（遗传学专业论文）内皮抑素融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定.pdf

杨梅：内皮抑素融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定内皮抑素融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定研究生：杨梅章金刚研究员导师：磊新妄荔囊摘要1 9 9 7 年o r e i l l y 等从鼠的血管内皮细胞瘤( e o m a ) 培养液中分离得到一种新的血管生成抑制因子，命名为内皮抑素( e n d o s t a t i n ) 。内皮抑素能有效抑制血管内皮细胞的增殖，进而抑制新生血管生成。由于肿瘤的发生和发展必须依赖大量的血管生成，因此，内皮抑素为肿瘤治疗提供了新的途径。目前已上市的抗癌新药恩度( e n d o s t a r ) 半衰期较短( 约为1 0 h ) ，需要每天静脉注射给药，加重了患者的经济负担。因此开发长效的内皮抑素药物显得更加重要。本研究旨在构建e n d o s t a t i n 与人血清白蛋白( h u m a ns e n l r na l b u m i n ，h s a ) 的融合基因e n d o a l b u ，表达e n d o a l b u融合蛋白，可望延长内皮抑素的半衰期，为开发长效的内皮抑素制剂奠定基础。1 e n d o a l b u 融合蛋白的空间结构预测为了延长e n d o s t a t i n 在体内作用的半衰期，采用富含甘氨酸与丝氨酸的柔性肽( g l y 4 s e r ) 3 将e n d o s t a t i n 与h s a 进行连接，构成e n d o a l b u 融合蛋白。h s a 由三个相似的结构域组成，每个结构域由两个亚结构域组成，形成圆桶状结构，几乎所有疏水性氨基酸都包埋在圆桶内部，构成疏水腔。为了验证h s a 这种特殊的蛋白结构在融合蛋白中是否对e n d o s t a t i n 的功能位点产生影响，我们对融合蛋白的结构进行了预测。结果表明e n d o s t a t i n 的结构域保持独立。2 e n d o a l b u 融合基因的构建采用重叠延 * p c r 的方法，构建了融合基因e n d o a l b u ，并将其克隆入p g e m t载体中。测序结果表明融合基因序列与g e n b a n k 数据库( n c b i ) q b 的e n d o s t a t i n 的a j 4 9 4 8 3 7 及h s a 的c r 6 0 7 9 2 8 序列完全一致。3 e n d o a l b u 融合蛋白的表达、鉴定与纯化将e n d o a l b u 融合基因克隆至酵母表达载体p p i c 9 中，然后将鉴定正确的重组表达载体p p i c 9 一e n d o a l b u 线性化后转入g s l l 5 。采用原位双膜筛选法快速筛选出表达株，并对其进一步鉴定后进行扩大培养。采用硫酸铵沉淀和蓝色琼脂糖凝胶f f 亲和层析的方法从酵母培养液的上清中成功分离出高纯度的目的蛋白。扬i 1 大学硕士论文4 e n d o a l b u 融合蛋白的生物学活性测定采用m t 法对纯化后的e n d o a l b u 融合蛋白进行测定，结果表明e n d o a l b u融合蛋白对人脐静脉内皮细胞e c v - 3 0 4 的增殖具有很好的抑制作用，抑制作用呈现剂量依赖性，其i c 5 0 为8 4 i t g m l 。在c a m 实验中发现其能显著抑制c a m x 新生血管生长。5 结论本研究在对e n d o a l b u 融合蛋白空间结构预测的基础上，构建了e n d o a l b u 融合基因，并对融合蛋白进行了表达、鉴定、纯化及生物学活性的测定。结果表明表达的e n d o a l b u 融合蛋白具有良好的生物学活性，为长效e n d o s 诅t i n 制剂的研究提供了理论依据。关键词：内皮抑素；人血清白蛋白；融合蛋白；e n d o a l b u ；毕赤酵母分泌表达；生物学活性杨梅：内皮抑素融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定i i ie x p r e s s i o na n di d e n t i f i c a t i o no fe n d o s t a t i o nf u s i o np r o t e i ni np i c h i ap a s t o r i sm s c a n d i d a t e ：m e iy a n ga d v i s o r s ：r e s e a r c h e rj i n g g a n gz h a n gp t o f e s s o rx i n a nj i a oa b s t r a c to r e i l l ye ta lf o a n dan e wa n t i a n g i o g e n e s i sf a c t o rc a l l e de n d o s t a t i nw a si s o l a t e df r o mc u l t u r e so fm o u s eh a e m a n g i o e n d o t h e l i o m a r e o m a ) i n1 9 9 7 e n d o s t a t i nc a ni n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no fe n d o t h e l i a lc e l l s ，a n dt h e ni n h i b i tt h eg r o w t ho fn e wb l o o dv e s s e l s t h eg r o w t ha n dm e t a s t a s e so ft u m o r sd e p e n do nn e o v a s c u l a r i z a t i o n , t h u se n d o s t a t i nb e c o m ean e ws t r a t e g yf o rt u m o rt h e r a p y an e wc o m m e r c i a la n t i c a n c e rd r u gn a m e de n d o s t a ro n l yh a st h es h o r th a l f - l i f co fa b o u tt e nh o u r s s ot h i sd r u gn e e d st ob ei n j e c t e dt op a t i e n t so n et i m ead a ya n di ti n c r e a s e sp a t i e n t s b u r d e n t h e r e f o r e i ti si m p o r t a n tt od e v e l o ps o m ek i n d so fl o n g - a c t i n ge n d o s t a t i na g e n t s t h ea i mo ft h i sr e s e a r c hp r o g r a l t li st oc o n s t r u c te n d o s t a i n 一爿黝f u s i o ng e n ea n de x p r e s st h ef u s i o np r o t e i nt op r o l o n gt h eh a i f - l i f eo fe n d o s t a t i n w h i c hl a yt h ef o u n d a t i o nf o r t h ed e v e l o p m e n to fl o n g a c t i n ge n d o s t a i nd r u g 1 t h ep r e d i c t i o no fe n d o a l b u ss p a c i a ls t r u c t u r et op r o l o n ge n d o s t a t i n sh a l f - l i f e ，l i n k e r ( g l y 4 s e r ) 3 ，w h i c hi sr i c hi ng l y e i n ea n ds e r i n e i su s e dt oc o n n e c te n d o s t a t i na n dh s at of o r maf u s i o np r o t e i n m es i m i l a rd o m a i n sm a k eu do f h s ap r o t e i n , e v e r yd o m a i nc o n t a i n st w os u b d o m a i n sw h i c hf o r mac y l i n d r a c e o u ss t r u c t u r e m o s to ft h e s eh y d r o p h o b i ca m i n oa c i d sl o c a t ei nt h ei n s i d ec h a m b e ro ft h ec y l i n d r a c e o u ss t r u c t u r ea n dh y d r o p h o b i cc h a m b e r sa r ep r o d u c e d i no r d e rt ov e r i f yw h e t h e rt h i ss p e c i a ls t r u c t u r eo ft h eh s ap r o t e i nw i l la f f e c tf u n c t i o n a ls i t e so f e n d o s t a t i n , w ep r e d i c t e dt h es t m c t u r eo f f u s i o np r o t e i n t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ee n d o s t a t i ne x h i b i tt h ei n d e p e n d e n ts n l l c t i l r ei nt h i sf u s i o np r o t e i n 2 t h ec o n s t r u c t i o no fe n d o a l b uf u s i o ng e n et h ee n d o a l b uf u s i o ng e n ew a sc o n s t r u c t e db yo v e r l a pe x t e n s i o np c rm e t h o d ，a n dt h e nc l o n e di n t ot h ep g e m tv e c t o r t h ed n as e q u e n c i n go ff u s i o ng e n es h o w e dt h a tt h eh u m a ne n d o s t a t i ng e n ea n dh u m a ns e r u ma l b u m i ng e n ew e r ee x a c t l yi d e n t i c a lt oa j4 9 4 8 3 7a n dc r6 0 7 9 2 8s e q u e n c ei no e n b a n ko f n c b ir e s p e c t i v e l y 扬卅l 大学硕士论文3 t h ee x p r e s s i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fe n d o a i b uf u s i o np r o t e i ne n d o a l b ug e n ew i t hc o r r e c td n as e q u e n c ew a sc l o n e di n t op p i c 9v e c t o rt of o r n lr e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 一e n d o a l b u 。t h e nt h ec o i t e c te x p r e s s i o nv e c t o rw a sl i n e a r i z e da n dt r a n s f o r m e di n t og s l l5 h i 曲y i e l de x p r e s s i o ns t r a i n sw e r es c r e e n e db yi ns i t ud o u b l e - f i l mm e t h o da n de x t e n s i v e l yc u l t u r e da f t e ri d e n t i f i c a t i o n f u s i o np r o t e i nw a sp u r i f i e db yt h em e t h o d so f a m i n o n i u n ls u l f a t ep r e c i p i t a t i o na n db l u es e p h a r o s e6 bf a s tf l o w 娟n i t yc h r o m a t o g r a p h yf r o mt h ey e a s tc u l t u r es u p e r t a n t 4 b i o a c t i v e i t yd e t e c t i o no f e n d o a i b uf u s i o np r o t e i nt h ep u r i f i e de n d o a l b uw a sd e t e c t e db ym t tm e t h o da n dr e s u l t ss h o w e dt h a ti tc o u l do b v i o u s l yi n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no fh u m a nv e i ne n d o t h e l i a lc e l l si nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e ra n dt h ei c s ow a se s t i m a t e dt ob e8 4 1 t g m l p u r i f i e de n d o a l b uc o u l da l s oi n h i b i tt h ef o r m a t i o no fn e wb l o o dv e s s e l si nc h i c k e nc h o r i o a l l a n t o i cm e m b r a n e ( c a m ) e x p e r i m e n t 5 c o n c l u s i o no nt h eb a s eo ft h ep r e d i c t i o no fe n d o a l b u ss p a c i a ls t r u c t u r e ，t h ee n d o a l b uf u s i o ng e n ew a sc o n s t r u c t e d ，a n dt h e nt h e f u s i o np r o t e i nw a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e da n dp u r i f i e d t h er e s u l ti n d i c a t e st h a te n d o a l b uf u s i o np r o t e i nh a sf a v o r a b l eb i o a c t i v i t y ,w h i c hp r o v i d e st h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h ep r e p a r a t i o no f l o n g a c t i n ge n d o s t a t i n k e yw o r d s ：e n d o s t a t i n ；h u m a ns e r u ma l b u m i n ；f u s i o np r o t e i n ；e n d o a l b u ：p l c h i 口p a s t o r i s ；s e c r e t i v ee x p r e s s i o n ；b i o a e t i v i t y杨梅：内皮抑素融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定缩写a m pbb c ab c i pb m g yb m m yb s ab pc ac a mddd m e md m s od n ad n t pe be c vg yhhh s ai c 5 0i p t gk bk d al bmm dm gn l mm lt英文a m p i c i l l i nb i o t i nb i c i n c h o n i n i ea c i d符号说明5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y - p h o s p h a t eb u f f e r e dg l y c e r o l - c o m p l e xm e d i u mb u f f e r e dm e t h a n o l c o m p l e xm e d i u mb o v i n es e r u m a l b u m i nb a s ep a i rc e l l a l o s ea c e t a tc h o r i o a l l a n t o i cm e m b r a n ed a yd e x t r o s ed u t b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u md i m e t h y ls u l f o x i d ed e o x yr i b o n u c l e a s et e t r a h y d r o c h l o r i d ed e o x y r i h o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t ee t l l i d i u mb r o m i d ev e i ne n d o t h e l i a lc e l l sg l y c e r o lh o u rh i s t i d i n eh u m a ns e r u ma l b u m i ni n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n5 0 i s o p m p y l p d - t h i o g a l a c t o s i d ek i l o b a s ek i l o d a l t o nl u r i a - b e r t r i l im e d i u mm e t h a n o lm i n i m a ld e x t r o s em e d i u mm i l l i g r a mm i n u t em i l l i l i t e rm i n i m a lm e t h a n o lm e d i u m3 - ( 4 , 5 ) - d i m e t h y l t h i a h i a z o ( - z - y 1 ) 3 , 5 -d i p h e n y t e t r a z o l i u m r o m i d e中文氨苄青霉素生物素二辛可宁酸5 溴4 氯3 吲哚磷酸缓冲甘油培养基缓冲甲醇培养基牛血清白蛋白碱基对醋酸纤维素鸡胚绒毛尿囊膜天葡萄糖d a l b e c c o 改良的e a g l e 培养基二甲基亚砜脱氧核糖核酸脱氧核糖核苷三磷酸溴化乙锭脐静脉内皮细胞甘油小时组氨酸人血清白蛋白半抑制浓度异丙基硫代1 3 d 半乳糖苷千碱基对千道尔顿l b 培养基甲醇m d 培养基毫克分钟毫升m m 培养基噻唑兰( 甲基偶氮唑兰)2扬州大学硕士论文m u t +n b tn co dp bp b sp c rp e gp hs d s p a g es e cs p ft a et b svx - g a ly n by p dm e t h a n o lu t i l i z a t i o np h e n o t y p en i r t ob l u et e t r a z o l i t t mc e l l u l o s en i t r a t eo p t i c a ld e n s i t yp h o s p h a t eb u f f e rp h o s p h a t eb u f f e rs a l i n ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np o l y e t h y l e n ep o w e ro f h y d r o g e ns o d i u md o d e c y ls u l p h a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r s i ss e c o n ds p e c e f i cp a t h o g e nf r e et r i s c l - a c e t a t e e d t ab u f f e rt r i s b u f f e r e ds a l i n ev o l t a g e5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 3 - i n d o l y l 1 3 - d g a l a c t o p y r a n o s i d ey e a s tn i t r o g e nb a s ey e a s te x t r a c tp e p t o n ed e x t r o s em e d i u m甲醇利用阳性表型硝基四氮唑蓝硝酸纤维素光密度磷酸缓冲溶液磷酸缓冲盐溶液聚合酶链式反应聚乙二醇酸碱值十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳秒无特定病原体t r i s 缓冲液t r i s 缓冲液伏特5 溴_ 4 氯3 吲哚d d 半乳糖昔酵母基础氮源y p d 培养基杨梅：内皮抑素融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定3综述基因修饰药物的长效性基因工程药物，又称为重组药物，是利用基因工程技术，将目的基因( 如人干扰素基因) 经重组技术导入微生物( 如大肠杆菌、酵母等) 或动、植物细胞中，通过发酵或细胞繁殖来生产出大量多肽或蛋白质( 如重组人干扰素) 制成的药物。利用人体内的天然活性物质来治疗人类的疾病一直是医学上的一个重要领域，但人体中多数极为重要的细胞因子、激素、酶类等含量极低，难以大量获取，通过基因工程技术能够很容易地获得大量的目标蛋白质用于商品化药物的生产1 1 1 。1 9 8 2 年，第一家遗传工程公司l i l l y 开发的基因工程人胰岛素推向市场，揭开了应用基因工程技术生产重组药物的序幕t 2 1 。1 9 8 9 年，我国批准第一个生物工程药物重组人干扰素1 b o j 。1 国内外生物制药行业状况目前美国和欧洲分别拥有生物技术公司约1 3 0 0 家和7 0 0 家。在美国己批准上市的生物药物有：重组n - l 干扰素、重组a - 2 a 干扰素、重组a - 2 b 干扰素、重组b l a 干扰素、重组b 1 b 干扰素、重组7 - 1 b 干扰素、重组自介素- 2 、重组白介素- 1 1 、重组红细胞生成素、重组人胰岛素、重组人粒细胞集落刺激因子、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组组织型纤溶酶原激活物、重组血小板源性生长因子、重组 i l i a 因子、重组人因子、重组人因子、重组人生长激素、重组链球菌d n a酶a 、重组乙型肝炎疫苗、重组乙型肝炎核心抗原、重组抗c d 2 0 单抗、重组抗白介素- 2 c t 受体抗体、重组抗癌胚抗原抗体、重组p 一葡糖脑苷脂酶、重组于细胞因子等。还有约7 0 0 种基因工程药物正在进行临床研究和f d a 评估，约7 0 0 种药物已进入早期研究阶段吼目前经中国s f d a 批准的基因工程药物有1 9 种【拍l ( 表1 ) 。4扬州大学硕士论文注射用重组人a 干扰素l b赛若金1 9 8 9冻干滴眼用重组入表皮生长因子注射用重组干扰索叫注射用重组链激酶注射用分泌型基因重组人生长激素慢性乙型肝炎、丙型肝炎和毛细胞自血瘸艾唯尔1 9 9 6眼角膜损伤丽珠因得福1 9 9 6思凯通1 9 9 6疗效不佳的类风湿关节炎急性心肌梗塞金磊 赛增1 9 9 7重度烧伤重组人o o2a 干扰素福康泰注射用重组入干扰素m 2b 利分能重组人红细胞生成素注射液重组人碱性成纤维细胞生长园子重缎人粒细胞集落刺激因子注射液注射用重组人粒细胞巨噬细胞重组人白介素- 2宁红欣扶济复吉粒芬特尔立长生安基因重组人胰岛素甘舒霖重组人p 5 3 腺病毒注射液今又生羹墼望重组改构人肿瘤坏纳科思死因子。注射用重组葡激酶施爱克差组人血小板生成素注射特比澳液重r 组人血管内皮抑制素注恩度月v l f , r 口r重组人5 型腺病毒注射液安柯瑞肿瘤、疱疹病毒、乙肝、丙肝病毒感染。慢性乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、带状疱疹、口唇疱疹、尖锐湿疣、慢性宫颈炎、流感肾功能不全所致贫血、外科围手术期的红细胞动员促进创面愈合，可用于烧伤创面癌症化疗等原因导致的中性粒细胞减少症骨髓抑制性治疗引起的白刺激因子细胞减少症肾细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌等恶性肿瘤、先天或后天免疫缺陷症的治疗、自身免疫疾病等i 型和u 型糖尿病现有治疗方法无效的晚期鼻咽癌肺癌等实体瘤成人冠状动脉血栓引起的急性心肌梗塞溶栓治疗实体瘤化疗后所致的血小板减少症联合n p 化疗方案用于治疗处治或复治的m v 期q e - 4 , 细胞肺癌患者对常规放疗或放疗加化疗治疗无效，并于5 一f u 、顺铂化疗方案进行姑息治疗的晚期鼻咽癌注：不同产家生产的同类产品中只列举第一个被s f d a 批准的药物的商品名。2 基因工程药物销售情况与市场前景聊嗍咖嗍卿嗍聊嚣姗础|；l ；杨梅：内皮抑素融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定5根据市场分析，基因工程药物的市场规模在2 0 0 1 年2 0 0 4 年间有了长足发展，2 0 0 1 年的全球市场规模为2 1 4 7 亿美元，到2 0 0 4 年已经增长到3 4 8 亿美元，平均年增长率达到2 l 。到2 0 1 0 年，基因工程药物的总市场规模预计增长到5 2 1 5 亿美元，将成为医药行业中获利最丰厚的市场之一曲。我国生物制药的研究和开发起步于上世纪7 0 年代，到了9 0 年代已有许多产品步入产业化并陆续上市，据不完全统计，我国已有1 9 个产品投入市场，有2 0 多种基因工程药物处于开发阶段。1 9 9 6 年我国生物技术药品产值约为1 8 亿元，到1 9 9 7 年底上市的基因工程药物有1 2 种，年产值达3 0 亿元，2 0 0 0 年产值则达到6 9 亿元，2 0 0 3 年达到9 9 亿元。有关专家预测，未来的若干年内，生物制药产业年平均增长率不会低于1 2 ，发展前景广阔【4 l 。3 基因工程药物的优、缺点新崛起的基因工程技术在医药研制方面的应用己取锝了十分显著的成效。首先，基因工程技术能明显提高生化药物的生产效率、降低生产成本和改进医疗效果。如用4 5 0 升含人体生长激素基因的微生物发酵液生产的激素，相当于从6 万具尸体的脑垂体中所得的激素量。其次，基因工程提供了大规模制取人体内活性物质的技术。人体内的许多生物活性极强、含量极微的活性物质，用传统技术难以制备，而用基因工程技术则可以在极其复杂的机体细胞内提取出所需的基因，生产出比原来多数百倍乃至数千倍的该类物质。其三，基因工程药物对以往难以治疗的病症有特效，如人的促红细胞生长素是治疗由肾功能衰竭引起的贫血的特效药。其四，基因工程药物大多来自人体内蛋白质、激素或活性多肽，一般毒副作用较少。最后，生产基因工程药物与生产化学合成药物不同，一般不需要庞大的厂房，污染问题也比较容易解决，新药开发周期较短p l 。随着基因工程技术的发展，生物技术药物的发展己进入蛋白质工程药物新时期，第一代生物技术药物逐渐被第二代基因工程药物所取代，很多蛋白质和多肽药物能够通过基因重组技术得到有效的开发。蛋白质和多肽药物与化学合成药物相比，具有副作用小、用量少、疗效好等特点，普遍受到医生和患者的欢迎，因此蛋白质和多肽药物具有广阔的发展前景。但是，蛋白质和多肽药物在用药时也存在着问题，如蛋白质和多肽药物的分子量不高，容易被肾小球过滤；血液内存在很多蛋白酶，使蛋白质药物分解而失去药效。这些问题会造成药物的半衰期短。另外，对于外源性蛋白质药物，人体内会产6扬州大学硕士论文生抗体，与蛋白质结合使其失去药效，并引起副作用。由于蛋白质和多肽药物的半衰期短，药物刚进入体内时，浓度一度会过高，产生较强的副作用。但随后药物浓度又会立即下降到有效药用浓度以下，而起不到治疗作用，因此，必须频繁给药，例如r h g c s f ( 重组人粒细胞集落刺激因子) 需要每天注射1 次，这不仅给患者带来很大的经济负担，影响了患者及其家属的生活质量，同时频繁用药的副作用又会导致其它疾病。4 长效蛋白质和多肽药物长效蛋白质和多肽药物剂型的研究不但能解决上述现有药物所存在的问题，而且能推动新的蛋白质和多肽药物的应用开发，使一些由于半衰期短、副作用大而无n 。法进入实际应用的药物获得理想的临床效果( 如抗肿瘤药等) ，从而为人民身体健康带来福音。2 0 0 4 年医药技术与经济发布会上，北京未名生物工程集团首席科学家于在林就指出改进( 长效) 性基因工程药物的研发是我国生物技术制药的突破口。延长蛋白质药物半衰期基于三种原理：( a ) 增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤率；( b ) 利用游离型药物和结合型药物在血浆内形成平衡的特点，缓慢释放游离型蛋白药物，使结合型药物和游离型药物的平衡向游离型药物方向移动；( c ) 减少异源蛋白的免疫原性，从而减少其体内清除率9 1 。近几年来各国学者主要从p e g 化修饰、基因融合( h s a 融合蛋白、f c 融合蛋白) 、构建突变体、点突变以及制剂改造等方面进行长效基因工程药物的研究。4 1p e g 化修饰p e g 化( p e g y l a t i o n ) ，即聚乙二醇( p o l y e t h y l e n e ，p e g ) 共价修饰蛋白质。2 0 世纪7 0 年代末，r u t g e r s 大学的f r a n kf d a v i s 教授等最早开发并使用聚乙二醇化技术来修饰蛋白质。当时研究的目的是为了解决异源蛋白的免疫原性问题，f r a n k e d a v i s 教授等认为加上一个亲水聚合物后，可以降低蛋白免疫原性，因此他选择了2 0 0 0 5 0 0 0 道尔顿的聚乙二醇。通过修饰后，他发现不仅蛋白的免疫原性成功减少，而且半衰期也大大延长【9 】。用聚乙二醇修饰蛋白质药物具有很多优点：( a )增大蛋白质药物的分子量，减少被肾小球过滤的频率，提高药物在体内的半衰期0 0 1 ；( b ) 保护蛋白质免受蛋白酶的降解1 1 】；( c ) 屏蔽外源性蛋白质的免疫原性，减少副作用：( d 1 蛋白质被修饰后仍能保持一定的活性，通过在体内长时间循环，起到杨梅：内皮抑素融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定7稳定的治疗效果；( e ) 适当的修饰产物能在体内水解，缓慢释放出药物，不但能使蛋白质药物恢复其活性，而且能长时间保持血液内的药物有效浓度：( f ) 聚7 , - - 醇是f d a 已经批准的药用材料，只要解决修饰剂和修饰工艺中的关键技术，就能迅速地得到批准并投入应用。p e g 化学修饰方法可分为两代，第一代p e g 化使用分子量1 2 k d a 的p e g 分子。先灵葆雅公司研究所( s p r i ) 在研究聚乙二醇干扰素o t 2 b ( 商品名：佩乐能) 时发现干扰素必须通过与细胞表面一种叫做干扰素受体的蛋白质结合才能起作用。聚乙二醇化后，干扰素与受体的结合会受到影响，使它的活性下降，而这种影响的大小取决于聚乙二醇分子的大小，聚乙二醇的分子越大，影响就越大。经过多年反复的研究，s p r i 最终确定1 2 k d a 分子大小的聚乙二醇是最理想的聚乙二醇，它在延长半衰期的同时，对干扰素活性的影响最小，既保证了一周一次给药，又最大程度地保留其抗病毒活性1 1 2 1 。第二代p e g 化采用分支的p e g t l 3 1 代替线性的p e g ，增加偶联p e g 的分子量，使偶联的p e g 分子量达到6 0 k d a t 4 1 ，并且增加偶联的p e g 数目，使每个p e g 化位点可以偶联两个p e t 分子。第二代p e g 化和第一代p e g 化修饰相比，由于使用分支的p e g 代替线性的p e g ，减少了蛋白酶和蛋白的接触，在很大程度上减弱了蛋白酶对蛋白药物的水解作用：分支p e g 对蛋白质屏蔽效应更为显著，使蛋白药物的抗原性和免疫原性降低；更重要的是随着偶联的p e g 分子量的增大，体内清除率下降，血清半衰期得到了进一步的延长。目前已上市的p e g 化的蛋白药物如p e g 化的l 天冬酰胺酶 1 5 ( e n z o n 公司的o n c a s p a r ) 、p e g 化的i f n a 2 b 1 6 1 ( s c h e r i n g 公司的p e g i n t r o n ) 、p e g 化的i f n c t 2 a 16 】( r o c h e 公司的p e g a s y s ) 和p e g 化的g c s f0 7 1 ( a m g e n 公司的n e u l a s t a ) 。它们经p e g 修饰后的特征，见表2 s l ：表2 已上市的p e g 化蛋白药物p e g 修饰前后体内半衰期比较t a b l e 2h a l f - l i f ec o n t r a s to f c o m m e r c i a ld r u gb e f o r ea n da f t e rp e g y l a t i o n药物名称平均分子量鞴碧子p e 量g未半p e 衰g 砦的p e g 萎磊的半公司p e g 笆篓! ：蚕苎譬胺酶1 4 3 k d a5 k d a2 0 h两周e 尬l u n c a s d a f ，p e g 化粤1 紫b ( a 阢3 1 k d a1 2 k d a4 1 2 h4 0 hschedngintron)v。卧裟兰s 。k d a。k d as 加蛐勋m8扬州大学硕士论文4 2 基因融合通过基因融合技术增加多肽和蛋白药物分予量或改变与受体的亲和性等原理延长药物半衰期。4 2 1h s a 融合蛋白人血清白蛋i 刍( h s a ) 是现有天然载体蛋白之一，并且是血液中含量最高的单一蛋白( 达4 0 9 l ) ，是人体血浆的主要蛋白成分，在体内有维持血液渗透压，运输营养和其它重要生物物质的作用，具有无免疫原性，人体相容性好，分子量大( 约为6 8 k d a ) ，半衰期长( 近1 9 d ) 1 8 1 等特性，已成功地在哺乳动物细胞和酵母中实现其高效表达。利用基因工程技术，将传统治疗性蛋白质药物基因与人血清白蛋白基因相连、重组，并在酵母菌内表达，从而获得重组的长效蛋白药物( 图1 ) 。治疗性蛋白质由人血清白蛋白带入体内，除了保持原有治疗性蛋白质的优点以外，还使治疗性蛋白质在体内存活半衰期大大延长，使其具有长效和缓慢释放、疗效更佳，病人易于接受，注射次数减少等优点。图1h s a 与多肽的基因发生融合导致了重组蛋白的产生f i g 1f o r m a t i o no f r e c o m b i n a n tp r o t e i nb yh s ag e n ef u s i o n1 9 9 0 年英国d e l t a 公司首先将白蛋白用于基因融合提高多肽、蛋白药物的半衰期，1 9 9 7 年申请了h s a 与人生长激素( h g s ) 的融合蛋白的专利i 旧。随后，许多科研工作者展开对h s a 融合蛋白的研究，h s a 融合蛋白技术是临床上确认有效的技术，已被证明能显著加快生物制药学产品的开发，这些产品在大量的临床i i 期实验中显示出了安全、有效的特性。与其它方法相比，h s a 融合技术具有以下优点：( 1 ) h s a 与目标蛋白在胞内经杨梅：内皮抑素融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定9蛋白翻译系统通过肽键连接，不需额外的体外处理；( 2 ) h s a 的表达水平高，与其融合后可以提高目的蛋白的表达水平：( 3 ) h s a 是一个稳定的“惰性”蛋白，与其融合后可以提高目的蛋白的稳定性；( 4 ) h s a 融合蛋白具有比p e g 修饰的蛋白药物更长的半衰期。h g s ( h u m a ng e n o m es c i e n c e s ) 公司公布的临床结果表明h s a - i f n融合蛋a l b u f e r o n 的半衰期长达1 4 5 h ，而p e g 修饰的干扰素的半衰期只有4 0 8 0 h 。目前h g s 公司已有白蛋白融合生长激素( m b u t r o p i n ) ，白蛋白融合粒细胞生长因子( a l b u g r a n i n ) 及白蛋白融合干扰素( a l b u f e r o n ) 等产品先后进入了i i i 期临床研究，并显示出了较长的体内半衰期和较好的安全性及体内疗效i 。4 2 2f c 融合蛋白利用抗体f c 段所特有的生物学功能与某些多肽或蛋白融合可增加该蛋白的血浆半衰期。f c 融合蛋白具有许多特性：引入重链稳定区，使融合蛋白半衰期明显延长，更适合于重组蛋白在体内应用。f c 段具有穿过胎盘、结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用、结合f c 受体并介导a d c c 效应等。镬) i g g ，i g m 和i g a 的f c 结构域可形成多聚分子，使重组蛋白具有更强的抗原结合力。上述特性使融合蛋白在下列领域具有广泛的临床应用前景叫1 。已上市的f c 融合蛋白有：1 9 9 8 年批准的e n b r e l ( a m g e n ) 是t n f 受体和i g g的f c 片段的融合蛋白，含9 3 4 个氨基酸，适应症为风湿性关节炎，为“重磅炸弹”，近5 年的销售额约1 0 0 亿美元。2 0 0 3 年上市的a m e v i v e ( b i o g e nl d e c ) 是l e f 3 的c d 2 与i g g 的f c 片段的融合蛋白，适应症是牛皮癣【2 2 l 。4 3 构建突变体通过构建突变体延长蛋白药物半衰期，常用方法有：1 、增加蛋白药物的糖基化程度，通过糖基化一方面在蛋白药物表面增加了侧链，增加蛋白质稳定性，阻碍了蛋白酶对蛋白药物的降解作用，另一方面使蛋白药物分子量增大，减少了肾小球滤过；2 、通过形成缓释的微沉淀物，使释放游离型药物的时间延长，例：l a n t u s是从大肠杆菌k 1 2 株表达的重组人胰岛素的突变体，在人胰岛素a 链第2 1 个位点将a s p 突变成g l y ；在b 链碳端最后第3 0 个位点加两个a r g ，使胰岛素等电点p i由原来的p h 4 0 变为p h 6 7 。这种突变使其在酸性环境下为完全澄清溶液，一旦注入皮下组织( p n 值提高) 则因为等电点特性，变成不溶的微沉淀物，可持续释放，最终进入血液，形成一平稳、长时间、无尖峰的药物浓度曲线，趋近于正常生理胰1 0扬州大学硕士论文岛素的基础分泌曲线【6 1 。4 4 点突变利用寡核苷酸引物、p c r 介导的定点突变及盒式突变等方法使蛋白药物中影响活性或稳定性的氨基酸发生突变可以有效提高蛋白稳定性，增加药物半衰期。例如白介素一2 是一条1 3 3 个氨基酸组成的多肽链，其中呈游离状态的c y s 1 2 5 易形成错误的二硫键配对或形成分子之间的二聚体影响活性和稳定性，将c y s 。1 2 5 用s e r 或a l a 取代后生物活性比正常高1 倍，体内半衰期由数分钟提高到1 2 h 口3 j 。重组组织型纤溶酶源激活) 前j ( r t p a l 能高效特异地溶解血栓，目前两种新型t p a ( k 2 t p a 、t n k - t p a ) 已被欧洲和美国批准上市。k 2 - t p a 保留了t p a l 3 及1 7 6 5 2 7 位氨基酸的肽段，缺失k i 区、e 区和f 区使之成为单链多肽，无糖基侧链，半衰期延长4 5 倍；t n k - t p a 突变体是将t p a1 0 3 位1 1 1 r 变成a s n ；1 1 7 位a s n 变成g h ；l y s 2 9 6 一h i s 2 9 7 一a r 9 2 9 8 - a r 9 2 9 9 替换成4 个a l a ，该突变体血清清除速率降低4 倍左右，已获得美国f d a 批准上市。自然界中亦存在天然突变体，使其具有更高的生物学活性和更长的血浆半衰期，如载脂蛋白a i ( a p o a i ) 的米兰突变体( a i m ) ，即a p o a i 的a r 9 1 7 3 突变为c y s l 7 3 ，两个a i m 单体通过c y s l 7 3 之间的二硫键形成同源二聚体，血浆半衰期得到进一步延长”9 1 。4 5 制剂改造重组蛋白药物是生物技术药物中很重要的一类，临床上一般通过静脉和皮下注射给药。经静脉和皮下注射后常伴有蛋白质降解，导致活性降低生物利用度低，要达到需要的血药浓度和治疗效果需要反复给药，不仅给患者带来不便，且易产生耐受性，耐药性及免疫原性等不良反应。用微囊包埋蛋白质和多肽药物，不仅可以通过缓释作用开发长效皮下注射制剂，而且可以通过优化微囊表面和粒径的设计，开发口服、黏膜给药、吸入等新剂型。微囊型的皮下注射制剂必须解决包埋和释药过程中的蛋白质活性保持问题。口服制剂必须