（细胞生物学专业论文）calceinam检测凋亡过程中线粒体膜通透性变化研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。近我所知，除文中已标明引用的内容外，本论文不包含任何其他人或集体已 经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明 确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：王佳 日期：2 0 0 6 年4 月5 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权数。 本论文属于 不保密口 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：王佳指导教师签名：余从年龚建平 日期：2 0 0 6 年4 月5 日t 3 期：2 0 0 6 年4 月5 日 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 c a l c e i n - a m 检测凋亡过程中线粒体膜通透性变化研究1 硕士研究生：王佳 导师：余从年教授 龚建平+ 教授 华中科技大学同济医学院细胞生物学教研室同济医院分子医学中心 第一部分 c a l e e i n - a m 检测细胞早期凋亡方法的确立 【中文摘要】 背景和目的： 众多研究均提示线粒体在控制细胞死亡中起重要作用，凋亡早期时线粒体膜 通透性即可发生变化。已有学者报道，与c a l c e i n - a m 共同孵育的细胞，其线粒体 基质能被c a l c e i n q 睁异性荧光染色，而胞质中的c a l c e i n 荧光可被c 0 2 + 猝灭。此种特 异性阳性染色要求线粒体内膜功能( 通透性) 完整，以便作为屏障将胞浆p 1 c 0 2 + 与线粒体基质内的c a l c e i n 隔开。本实验旨在利用此原理建立一种新的检测细胞早 期凋亡的方法并论证其可行性。 方法： 将人类急性t 淋巴细胞白血病细胞株( m o l t - 4 ) 与c a l c e i n - a m 及c o c l 2 共同孵育染 色，再经喜树碱( c p t ) 、紫外线( u v ) 诱导凋亡发生，用流式细胞仪检测凋亡诱 导后不同时间点c a l c e i n 荧光( f l l ) 的变化。 结果： ( 1 ) 不同凋亡诱导方式下，诱导后培养一定时间，c a l c e i n 荧光( f l l ) 低信 号区域均比相应对照增多；( 2 ) 同种诱导方式下，随着诱导后培养时间的延长， 1 基金项目；国家自然科学基金资助项目( n o 3 9 7 3 0 2 7 0 ) ：国家9 7 3 肿瘤计划资助项目( g 1 9 9 8 0 5 1 2 1 3 ) ；卫 生部临床重点学科( n o 2 0 0 1 2 5 3 7 ) 项目负责人 1 华中科技大擘同济医学1 免硕士学位论文 c a l e e i n 荧光( f l i ) 低信号区域逐渐增多；( 3 ) 同种诱导方式及诱导后培养时间 下，随着诱导因素强度的增加，c a l c e i n 荧光( f l l ) 低信号区域增多。 结论： 亡。 c a l c e i n - a m 可以作为一种敏感的活细胞染料，用于流式细胞术中检测早期凋 关键词：凋亡；线粒体；c a l c e i n - a m ；流式细胞术 2 竺主整苎兰璺查垦兰堕! 坠兰堡丝塞! 一 p a r ti e a r l ya p o p t o s i s d e t e c t i o nw i t hc a k e m - a mb yc y t o m e t r y 【a b s t r a c t 】 b a c k g r o u n da n do b j e c t i v e ： m a n yr e s e a r c h h a v ed e m o n s t r a t e dt h a tm i t o c h o n d r i aw e r ei m p o r t a n ti n c e l l a p o p t o s i sr e l a t i o n , a n di n n e rm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep e r m e a b i l i z a t i o nc o n s t i t u t o d a l le a r l ye v e n ti nt h ea p o p t o t i cc a s c a d e t h em i t o c h o n d r i a lm a t r i xc 觚b es p e c i f i c a l l y l a b e l e db yl o a d i n gc e l l sw i t hc a l c e i nf l u o r e s c e n c ew i t h 洲t ( c d b p o s i t i v es t a i n i n go f m i t o c h o n d r i o nt h u sr e q u i r e st h a tt h ei n n e rm i t o c h o n & i a lm e m b r a n ef u n c t i o n sa sa b a r r i e rs e p a r a t i n gc a l c e i n ( w i t h i nt h em a t r i x ) f i n o mc 0 2 + ( o u t s i d eo ft h em a t r i x ) t h e c u r r e n ts t u d yw a sd e s i g n e dt oe s t a b i l i s han e wm e t h o df o re a r l yd e t e c t i o no fa p o p t o s i s b yc y t o m e t r y m 匝t h 凹s ： t h em o l t - 4c e l ll i n el o a d e dw i t hc a l c d n - a ma n do d b a 城c 0 1w 哦t r e a t e dw i t h c a m p t o t h e c i n ( c p t ) o ru l t r a v i o l e t ( u v ) , t h e n 舡i a l y z c dt h ed i v e r s i f i c a t i o no fc a t c c m f l u o r e s c e n c eb yc y t o m e t r yi nc e r t a i nt i m ea f t e ra p o p t o s i si n d u c i n g r e s u l t s ： ( 1 ) t h eo v e r a l lc a l c e i nf l u o r e s c e n c ed e c r e a s e da i d e ra p o p t o s i si n d u c i n g , w h e t h e r i n d u c e dw i t hc a m p t o t h e c i n ( c p t ) o ru l t r a v i o l e t ( u v ) ；( 2 ) t h ec a l c e i nf l u o r e s c e n c e d e c r e a s e di nt i m e - d e p e n d e n tp a t t e r na f t e rc 贮r t a m m e t h o do f 印o p t o s i si n d u c i n g ；( 3 ) t h ec a l c e i nf l u o r e s c e n c ed e c r e a s e di nd o s e - d e p e n d e n tp a t t e r na f t e rc e r t a i n m e t h o do f a p o p t o s i si n d u c i n g ； c o n c l u s i o n ： c a l c e i n - a mi sak i n do fs e n s i t i v ev i t a ld 1 a k e ro fa p o p t o s i s ，a n di tc a nb eu s e dt o d e t e c te a r l ya p o p t o s i sb yc y t o m e t r y k e y w o r d s ：a p o p t o s i s ；m i t o c h o n d r i o n ；c a l c e i n - a m ；f l o wc y t o m e t r y 3 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 前言 凋亡早期时线粒体会发生一系列的变化，其中线粒体膜屏障功能的丧失是各 种类型细胞发生凋亡的共同的、不可逆性环节。因此，对这一现象的检测也可以 像“膜外翻”一样成为检测早期凋亡的方法 1 - 2 1 0c a l c e i n - a m 是一种脂溶性物质， 本身无荧光，可自由通过胞膜进入细胞质和细胞器中，包括线粒体基质内。进入 后c a l c e i n - a m 可被胞内酯酶水解产生水溶性的c a l c e i n ( 钙黄绿素) ，由于c a l c e i n 不能自由通过细胞膜和线粒体膜而被存留在胞质以及线粒体基质中。c a l c e i n 在 4 9 4 n m 激发光下可产生绿色荧光，而这种荧光在c 0 2 + 存在的情况下可被猝灭掉。 已知线粒体内膜是细胞内唯一不能被c 0 2 + 通过的膜性结构，所以，正常细胞加入 c a l c e i n - a m 和c o c l 2 后，有且只有线粒体内仍存在c a l c e i n 的绿色荧光，利用流式 细胞仪可检测到其信号。若已由c a l c e i n - a m 和c o c l 2 染色的细胞被诱导后发生凋 亡，则线粒体内膜通透性变大，c 0 2 + 进入线粒体内，猝灭掉c a l c e i n 的荧光，流式 细胞仪上所检测的荧光信号必然会有所变化 i - 2 1 0 因此，此种通过c a l c e i n 来检测 细胞线粒体内膜通透性改变的方法( 以下简称为m m p 法) 可用来检测细胞的早期 凋亡。 材料与方法 1 实验材料 1 1 细胞来源及细胞培养 t 淋巴细胞白血病细胞株m o l t - 4 细胞，购自武汉大学典型物保藏中心。将 m o l t - 4 细胞置入含1 0 d x 牛血清、1 0 0p g m l 链霉素以及2m m o l l 谷氨酰胺的 r p i v i i - 1 6 4 0 培养基中悬浮培养，标准培养条件为恒温3 7 、5 c 0 2 、湿度9 5 。 1 2 药物与试剂 1 ) 喜树碱( c a m p t o t h e c i n ，c p t ) 2 ) 碘化丙啶( p r o p i d i u mi o d i d e ，p i ) 3 ) 核糖核酸酶( r n a s e ) 4 竺整垄竺璺查苎兰堕璺主堂壁垒墨 4 ) 羟乙基哌嚷乙磺酸( 脚e s ) 5 ) 水合氯化钴( c o c h 6 h 2 0 ) 6 ) l 口m i - 1 6 4 0 培养基 以上均为s i g m a 公司所提供的产品。 7 ) c a l c e i n - a m 购自m o l o z u l a rp r o b e s 公司 8 ) 小牛血清购自g i b c o 公司 9 ) 1 甲醛( 不含甲醇) 溶液购自p o l y s c i c n c e 公司 10 ) 异硫氰酸荧光素凹e ) 标记的膜联蛋白v ( a a n e x i n - v ) 购自晶美公司。 1 3 仪器和器材 1 ) f a c s o r t 流式细胞仪为美国b d 公司产品 2 ) 台式高速离心机 3 ) 超净工作台 4 ) 恒温c 0 2 培养箱 5 ) 倒置显微镜 6 ) 细胞计数板 7 ) 恒温水浴箱 8 ) 低温冰箱 9 ) 超低温冰箱 1 0 ) 高温烤箱 1 1 ) 高压灭菌锅 1 2 ) 磁力振荡器 1 3 ) 精密电子天平 1 4 ) 超滤除菌器( 美国g e l m a n 公司) 1 5 ) 微量加样器 1 6 ) 酒精灯 1 7 ) 实验用玻璃器皿和消耗性材料 5 竺! 燮苎兰璺查垦兰堕堡主兰苎丝圭 2 实验方法 2 1 药品制备 喜树碱( c a m p t o t h e c i n ，c p t ) 溶于二甲基亚砜，配制成浓度为2 0 0p 咖l 的 储备液。将上述储备液用0 2 2n m 超滤除菌器过滤除菌后，储存于一2 0 冰箱备用。 2 2 常用试剂的配制 1 ) 8 0 乙醇溶液：用8 0m l 无水乙醇和2 0m l 双蒸水混合配成，置于一2 0 冰 箱保存，备用。 2 ) p b s 缓冲液：精确称取n a c i4 0g ，k c lo 1g ，n a 2 h p 0 4 。1 2 h 2 01 4 3 9g ， k i - - 2 p 0 4 0 1 2 9 溶于5 0 0m l 双蒸水中，置于室温下保存，备用。 3 ) b i n d i n gb u f f e r 缓冲液：精确称取n a c i4 0 9g ，c a c l 2o 1 3 8g ，h e p e s1 1 9g 溶于5 0 0 m l 双蒸水中，置于一4 冰箱保存，备用。 4 ) a p i 法专用p i 染液：精确称取p io 5m g ，d i g i t o n i n5m g ，r n a s e1m g ，p i p e s 3 4 6m g ，c a c h2 7 7n a g ，n a c l5 8n a g 溶于1 0m l 双蒸水中，置于一4 冰箱 保存，备用。 5 ) 1 不含甲醇的甲醛溶液：将1 6 无甲醇的甲醛溶液1 0m l 溶于1 5 0m l b i n d i n gb u f f e r 缓冲液中，置于- - 4 c 冰箱保存，备用。 6 ) m m p 法专用h a n k s 液：精确称取n a c lo 8 9 ，k c l0 0 4 9 ，c a c l 20 0 1 4 9 ， m g s 0 4 7 - 1 2 00 0 2 9 , n a z h p 0 4 h 2 00 0 0 6 9 , k h z p 0 40 0 0 6 9 , 葡萄糖o 1 舀 h e p e s0 0 2 3 8 9 溶于1 0 0 m l 双蒸水中，调节p h 值至7 3 。高压蒸汽灭菌后置 于一4 冰箱保存备用。 7 ) c o c l 2 溶液： 精确称取c o c l e 6 h 2 01 1 8 9 5 9 ，溶于5 m l 上述h a n k s 液中。 8 ) c a l c c i n - a m ：向l m g 装c a l e e i n - a m 中加入l m l 灭菌h a n k s 液即可。 2 3 凋亡诱导处理及分组 m o l t - 4 细胞分为三组：对照组、喜树碱( c p t ) 诱导组及紫外线( u v ) 诱导 组，其中c p t 作用浓度为0 2 m g l ，紫外线诱导组取照射4 0 秒和6 0 秒两种诱导 强度。采用a p i 法b 1 确立凋亡诱导成功后再行m m p 检测。 2 4 流式细胞仪检测 6 竺! ! 燮苎茎璺壹墨兰堕 翌主茎堡垒墨 2 4 1 a p i 双参数分析法 1 ) 收集新鲜细胞2m l ，在台式离心机上1 0 0 0r m i n 离心5 m i n 2 ) 弃上清，用预冷h ，下同) b i n d i n gb u f f e r 缓冲液洗涤一次，1 0 0 0r r a i n 离心5 m i n 3 ) 弃上清，将细胞用b i n d i n gb u f f e x 缓冲液重新悬浮，调节细胞浓度为l 1 0 6 m l 4 ) 取1 0 0p 1 细胞悬液，加入f i t c a n n e x i n - v5 肛l ，避光室温孵育3 0m i n 5 ) 以预冷的b i n d i n g b u f f e r 洗涤1 次 6 ) 1 0 0 0r m i n 离心5 m i n ，弃上清，加入1m l1 不含甲醇的甲醛( m e t h a n o l - f l e e f o r m a l d e h y d e ) 冰浴固定3 0m i l l 7 ) 以b i n d i n g b u f f c r 洗涤2 次 8 ) 1 0 0 0r m i n 离心5 m i n ，弃上清，加入o 5m i a p l 法专用p i 染液，室温下染 色lh 后，上机检测。 2 4 2m h 但法 1 ) 收集一定量对数生长期m o l t _ 4 细胞于无菌离心管中，等分为两份，台式离 心机上1 0 0 0r m i n 离心5 m i n 2 ) 弃培养基，加入等量h a n k s 液 3 ) 加入c a l c e i n - a m ( 终浓度为l u m ) ，c o c l 2 ( 终浓度i t e m ) ，轻轻吹打均匀 4 ) 置于3 7 温箱中孵育1 5 - 2 0 分钟 5 ) 取出细胞，1 0 0 0r m i n 离心5 m i n ，弃上清，加入等量正常1 6 4 0 培养基 6 ) 凋亡诱导后重入培养箱继续培养，注意避光 7 ) 凋亡诱导后不同时间点收获细胞，1 0 0 0r r a i n 离心5 m i n ，弃培养基 8 ) h a n k s 液洗涤一次，弃上清，将细胞浓度调至1 0 6 n i l ，取1 0 0 u l 细胞悬液 加入4 0 0 u l h a n k s 液后流式细胞仪检测 9 ) 应用f a c s o r t 流式细胞仪进行检测。激发光波长4 8 0 眦，每个样本获取 6 0 0 0 个细胞，用c e l l q u e s t 软件进行分析 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 结果 1 a p i 法检测结果 用f a c s o r t 流式细胞仪，以参数荧光1 高度( f l l - h ) 对数放大检测 f i t c - a n n e x i nv 荧光强度，以参数荧光2 面积( f l 2 - a ) 检测d n a 含量。结果如 图l 所示，可见两种诱导方式( c p t 和u v 诱导) 均能顺利引起细胞凋亡，可作 为研究模型。 氛3 l 锱哩c o a t r o l l el r r e o a t 譬o l 协c a , r 蔫鼍 魏奎磊 i d 珊瓣每 图la p i 法检测c p t 和u v 两种方式诱导的细胞凋亡情况 f i g u r e1 ：a p o p t o s i si nm o l t - 4c e l l si n d u c e db yc p t 衄d u vd e t e c t i n gb ya p i 注：图l a 为c p t 诱导凋亡细胞的相应对照，l b 为c p t 诱导细胞，l c 为u v 诱导凋亡细胞的 对照，l d 为u v 4 0 s 细胞 8 兰燮查兰塑童墨兰堕矍主兰竺坚 2 m m p 法检测结果 以参数荧光1 高度( f l l h ) 对数放大检测c a l c e i n 荧光强度，实验中可见以 下现象： ( 1 ) 无论是c p t 还是u v 诱导，诱导后培养一定时间检测，c a l e e i n 荧光 ( f l l - h ) 低信号区域均比对照增多。( 图2 ) 氛e m a t m ! 孙o r r i l 舞 2 cl 阿疆辛 图2 m 咿法检测c p t 和u v 两种方式诱导的细胞凋亡情况 f i g u r e2 ：a p o p t o s i si nm o l t - 4c e l l si n d u c e db yc p t a n du v d e t e c t i n gb ym m p 注：图2 a 为对照，2 b 为c p t 诱导细胞，2 c 为u v 诱导细胞 ( 2 ) 两种诱导方式下，c a l c e i n 荧光( f l l h ) 低信号区均随诱导后培养时间 延长而逐渐增多，至特定时间点时可出现“凋亡峰”。图3 示u v 6 0 秒诱导凋亡后 不同时间点所测得的f l l - h 变化情况。 9 华中科技走学同济医学院 硕士学位论文 l 察 2 尊 l 蠡 ： 弼篮黼剖o 皓 j 融盟嘲艚堋蝴 譬譬1 翻 朋棚b 蠊耵雨 吲 瓠郴妇a越w 6 0 r h 图3m m p 法检测u v 诱导后不同时间点细胞凋亡情况 f i g u r e3 ：a p o p t o s i si nm o l t - 4c e l l si n d u c e db yu vd e t e c t i n gb ym m p 注：图中m 1 标示c a l c e i n 荧光阴性区，即凋亡区；3a 为对照细胞，以下从3 b 至3 i 依次为诱 导后培养1 h 至8 h 后细胞凋亡情况 1 0 羞稍鼬一霹鼬一渊划鼬一露鼬 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 ( 3 ) 相同的诱导方式下，诱导后培养相同时间时，c a l c e i n 荧光( f l l h ) 低 信号区随诱导因素强度的增加而逐渐增多。如图4 中所示，u v 6 0 秒和u v 4 0 秒照 射后同样培养4 小时，前者比后者“凋亡峰”明显。 抽弭o ，i h4 e 搬6 0 m 图3m m p 法检测不同强度u v 诱导后相同时间点细胞凋亡情况 f i g u r e3 ：a p o p t o s i si nm o l t - 4c e l l si n d u c e db yd i f f e r e n td o s a g eu vf o u rh o u r sa f t e r i n d u c i n g , d e t e c t i n gb ym m p 注：图中m i 标示c a l c e i n 荧光阴性区，即凋亡区；4 a 为对照细胞，4 b 为u v 4 0 秒后培养4 小时的细胞，4 c 为u v 6 0 秒后培养4 小时的细胞 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 讨论 生物体细胞在其整个生命活动中有四种不同的生存状态：静息状态、分裂增殖、 分化以及凋亡 4 1 0 这四种状态息息相关，彼此间存在着千丝万缕的联系，而凋亡 是其中研究的热点。早期的研究已经阐明了部分凋亡机制及信号传导途径。随着 科学的进展，细胞凋亡的研究已经从细胞核控制凋亡过程的研究一部分地转移到 线粒体控制凋亡过程的研究上来。现在人们已经接近达成一个共识，即接受线粒 体是决定细胞死亡的又“战场”。 线粒体是真核细胞的重要细胞器，是动物细胞生成a t p 的主要地点。线粒体 基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成n a d h 。n a d h 通过线粒体内膜呼 吸链氧化。与此同时，导致跨膜质子形成跨膜质子梯度和( 或) 跨膜电位。线粒 体内膜上的a t p 合成酶利用跨膜质子梯度能量合成a t p ，参与细胞的各种需能过 程5 羽。 已有许多实验观察显示线粒体参与对细胞死亡的控制：( 1 ) 无论死亡细胞类 型如何，导致其死亡因素如何，细胞死亡( 包括凋亡和坏死) 的共同特征是在细 胞死亡前都有线粒体膜通透性改变；( 2 ) 相对于其他细胞生物学指标( 包括c a s p a s e ) 而言，线粒体通透性的改变是预测细胞死亡更有价值的指标；( 3 ) 加大原凋亡效 应物的作用剂量，可通过作用于线粒体膜而诱导线粒体膜通透性的改变；( 4 ) b c i 2 家族中抑制凋亡的成员能与线粒体膜蛋白产生交叉反应，通过抑制线粒体膜的通 透性而抑制细胞凋亡；( 5 ) 通过特异性药物抑制线粒体膜的通透性，可阻止或延 缓细胞死亡 7 1 0 这些研究都说明：线粒体构成了导致细胞死亡的一个或几个关键 步骤。 从大量有关凋亡的研究中我们已经知道，在凋亡发生过程中，线粒体也会产 生一系列相关的结构及功能变化。包括各种促凋亡蛋白( 如细胞色素c ，凋亡诱导 因子等) 的释放，线粒体膜电位的丢失，线粒体内膜通透性的变化等。这些变化的 出现或早或晚，有一定时相性 8 - 1 0 1 1 0 利用此过程中线粒体变化的特性，可选用适 当的荧光染料进行凋亡的流式细胞仪检测，如检测跨膜压的变化、活性氧的产生、 细胞色素c 的释放等。本实验的着眼点就在于寻求一种新的检测细胞凋亡尤其是 1 2 ! 竖查茎塑塑垦兰堕堕主兰堡垒圭 早期凋亡的方法。 现有的针对线粒体的凋亡检测法中，线粒体膜通透性变化主要是利用跨膜压 的变化导致的特异性荧光染料异常分布来检测的。其原理大都是使用阳离予疏水 性荧光染料( 如罗丹明1 2 3 ) 与细胞共同孵育，由于线粒体本身存在着跨膜压，在 n e m s t 平衡的作用下染料可进入线粒体基质内，发生凋亡跨膜压消失后染料分布将 出现变化，由些可进行凋亡探测。近来陆续有研究表明，在细胞凋亡早期，线粒 体最先发生的变化就是其内膜通透性的增大，这种改变进一步造成了线粒体跨膜 压的消失以及促凋亡蛋白的释放1 1 1 1 。而这种通透性的增大存在着两种形式，一种 是永久性增大，另一种是短暂性增大( 凋亡早期时多为此种状况) 。前者会进一步 造成跨膜压的消失，可用前述方法检测到，而后者则不能。线粒体内膜通透性短 暂性增大后，质子梯度将会“重建”，跨膜压并不消失，必须使用一种更加灵敏的 探测剂才能够捕捉到这一短暂的变化1 1 2 3 。 本实验采用荧光染料c a l e e i n - a m 作为凋亡指示剂，其化学特性( 如前述) 决 定了它对线粒体内膜通透性检测的可能性。为了研究c a l e e i n - a m 是否可被用于检 测细胞凋亡，实验设计了两种凋亡模型：喜树碱诱导和紫外线诱导，这两种条件 诱导细胞凋亡的机制是不同的，前者主要引起s 期细胞的凋亡，而后者则主要引 起g 0 - g 1 期细胞的凋亡t 3 1 。 实验中可见，无论采用哪一种诱导方式，诱导后培养一定时间检测，c a l e e i n 荧光( f l l - h ) 低信号区域均比对照增多；同种诱导方式下，c a l e e i n 荧光( f l l 。h ) 低信号区随诱导后培养时间延长而逐渐增多，至特定时间点时可出现“凋亡峰”， 存在时间效应信赖性；相同的诱导方式下，诱导后培养相同时间时，c a l e e i n 荧光 ( f l l - h ) 低信号区随诱导因素强度的增加而逐渐增多，存在剂量效应依赖性。 综合上述实验结果我们可确定，c a l e e i n - a m 可以作为一种敏感的活细胞染料， 用于流式细胞术中检测早期凋亡。 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 参考文献 1 v a l c 目r i ap e t r o n i l l i ，g i o v a n n im i o r t o ，m a r c c l l ac a n t o n , c ta 1 t r a n s i e n ta n dl o n g - l a s t i n g o p e n i n go f t h em i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i u t yt r a n s i t i o np o r ec a nb em o n i t o r e dd i r e c t l y i ni n t a c tc e l l sb yc h a n g e si nm i t o c h o n d r i a lc a l c e i nf l u o r e s c e n c e b i o p h y s i c a l j o u r n a l , v o l u m e7 6 , f e b r u a r y1 9 9 9 ：7 2 5 - 7 3 4 2 d p o n c c t , e b o y a , d m e t i v i e r , e ta 1 c y t o f l u o r o m e t r i cq u a n f i t a f i o n o fa p o p t o s i s d r i v e ni n n e rm i t o c h o n d r i a lm 锄b r a n cp e n n e a b i l i z a f i o n a p o p t o s i s ，2 0 0 3 ，8 ：5 2 1 - 5 3 0 3 d o d i n gt a o d i a n h o n gw u , y o n g d o n gf e n g , e ta l 小i e wm e t h o df o rt h ea n a l y s i s o fc e l l c y c l e - s p e c i f i c a p o p t o s i s c y t o m c t r y 2 0 0 4 ，p a r t a 5 7 a ：7 0 - 7 4 4 j a c k sta n d w e i n b e r gr a c e l l - c y c l e c o n t r o la n d i t s w a t c h m a n n a t u r e , 1 9 9 6 , 3 8 1 ：6 4 3 5 l u ri lt h ed e v e l o p m e n to fm i t o c h o n d r i a lm e d i c i n e p r o cn a i la c a ds c i u s a , 1 9 9 4 ，9 1 ：8 7 3 1 8 7 3 8 6 s c h a t zgt h e p r o t e i n i m p o r ts y s t e m o f m i t o c h o n d r i mjb i o l c h e m ，1 9 9 6 ，2 7 1 ：3 1 7 6 3 3 1 7 6 6 7 s k u l a c h e vv p w h ya r cm i t o c h o n d r i ai n v o l v e di na p e p t o s i s ? p e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o n p o r e sa n da p o p t o s i sa ss e l e c t i v em e c t 恼岫i 鄹n st oe l i m i n a t es u p e r o x i d e - p r o d u c i n g m i g o c h o n d r i aa n dc e l l f e b sl e t t , 1 9 9 6 ，3 9 7 ( 1 ) ：1 0 8 m i c h a e lo h e n g a r t n e r t h eb i o c h e m i s t r yo f a p o p t o s i s n a t u r e , 2 0 0 0 ；4 0 7 ：7 7 0 - 7 7 6 9 z a m z a m in ，s u s i nsa ，m a r c h e t t ip ，h i r s c ht ，g o m e z - m o n t e r r e y ，c a s t e d om ， k r ( ) e m e rgm i t o c h o n d r i a lc o n t r o lo fn u c l e a ra p o p t o s i s je x pm e d , 1 9 9 6 ；1 8 3 ： 1 5 3 3 1 5 4 4 1 0 z a m z a m in ，h i r s c ht ，d a l l a p o r t ab ，p e t i tpx ，k r o e l n e rgm i t o c h o n d r i a l i m p l i c a t i o ni na c c i d e n t a la n dp r o g r a m m e dc e l ld e a t h ：a p o p t o s i sa n dn e c r o s i s j b i o e n e r g e t i c s & b i o m e m b r a n e s ，1 9 9 7 ；2 9 ：1 8 5 - 一1 9 3 1 1 j e a nc l a u d em a r t i n o ua n dd o u g l a sr g r c e n b r e a k i n gt h em i t o c h o n d r i a lb a n i c r 1 4 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 m o l e c u l a rc d lb i o l o g y 2 0 0 1 , v o l u m e2 ：6 3 - - 6 6 1 2 j o r gh u s e r , c h r i s t i n ee ，r e c h e n m a c h e r , e ta 1 i m a g i n g t h e p e r m e a b i l i t y p o r e t r a n s i t i o n i n s i n g l em i t o c h o n d r i a b i o p h y s i c a lj o u r n a l , v o l u m e7 4 ，a p r i l 1 9 9 8 ：2 1 2 9 2 1 3 7 1 5 华中科技大擘同济医学院硕士学位论文 第二部分 c a l c e i n - a m 和a n n e x i nv 用于流式细胞术检测早期凋亡敏感性的比较 【摘要】 目的： 比较c a l c e i n - a m 与a n n e x i nv 用于流式细胞仪检测活细胞早期凋亡时的敏感 性，以建立一种新的检测早期凋亡的方法。 方法： 将人类急性t 淋巴细胞白血病细胞株( m o l “) 经喜树碱( c p t ) 、紫外线( u v ) 诱导后，分别采用c a l c e i n - a m 及异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白v ( a n n e x i nv ) 进行标记，然后用流式细胞术分析凋亡率，通过比较凋亡诱导后不同时间点的凋 亡率来分析c a l c e i n - a m 和a n n e x i nv 对于检测细胞早期凋亡的敏感性。 结果： 在喜树碱诱导模型中，加药后2 小时即可用c a l c d n - a m 检测到明显的细胞凋 亡，而3 小时后才能用a n n e x i nv 检测到；在紫外线诱导模型中，照射后l 小时即 可用c a l c e i n - a m 检测到明显的细胞凋亡，而要在2 小时后才能用a n n e x i nv 检测 到。 结论： c a l c e i n - a m 用于检测活细胞早期凋亡比a n n e x i nv 更为敏感，是一种稳定、 可靠、灵敏度高并且十分经济的检测早期凋亡的活细胞染料。 关键词：流式纫艇采；冯拦；线粒体膜通透性；c a l 。争函f ! 幽；膜联蛋白v 1 6 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 p a r t c o m p a r i s o no fc a l c e i n - a ma n da n n e x i n - v a se a r l yv i t a lm a r k e r so f a p o p t o s i sb yc y t o m e t r y 【a b s l u c t 】 o b 沁c 1 1 e ： n 地c u r r e n ts t u d yw a sd e s i g n e dt oc o m p a r et h es e n s i t i v i t yo fc a l c e i n - a ma n d a n n e x i nv - f i t cf o re a r l yd e t e c t i o no f a p o p t o s i si nl i v i n gc e l l sb yh o wc y t o m e t r ya n d t oe s t a b i l i s han e wm e t h o df o re a r l yd e t e c t i o no f a p o p t o s i s m 咂t h o d ： t h em o l t - 4c e l ll i n et r e a t e dw i t hc a m p t o t h o c i n ( c p t ) o ru l t r a v i o l c t ( u v ) w e r e l a b e l e dw i t hc a l c ：e i n - a ma n dh t c - c o n j u g a t e da n n c x i nv r e s p e c t i v e l y , t h e na n a l y z e d t h ea p o p t o s i sr a t eb yf l o wc y t o m c t r ya n dc o m p a r e c lt h ep e r f o r m a n c eo f c a l c e i n - a ma n d a n n e x i nvf o re a r l yd e t e c t i o no f a p o p t o s i s r e s i ：r s ： o u rr e s u l t ss h o wt h a tb o t hp r o b e sa l l o w e dt h ed e t e c t i o no fa p o p t o t i cc e l l s h o w e v e r , c a l c e i n - a mw a sm o f es e n s i t i v et h a na n n e x i nvw ec o u l dd e t e c tt h e a p o p t o s i si n d u c e db yc p l rt w oh o u r sa r c ri n d u c i n gw i t hc a l c e i n - a mb u tt h r e eh o u r s a f t e ri n d u c i n gw i t ha n n e x i nva n d , t h ea p o p t o s i si n d u c e db yu vc o u l db ed e t e c t e do n e h o u r sa f t e ri n d u c i n gw i t hc a l c c i n - a mb u tt w oh o u r sa f t e ri n d u c i n gw i t h a n n e x i nv c o n c l u 跚o n ： a n n e x i nvi sl e s ss e n s i t i v et h a nc a l c c i n - a mf o re a r l ya p o p t o s i sd e t e c t i o n , a n dt h e 删m e t h o dd e t e c t i n ge a r l ya p o p t o s i sw i t hc a l c e i n - a mi ss t a b l e ，r e l i a b l e ，s e n s i t i v ea n d l o w - c o s t k e yw o r d s ：f l o w c y t o m e l r y ；a p o p t o s i s ；m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep e r m e a b i l i z a t i o n ； c a l c c i n - a m ；a n n c x i n - v 1 7 华中科技大学同济医学院 硕士擘住论文 前言 凋亡是细胞生物学的一个重要方面，也是当今生命科学研究的重要课题。现 有的研究已知，凋亡过程中有系列的事件发生，包括形态学变化、非随机性d n a 降解、细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻以及线粒体膜电位和通透性的变化等等。而后两 种现象在凋亡早期即可发生并被检测到。 凋亡早期就可发生“膜外翻”现象，而依赖c a 2 + 的磷脂结合蛋白a n n e x i nv 能够与外翻的磷脂酰丝氨酸( p s ) 高亲和结合。根据这一原理，a n n e x i n v 被当作 检测细胞膜表面p s 的敏感探针，用于早期凋亡细胞的检测1 t - 2 1 0 而为了进一步区 分坏死与凋亡细胞，可以同时使用膜非通透性d n a 染料如p i 进行双重标记，再 利用流式细胞仪( f c m ) 进行双参数检测和分析。这就是现在广为科研者使用并 认可的a n n e x i n v & p i 法。此法灵敏度高，操作亦十分简便。 凋亡早期时线粒体也会发生一系列的变化，其中线粒体膜屏障功能的丧失是 各种类型细胞发生凋亡的共同的、不可逆性环节。因此