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水产品中副溶血性弧菌快速检测技术及风险评估研究 摘要 副溶血性弧菌是我国一种重要的食源性病原菌，可引起急性胃肠炎，少数情 况还能引发败血病，危及生命。目前，副溶血性弧菌己成为我国一个严重的食源 性公共卫生问题之一。该菌引发的疾病居微生物性食源性疾病暴发之首，且发病 人数呈显著上升趋势。特别在沿海地区，发病起数和涉及人数较我国其它地区更 为严重，必须建立可靠的快速检测方法，持续地进行水产品中副溶血性弧菌的主 动监测和污染控制。 本文以副溶血菌具有种特异性的砌基因为靶基因，建立聚合酶链式反应 ( p c r ) 方法检测水产品中的副溶血性弧菌。经过特异性实验证明本方法具有很 好的特异性。用p c r 法对四种水产品中副溶血性弧菌进行检测，同国标方法检 测结果完全一致，表明此法适合于快速检测水产品中副溶血性弧菌。对于水产品 样品，副溶血性弧菌含量为1 c f u m l 的样品匀浆液增菌5 h 后，就可以达到最 低检出要求。此法大大缩短了副溶血性弧菌的检测时间( 7 h 8 h ) ，提高了检测效 率，可以满足快速检测水产品中副溶血性弧菌的需要，为行业提供科学可靠的技 术支持。 青岛作为沿海城市，由于水产品的消费量较大且某些居民有生食海鲜的习 惯，副溶血性弧菌成为主要的食源性致病菌，因此有必要了解青岛地区零售水产 品中副溶血性弧菌的污染情况，以作出应对措施确保消费者安全。运用快速检测 方法( p c r 法) 和m p n 法，调查分析了2 0 0 5 年1 2 月至2 0 0 6 年1 2 月期间青岛 地区零售环节副溶血性弧菌的污染情况，比较了在不同月份和不同采样地点，同 种水产品中副溶血性弧菌含量变化并比较了不同种类水产品中副溶血性弧菌的 l 污染水平，同时分析了青岛地区水产品中副溶血性弧菌污染情况同我国其他沿海 地区的污染情况。结果表明，青岛零售水产品受副溶血性弧菌污染严重。水产品 中副溶血性弧菌的含量会随采样地点、时间有所不同，青岛地区相较我国其他沿 海地区而言，零售水产品中副溶血性弧菌污染状况更为严重。有必要加强对水产 品的检验监督力度，并进行水产品中副溶血性弧菌的风险评估，根据评估结果提 出合理的风险管理措施。 利用风险评估软件r i s kr a n g e r ，进行青岛零售水产品中副溶血性弧菌的半 定量风险评估，预测消费者因食用被致病性副溶血性弧菌污染的水产品所面临的 风险。半定量风险评估结果为：青岛地区食用水产品摄入副溶血性弧菌引发疾病 的风险级剐为5 2 ，青岛地区每个消费者每天的发病几率为4 6 1 l o 石，青岛地区 每年预测总发病人口数为9 2 3x1 0 2 ，即每年青岛地区由副溶血性弧菌引发胃肠 炎的人数为9 2 3 人，推测这个数与实际数据较为接近。基于评估内容和结果，提 出风险的管理措施，以保证消费者的安全：( 1 ) 运输、零售环节要有良好的存放 条件；( 2 ) 建议家庭自己制作时要充分的烹调，在不影响风味的同时尽可能延长 煮沸时间，充分地杀掉水产品体内的致病菌；( 3 ) 加强零售水产品的监管力度； ( 4 ) 完善我国食源性疾病监控网络；( 5 ) 尽快制定水产品中副溶血性弧菌的限 量标准，完善我国食品中微生物标准体系。青岛地区零售水产品中副溶血性弧菌 的半定量风险评估，这在我国尚属首次，为以后开展全面、科学的风险评估提供 良好的技术支持。 通过半定量风险评估，可以得到青岛地区消费者的风险级别，相对于定量风 险评估的成本更低、耗时短。但如果需要更精确的预测数据，应用数学模型模拟 实际情况，进行定量风险评估。本文初步探讨了用定量的方法评估消费者生食水 产品所面i | 螽的风险。定量风险评估包括危害识别、危害描述、暴露评估和风险描 述四部分内容。参考世界卫生组织( w h o ) 和美国食品药品监督管理局( f d a ) 公布的评估报告，利用b e t a - p o i s s o n 模型模拟剂量反应关系，通过暴露评估预测 青岛市居民每人每天生食水产品而摄入的副溶血性弧菌数为2 3 5 0 个，致病性副 溶血性弧菌摄入量为2 个一3 个。定量评估结果显示，水产品单次食用引起食源性 副溶血性弧菌胃肠炎的发生概率为1 0 4 x1 0 石。并通过数学模型模拟了四种控制 措旌的实际效果，结果表明通过这四种措施，可以有效地降低食用水产品面引发 副溶血性弧菌胃肠炎的风险。本部分研究，通过数学模型预测了生食水产品引起 副溶血性弧菌性胃肠炎的风险，为我国进行微生物危害定量风险评估的研究以及 建立水产品中副溶血性孤菌的限量标准打下良好的基础。 关键词：副溶血性弧菌风险评估快速检测水产品 f a s td e t e r m i n a t i o na n dr i s ka s s e s s m e n to fv b r o a b s t r a c t i 矗b r i o p a r a h a e m o l y t i c u $ i sa ni m p o r t a n th u m a np a t h o g e ni nc h i n a , w h i c hc o u l d c a t l s ea c u t ea s t r o i n t e s t i n a li l l n e s s ，a n dc a u s cs a p 蒯al e a d i n gt od e a t hi ns o m ec a s e s a tp r e s e n t ，h b r i op a r a h a e m o l y t i c u sh a sb e c o m eo u eo f m o s ts e r i o u sp r o b l e m sw h i c h h a v eb a de f f e c to np u b l i ch e a l t hi no u rc o u n t r y f i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u si sp r i m a r y p a t h o g e ni no u rc o u n t r y ，t h ef o o dp o i s o n i n gc a u s e db yv i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s i s g o i n gu pi nr e c e n ty e a r s ，e s p e c i a l l yi nc o a s ta r e a s i ti sn e c e s s a r y t od e v e l o pr e l i a b l e f a s t m e t h o d o f d e t e c t i o n a n ds u p e r v i s e c o n t a m i n a t i o ns t a t u s o f s e a p r o d u c t s w i t h v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s a p c ra m p l i f i c a t i o n - b a s e dd e t e c t i o no f t o t a lv i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u si ns e a f o o d i sd e v e l o p e db yt a r g e t i n gt e r m o l a b i l eh e m o l y s i ne n c o d eb yt hg e n e t h ep c r i s a p p l i e dt od e t e c t 4 v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u ss t r a i n s ，3n o n v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s s t o f i n sa n d2 0p i e c e so fs e a f o o d ，t h er e s u l ts h o w st h a tt h ep c ra p p r o a c ha r c s u c c e s s f u l l yu s e dt od e t e c tv a r i o u ss t r a i n so f v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u si ns e a f o o d s e n s i t i v i t yo f d e t e e t i o nf o rt a r g e tg e n es e g m e n t s w a sa l e a s t1 m p np e r1 0 0go f a l k a l i n ep e p t o n ew a t e re n r i c h e ds e e d e do y s t e rt i s s u eh o m o g e n a t e t h ef u l lc o u r s eo f d e t e e i o nc o u l eb ec o m p l e t e di n8h o u r sw h i c hi ss i g n i f i c a n t l ys h o r t e rt h a nt h et i m e n e e d e db yc o n v e n t i o n a lt e c h n i q u e s c o m p a r e dt oc o n v e n t i o n a lm i c r o b i o l o g i c a l c u l t u r em e t h o d s ，t h i sp c r a p p r o a c hi sr a p i da n d r e l i a b l ef o ra c c o m p l i s h i n ga c o m p r e h e n s i v ed e t e c t i o no f v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u si ns e a f o o d ， q i n g d a oi sac o a s t a lc i t ya n dt h e r ea t em a n yp e o p l ev i s i th e r ee v e r yy e a r n l e c o n s n r f l p t i o no fs e a f o o di sl a r g ea n ds o m ec o n s u m e r sl i k ee a t i n gr a w o ru n d e r c o o k e d a q u t i cp r o d u c t s ，f i b r i op a r a h a e m o l y t i c u si sa nm o s ti m p o r t a n th u m a np a t h o g e ni nt h e c i t y , s oi t sn e c e s s a r yt os u r v e yt h ec o n t a i n m i n a t i o ns i t u a t i o no fs e ap r o d u c t sw i t h v i b r i op a r a h a e m o l y t i c u si nt h ec i t ya n dt a k ei t l e a s u r et oe n s u r ec o n s u m e r s h e a l t h i n o r d e rt og e ti n f o r m a t i o na b o u tt h ev i b r i op a r a h a e m o l y t i c u sc o n t a m i n a t i o ni nr e t a i l s e a f o o d s ，3 2 6s a m p l e sa r ec o l l e c t e df r o m s e a f o o dw h o l e s a l em a r k e t s ，r e t a i lm a r k e t si n q i n g d a oc i t yw i t h i nt h ep e r i o df r o md e c e m b e r2 0 0 5t od e c e m b e r2 0 0 6 ，t h es a m p l e s a r ed e t e r m i n e dq u a l i t a t i v e l ya n dq u a n t i t a t i v e l yb yt h ep c ra n dm o s tp r o b a b l en u m b e r ( m p n ) t e c h n i q u e i n c i d e n c e o fv i b r i op a r a h a e m o l y t i c u si nd i f f e r e n ts o r to f s e a f o o d ，s e a s o na n da r e aa r ec o m p a r e d h i g hf r e q u e n c yo f v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u si s d e t e c t e di nr e t a i ls e a f o o d s i ti sc o n e l u e dt h a tt h i sp a t h o g e nn e e d st ob ei n t e n s i v e l y m o n i t o r e da n dc o n t r o l l e di ns e a f o o d s a ns e m i - q u a n t i t a t i v er i s ka s s e s s m e n tw a sc a r r i e do u tb yu s i n gr i s ka s s e s s m e n t s o f t w a r er i s kr a n g e r t h er i s ko fv i b r i op a r a h a e m o l y t i c u si l l n e s sw a sp r e d i c t e db y r i s kr a n g e r t h ea s s e s s m e n tp r e d i c t st h a tr i s kr a n kv a l u eo fv i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s i l l n e s si s5 2i nq i n g d a o ，a n dt h e r ew i l lb e9 2 3c a s eo f v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u si l l n e s s d u et oe a ts e a f o o d se v e r yy e a ri nq i n g d a o t h ep r e d i c t e dn u m b e ro fc a s e si sc l o s et o r e a ld a t a _ a c c o r d i n gt ot h ea s s e s s m e n t c o n t r o l l i n gm e a s u r e sa r cs u g g e s t e dt oe n s u r e g o n s u m e r s h e a l t h , a q u t i cp r o d u c t ss h o u l db ep u ti ng o o dc o n d i t i o n s ；s e a f o o d ss h o u l d b ec o o k e de n o u g ht oe l i m i n a t e st h ep a t h o g e na n ds oo n t h es e m i - q u a n t i t a t i v er i s k a s s e s s m e n ti sf i r s ta s s e s s m e n ti no n rc o u n t r y , i tp r o v i d e st h eg o o dt e c h n i c a ls u p p o r t f o rq u a n t i t a t i v ea s s e s s m e n t t h r o u g hs e m i - q u a n t i t a t i v er i s ka s s e s s m e n t ，w ec a no b t a i nt h er i s kr a n kv a l u eo f c o n s u m e r si nq i n g d a oc i t y t h ec o s to f s e m i - q u a n t i t a t i v er i s ka s s e s s m e n ti sl e s st h a n q u u n t i t a d v ea s s e s s m e n t , b u tt h er e s u l t o fq u a n t i t a t i v er i s ka s s e s s m e n ti sm o r e e l a b o r a t ea n dc o m p r e h e n s i v e a q u a n t i t a t i v ea l eu n d e r t a k e nt om o d e lt h er i s ko f v i b r i op a r a h a e m o l y t i c u sf o o d b o m ei l l n e s sa s s o c i a t e dw i t ht h ec o n s u m p t i o no fl a w s e a f o o d si nq i n g d a oc i t y t h ea s s e s s m e n ti sc o n d u c t e di na c c o r d a n c e 、 ，i t i lt h ew i d e l y a c c e p t e d p r o c e d u r e sa n dm e t h o d sf o rr i s ka s s e s s m e n t ，w h i c hi n v o l v e s h a z a r d i d e n t i f i c a t i o n ，h a z a r dc h a r a c t e r i z a t i o n ，e x p o s u r ea s s e s s m e n ta n dr i s kc h a r a c t e r i z a t i o n t h eo u t c o m eo ft h ee x p o s u r ea s s e s s m e n tm o d u l e sw a sc o m b i n e dw i t hab e t a - p o i s s o n d o s e - r e s p o n s em o d e l ，p r e d i c t i n gp e o p l ew i l li n g e s t2 - 3c e l lo fp a t h o g e n i cv i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u sa n dt h er i s ko fi l l n e s sa s s o c i a t e dw i t ht h ec o n s u m p t i o no fv i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s c o n t a m i n a t e dr a ws e a f o o dt ob e1 0 4 1 0 4 t h ee f f e c to f c o n t r o l m e a s u r e si se v a l u a t e db yd o s e - r e s p o n s em o d e l ，i m p l e m e n t i n gc o n t r o lm e a s u r e s ， i n c l u d i n gr e d u c et i m eu n f r i g e r a t e d ，r a p i dc o o l i n g ，m i l dh e a tt r e a t m e n ta n df r e e z i n g ， m a ys u b s t a n t i a l l yr e d u c et h en u m b e ro fi l l n e s s t h eq u a n t i t a t i v er i s k a s s e s s m e n t p r o v i d e st h eg o o dt e c h n i c a ls i l p p o nf o r f u r t h e rq u a n t i t a t i v ea s s e s s m e n ta n de s t a b l i s h s t a n d a r do f v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u si ns e a f o o d k e y w o r d s ：v i b r i o p a r a h e m o l y t i c u s ，r i s ka s s e s s m e n t ，f a s td e t e r m i n a t i o n ，s e a f o o d 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( ) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：矗姊 签字日期：如7 年占月争日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名壶哮 签字日期：& 司年6 月霉日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签字饲体象 签字日期：山谣珀占日 ， 电话： 邮编 水产品中副溶血性弧菌快速检测技术及风险评估研究 0 前言 水产品由于鲜美爽口、营养丰富，深受消费者尤其是沿海居民的喜爱。我国 水产品资源丰富，水产品产量约占世界总产量的三分之一。随着生活水平的提高， 全球对水产品安全性更加重视，特别是近年来，水产品安全事件屡发，我国出口 的水产品曾有因检出副溶血性弧菌而导致退货、销毁、取销注册代号。欧盟3 6 8 决议( 9 7 3 6 8 e c ) 和5 8 7 号决议( 9 7 ，5 8 7 e c ) 要求对原产于中国的水产品批批 检验副溶血性弧菌。因此，水产品中副溶血性弧菌的快速检测技术以及在此技术 基础上的风险评估具有重要的现实意义。 o 1 水产品中副溶血性弧菌污染情况及危害 水产品是指来源于水环境、供人类食用的水生动植物产品，包括鲜、冷、冻、 干、盐腌或盐渍的鱼类、软体动物类、甲壳动物类等水生动物、植物产品i “。我 国水产品的种类繁多，其中鱼类有3 0 0 0 多种、虾类3 0 0 多种、蟹类6 0 0 多种、 贝类7 0 0 多种、头足类9 0 多种、藻类1 0 0 0 多种。2 0 世纪9 0 年代以来，世界水 产品总量稳步增长，与此同时世界水产品的消费量和贸易量稳步增长。近2 0 多 年来我国水产业发展迅猛，水产品总量大幅增加，综合生产效益明显增强。2 0 0 5 年我国水产品总量达到5 1 0 2 1 万吨，连续十多年居世界首位。我国是唯一养殖 产量超过捕捞产量的国家，随着水产品总量的增加，我国水产品国际贸易量也在 持续增长，在世界水产品贸易中地位不断提高，所占份额不断上升。由此可见， 水产品是我国农业的一个重要组成部分，在国民经济中占有重要地位，水产行业 对促进农业产业结构的调整、增加农民收入、出口创汇都具有积极的意义。 与水产品安全相关的危害涉及到能长期或短期影响人体健康的各个方面。国 际食品法典委员会将危害定义为“食品中可以引起食物不安全的消费的生物、化 学或物理的因素”【2 】。具有公共卫生意义的生物危害主要包括致病性细菌、病毒、 蠕虫、原生动物等。现在对全球性食品安全构成最显著威胁的是致病性细菌。副 溶血性弧菌在世界范围内被公认是一种重要的食源性病原菌，副溶血性弧菌是一 种在河、海、港口等环境中自然生长的革兰氏阴性嗜盐菌，它广泛分布于海水及 多种水产品中，如人们经常食用的鲽鱼、鲅鱼、带鱼、牡蛎、蛤蜊、对虾、梭子 蟹等，可引起急性胃肠炎，少数情况还能引发败血病，危及生命，但其最低感染 水产品中副溶血性弧菌快速检测技术及风险评估研究 剂量尚无定论。 副溶血性弧菌引起的食物中毒，在日本、东南亚、美国等国家及中国台北地 区较为多见。1 9 9 6 年以来，东南亚、日本和北美等地，相继发生过副溶血性弧 菌0 3 ：k 6 株、0 4 ：k 8 株的大流行【3 】。美国沿海城市1 9 8 9 年的弧菌感染监测结果 显示，生食牡蛎引起的弧菌性食物中毒贯穿全年，而接受水产品消费调查问卷的 病人中有7 3 在发病前一周内曾生食牡蛎，这就说明确保生食牡蛎的微生物安 全性对于预防胃肠炎极为重要【4 】。c o o k 等【5 1 对美国零售带壳牡蛎中的副溶血性弧 菌进行了全国调查，结果显示零售牡蛎中副溶血性弧菌密度呈季节分布，以夏季 最高。海湾沿岸收获的牡蛎菌量最高，通常 1 0 ，0 0 0 m p n g 。某些大西洋中部地 区样品批次副溶血性弧菌密度 1 0 ，0 0 0 m p n g 。1 9 9 7 年至1 9 9 8 年美国发生4 起与 生食牡蛎相关的中毒事件，涉及病例7 0 0 余人，随后美国食品药品管理局于1 9 9 9 年开始进行生食牡蛎中副溶血性弧菌公共卫生影响的危险性评估，该研究对美国 f d a 现行指南中甲壳类动物体内副溶血性弧菌 1 0 ，0 0 0 g 等标准提出疑问嗍。 在我国，副溶血性弧菌所致食物中毒，在细菌性食物中毒占有重要地位 7 1 。 许多资料表明，副溶血性弧菌已经成为我国个严重的食源性公共卫生问题之 一。国家食源性疾病监测网( 包括1 3 个省份) 1 9 9 2 年至2 0 0 1 年的数据显示， 副溶血性弧菌病暴发居微生物性食源性疾病暴发之首，且呈显著上升趋势【g 】。我 国浙江、江苏、福建和广东4 省共上报3 8 6 起副溶血性弧菌食源性疾病暴发事件， 约占微生物性食源性疾病暴发的3 5 。而在浙江省，副溶血性弧菌食源性疾病 暴发的发生率占细菌性食源性疾病的6 0 左右【9 】。国家食源性疾病监测网( 包括 1 3 个省份) 2 0 0 3 年的监测数据表明，食源性疾病事件中微生物引起的疾病事件 和涉及人数最多，分别占总体的4 6 4 和6 0 4 ，其中副溶血性弧菌( 4 0 1 ) 是主要致病菌【1 0 l 。 2 0 0 3 年8 月河北唐山某所县级重点高中学校有6 9 名学生发病，经流行病学 调查，证明为一起副溶血性弧菌引起的食物中毒| l l l 。2 0 0 5 年5 月，温州市某公 司2 0 7 名职工因食用被副溶血性弧菌污染的盒饭而出现集体食物中毒事件i l q 。 2 0 0 5 年7 月浙江省某镇村民参加寿宴后，人出现食物中毒，调查后证明是食 用了不洁虾干而引起的一起副溶血性弧菌性食物中毒1 1 3 】。沈阳市某工地食堂， 4 6 人发生副溶血性弧菌引起的食物中毒，原因是豆芽菜在加工操作中被交叉污 2 水产晶中副溶血性弧菌快速检测技术及风险评估研究 染而带有此菌f 1 4 j 。2 0 0 5 年1 0 月在广东番禺某1 2 1 岸工地食堂，2 6 人因食用被副 溶血性弧菌污染的食物而引起中毒【l s 】。王世杰等人分析了1 9 9 4 年一2 0 0 3 年在公 开期刊上报道的食物中毒个案调查资料，共收集1 5 6 8 起中毒个案，其中细菌性 食物中毒7 6 6 起( 中毒人数为4 3 7 6 6 人，4 4 人死亡) ，约占5 0 。细菌性食物中 毒中，由副溶血性弧菌引发的起数最多( 1 5 5 起) ，占2 0 2 0 0 ，其中沿海城市所 占的比例较高i l 6 j 。 高亚色等对厦门市市售牡蛎致病性弧菌携带状况的研究结果发现，副溶血性 弧菌是主要的检出菌种，而且能在分别送检的急性腹泻病人检样中同期检出，为 食用牡蛎与致病性弧菌腹泻存在密切关系提供了可靠依据【1 7 1 。2 0 0 3 年至2 0 0 5 年 间，严纪文等人针对广东省零售市场和餐饮店的水产品中副溶血性弧菌的分布情 况，进行监测。4 3 1 份水产品样品中1 5 6 份检出副溶血性弧菌，总检出率为3 6 2 。 2 0 0 5 年的检出率明显高于2 0 0 3 和2 0 0 4 年。其中广州地区的检出率高达5 0 o 。 各地区检出率存在着显著差异。在8 类水产品中副溶血性弧菌检出率最高的是淡 水虾6 6 ，7 ；海鱼最低，为1 9 5 ( 1 7 ，s 7 ) 。品种间检出率的比较，经统计学分 析有显著差异。监测结果表明，广东省水产品中副溶血性弧菌污染严重，对公众 健康构成一定的威胁【l8 】。高春玉等人对2 0 0 5 年扬州市水产品中致病菌污染状况 进行研究，1 0 的水产品样品中检出副溶血性弧菌，且副溶血性弧菌是水产品污 染水平最高的致病菌1 1 9 。马聪等人对2 0 0 5 年珠江三角洲地区( 佛山、惠州、深 圳、中山，珠海、增城) 生吃水产品中副溶血性弧菌污染情况进行调查，检测结 果比2 0 0 0 年该地区调查数据有显著提高( p o 0 5 ) ，1 0 3 份样品有5 1 份检出副 溶血性弧菌。深圳生吃鱼类中副溶血性弧菌m p n 浓度几何均值最高；三文鱼阳 性率7 2 7 ，显著高于其它鱼生( p 0 0 5 ) 。高阳性率显示生吃水产品副溶血性 弧菌污染较严重1 2 0 1 。2 0 0 3 年刘秀梅等监测中国部分沿海地区( 浙江、江苏、广 东、福建4 省) 零售水产品中副溶血性弧菌污染状况，共计2 3 6 份水产品试样， 3 8 6 的试样检出副溶血性弧菌，浙江省试样的阳性率最高【2 l j 。2 0 0 3 年4 月一8 月间，陈艳等针对福州、厦门两地零售带壳牡蛎中副溶血性弧菌进行定量研究， 1 1 3 份牡蛎样品中，5 8 4 的牡蛎副溶血性弧菌密度高于3 0 m p n 1 0 0 9 ，厦门的样 品中副溶血性弧菌密度较高，不同月份问样品菌蕈的差别有统计学意义【2 甜。种 种监测数据表明零售水产品中副溶血性弧菌的污染率较高，在沿海地区此种情况 水产晶中副溶血性弧蓖快速检测技术及风险评估研究 尤为严重，必须持续地进行水产品中副溶血性弧菌的主动监测和污染控制。 0 2 副溶血性弧菌检测方法研究现状 副溶血性弧菌能产生3 种类型的溶血素，即耐热直接溶血素( t d h ) 和 两种t d h 相关溶血素( t r h l 、t r h 2 ) 。副溶血性弧菌临床分离株绝大部分都能 产生t d h ，在w a g a t s u m a 血琼脂平板上产生一种特殊的溶血现象。叫神奈川现 象( k a n a g a w ap h e n o m e n o n ，k p ) 1 2 4 】。t d h 具有肠毒素活性、细胞毒性、溶血 活性和心脏毒性等【2 5 阗。基因组序列揭示，t d h 基因位于细菌小染色体上，并有 2 个拷贝，分别命名为t d h l 和t d h 2 。k p + 菌株均含有2 个拷贝的t d _ h 1 2 7 1 ，两者对 神奈川现象表型的作用也是不同；t d h 2 的作用大于9 0 ，t d h i 约为o 5 - 9 4 。 临床分离的副溶血性弧菌株大部分携带t d h ，少数携砌，或是两者均有f 嚣捌。通 过测序了解3 种毒素的作用及其序列，为副溶血性弧菌的快速检溅提供了理论基 础。 致病微生物的快速检测与分离技术是致病微生物研究的热点之一，近几年 关于副溶血性弧菌的检测方法多有报道。根据己发表的文献资料，总结副溶血性 弧菌的检测方法主要是以下几种：k i 溶血实验、免疫学方法( 应用最广的是 e l i s a ) 、核酸杂交、p c r 法( 多重p c r 、实时p c r 等) 1 3 0 l 。 ( 1 ) k p 溶血试验 k p 溶血试验是检测副溶血性弧菌最基本的方法，能把绝大部分副溶血性弧 菌检测出来，但操作繁琐、所需时间长( 约4 d ) ，而且存在部分具有致病性的 t d h 一株，易漏检1 3 ，给人们健康带来危害。 ( 2 ) 免疫学方法 免疫学具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点。血清学反应是最基本 的免疫学反应，通过血清学反应，副溶血性弧菌可分为1 3 中o 血清型、7 1 种k 血清型【3 2 j 孔。应用免疫学方法已经具备了成熟的技术，但是当出现新的血清型时， 以现有的血清检测就会造成漏检。 ( 3 ) 核酸杂交 免疫学方法是在蛋白质水平检测副溶血性弧菌，而核酸杂交法则是在基因 水平进行检测，结果比免疫法更为特异、准确、可靠删。用于检漏副溶血性弧 菌的核酸杂交方法主要有斑点杂交、s o u t h e r n 杂交、夹心法杂交f 3 习。1 9 9 2 年 4 水产品中副溶血性弧菌快速检测技术及风险评估研究 y a m a m o t o 等1 3 6 1 针对f 砌和t r h l 0 1 1 2 5 b p 的基因设计探针进行斑点杂交检测，结 果显示t d h 探针特异性为1 0 0 、灵敏度为9 3 ；t r h 探针特异性为9 3 、灵敏度 为8 6 。但是，t d h 探针把部分弧菌科的其他细菌也检测出来，造成一定的假阳 性。s o t t h e m 杂交法操作繁琐、时间长，不适合临床实验室的快速检测。1 9 9 8 年， s u t h i e n k u l 等t 3 7 对1 3 7 株副溶血性弧菌临床分离株进行s o u t h e r n 杂交， 砌探针 和t r h 探针的d u t p 都标记上地高辛，结果显示，t d h 和t r h 探针特异性好，把 t d l - f 株( 共1 2 7 株) 和 r r w 株( 共3 7 株) 全部检测出来。然而，这种方法操 作繁琐、时间长，不适合临床实验室的快速检测。 ( 4 ) p c r 法 微生物基因组学和分子生物学技术的发展使得p c r 技术引入该方面的检 测，为微生物基因检测提供了新的方法。p c r 法是根据副溶血性弧菌特异基因 序列，设计引物进行检测，是现阶段检测副溶血性弧菌的最快速准确的方法。目 前应用于检测副溶血性弧菌的p c r 方法主要有任意引物p c r 、多重p c r f 3 8 , 3 9 , 4 0 1 、 实时p c r 【4 1 明、荧光定量p c r 4 3 等。目前运用p c r 技术检测副溶血性弧菌的引 物大多选择编码t d h 基因或f 砌基因的保守序列【4 4 5 t 4 6 ，4 7 鹕，4 9 1 ，也有选择编码促旋 酶( g y r a s e 占) 的基因序列闭。 任意引物p c r 由于临床分离株绝大多数含有t d h 基因，因此绝大部分研究者都以t d h 基因 做靶基因设计引物进行特异扩增。1 9 9 3 年，l e e 等1 5 0 】根据t d h 基因设计引物，对 3 6 株t d f r 株、8 9 株t d h 一株以及4 6 株其他弧菌和肠道菌进行p c r 检测。结果 显示3 6 株) h + 株全部特异扩增出来，其余菌株都没有扩增，最低检测量可至 4 0 p g d n a 。1 9 9 9 年k i m 等1 5 1 魄择t o x r 基因序列设计两对引物，对1 4 株副溶血 性弧菌和1 4 株其他弧菌进行p c r 。结果显示，1 4 株副溶血性弧菌都得到一条特 异扩增亮带而其他菌株没有。此外，v e n k a t e s w a r a n 等【5 2 】选择g y r b 基因设计引物 对副溶血性弧菌进行p c r 扩增、c o r d o v a 等1 5 3 链择础7 捐基因设计引物进行p c r 扩增，特异性、灵敏度都比较好。 多重p c r 由于不是所有的副溶血性弧菌都含有t d h 或t r h 基因，所以只针对t d h 或t r h 的单一p c r ，有时会造成漏检，多重p c r 就能弥补这方面的不足。1 9 9 4 年b e j 水产品中副溶血性弧菌快速检测技术及风险评估研究 等【5 4 1 针对t l h 、t d h 、t r h 设计不同的引物，在同一p c r 反应体系内同时扩增f 胁、 t d h 、t r h 。结果显示，所有的副溶血性弧菌都扩增出砌基因，砌基因是副溶血 性弧菌特异的：5 4 的副溶血性弧菌扩增出t d h 基因；只有3 8 7 3 的副溶血性弧 菌扩增出砌基因。该法灵敏度高，能把1 0 9 牡蛎培养肉汤里1 0 个一1 0 0 个副溶 血性弧菌检测出来。吴彩云等人对打五和t d h 两种基因同时检测，基本确立了同 时检测这两种基因的d p c r 技术，其实验结果也进一步证实了砌基因是副溶血 性弧菌所特有的【4 9 】。与其他常规生化方法相比，多重p c r 更快速，仅8 h 就能完 成检测，结果准确、可靠，而且还可改进成定量p c r ，对标本中靶序列进行定 量检测。 实时p c r 1 9 9 6 年t y a g i 开创了实时p c r 。常规p c r 检测，需要从反应体系中吸取产 物做电泳或s o u t h e r n 杂交等实验进行鉴定，转移过程中易污染造成假阳性。实 时p c r 是在p c r 反应体系中加入标记有报告基团和猝灭基团的线性t a q m a n 探 针或茎环型荧光分子信标探针，在基因扩增过程中与产物杂交，此时，报告基团 和猝灭基团距离分开，根据能量共振转移现象，报告基团发出荧光而被检测。这 种方法操作简单，闭管检测，污染少，灵敏度高，并且可以在p c r 结束或p c r 过程进行同步定性或定量检测，而且可以进行临床大规模快速检测。2 0 0 3 年， b i a e k s t o n e 等1 5 5 1 针对t d h 基因设计荧光分子信标探针，对牡蛎中富集的1 3 个不 同种类的菌株进行实时p c r 检测，该法能把每个纯培养体系的1 个c f u 检测出 来，并且只有含t d h 基因的副溶血性弧菌才被检测出来，特异性好、灵敏度高。 扈庆华等f 5 6 】建立改良分子信标实时p c r 方法检测副溶血性弧菌，d n a 灵敏度 为1 6 6 4 f g 止，菌液灵敏度为6 c f u p c r 反应体系，原始样品的菌液灵敏度为 6 9 c f u m l 。实时p c r 检测快速准确，但需要价格昂贵的荧光检测仪和荧光分子 标记探针，一般的实验室不广能泛开展。分子信标实时p c r 自1 9 9 6 年开创以来 短短几年就得到蓬勃的发展，相信随着经济的发展、技术的进步和实时荧光检测 仪的普及，实时p c r 将会得到更为广泛的应用。 ( 5 ) 标准方法 目前，我国副溶血性弧菌检验方法的标准有：国家标准g b t 4 7 8 9 7 - 2 0 0 3 食 品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验；行业标准s n 0 1 7 3 9 2 出口食品副溶 6 水产品中副溶血性弧菌快速检测技术及风险评估研究 血性弧菌检验方法，w s t8 1 1 9 9 6 副溶血性弧菌食物中毒诊断标准及处理原 则。这些皆属于经典检测方法标准，耗时长，操作繁琐。另外，产品标准n y5 1 5 2 2 0 0 2 无公害食品大菱鲆、n y5 0 5 8 2 0 0 1 无公害食品对虾、n y5 15 7 - 2 0 0 2 无公害食品海蜇等，规定产品中“不得检出”副溶血性弧菌。 国际相关标准有：i s o8 9 1 4 ：1 9 9 0 微生物学副溶血性弧菌检测通用指南，属 于传统检测方法标准，耗时长，操作比较烦琐；国际食品法典委员会( c a c ) 标 准c o d e xs t a r t1 6 7 1 9 8 9 盐腌鳕鱼和盐腌鳕鱼干以及欧盟2 0 0 1 4 6 6 e c 指令等规 定了产品的限量标准，都要求进口水产品中“不得检出”副溶血性弧菌。 副溶血性弧菌是引起食物中毒的主要病原体之一，快速准确地分离、鉴定副 溶血性弧菌，是积极采取防治措施的关键f 锕食品中副溶血性弧菌的检测方法 的国际、国家标准和行业标准，皆属于传统的培养及生化鉴定方法，要经过前增 菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定和血清学反应等过程，检测周期5 7 天 左右。这种检测方法周期长、工作量大，不能满足水产品质量安全快速反应体系 的需求，给水产品养殖、出入境检验检疫、食品卫生监督等带来困难。上述快速 检测方法，如p c r