（食品科学专业论文）川芎多糖分离纯化工艺研究.pdf

西华大学硕士学位论文 摘要 中药川芎始载于神农本草经，是伞形科川芎l i g u s t i c u mc h u a n x i o n gh o r t 的干燥根茎，具有活血化淤，祛风止痛的功效。川芎在我国分布广泛，资源丰 富，主要产区为四川灌县。本论文以川芎为原料，对其多糖的提取工艺、脱色 工艺进行了研究，其主要结论如下： 1 、热水浸提川芎多糖工艺条件 分别进行单因素和正交试验后得出热水提取川芎多糖最佳工艺条件为：提 取温度为1 0 0 ，提取时间为1 2 0 m i n ，水与川芎液固质量比为1 0 m l ：l g ，提取 次数为3 次。 2 、川芎多糖脱色 ( 1 ) 活性炭脱色法：采用活性炭法对川芎多糖提取液进行脱色的最佳工艺 条件为活性炭用量为3 ，p h 3 5 ，脱色时间为6 0 m i n ，常温，脱色次数为4 次。 在此条件下，脱色率为9 1 1 ，多糖保留率为6 3 8 ，但活性炭难去除。 ( 2 ) 双氧水脱色法：采用双氧水法对川芎多糖提取液进行脱色的最佳工艺 条件为双氧水用量为0 5 ，脱色温度为6 0 。c ，时间5 h 。在此条件下，脱色率 为2 5 4 ，多糖保留率为8 5 5 。 ( 3 ) 大孔树脂脱色法：研究了7 种不同的大孔树脂对川芎多糖提取液的脱 色效果，从脱色率和多糖保留率双重指标考虑，7 种树脂排序依次为s - 8 d 3 0 1 t 宜宾 b s i i l s 8 d 2 9 6 、d 1 4 0 。因此s 8 为比较理想的川芎多糖提 取液脱色树脂，其工作液流速为2 - - 3 b v h ，川芎浓度为0 2 5 9 , m l 。在此条件 下，脱色率为9 1 3 ，多糖保留率为9 0 1 。 因此，在实际应用中，选择s 一8 为川芎多糖脱色树脂。 关键词：川芎多糖；提取；脱色；大孔树脂 西华大学硕士学位论文 a b s t r a c t l i g u s t i c u mc h u a n x i o n gh o r t i so n eo fc h i n e s et r a d i t i o n a ld r u g sw i t ht h e f u n c t i o no fp r o m o t i n gf l o wo fq ia n db l o o da n dr e m o v i n gw i n df o r s t o p p i n g p a i n a sad r u g ，i tc a nb et r a c e db a c kt os h e nn o n eb e nc a o , l i n g l i g u s t i c u m c h u a n x i o n gh o r t i s d i s t r i b u t e de x t e n s i v e l yi no u rc o u n t r y , e s p e c i a l l yi ns i c h u a n p r o v i n c e ，a n di t sr e s o u r c ei sa b u n d a n t i nt h i sp a p e r , t h el i g u s t i c u mc h u a n x i o n gh o r t w a su s e da s s t u d ym a t e r i a la n di t sp o l y s a c c h a r i d ew a ss t u d i e di nt h ef o l l o w i n g r e s p e c t s ，e x t r a c t i o nt e c h n o l o g i e s a n dd e c o l o r i z a t i o n t e c h n o l o g i e s t h e m a i n e x p e r i m e n tr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 、p o l y s a c c h a r i d ei nl i g u s t i c u mc h u a n x i o n gh o r t e x t r a c t i o nt e c h n i q u eb y h o t w a t e r u s i n gb o t ht h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n ta n dt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h e o p t i m u mp a r a m e t e r sf o rh o t w a t e re x t r a c t i o nm e t h o dw e r et e m p e r a t u r e10 0 ， e x t r a c t i o nt i m e12 0m i n u t e s ，r a t i oo fl i q u i dt or a wm a t e r i a l10 m l ：l g ，e x t r a c t i o n t i m e s3 2 、p o l y s a c c h a r i d ei nl i g u s t i c u mc h u a n x i o n gh o r t d e c o l o r i z a t i o nt e c h n i q u e ( 1 ) a c t i v a t e dc a r b o nd e c o l o r i z a t i o nm e t h o d ：t h eo p t i m u mp a r a m e t e r sf o r a c t i v a t e dc a r b o nd e c o l o r i z a t i o nm e t h o dw e r ea c t i v a t e dc a r b o n d o s a g e 3 , p h 3 5 ，d e c o l o r i z a t i o nt i m e6 0m i n u t e s ，n o r m a lt e m p e r a t u r ea n dd e c o l o r i z a t i o n t i m e s4 u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h ed e c o l o r i z a t i o nr a t ew a s91 1 ，t h ep o l y s a c c h a r i d e r e s e r v e dw a s6 3 8 d u r i n gt h ee x p e r i m e n t o n eh e a d a c h yp r o b l e mw a st h ea c t i v a t e d c a r b o nw a sc o m b i n e dw i t hp o l y s a c c h a r i d e ，a n di ti sd i f f i c u l tt og e ta w a y ( 2 ) h 2 0 2 d e c o l o r i z a t i o nm e t h o d ：t h e o p t i m u mp a r a m e t e r s f o r h 2 0 2 d e c o l o r i z a t i o nm e t h o dw e r eh 2 0 2d o s a g eo 5 d e c o l o r i z a t i o nm e t h o dt e m p e r a t u r e 6 0 a n dd e c o l o r i z a t i o nt i m e5h o u r s u n d e rt h i sc o n d i t i o n t h ed e c o l o r i z a t i o nr a t e w a s2 5 4 t h ep o l y s a c c h a r i d er e s e r v e dr a t ew a s8 5 5 ( 3 ) m a c r o p o r o u sr e s i nd e c o l o r i z a t i o nm e t h o d ：t h ed e c o l o r i z i n ge f f e c t so fc r u d e p o l y s a c c h a r i d ei nl i g u s t i c u mc h u a n x i o n gh o r t b y7d i f f e r e n tm a c r o p o r o u sr e s i n s i i i 西华大学硕士学位论文 w e r es t u d i e di nt h i sp a p e r f r o md e c o l o r i z a t i o nr a t ea n dp o l y s a c c h a f i d er e s e r v e d r a t e t h eo r d e ri s ：s 8 d 3 0 1 t y i b e n b s i i l s 8 d 2 9 6 、d 1 4 0 t h e a b o v er e s u l t ss h o wt h a tt h es 8 i ss u i t a b l ef o rd e c o l o r i z a t i o n ，a n di t sv e l o c i t yo f f l o w i s2 - 3 b v h ，r a t i oo fr a wm a t e r i a lt ol i q u i d0 2 5 9 m l u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h e d e c o l o r i z a t i o nr a t ew a s91 3 ，t h ep o l y s a c c h a r i d er e s e r v e dr a t ew a s9 0 1 s os 一8i ss u i t a b l ef o rd e c o l o r i z a t i o no fp o l y s a c c h a r i d ei n l i g u s t i c u m c h u a n x i o n gh o r t i np r a c t i c e k e yw o r d s ：p o l y s a c c h a r i d e ；l i g u s t i c u mc h u a n x i o n g h o r t ；e x t r a c t i o n ； d e c o l o r i z a t i o n ；m a c r o p o r o u sr e s i n i v 西华大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西华大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在西华大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归西华大学所有，特此声明。 作者签名：生日乳雾8 年7 月p 日 剔醛轹刁咻口罗年6 月沙日 西华大学硕士学位论文 l 绪论 近年来，随着社会经济的发展及生活水平的提高，人口老龄化的趋势越来 越突出。很多老年疾病如心脏病、心肌梗塞、高血压、糖尿病等疾病的发病率 也越来越高，在此形势下，用食品防治疾病己逐渐成为各国的健身手段。而中 药保健食品在防治疾病方面有较多优势，因此随着社会的发展，中药保健食品 的发展越来越受到世界各国人民的重视。从人类保健食品的发展历程来看，它 经历了第一代保健食品、第二代保健食品和从第二代向第三代保健食品过渡的 过程，第三代保健食品要求有明确的保健功能的功能因子的结构、含量及其作 用机制。因此可以预见，第二代保健食品将会被第三代保健食品所代替。从 2 0 世纪9 0 年代后期，含天然中药的保健食品越来越受到人们的重视，特别是 植物性中药的保健食品，将成为人类研究开发的焦点。 我国是世界上植物种类最多的国家之一，而中药保健食品多取材于药食兼 用植物，且野生者甚多。因此，利用我国丰富的野生及家种植物资源，依据有 机化学、生理学、生物化学、营养学、及中医药等多种学科的基本理论，从分 子、细胞和器官水平研究功能因子的构效、量效关系及其作用机制和可能毒性 作用，开发和利用第三代保健食品，为人类健康服务【l 】。多糖是自然界含量最 丰富的物质之一，也是保健品研究的主力军。到目前为止，已有近3 0 0 种的多 糖类化合物从天然产物中被分离提取出来，其中从植物中，尤其从中药中提取 的水溶性多糖最为重要【2 j 。 1 1 多糖的研究综述 多( 寡) 糖是重要的具有生物学活性的高分子化合物之一，在自然界分布 极为广泛。其研究已有百余年的历史 3 】，但因基础研究的困难，长期未受重视， 研究水平较蛋白质、核酸相对滞后。近二十年来，由于膜的化学功能，免疫物 质的化学研究与发展，以及新药物资源的寻找和研究等，科学家们认识到糖类 在生物体内的作用不仅是作为能量资源( 如淀粉、糖原等) 或结构材料( 如纤 维素、甲壳等) ，更重要的是其作为一类天然大分子化合物，具有可同核酸和 蛋白质相比拟的信息功能，参与生命各种活动，具有多种生物学功能【4 1 。因此 糖的生物功能研究日渐成为又一新的研究热点，成为带动多门学科的又一场突 1 西华大学硕士学位论文 破的关键所在【5 j 。2 0 世纪8 0 年代末形成的糖生物学和糖工程掣6 】，发展极其 迅速，成为本世纪的前沿学科之一。 现已从天然产物中分离出3 0 0 余种多糖类化合物。这些多糖在结构上不同 寻常的复杂性引起了人们的关注。其中，一些分子量在几千以上，具有很强生 物活性的多糖的研究日益受到重视，其生理活性、化学结构及构效关系等已成 为多糖研究的前沿阵地，取得了相当大进展【7 10 】。英国牛津大学糖生物研究所 利用高分辨率核磁共振、试剂列阵分析法及快速原子轰击电离质谱和基质辅助 的激光解吸电离飞行时间质谱，再配合高分辨率x 线衍射，可在不到一周时间 内测出糖链的全部结构，甚至包括其立方体结构【l l 】。 随着分子生物学、天然药物化学、药理学研究的不断深入，科学家逐渐认 识到糖及其复合物分子( 如糖蛋白、糖脂等) 具有极其重要的生理作用。其不 仅参与细胞生命现象的调节，还参与免疫功能的调节、细胞间相互识别、细胞 间物质的运输；还与癌症的诊断和治疗等有着密切的联系【1 2 1 。因此科学家们试 图开发多糖类药物，应用于预防和治疗一些疑难疾病。目前人们已成功地从近 百种植物中提取出了多糖并广泛地用于医药和保健食品的研究和开发中。 我国对多糖的研究始于7 0 年代，起步较晚。我国有非常丰富的中草药资 源和雄厚的传统中医理论，近年来对植物多糖的研究发展很快，研究水平日益 提高，层次日益深入，其中对免疫机理、抗肿瘤活性的研究已深入到分子水平 【1 3 】 o 植物多糖研究得比较深入的是稻草多糖、麦秸多糖、竹多糖、黄茂多糖、 刺五加多糖、茶叶多糖等【1 4 , 1 5 】。从中草药中分离得到的多糖，多数表现出较强 的活性。 1 1 1 多糖的分离提取工艺 天然多糖主要是从自然界中的植物或农副产品中提取分离得到的，其提取 分离基本过程如下：原料烘干粉碎一脱脂一浸提一浓缩一除蛋白一脱色一透析 去小分子一乙醇沉淀一无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后烘干得精制多糖【l6 】。在上 述工艺流程中，提取是关键步骤之一，对多糖得率有极其重要的影响。目前多 糖常用的破壁提取方法有：热水浸提法【1 7 2 0 】、超滤法、超声提取法、微波提 取法、酸浸提法【2 l 】、碱浸提澍2 2 1 和酶法等。 2 西华大学硕士学位论文 1 1 1 1 热水浸提法 热水浸提法是多糖提取的传统方法【2 3 1 。它遵循相似相溶原则，多糖是极性 大分子化合物，应选择水、醇等极性强的溶剂。水是典型的强极性溶剂，对植 物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全。用水作溶剂来提取多糖 时，温度一般控制在5 0 - 1 0 0 左右，在恒温水浴上回流浸提，过滤后得滤液 和滤渣。根据多糖不溶于乙醇、石油醚、氯仿等溶剂的性质，用高浓度乙醇将 其从水提物中沉淀析出【2 4 1 ，然后用适量乙醇或丙酮洗涤脱水，冷冻干燥便得到 粗多糖。李宏燕等【2 5 】在紫菜粗多糖提取方式研究中，热水提取控制条件为：温 度为2 0 1 0 0 ，水与紫菜的液固质量比( 2 0 - - 5 0 m l ：l g ) ，提取时间3 0 - - , 2 4 0 m i n ，最终得率为2 0 5 。热水浸提法操作简单，不需特殊设备，成本低，但 提取效率较低且费时。伴随着现代工业工程技术的迅猛发展，一些现代高新技 术将不断被应用到多糖的提取中。 1 1 1 2 超声提取法 超声波技术是近年来发展起来的一种新方法。将超声波技术应用于提取植 物的有效成分，是利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈的空化效应和 搅拌作用等，加速有效成分进入溶剂，从而提高浸出率，缩短提取时间，同时 可避免高温对浸出成分的影响【2 6 】。超声波是频率在2 0k h z 以上的声波，对媒 介主要产生独特的机械振动作用和空化作用。超声波振动能产生并传递强大的 能量，引起媒质以大的速度加速进入振动状态，使媒质结构发生变化，促使有 效成分进入溶剂中。同时，超声波在液体中还会产生空化作用。空化泡在瞬间 涨大破裂，破裂时吸收的声场能量在极短时间和空间内释放出来，形成高温和 高压的环境，并伴随有强大的冲击波和微声波，从而破坏细胞壁结构，使其在 瞬间破裂，胞内成分得以释放，直接进入溶剂并充分混合，进而提高提取率。 江发寿等【27 j 研究了超声提取法提取沙枣多糖，经烘干处理的沙枣用8 0 的乙 醇液提取除去单糖和低聚糖后，采用水为溶剂于4 5k h z 超声提取2 次，2 0 m i n 次。结果表明超声波提取多糖有较大的优势，提取时间大大缩短，收率提高近 5 0 。 1 1 1 3 微波提取法 微波是频率在3 0 0m h z - - - 3 0 0g h z 的电磁能。微波加热导致细胞内的极性 物质，尤其是水分子，吸收微波能后产生大量的热量，使细胞内温度迅速上升。 3 西华大学硕士学位论文 液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，进一步加热， 导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。孔洞或裂纹的存 在使细胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内产物。微波浸提技术可使 浸提时间减少至3 0m i n 内【2 8 1 ，并具有穿透力强、选择性高、加热效率高、可 破碎细胞壁等优点，近年来在各个领域得到广泛的应用。中国农业大学农业工 程研究院刘依、韩鲁佳等【2 9 】应用微波技术对板蓝根多糖提取进行探讨，通过正 交试验确定微波处理的最佳工艺参数，并与水煎煮法提取板蓝根多糖进行比 较。结果表明：微波处理后板蓝根粗多糖得率达到3 3 0 6 ，多糖质量分数达 到7 5 2 l ，明显优于单独水煮煎法。 1 1 1 4 酸浸提法 该法的浸提过程是在酸性条件下完成的，实际操作过程如下：向原料中加 盐酸溶液使其最终浓度为0 3 m o l l ，然后置于9 0 c 恒温水浴中浸提1 4 h ，用 碱中和后过滤，滤渣加盐酸溶液反复浸提2 3 次，最后合并滤液，浓缩，用 9 5 乙醇沉淀、分离、洗涤、干燥得粗多糖。赵宇等【3 0 】对海篙子多糖的提取方 法研究发现，从硫酸根含量及粗多糖产率来看，酸提方法好于水提方法。孟宪 元等【3 l 】在茜草多糖提取研究中发现，相对于水提，以稀酸提取茜草多糖，产品 纯度较高。但酸提法有其特殊性，只在一些特定的植物多糖提取中占有优势， 目前报道的并不多，并且在操作上要求严格，因为酸性条件下可能引起多糖中 糖苷键的断裂。 1 1 1 5 碱浸提法 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖【3 2 1 。碱 提过程中为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。h a y a s h i 3 3 】 研究了一种从绿色藻类提取酸性多糖的方法，而这种多糖用常规的热水法是无 法得到的。碱提优势也是因多糖类的不同而异，碱的浓度也应得到有效控制， 因为有些多糖在碱性较强时会水解【3 4 1 。 1 1 1 6 酶提法 大部分中药材有效成分往往包裹在细胞壁内，植物细胞壁是由纤维素、半 纤维素、果胶质、木质素等物质构成的致密结构。在药用植物有效成分提取过 程中，当存在于细胞原生质体中的有效成分向提取介质扩散时，必须克服细胞 壁及细胞间质的双重阻力。选用适当的酶作用于药用植物材料，如水解纤维素 4 西华大学硕士学位论文 的纤维素酶、水解果胶质的果胶酶等，可以使细胞壁及细胞间质中的纤维素、 半纤维素、果胶质等物质降解，破坏细胞壁的致密构造，减小细胞壁、细胞间 质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从而有利于有效 成分的溶出。酶技术是一种新型高效绿色提取技术，具有快速、高效、反应温 和、专一性强等诸多优点【35 3 6 1 。随着生物技术的提高，酶制剂来源的广泛， 酶活性将不断提高，性价比也不断提高，为其在工业化生产中的应用提供了极 大的空间，更适合工业化生产。孟江【37 】研究不同酶对大枣渣多糖提取效果的影 响，得到酶提多糖的最佳工艺。 1 1 2 多糖的脱色工艺 多糖浸提液颜色较深，浓缩后颜色更深，所以需要将其脱色。根据其不同 性质采取不同的方法，常用的脱色方法有：离子交换法、氧化法、金属络合物 法、吸附法( 纤维素、硅藻土、活性炭等) 。下面将介绍活性炭吸附法、氧化 法、大孔吸附树脂吸附法以及离子交换法脱色。 1 1 2 1 活性炭吸附法脱色 活性炭由于具有较强的吸附作用及良好的助滤效果，性质稳定，可吸附溶 液中的色素、杂质，来源广泛，制作技术简单，价格低廉，被广泛用于各种溶 液脱色。但是活性炭对物质的吸附属于纯物理吸附，特异性差，用于多糖脱色 时虽然能够脱掉色素，但同时导致大量多糖损失，并且活性炭容易受到有机物 浓度、p h 值、操作温度的影响，脱色使用后的活性炭处理困难，很难再生， 容易造成浪费和环境污染。 大量文献记载了使用活性炭的浓度范围在配制量的0 2 - - - 1 之间，因配 制量分为浓配制量和稀配制量两种，致使炭量难以确定。例如：同配5 和5 0 两种葡萄糖注射液1 0m l ，原料量相差1 0 倍，而炭用量却一致；若按浓度配 置来计算炭用量，却又忽视了溶液浓度的影响，浓度越高而炭用量越少。显然， 按配制量计算炭用量易忽视原料质量这一重要因素【3 8 1 。 1 1 2 2 过氧化氢氧化法脱色 植物中所含的色素一般为酚类、羟基葸醌衍生物等，这类物质多含有不饱 和双键、羟基、芳香环等，在碱性条件下能与氧化剂反应而脱色。这种方法适 合于目的产物较为稳定，不易被氧化的体系，由于h 2 0 2 脱色一般要在酸性或 5 西华大学硕士学位论文 碱性进行，目的产物须在酸性或碱性下能稳定存在。 1 1 2 3 大孔吸附树脂脱色 大孔吸附树脂是2 0 世纪6 0 年代发展起来的一类新型高分子分离材料，具 有良好的吸附性能。它是一类高度交联的、具有三维网状结构的高分子聚合物， 不溶于任何有机溶剂，在常温下十分稳定，因此在使用过程中不会有任何物质 释放出来，在生产过程中残留的某些杂质也完全可以在使用前彻底的清洗出 来。它依靠和被吸附的分子( 吸附质) 之间的范德华引力，通过巨大的比表面 积进行物理吸附。与活性炭和其它吸附剂相比，吸附树脂用于脱色具有很多的 优点，如对某种物质的吸附选择性较高；物理化学稳定性和机械强度较好；品 种规格较多，可根据需要改变树脂物理或化学结构；吸附树脂一般为球状颗粒， 流体阻力较小；脱色体积大，再生使用次数多，污染小，使用安全等等。 于志萍等1 3 9 j 选取n k d 1 、d 4 0 2 0 、n k a 9 三种大孔吸附树脂进行d 核糖 发酵液脱色实验，结果表明d 4 0 2 0 效果最好，脱色率在9 5 以上，回收率在 9 4 以上。高生彬等【4 0 】用大孔吸附树脂采用动态吸附的方法对维生素c 进行脱 色，也取得了较好的效果。 1 1 2 4 离子交换法脱色 离子交换树脂是一类具有特殊功能的高分子合成材料。自1 9 4 3 年英国 a d a m s 和h o l m s 用人工方法合成酚醛性阳、阴离子交换树脂以来，己有六十 多年的历史。此期间，其合成及应用技术得到迅速发展。1 9 4 5 年美国人a l e l i o 发表了聚苯乙烯阳离子交换树脂及丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂的制备方 法，后来又相继出现了苯乙烯系阴离子交换树脂、氧化还原树脂以及鳌合树脂。 到2 0 世纪五十年代后期各种大孔树脂又相继发展起来。我国的离子交换树脂 起步于2 0 世纪五十年代，经过近5 0 年的发展，目前已经具有相当的水平和规 模。在现代工业和科学研究中，离子交换树脂起着越来越重要的作用【4 1 1 。 离子交换树脂法用于多糖脱色，现己被欧美国家广泛使用。色素多带负电 荷，故可用阴离子交换树脂将其除去。选择特异性强的离子交换树脂，可以在 多糖损失较少的情况下除去色素，为进一步的精制多糖创造条件。岳金山【4 2 1 将国产d 2 9 6 离子交换树脂用于糖浆脱色，结果显示脱色效率稳定在7 4 5 7 5 5 之间，再生率最低9 3 8 ，最高9 8 6 ，糖浆纯度提高0 1 2 7 。 6 西华大学硕士学位论文 1 1 3 中药材中多糖的药理作用 中医药是中华民族优秀的文化瑰宝，为中华民族的繁衍昌盛，为世界医药 的发展和全人类的健康做出了巨大贡献。我国是中草药大国，是中草药的发源 地。常用中草药多达5 0 0 0 余种，多糖广泛地存在于多种中草药材中，是中药 发挥独特疗效的重要物质基础之一。 1 1 3 1 提高机体的免疫功能 这是目前公认的多糖类抗肿瘤作用的主要机理。多糖对机体的免疫调节作 用主要有以下的方式和途径：( 1 ) 激活巨噬细胞；( 2 ) 激活网状内皮系统；( 3 ) 激活免疫活性细胞；( 4 ) 激活补体；( 5 ) 促进干扰素的生成；( 6 ) 促进白细胞 介素的生成；( 7 ) 诱生肿瘤坏死因子等几方面【4 3 】。 柴胡多糖、紫松果菊多糖等能激活体内的巨噬细胞功能，进而抗肿瘤；女 贞子多糖、商陆多糖等能增强细胞免疫功能；波叶大黄多糖、板蓝根多糖等对 体液免疫有促进作用【“，4 5 1 。 1 1 3 2 增强红细胞免疫功能 1 9 8 1 年s i e g e l 提出“红细胞免疫系统 ，并推测r b c 可阻止癌细胞在血 液循环中播散【4 6 】。此后红细胞免疫与肿瘤发生的研究不断受到重视【4 7 1 。其机 理是：r b c 可通过c 3 b 受体粘附已激活粘附补体的肿瘤细胞，从而增强吞噬细 胞的功能，防止癌细胞的血行转移。肿瘤细胞的繁殖可产生对抗机体r b c 免 疫功能的物质，使r b c 免疫功能处于低下。粘附肿瘤细胞的能力降低，李娜 等( 1 9 9 6 ) 报道，多糖类可提高r b c 的免疫功能，粘附肿瘤的能力也增强， 对防止肿瘤扩散有很大的价值。 1 1 3 3 改变肿瘤细胞膜的结构 多糖类还可直接作用于肿瘤细胞。黄添友等报道刺五加、获荃等4 种多糖 对s 1 8 0 细胞膜的磷酰肌醇的转换有抑制效应【4 8 】。另一方面，多糖类还可促使 肿瘤细胞膜磷脂的生化特性发生改变，进而破坏肿瘤细胞的正常结构及功能。 侈丽等发现刺五加多糖对肿瘤细胞膜中性脂的脂肪酸组成发生了明显的改变 【4 9 】 o 1 1 3 4 抑制肿瘤组织中s o d 活力 w e i w s 等报道灵芝多糖对小鼠正常组织s o d 活性有促进作用。而对肿瘤 组织中的s o d 活性产生抑制，这样促进了肿瘤细胞的脂质过氧化，加速肿瘤 7 西华大学硕士学位论文 细胞的死亡，而对正常组织起到保护作用【5 0 1 。 1 1 3 5 清除自由基、抗衰老功能 陈群等人研究发现人参多糖具有抗衰老作用：黄茂多糖可明显降低大鼠血 浆中过氧化脂质的含量，显示其抗衰老作用；枸杞多糖能显著缩短果蝇从卵到 蛹以及卵到成虫的发育期，并能显著提高小鼠和果蝇的平均寿命。多糖能有效 对抗自由基过氧化，使受损膜电学功能发生逆转，是其抗衰老的原因之一。莲 子多糖提取液具有较好的清除羟基自由基( o h ) 的功效，最高清除率可达 2 9 1 。芦荟多糖有清除体内0 2 、o h 及h 2 0 2 的自由基功能，间接地达到抗 衰老作用。枸杞多糖可以提高小鼠心、肝、肺组织超氧化物歧化酶( s o d ) 、 过氧化氢酶( c a t ) 、总抗氧化能力( t - a o c ) 活性，进而具有延缓衰老活性【4 4 , 4 5 】。 1 1 3 6 抗氧化、抗疲劳功能 刘晓莉等发现，枸杞、人参、银杏叶、天麻水提液均可降低小白鼠体内丙 二醛( m d a ) 的含量。人参对脑和心肌中m d a 含量的抑制率最高，分别为 2 0 6 和2 1 3 ；天麻对肝和肾组织中m d a 含量的抑制率最高，分别为1 4 5 和1 3 6 。魏文树等对云芝多糖生理活性研究证明其对活性氧有清除作用。以 生理盐水为对照，0 3 2 的沙棘多糖溶液就已有明显的抗氧化作用( p b c ，即温度 时间 液固质量比；优水平为a 3 8 2 c 2 ，即热水提取 温度1 0 0 。c ，时间1 2 0 r a i n ，水与川芎液固质量比1 0 ：1 。 1 7 西华大学硕士学位论文 表3方差分析表 t a b l e3v a r i a n c ea n a l y t i c a ls c h e d u l eo fe x t r a c t i o n 方差来源离差平方和自由度方差f 值显著性 注：f o 0 1 ( 2 ，2 ) = - 9 9 0 0 ，f 0 0 5 ( 2 ，2 ) ：1 9 0 0 。 从表3 的方差分析可知：f a = 2 7 3 7 1 4 9 9 ，f c = 2 9 5 7 1 1 9 ，f b = 1 0 0 0 0 时间 液固质量比；提取温度对川芎多糖含量有显著 影响，提了时间对多糖含量有较显著影响，水与川芎液固质量比则最不显著。 1 9 西华大学硕士学位论文 3 川芎多糖脱色工艺研究 川芎多糖浸提液颜色较深，浓缩后颜色更深，所以需要将其脱色。本文采 用3 种方法脱色，分别为活性炭法、双氧水法、大孔树脂法，以期找出一种最 适合川芎多糖浸提液的脱色方法。 3 1 实验原料、试剂及仪器 3 1 1 原料 川芎购于成都中药材市场，烘干、粉碎、过4 0 目筛后，于恒温干燥箱中 干燥至恒重为止，置放于干燥器中待用。 3 1 2 试剂 大孔树脂d 1 4 0 、b s i i由成都辰光生物制品有限公司提供 大孔树脂s 8 、d 3 0 1 t 、d 2 9 6由天津南开大学化工厂提供 大孔树脂( 宜宾)由四川宜宾县天源离子交换树脂厂提供 大孔树脂l s 8购于西安蓝深特种树脂有限公司 其他试剂如：活性炭、双氧水、无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸等均为国产 分析纯。 3 1 3 仪器 一 分光光度计、层析柱( 1 0 3 0 e m ) 、锥形瓶等。 3 2 实验方法 3 2 1 川芎粗多糖的提取 称取5 0 0 9 川芎粉末，经石油醚索氏抽提脱脂后风干，均分3 份，分别置 于3 个3 0 0 0 m l 烧瓶中，加入1 0 倍蒸馏水，搅匀，1 0 0 提取2 h ，离心取上清 液，滤渣则以同样条件重复提取2 次，合并总提取液，旋转蒸发浓缩至小体积 后，加入1 5 倍s e v a g 试剂( 氯仿：正丁醇= 5 ：1 ) 脱除蛋白，离心分离，反复操 作至无蛋白层为止( 约1 2 次) ，4 。c 冰箱保存待用。 3 2 2 色素含量测定方法 西华大学硕士学位论文 为确定色素的特征吸收波长，将川芎粗多糖提取液配成一定浓度，进行可 见紫外全波长扫描。 3 2 3 活性炭脱色法的工艺条件研究 将川芎多糖提取液配成1 0 ：l 的比例( 即1 0 m l 水：l g 川芎，简称为“液固 比 ，以下均同) ，准确量取1 0 m l 川芎多糖提取液，置于5 0 m l 锥形瓶中，按 设定比例加入活性炭，保鲜膜封口，在相应温度下水浴振荡( 1 2 0 r m i n ，以下 均同) 一定时间，抽滤，稀释后分别在3 5 9 n m 和6 2 0 n m 检测吸光度，计算脱 色率和多糖保留率。 3 2 3 1 活性炭用量对脱色效果的影响 实验设定活性炭用量分别为0 0 5 、0 2 、0 5 、1 o 、1 5 、2 o 、 5 0 ；其他条件为脱色温度4 0 c ，时间1 5 m i n ，未调p h ，研究不同活性炭用 量对川芎多糖提取液脱色效果的影响。 括性炭用量( ) = 3 2 3 2 脱色时间对脱色效果的影响 实验设定脱色时间分别为5 m i n 、1 5 m i n 、3 0 m i n 、4 5 m i n 、6 0 m i n 、9 0 m i n 、 1 2 0 m i r a 其他条件为活性炭加量2 ，脱色温度4 0 ，未调p h ，研究不同脱 色时间对川芎多糖提取液脱色效果的影响。 3 2 3 3 脱色温度对脱色效果的影响 实验设定脱色温度分别为2 0 、，3 0 。c 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 ；其他 条件为活性炭加量2 ，脱色时间4 5 r a i n ，未调p n ，研究不同脱色时间对川芎 多糖提取液脱色效果的影响。 3 2 3 4 溶液p h 对脱色效果的影响 实验设定活性炭脱色p h 值2 5 、3 5 、4 5 、5 4 、5 5 、6 5 、7 5 ；其他条件 为活性炭加量2 ，脱色时间4 5 m i n ，室温( 约2 0 ) ，研究不同脱色p h 对川 芎多糖提取液脱色效果的影响。 注：原液的p h 值为5 3 5 5 ，实验中均以5 4 表示。 3 2 3 5 活性炭脱色正交试验 在单因素试验的基础上，对影响活性炭脱色的主要因素( a 活性炭用量、 西华大学硕士学位论文 b 时间、c 温度、d p h ) 进行l 9 ( 3 4 ) 正交试验，影响因素水平表见表4 。 表4活性炭脱色影响因素表 t a b l e4f a c t o ro fa c t i v a t e dc a r b o nd e c o l o r i z a t i o ns c h e d u l e 3 2 3 6 脱色次数对脱色效果的影响 实验设定脱色次数为6 - 7 次，研究不同脱色次数对脱色率及多糖保留率 的影响。具体操作如下：量取4 0 m l 川芎多糖提取液，加入一定量的活性炭， 调至相应p h ，在摇床里常温下振荡脱色6 0 m i n 。抽滤结束后吸取2 m l 用以检 测a 3 5 9 和a 6 2 0 ，其余的则按同样条件反复脱色，最后一次脱色完毕后，用 0 4 5 u r n 微孔滤膜抽滤。本实验共分为5 组，以炭加量和p h 为可变条件，时间 和温度为固定条件，力求找到一个脱色率与多糖保留率均较高的脱色条件，具 体安排见表5 。 表5活性炭脱色次数实验安排表 f a c t o ro fa c t i v a t e dc a r b o nd e c o l o r i z a t i o nt i m e ss c h e d u l e 塑型巳蔓塞加量! 丝!堕闽! 墅翌!塑鏖 a 组2 53 b 组2 5 c 组5 4 d 组4 5 e 组3 5 6 0常温 3 2 4 双氧水脱色法的工艺条件研究 准确量取1 0 m l 川芎多糖提取液置于5 0 m l 锥形瓶中，按设定比例缓慢加 入双氧水原液，边加边混匀，避免局部浓度过高，保鲜膜封口，在相应温度下 2 2 西华大学硕士学位论文 水浴振荡一定时间，抽滤，稀释后分别在3 5 9 n m 和6 2 0 n m 检测吸光度，计算 脱色率和多糖保留率。 注：双氧水原液浓度为3 0 。 3 2 4 1 脱色时间对脱色效果的影响 实验设定脱色时间分别为0 2 5 h 、0 5 h 、l h 、2 h 、3 h 、4 h 、5 h ；其他条件 为双氧水用量2 ，温度4 0 ，p h 未调，研究不同时间对川芎多糖提取液脱 色效果的影响。 3 2 4 2 双氧水用量对脱色效果的影响 实验设定双氧水用量分别为0 5 、1 、2 、3 、4 、5 、1 0 ；其他 条件为脱色时间5 h ，温度4 0 c ，p h 未调，研究不同双氧水用量对川芎多糖提 取液脱色效果的影响。 3 2 4 3 脱色温度对脱色效果的影响 实验设定双氧水脱色温度分别为2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 ； 其他条件为脱色时间5 h ，双氧水加量1 ，p h 未调，研究不同温度对川芎多 糖提取液脱色效果的影响。 3 2 4 4 脱色p h 对脱色效果的影响 实验设定溶液p h 分别为4 0 、5 0 、5 5 、6 o 、7 0 、8 0 、9 o ；其他条件为 脱色时间5 h ，双氧水用量1 ，温度6 0 ，研究不同p h 对川芎多糖提取液脱 色效果的影响。 3 2 4 5 双氧水脱色正交试验 在单因素试验的基础上，对影响双氧水脱色的主要因素( a 双氧水用量、 b 时间、c 温度) 进行b ( 3 4 ) 正交试验，影响因素水平表见表6 。 表6双氧水脱色影响因素表 t a b l e6f a c t o ro fh 2 0 2d e c o l o r i z a t i o ns c h e d u l e 西华大学硕士学位论文 3 2 5 大孔树脂脱色法的工艺条件研究 3 2 5 1 树脂的物理结构参数 表77 种大孔树脂的物理结构参数 黾b l e7 p h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e ro fe v e r yr e s i n 型号比表面积平均孔径外观极性产地 ! 丝堡! 婴! d 1 4 0 5 0 0 - - 一6 0 0 9 5白色非极性成都晨光 l s 8 8 5 02 0乳白色非极性西安蓝深 s 8 1 0 0 - - 1 2 0 2 8 - - 3 0乳白色强极性天津南开 d 3 0 1 t淡黄色弱碱性天津南开 b s i i黄色弱碱性成都晨光 d 2 9 6 浅黄色强碱性天津南开 宜宾黄色吸附树脂宜宾天源 3 2 5 2 树脂预处理 ( 1 ) 非离子大孔吸附树脂的预处理 。 树脂湿法装柱，用蒸馏水洗2 - - 一3 b v ： 用9 5 7 , 醇浸泡2 - 3 h 后，再用乙醇洗至1 份流出液兑1 份水不产生浑浊； 用蒸馏水反复洗涤至无乙醇味； 树脂表面层上保持2 - - 一5 m m 液体，以防干柱，备用。 注：b v = 树脂填装的体积，即柱体积。 ( 2 ) 阴离子交换树脂的预处理 树脂湿法装柱后，用蒸馏水洗2 - - 一3 b v ； 用l m o l l 的n a o h 浸泡2 3 h 后，用蒸馏水洗至近中性； 用l m o l l 的h c l 浸泡2 - - 3 h 后，用蒸馏水洗至近中性； 交叉重复、过程2 - - 3 次，最后一次必须用碱洗； 树脂表面层上保持2 - - 一，5 m m 液体，以防干柱，备用。 3 2 5 3 树脂再生 ( 1 ) 非离子大孔吸附树脂 西华大学硕士学位论文 1 m o l l 的n a o h 或1 m o l l 的h c l 以3 - 5 b v h 洗涤层析柱至流出液为无色， 用蒸馏水洗至近中性； 再用2 - 3 b v 的9 5 乙醇洗涤后，用蒸馏水洗至1 份流出液兑1 份水不产生 浑浊； 继续使用或保存于高浓度酒精中。 ( 2 ) 阴离子交换树脂 用l m o l l 的n a o h 以3 - 5 b v h 洗涤层析柱至流出液为无色，用蒸馏水洗 至近中性； 继续使用或保存于高浓度酒精中。 3 2 5 4 流速与滴速关系试验 为了找出流速与滴速的关系，在日后的试验中方便用滴速来计算流速，特 进行如下试验。将预先处理好的d 1 4 0 树脂湿法装柱，柱体积( b v ) = 2 5 m l ， 准确加入5 m l 蒸馏水，计数这5 m l 流体流经层析柱的滴数，并计录所用时间。 流速( b v h ) = 1 6 0 r 两n i n 瓦x5 f m l 注：t 为滴完这5r n l 蒸馏水所用的时间； 流速( b v i i ) 为单位时间( 1 h ) 内流体流经的柱体积数； 滴速( 滴m i n ) 为5 m l 流体流经层析柱的滴数与所用时间的比值。 3 2 5 5 吸附洗脱试验 一定量的川芎多糖提取液流经层析柱后，为了确定洗脱液用量，特进行如 下试验。将预先处理好的d 1 4 0 树脂湿法装柱，准确加入2 5 m l 川芎粗多糖提 取液，蒸馏水洗脱，自加入提取液后每1 0 m l 收集一次，稀释后6 2 0 n m 检测吸 光度。 3 2 5 6 筛选试验 为了筛选出一种