难题，常规的生物法很难有效地处理该类废水。为了解决难降解有 机废水中高盐含量对传统生物处理系统的抑制问题，本文以含有高浓度氯离子 ( 大于3 00 0 0 m g l ) 的医药废水( c o d 浓度大于1 00 0 0 m g l ) 为研究基质筛选出 既耐高盐又可以高效降解有机污染物的两株菌株，分别命名为f i b l 和h b 2 ，根 据菌株生理生化特性作初步鉴定。然后分别研究了两株菌的基础生物学特征及在 不同环境因素的条件下降解主要成分为杂环芳烃的医药废水的能力；最后为了进 一步提高c o d 去除率，紫外诱变处理耐盐菌h b 2 ，将突变菌株u v h b 2 1 、 u v h b 2 2 投加到制药废水中，同原出发菌株的投加作对比，考察紫外诱变对c o d 去除率的影响，并且筛选出c o d 去除率明显提高的优势突变菌。实验结果表明： ( 1 ) 分离到两株耐盐菌株，初步鉴定分别为盐杆菌属和节杆菌属，在含有 0 5 1 0 n a c l 的液体基本培养基中生长良好，菌株h b l 最适生长温度为 2 0 3 0 ；菌株h b 2 最适生长温度为3 5 _ 4 0 ；两菌株最适p h 值都在7 5 ； ( 2 ) 菌株降解医药废水c o d 的实验表明，废水初始c o d 、p h 值、温度、接种量 以及处理时间均对其降解能力有较大的影响。c o d 初始浓度为1 18 8 0 m g l ，接 种量为6 m l ，p h 为7 5 ，盐浓度为5 ，温度为3 5 ，培养时间为4 天的条件下， h b 2 的c o d 去除率最高可达到3 9 9 ；c o d 初始浓度为1 18 8 0 m g l ，接种量为 6 m l ，p h 为7 5 ，盐浓度为5 ，温度为3 0 ，培养时间为4 天的条件下，h b l 的c o d 去除率最高可达到3 4 7 。( 3 ) 经过紫外诱变处理筛选出一株优势突变菌 i h b 2 1 ，处理医药废水的效果有明显提高，降解率可达6 8 2 ，而且遗传性稳 定，同时仍具有耐盐性能。 关键词耐盐菌，杂环芳烃，c o d 去除率，紫外诱变 耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究 a b s tr a c tt h e r ei sm a n yk i n d so fm e d i c a lw a s t e w a t e rw i t hc o m p l i c a t e do r g a n i c c o m p o s i t i o ns u c ha sh e t e r o c y c l i ca r o m a t i cw h i c hi sd i f f i c u l tt ob ed e g r a d e d a t p r e s e n ts t u d i e s s h o wt h a th e t e r o c y c l i ca r o m a t i ca n di t sd e r i v a t i v em a yb e c a r c i n o g e n i c i t y , t e r a t o g e n i c i t ya n dm u t a g e n i c i t y , w h i c hi sd a n g e r o u st on a t u r ea n d h u m a n s oi ti si m p o r t a n tt os c r e e nh e t e r o c y c l i ca r o m a t i c d e g r a d e dm i c r o b i o l o g y b e c a u s et h e r ei sa l s oh i g hs a l i n i t y ( i o n ss u c h 嬲n d ，c l 。，c a 2 + m + ) ，i ti sd i f f i c u l tt o b et r e a t e db yc o n v e n t i o n a lb i o c h e m i c a lp r o c e s s e s t os o l v et h ep r o b l e mo fi n h i b i t o r y e f f e c to fh i g hs a l i n i t yo nt r a d i t i o n a lb i o l o g i c a lw a s t e w a t e rt r e a t m e n ts y s t e m , t h e o b j e c t i v eo ft h i sp a p e rw a st os c r e e na n du s eh a l o p h y t i cs t r a i n st o t r e a tm e d i c a l w a s t e w a t e r f i r s t l y , s a l t - t o l e r a n ts t r a i n sw i t hh i g hb i o d e g r a d a t i o nc a p a b i l i t yw e r e s c r e e n e da n di d e n t i f i e dp r i m a r i l y s e c o n d l y , r n o r p h o l o g y , b i o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n d r e m o v a le f f i c i e n c i e so fm e d i c a lw a s t e w a t e rw i t hh e t e r o c y c l i ca r o m a t i cb ys t r a i n si n d i f f e r e n tc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d o n eo fs a l t t o l e r a n ts t r a i n sk n o w na sh b 2w a s t r e a t e db yu s i n gt h em e t h o do fu vr a d i a t i o ni no r d e rt oi m p r o v er e m o v a le f f i c i e n c i e s 曩1 cm a i nr e s u l t sa r e 舔f o l l o w s ：( 1 ) t w on o v e ln a c i - t o l e r a n tb a c t e r i a l s t r a i n s ( h b1a n dr m 2 ) i s o l a t e da n di d e n t i f i e dp r i m a r i l y 邪h a l o b a c t e r i u ms a l i n a r i u m a n da r t h r o b a c t e rc o r ma n dd i m m i c k r e s u l t ss h o w e dt h a tb a c t e r i a ls t r a i nh b1a n d h b 2c o u l dg r o wi nt h em e d i ac o n t a i n e d0 5 5 n a c l ；a n dt h e yg r e ww e l li nt h e m e d i aw i t hp h7 5 ，t h eb e s tt e m p e r a t u r ei s 2 0 c 一3 0 。c f o rh b la n di s3 5 c 4 0 。c f o r h b 2 ；( 2 ) s t u d i e so nc o do fm e d i c a lw a s t e w a t e rr e m o v a le f f i c i e n c i e so ft w os t r a i n s s h o wt h a ts o m ef a c t o r sh a v ei n f l u e n c ei nr e m o v a le f f i c i e n c i e s ：w i t hp r i m a r y c o n c e n t r a t i o nl18 8 0 m e g l ，s a l tc o n c e n t r a t i o n5 a n di n o c u l a t i o n6 m l ，c o dr e m o v a l e f f i c i e n c yw a sh i g hu pt oa b o u t3 9 9 w h e nd e g r a d a t i o nt i m e , p h t e m p e r a t u r ew e r e 她7 5 。3 5 f o rh b 2 ；w h i l et h ec o dr e m o v a le f f i c i e n c yw a sa b o u t3 4 7 w h e n d e g r a d a t i o nt i m e , p h ，t e m p e r a t u r ew e r e4 d ，7 5 ，3 0 * c f o rh b l ( 3 ) h b 2w a sm u t a t e d 丽mu l t r a v i o l e n tr a d i a t i o n ( u v ) w eg o tam u t a n tu vh b 2 一lc o dw h o s er e m o v a l e f f i c i e n c y w a si n c r e a s e d o b v i o u s l yu p t oa b o u t6 8 2 ，w h i c hm a i n t a i n e d s a l t - t o l e r a n c ea n dg e n e t i cs t a b i l i t y k e yw o r d s ：s a l t t o l e r a n c em i c r o b i o l o g y ；h e t e r o c y c l i ca r o m a t i c ；c o dr e m o v a l e f f i c i e n c y ；u vm u t a g e n e s i s 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特 别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其 他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示 谢意。 学位论文作者签名：鱼，童莛 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：圣墨拉指导教师签名：学位论文作者签名：皇兰塑型指导教师签名： 签名日期： z e 争罗 耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究 1 绪论 第一章前言 1 1 研究背景 自然环境中，存在着各种各样的微生物及其基因资源，并且许多环境的微生物 资源有待调查和开发。据报道【i 】地球上已经开发利用的微生物不到微生物总数的1 。 所以目前微生物已发展成为生命科学的前沿学科。生物进化的研究已成为生命科学 的中心问题，尤其是特殊环境下的微生物( 嗜冷微生物，嗜热微生物，嗜压微生物， 嗜盐微生物，嗜酸微生物，嗜碱微生物以及抗高辐射、抗干燥、抗低营养物浓度和 抗高浓度金属离子的微生物) 。它们能生活在其他生物无法生存的环境中，它们的化 学组成和生理功能也明显不同于一般细菌和真核微生物。极端环境微生物的研究已 成为目前国际上微生物研究的一个重要领域。由于嗜盐微生物长期生长在特殊环境 下，具有特殊的细胞结构、生理机能和遗传基因，其生物活性物质也具有独特的性 质，是一类重要的极端微生物资源，同时也是研究生物多样性的重要材料，因此这 些特殊环境生存的微生物己成为国际上微生物研究热点。 高盐医药废水种类很多，这些废水中既含大量的盐分( o r ，c a z + ，n a 十等离子) ，又 含高浓度有机污染物【1 - 6 1 ，是废水处理领域中的技术难题。目前，含盐有机废水主要 采用两种处理方式：非生物法( 物理、化学) 和生物法。由于此类废水的溶解性有机 物含量高，一般物理、化学方法难以处理并且处理成本高，而生物处理法具有经济、 高效、无害的特点，仍然是首选的处理方法。针对本文的中间体医药废水来讲，废 水中含有稠环芳烃等生物难降解有机物质及大量的氯离子，其混合废水的c o d 值 在1 00 0 0 m g l 以上，氯离子浓度可达3 00 0 0 m g l 以上，p h 值在7 5 8 5 左右。虽 然无机盐类在微生物生长过程中起着促进酶反应，维持膜平衡和调节渗透压的重要 作用。但盐浓度过高，会对微生物的生长产生抑制作用，因而，在含高盐废水的生 化处理中，传统的生物处理法受到了极大的限制【_ 7 - 9 1 。如何去除含高盐废水中的 c o d ，是含盐废水生物处理中急待解决的问题。要解决这个难题，首先要得到既耐 盐又高效降解废水c o d 的微生物。 1 2 研究目的和意义 本文研究的高盐医药废水成分复杂，含有许多难以降解的杂环芳烃等有机物。 目前研究表明杂环芳烃如喹啉及其衍生物具有致癌、致畸、致突变性，对自然界生 物安全和人类健康构成巨大威胁【1 0 - 1 2 ，因而杂环芳烃等有机物降解菌的筛选一直是 国内外微生物降解的一个重要方面。为了解决难降解医药废水中高盐含量对传统生 耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究 物处理系统的抑制的问题，采用耐盐菌处理含盐有机废水具有重要的理论和实践意 义。 ( 1 ) 开展嗜盐微生物的研究对于推动生命科学研究，加快我国微生物产业的发展及微 生物资源的开发利用具有重要的现实意义；同时也可丰富生物多样性研究的内容， 并为生命演化研究提供重要的基础资料。 ( 2 ) 分离筛选出耐盐、降解有机污染物的高效菌株，研究其降解性能、生物特性和耐 盐机理。为构建耐盐工程降解菌提供菌源，为生产工艺参数的确定和生产工艺的调 整提供生物学依据。 ( 3 ) 将紫外诱变后的耐盐菌投加到医药废水中，同出发耐盐菌株投加相比，研究诱变 后菌株处理含高盐度、难降解有机物废水的效果。因为紫外诱变方法操作简单，所 以为诱变后的耐盐菌经济、高效地处理高盐机废水提供有利经验。 ( 4 ) 本研究的理论和方法可以指导和应用到其它含高盐难降解有机污染物废水的领 域，为生物法处理该类废水提供理论依据，为废水处理工程开辟新的方法与思路。 同时可推动环境工程学、微生物学等学科的发展。 1 3 耐盐微生物的研究进展 1 3 1 耐盐微生物的种类及特性 刘铁汉和周培瑾把在高盐环境中的生长的微生物分为3 类【l3 】： ( 1 ) 能耐受一定浓度的盐溶液，但在无盐条件下生长较好的菌称为耐盐菌。 ( 2 ) 生长需要一定浓度的盐，且在一定浓度的盐溶液中生长最好，称为嗜盐菌。 ( 3 ) 在盐度从0 到饱和溶液中均能生长，但在一定浓度的盐溶液中生长最好的特殊类 群称为多能盐生菌。 嗜盐菌在种属上可分为嗜盐杆菌属，嗜盐球菌属，嗜盐碱杆菌属，小盒球菌属 等1 1 4 0 6 】，按最适宜生长所需的盐量，分为中度嗜盐菌和极端嗜盐菌。中度嗜盐菌指 在含盐浓度为3 1 5 的环境中能良好生长的微生物，主要是真菌群落。极端嗜盐 菌是指在含盐浓度为1 5 一3 0 的介质中也能良好生长的微生物，最适宜生长浓度为 2 0 2 5 ，甚至在饱和浓度中也能生长。 其中部分极端嗜盐菌为嗜盐古菌，嗜盐菌多是好气化能异养类型，一些盐杆菌 的某些种可进行厌氧呼吸，只有少数种靠丛生鞭毛缓慢运动，采用二分分裂法进行 繁殖，无休眠状态，不产生孢子，嗜盐菌种类繁多，它们的分类主要依据三个方面 表型特征，化学分类数据和分子生物学数据。根据表型特征的不同，有嗜盐球菌和 嗜盐杆菌。根据序列分析并结合其它生物学形状有盐杆菌属，盐深红菌属，富盐菌 属，盐盒菌属，盐球菌属，嗜盐碱杆菌属，嗜盐碱球菌属等菌属【幡1 。7 1 ，表1 - 1 列出 了部分耐盐菌和嗜盐菌及其特性【1 8 】。 2 耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究 表1 - 1 部分耐盐菌和嗜盐菌的特性 t a b l e l - 1 c h a r a t e r i s t i c so fs o m es a l t - t o l e r a t eb a c t e r i a la n dh a l o p h i l i cb a c t e r i a l 1 3 2 微生物耐盐机理的研究进展 总的来说，对微生物的盐适应机理，e l 前有如下几种观点【1 9 】。 ( 1 ) 嗜盐菌的细胞结构稳定和细胞内k + 等离子浓度的维持，需要高盐浓度。 在嗜盐菌，特别是极端嗜盐菌的细胞内具有相当高的离子浓度，且细胞壁成份 耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究 特殊，不含肤聚糖而以脂蛋白为主。这种细胞壁结构的完整由离子键维持，高n a + 浓度对于其细胞壁蛋白质亚单位之间的结合，保持细胞结构的完整性是必需的。当 环境中的n a + 浓度较低时，一方面细胞壁蛋白解聚为蛋白质单体，使胞壁失去完整； 另一方面细胞内外离子浓度平衡打破，细胞吸水膨胀，最终引起胞壁破裂，菌体完 全自溶。如红皮盐杆菌( h a l o b a c t e r i u mc u t i r u b r u m ) 的生活环境中，n a + 和k + 浓度 分别为3 3 m o l l 和0 0 5 m o l l ，而细胞内n a + 和k + 浓度分别为0 8 m o l l 和5 3 3 m o l l 。 它能在饱和盐水( 5 2 m o l l ) 中生长；在盐度小于2 1 m o l l 的环境中不生长；当盐度低 于1 6 m o l l 时，细胞壁开始破裂。 由h c u t i r u b r u m 还可看出，尽管环境中n a + 占优势，但细胞内部n a + 浓度比k + 浓度小得多。这说明嗜盐菌对环境中离子有选择作用，具有浓缩k + 和排斥n a + 的能 力，使细胞内c 浓度维持较高水平。我们知道多数微生物体内酶被高浓度的k + 所 抑制。但极端嗜盐菌正好相反，它不仅主要靠积累k + 来调节细胞内渗透压，而且其 核糖体、蛋白质及酶只有在k 十等离子浓度高时才能维持正常的结构与功能。这就限 制此类菌只能在高盐环境中生存。嗜盐菌这种生长需要高盐浓度的生理特性是在漫 长的进化过程中，通过自然选择，使细胞结构与功能高度适应于高盐环境的结果。 它与既可在高盐环境中生长又可在低盐环境中生长的耐盐菌有着遗传本质的不同。 以上可见，高盐浓度既稳定了嗜盐菌的细胞结构，又满足了细胞生长对高浓度k + 的需要。 ( 2 ) 嗜盐菌酶的产生、稳定和活性发挥需要高盐浓度 生物体内酶的产生、稳定和活性发挥都需要一定的理化条件。嗜盐菌的酶是嗜 盐性的。它的产生、稳定和发挥活性需要高盐浓度条件。如自内蒙古碱湖分离到的 极端嗜盐碱杆菌( n a t r a o n o b a c t e r i u ms p ) c 2 1 2 菌株的胞外淀粉酶产生受n a c i 浓度 影响。当n a c l 低于1 7 m o l l 时，几乎不产酶，菌体生长受抑制；在n a c i 为2 6 5 2 m o l l 时，产生相当量的酶，菌体生长良好。 表1 2 嗜盐菌一些酶发挥活性的适宜盐浓度1 2 0 1 t a b l e l - 2t h ea p p r o p r i a t es a l tc o n c e n t r a t i o nf o re n z y m ea c t i v i t yo fs o m eh a l o p h i l i cb a c t e r i a 酶的稳定性亦受n a c l 浓度的影响。如上述淀粉酶当n a c l 为1 0 m o l l 时，不稳 4 耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究 定，5 0 保温2 0 r a i n 完全失活，当n a c l 为4 0 m o l l 时，5 5 。c 稳定，7 0 失活。实 验表明，随着n a c i 浓度的增加，酶的热稳定性提高。表1 2 为中度嗜盐真细菌和极 端嗜盐古细菌某种酶发挥活性的适宜盐浓度，此表说明，嗜盐菌的酶要求在一定的 高盐浓度下发挥其正常活性。 ( 3 ) 渗透调节 在盐胁迫下，由于外界渗透势较低，细胞会发生水分亏缺现象，即渗透胁迫。 为免这种伤害，在胁迫情况下必须产生一种适应机制【2 1 - 2 2 ，即在高盐条件或盐胁迫 下，微生物细胞体内会主动积累一些物质( o s m p r o t e c t a n t ) 来抗衡外界高渗环境。目前， 国内外学者认为基本存在两种不同的渗透调节机制：细胞内会积累高浓度的盐， 其渗透压至于胞外盐的浓度，即“s a l t - i n s t r a t e g y ，在绝大多数的好氧嗜盐杆细菌幽j 和厌氧嗜盐菌【2 4 1 中，高盐度下，它们胞内的无机盐浓度往往和生长的培养基中的相 同，并且胞内的含量往往随生长的培养基中n a c l 盐浓度的变化而不同。另外，除 了嗜盐杆细菌外，厌氧菌和最近发现的s a l i n i b a c t e rm b r u m ，受到外界突然胁迫时主 要在胞内积累无机斟2 5 1 。细胞内能保持低浓度的盐，其渗透压由胞内的有机可溶 性物质来平衡，即“c o m p a t i b l e s o l u t e s t r a t e g y 。多数的耐盐菌更喜欢采用这种机制 来适应外界的渗透压【2 啦7 】这些可溶性物质主要包括多羟基化合物如甘油、可溶性糖、 氨基酸及其衍生物、季铵化合物、1 羟基3 甲基吡啶( e c t o i n e ) 等。大多数耐盐菌一般 是积累一些有机小分子如谷氨酸、脯氨酸及氨基酸衍生物，可溶性甘油和1 羟基3 甲基吡啶等作为调渗物质来平衡外界的高盐环境【2 泓l 。耐盐菌作为一类新型的、极 具应用前景的微生物资源，近年来受到人们的广泛关注，它们具有极为特殊的生理 结构和代谢机制，同时还产生了许多具有特殊性质的生物活性物质来抗盐，对它的 研究既具有理论意义，又有应用价值。 洪青等【3 5 】研究一株从活性污泥中分离的中度嗜盐菌h a l o m o n a s s p b y s 1 ，它能 在0 1 - 2 6 m 0 1 l n a c l 的基础培养基中生长。b y s 1 在不同n a + 条件下时，胞内的n a + 含量基本不发生变化，它主要通过积累k + 、谷氨酸和甜菜碱来调节胞内外的渗透压 平衡。顾立锋等从化工厂污泥中分离到一株酵母菌，初步鉴定为德氏酵母属 ( i k b a r y o m y c e s s p ) ，对其耐盐机理进行了初步研究，发现细胞内海藻糖含量随外界盐 浓度增加而增加，表明l k b a r y o m y c e s s p 在高盐条件下能以海藻糖作为渗透调节物质。 ( 4 ) 耐盐基因片段 八十年代以来，细菌耐盐机制的研究日益深入，以大肠杆菌和其它遗传背景较 清楚的肠道细菌为对象进行的工作，使细菌渗透调节机理推进到分子水平。已相继 分离和鉴定了与渗透保护物合成途径有关的结构基因，如p r o a b c 和b e t 基因，以 及转录表达受到渗透压调控的一些操纵子，如k d p 操纵子，p r o 和o p u 系统以及作 为全细胞调节因素的o m p r 系统【3 6 】，并且进行了有关耐盐基因的分离和转移研究1 3 。 j a v e d 等【3 8 】从巴基斯坦的盐碱地中生长的卡拉草根部分离得到一株克雷伯氏菌 5 耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究 ( k l e b s t e l l as p ) 发现其唯一的内源质粒( 约5 0 k b ) 与耐盐有关。h a s n a i n s 等从耐盐质粒 中挑选两个质粒(和研究，发现有编码复制区功能，且 可加到低拷贝数p s h l 载4 1 体8 s 上，p 在s h 大1 4 肠5 杆1 ) 菌中已克隆p 的s h 质1 粒4 5 1 i n c pp s h l 4 1 8 和p s h l 4 5 l 具 有耐盐特性，但表型是不稳定，质粒p s h 4 5 1 序列中有许多能编码耐盐的阅读框 ( o r f s ) ，其中o r f 4 和o r f 5 片段可以一起作用转录一个分子如促进耐渗透性的天门冬 氨酸。有关嗜盐菌遗传学方面的研究国外已有大量报道p 9 j ，但由于这类菌难以得到 合适的选择标记，突变株不稳定等特性，进展缓慢，目前在嗜盐菌中发现了质粒， 但这些质粒的分子量较大，拷贝数低，缺乏便于克隆外源d n a 的单一酶切位点， 而不能用作载体i 加】。 ( 5 ) 酵母菌耐盐机制 耐盐酵母菌已被应用于发酵行业，如酱油生产和单细胞蛋白质的生产【4 l 】。这些 酵母菌能在高盐、高糖环境中生长良好，有些酵母菌还能在饱和盐浓度下生长【4 2 1 。 与嗜盐菌不同，酵母菌通常不依靠盐生存。当它们受到盐水冲击时，细胞萎缩，一 旦它们长时间地适应后，细胞体积恢复1 4 3 j 。对数生长期细胞比稳定期细胞具有更强 的耐盐性】。这种耐盐性包括了很多复杂的反应和机理：( 1 ) 具有有效的离子输送泵， 及时排出细胞内n a + 等有毒物质：原生质膜中的n a + - a t p 酶活性不受盐影响，有利 于细胞内保持较低的稳定的n a + 浓剧4 5 1 。( 2 ) 具有保护性物质海藻糖。脱水的干细胞 内大部分的水被海藻糖取代，改变了细胞内水的结构和动力，降低了细胞膜和蛋白 质的环境温度，因此抑制了细胞的生物活性，保护细胞不会自我分解；并且海藻糖 有利于蛋白质的稳定，在水合细胞内，海藻糖稳定了周围水的结构。( 3 ) 具有有效快 速的新陈代谢途径合成多元醇，在高盐浓度下，耐高渗透压酵母菌产多元醇的代谢 途径改变。m a g d a 等以一株极端耐盐酵母菌( c a n d i d ah a l o p h i l ac b s4 0 1 9 ) 为对象，研 究了该菌株长时间在高盐度下( 4 - 5 m o l l n a c l ) 的生理特性：高盐度下生长速率减慢， 受盐度影响较小但受其外界初始p h 值影响较大，甘油是主要的调渗物质，细胞的 体积并随外界p h 和盐度的变化而变化，矿a t p a s e 的活性不受盐度影响1 4 6 , 4 7 。 1 4 微生物降解芳香烃有机废水的研究进展 芳香烃在有机化学工业里是最基本的原料，现代用的药物、炸药、染料，绝大 多数是由芳香烃合成的。芳香烃主要用于制药、染料等工业。燃料、塑料、橡胶及糖 精也用芳香烃为原料。因此，目前焦化废水、石油废水、医药废水等多种工业废水 中都含有难降解的芳香烃类有机物。其中杂环芳烃和多环芳烃都是最常见的污染物， 都具有“三致性”，对自然界生物安全和人类健康构成巨大威胁1 4 8 - 5 2 1 。 1 4 1 芳香烃 芳香烃简称“芳烃”，通常指分子中含有苯环结构的碳氢化合物，是闭链类的一 种。具有苯环基本结构，历史上早期发现的这类化合物多有芳香味道，所以称这些 6 耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究 烃类物质为芳香烃，后来发现的不具有芳香味道的烃类也都统一沿用这种叫法，例 如苯、萘等。苯的同系物的通式是c n h 2 n - 6 ( n 薹) 。 根据结构的不同可分为三类： 单环芳香烃，如苯的同系物；稠环芳香烃，如萘、葸、菲等；多环芳香烃， 如联苯、三苯甲烷。 多环芳烃( p a h s ) 是一类重要的全球性污染物，是美国环保局制定1 2 9 种优 先污染物中的一类，它广泛存在于人类生活的自然环境如大气、水体、土壤、作物 和食品中。多环芳烃是指一类含有两个或两个以上苯环，以线状、角状或簇状排列 的稠环型化合物，熔点和沸点较高，具有疏水性、蒸气压小，辛醇水分配系数高。 目前已知的多环芳烃约有2 0 0 多种，近年来的大量调查研究表明，空气、土壤、水 体及生物体等都受到了多环芳烃的污染。生物毒性实验表明多种具有致畸、致癌和 致突变性，因此受到人们的高度重视。人们长期处于多环芳烃污染的环境中，可引 起急性或慢性伤害。多环芳烃的毒性还表现在，它们能使一些生物的生长受到抑制， 以及光诱导毒性；使包括人类在内的动物界体内细胞的生长繁殖速度失控，基因突 变，畸形繁殖，引发肿瘤或癌变。p a h s 种类繁多，每一类在与细胞接触时，进攻 破坏的方式有所差异，所以多环芳烃引发的癌变是多种类型的，其中肺癌居多。多 环芳烃毒性的另一个表现是，光诱导毒性。p a h s 的光诱导毒性大小与化合物分子 结构、成链轨道与反键轨道能级差、化学稳定性等内部因素及辐射光波长、辐射强 度等外部因素有关。多环芳烃分子量越大，在土壤中的半衰期越长，影响土壤中p a h s 的降解速度的因素还有p a h s 的浓度、土壤结构、土壤是否种植作物等。环境中的 多环芳烃主要来源于人为生产生活活动过程，每年因人类生产生活活动向地球上各 种环境系统中释放的有成千上万吨，远远超过了环境的自净能力。如果再不采取措 施防治，其后果是严重的。因此多环芳烃的治理研究已引起国内外有关专家的高度 重视，是目前污染防治的重点和难点【5 3 1 。其中致癌性多环芳香的类别，按其化学结 构基本上可分成苯环和杂环两类。苯环类多环芳香烃如9 ，1 0 二甲基葸、1 ，2 ，9 ，1 0 一四 甲基菲等都有致癌性。 杂环芳香烃是多环芳香烃的环中碳原子被氮、氧、硫等原子取代而成的化合物 为杂环多环芳香烃。杂环类多芳香烃中有一些化合物具有一定的致癌性。含氮苯稠 杂环的致癌性是本世纪五十年代才开始研究的。这类化合物的致癌作用不像对多环 芳香烃化合物研究得那样深入、广泛，而且大多数缺乏对人致癌充分证据。这类化 合物广泛分布于自然界，不少是植物中的生物碱和其他生物物质，很多还是人工合 成的药物。因此，利用这些化合物时应加注意。其中含氮杂环化合物大都是有毒、 难降解有机物，它不易受代谢过程破坏的性质决定了含氮杂环化合物是属于污染面 广的一类难降解有机物。由于其毒性较大，含氮杂环化合物严重破坏环境并影响人 7 耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究 体健康。含氮杂环化合物其生物降解性能也很差，并且此类物质中许多具有致癌、 致畸、致突变的性质，对环境和人体健康会产生长期的、潜在的危害【5 4 】。国内外对 含氮杂环化合物的研究不足。目前，仅有的少数含氮杂环化合物的研究集中在焦化 废水。已有研究表明，含氮杂环化合物( p a n h s ) 、含硫杂环化合物( p a s h s ) 、含 氧杂环化合物( p a o h s ) 对生物降解多环芳烃化合物( p a h s ) 和单原子烃 ( m o n o a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s ) 类有明显的抑制作用。但是，在复杂土壤混合物中， 多环芳烃化合物和杂环芳烃化合( h e t c r o p a h s ) 在生物降解过程中的相互作用关系 不确定。除此以外，有报道称几种杂环芳烃化合物在降解过程中，即使在很低的浓 度下，也会产生毒害、致突变、致癌作用，尤其是含氮杂环化合物有强烈的致诱变 作用【5 5 】。 1 4 2 芳香烃有机废水降解研究的现状 微生物是生态系统中最重要的分解者，对多环芳烃具有较强的分解代谢能力和 较高的代谢速率。刘世亮等研究表明，微生物降解多环芳烃一般有两种方式：一种 是以多环芳烃为唯一碳源和能源；另一种是将多环芳烃与其他有机质进行共代谢。 沈德中研究表明微生物降解难易度取决于化学结构的复杂性和降解酶的适应程度。 另外，影响微生物降解的因素还有温度、盐度、p h 、通气状况、营养盐和p a h s 浓 度等5 筇7 】。 ( 1 ) 筛选分离高效优势菌种，进行p a h s 的降解 微生物降解是自然环境中去除的主要途径。研究表明，在被p a h s 污染的沉积 物中，微生物降解p a h s 的能力远高于未受污染的沉积物。许多细菌、真菌具有降 解多环芳烃的能力，在多环芳烃高效降解菌中，研究最充分的是白腐菌，曾经报道 了1 2 种具有降解蒽、苯并芘的白腐菌，但不同种的菌对各多环芳烃及其转化产物 的降解能力不同，有些仅仅只能将多环芳烃转化为中间产物，而有些则能将多环芳 烃矿化。 ( 2 ) 寻找对微生物代谢难降解物有促进作用的共代谢物质，利用共代谢技术进行多环 芳烃的降解。 现在一般把微生物的共代谢定义为：只有在初级能源物质存在时才能进行的有 机化合物的生物降解过程，并把提供碳源和能源的物质称为共代谢底物。目前利用 共代谢原理，在厌氧反应器中添加初级基质来处理含氯酚的废水。共代谢作为一种 代谢机制，不仅有助于我们更加准确地认识环境中存在共代谢情况下物质的生物降 解，而且为我们寻求难降解有机污染物的生物降解技术提供了新的思路。 ( 3 ) 组建遗传基因工程菌进行多环芳烃降解 基因工程菌以其高效、易于控制、低抑制性而受到青睐。基因工程菌构建，可 以通过质粒转移、质粒突变和降解基因克隆等多种途径实现。近几年来，该领域的 8 耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱交的研究 研究有了许多进展，可用于污染环境的治理修复。 ( 4 ) 投加外源降解菌强化生物降解作用，提高生物修复效率 研究表明通过补充碳源大大提高了啤酒废水污泥对氯酚的降解作用，投加外源 降解菌可以促进生物降解，达到生物强化的目的，降解菌对堆肥中多环芳烃具有降 解作用。 1 4 3 微生物降解杂环类芳烃 ( 1 ) 降解含氮杂环芳烃的研究进展 含氮杂环芳烃属于污染面广、毒性较大的一类难降解有机物，广泛存在于许多 工业污染物中( 如焦化、石油化工、农药、染料等) ，由于其难以生物降解，常常导 致常规的生物处理系统处理效果不够理想，对杂环化合物生物降解性能的研究是解 决这类污染问题的一个重要方向。 ( 2 ) 含氮杂环芳烃的好氧生物处理 杂环芳烃的好氧生物降解性能与其分子结构特点密切相关【5 8 1 。杂环芳烃中的单 环杂环芳烃，具有“缺电子结构的六元杂环吡啶的生物降解速率常数大大低于 具有“超电子结构”的五元杂环的吡咯、呋喃、噻吩。具有“缺电子结构 的 单环杂环化合物难于生物降解，而具有“超电子结构”的单环杂环化合物表现出 较好的生物降解性。这是因为，五元杂环化合物这类“超丌电子物质”中杂原子上 的未共用电子对参与环上共轭体系的形成，起到了推电子作用，超过了因杂原子强 电负性的吸电子作用，致使环上电子云密度加大，有利于氧从分子中获得电子，因 此，它们呈现较好的生物降解性能。对于与苯环稠合形成的双环或三环杂环化合物， 其生物降解性能较原物质减弱，这主要是因为环上的电荷密度下降、空间体积位阻 效应增大以及疏水性增强三方面因素综合作用的结果。咔唑、吩噻嗪的生物降解性 能与联苯相似，喹啉的生物降解性能较吡啶的生物降解性能差，这主要是由它们结 构特征决定的1 5 9 】。目前这些含氮杂环化合物难于生物降解的特性是致使实际工业废 水( 焦化废水，制药废水等) 出水c o d 难以达标的一个主要原因。因此，有些研 究者对含氮杂环化合物的好氧降解进行了深入研究。宋秀兰等1 6 0 】研究了固定化胶质 红环菌在好氧条件下对吲哚的降解，其在好氧条件下可以利用吲哚作为唯一碳源和 氮源，对吲哚的去除率最高可达9 7 0 。国内外学者己筛选到一些降解喹啉的菌种， 并进行了喹啉生物降解的动力学和途径研究。韩力平掣”】研究了固定化细胞技术用 b p i c k e t t i i s p 菌降解喹啉，其动力学符合零级反应，反应动力学常数随着初始喹啉 浓度的升高而升高。 ( 3 ) 含氮杂环芳烃的厌氧生物处理 近年来有关研究表明，经过厌氧处理可以改变难降解有机物的化学结构和生物 降解性能，使其可生化性提高【6 1 1 。张晓健【6 2 】等以焦化废水中具有代表性的难降解杂 9 耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究 环化合物( 吡啶，吲哚，喹啉) 为研究对象，采用厌氧处理得出以下结论：吡啶、 吲哚、喹啉在厌氧条件下可以降解，其降解速度的快慢顺序为：喹啉、吡啶、吲哚； 李咏梅 6 3 1 研究中以五种杂环有机物( 吡啶、吲哚、喹啉、异喹啉、2 甲基喹啉) 作 为单一基质进行厌氧研究，得出以下结论：在厌氧条件下，它们的降解程度从易到 难依次为：吲哚 异喹啉喹啉 吡啶 2 甲基喹啉。从以上两人的研究可以发现，得 出的结论并不相同。这可能主要是因为两者的实验条件并不完全相同，而且也说明 了杂环的厌氧降解的研究并不是完全透彻，需要迸一步进行研究。 ( 4 ) 含氮杂环芳烃的缺氧生物处理 含氮杂环芳烃在缺氧条件下有一定的去除效果，在实践中有所应用，但是研究 较少，理论不足。传统的活性污泥法对难降解有机物的去除率很低，难于达到排放 标准。近年来，有研究者畔】对焦化废水采用厌氧缺氧好氧( a 2 o ) 工艺进行了研 究，发现含氮杂环化合物在缺氧段得到了很大程度的去除，且明显高于厌氧段的去 除率。上海焦化厂酚、氰废水生物处理工艺的中试研究结果表明，其反硝化段不仅 具有生物脱氮的功能，且可使一些在传统好氧生物处理过程中不易被降解的有机物 ( 如毗啶、吲哚、喹啉等) 较好地得到降解【6 5 j 。这说明硝酸盐的加入有利于含氮杂 环有机物的去除，其去除机理完全不同于厌氧情况下的降解，也不同于好氧降解。 目前微生物降解含硫杂环芳烃和含氧杂环芳烃的报道很少见。张英掣6 6 j 从不同 污泥与堆煤土样中分离出七株菌株，均能专一地切断二苯并噻吩( d b t ) 中的c s 键，经过代谢最终生成2 羟基联苯( 2 h b p ) 。通过对七株菌株4 6 h 休止细胞和繁殖 期生长细胞脱硫活性的比较，筛选出具有较高脱硫活力的微杆菌( m i c r o b a c t e r i u m s p ) z d m 2 和棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) z d c 7 ，并在生长温度3 0 ，p h7 0 ，0 5 m m o l ld b t 作为唯一硫源，以甘油为碳源，用摇瓶培养法测定了它们的生长和脱 硫曲线。同时两菌都能脱除燃料油中的其他含硫杂环化合物：噻吩、苯并噻吩、二 苯硫醚和4 ，6 二甲基二苯并噻吩的硫，是有工业化应用前景的生物脱硫催化剂。 1 5 微生物降解高盐有机废水的研究进展 到目前为止，一些研究表明，在生物法处理过程中，耐盐菌的投加能改善盐分 对微生物活性的抑制作用，大大提高废水的有机物的去除效果。w o o d a r d 等人从大 盐湖的土壤中筛选的嗜盐菌在s b r 反应器中处理模拟含酚( 约l o o m g l ) 油田废水， 含盐量1 4 ，经过7 个月的连续运行，出水的酚浓度小于0 1 m g l ，c o d 浓度小于 1 0m p d l ，而处理含盐量1 5 的含酚( 约1 0 0m g l ) 废水，处理后出水酚含量低于5 m g l 6 7 , 6 8 1 。 k 呼和u y g u r 研究了采用多种生物法好氧处理含盐废水。发现耐盐菌 h a t o b a c t e r 投加到活性污泥中能取得最好的c o d 去除效果。即当废水含盐度为5 1 0 耐盐菌的分离筛选、生理特性和降解医药废水能力及其诱变的研究 时，c o d 的去除率大约为8 0 【6 9 】。另外，嘶，d i n c e r 和u y g u r 还研究了f e d b a t e h 法、生物转盘( r o a t i n g b i o i s c c a n t a c t r o ) r b c t m i t 处理含盐废水，他们还发现耐盐 菌的加入可以有效的缓解盐度对活性污泥的不利影响，并且还提高了c o d 的去除 率，尤其是在高盐度情况下效果更为明显【7 呻3 1 。 k a r g i 等人用合成的含盐质量分数为0 1 0 的废水在连续的生物转盘中试验，实 验过程中加入了嗜盐菌的加入和盐浓度对系统性能的影响。结果表明，嗜盐菌的加 入增加了c o d 的去除效率，在生物转盘中，以嗜盐菌和活性污泥的混合污泥为菌 种研究了含盐废水生物降解的经验模型。试验结果表明，c o d 随进水c o d 和盐浓 度的增加而减少【74 。 p e y t o n 将五种不同的嗜盐菌放在含盐质量分数为1 0 ，以酚为培养基的介质中 培养。这五种菌都能将5 0m g l 的酚降解到小于2m g l 。其中一种菌能降解初始质 量浓度为3 2 0m g l 的酚溶液【，引。 魏呐等人筛选驯化了耐盐复合高效处理菌群对大港油田石油开采废水进行有机 物降解，