（食品科学专业论文）溶菌酶和超声处理发酵剂及其加速干酪成熟的研究.pdf

溶菌酶和超声处理发酵剂及其加速干酪成熟的研究 谢爱英 摘要：干酪成熟过程中主要的变化是残存在于酪中的酶与乳酸菌发酵剂中的蛋 白酶和肽酶催化酪蛋白降解，生成典型干酪风味的过程。通常千酪成熟要求在低 温下进行，需耗费的时间较长，成熟费用很高，因此，加速干酪成熟已成为国内 外乳品研究领域关注的热点。在发酵剂种类及干酪制作工艺不变的条件下，加速 干酪成熟的一种最有效方法是提高发酵剂的添加量。然而提高发酵剂的添加量虽 然可以促进干酪成熟期间活性成熟酶的释放，同时也会产生大量的乳酸，影响干 酪的质量。因此，采用不同方法对发酵剂进行处理，抑制其在干酪成熟中的产酸 量，不仅可加速干酪成熟效果，也可提高干酪的品质。本研究采用溶菌酶处理发酵 剂和溶菌酶与超声复合处理发酵剂，以乳酸脱氢酶活性( l d h ) 、蛋白水解酶活性 和活细胞数为处理指标，研究了不同因素对于酪发酵剂处理效果及其对加速干酪 成熟的影响。结果如下： 1 、用溶菌酶处理发酵剂时，当溶菌酶添加量为4 o k u ，m l 的溶菌酶，处理温 度为3 7 ，处理时间为1 h ，发酵剂的乳酸脱氢酶( l d h ) 活性为4 6 7 8 u g ，蛋白 水解酶活性为7 7 7 1 u g 。分别较未处理发酵剂的l d h 和蛋白水解酶活性高 3 8 1 7 札和2 8 9 2 5 u g ，同时发酵剂细胞的存活率仅为0 0 0 2 2 ，表明通过溶菌酶 处理可有效的降低活细胞数量，有利于细胞酶的释放。用超声和溶菌酶复合处理 发酵剂时，在溶菌酶添剂量为1 6 k u m l ，溶菌酶作用时间为4 h ，超声作用时间为 6 m i n ，在此条件下处理的发酵剂中l d h 酶活性为5 2 2 5 u 儋，蛋白水解酶活性 1 0 8 5 5 u g 。分别较未处理发酵剂的l d h 和蛋白水解酶活性高4 3 6 4 4 u g 和 5 9 7 6 5 u g ，同时发酵剂细胞的存活率0 0 0 0 5 ，表明用超声与溶菌酶复合处理发 酵剂可有效的降低活细胞数量，并有利于细胞酶的释放。用溶菌酶与超声复合处 理效果优于单独用溶菌酶处理。 2 、干酪成熟期间的理化指标变化表明，添加溶菌酶处理发酵剂和溶菌酶与超 声复合处理发酵剂的干酪在成熟期间水分含量、蛋白质含量、脂肪含量和食盐含 量与对照组( 未添加处理发酵剂) 干酪差异不明显( p 0 0 5 ) ，各试验组千酪的 口h 值在整个成熟期处于对照1 ( 添加发酵剂量为2 0 ) 干酪和对照2 ( 添加发酵 剂量为2 0 + 0 5 0 7 ) 的p h 值之间；试验组的w s n 、t c a - s n 和p t a - s n 值在整 个成熟期均高于对照组1 ，并且随着成熟期的延长逐渐升高；试验组干酪中成熟期 游离脂肪酸的含量较对照组1 干酪高，表明通过溶菌酶处理发酵剂和溶菌酶与超 声复合处理发酵剂可明显抑制干酪成熟期间的产酸量，同时可加快蛋白质降解和 脂肪分解，有利于缩短干酪的成熟时间；感官评价结果添加处理的发酵剂可明显 提高干酪风味的强度，在相同的成熟时间实验组干酪的质地也较对照1 好，表明 添加处理的发酵剂能有效地加速干酪成熟。 关键词：溶菌酶；超声；干酪发酵剂；干酪成熟 s t u d yo fs t a r t e rc e l lm o d i f i e db yl y s o s y m ea n du l t r a s o u n d a n di t sa c c e l e r a t e dc h e e s er i p e n i n g a i y i n gx i e a b s t r a c t ：c h e e s er i p e n i n gi sat i m e c o n s u m i n gp r o c e s so ft h eb r e a k d o w na n d s u b s e q u e n tt r a n s f o r m a t i o no fd e g r a d a t i o nc a t a l y z e db ym i c r o b i a le n z y m e sa n dr e n n e t r e m a i n i n gi nc h e e s ec u r tt od e v e l o p st y p i c a lf l a v o r t h i sr e a c t i o n su s u a l l yr e q u i r el o w e r t e m p e r a t u r el e a d i n gh i g h e rc o s t s oc h e e s er i p e n i n g h a sb e e nt h es u b j e c to f c o n s i d e r a t i o ni n v e s t i g a t i o ni nt h ef i l e do fm i l kr e s e a r c h o n eo ft h em o s te f f i c i e n tw a y s t oi n c r e a s et h eb a c t e r i a le n z y m ep o o li nc h e e s ec u r d ，w i t h o u ta l t e r i n gt h ep r i m a r ys t a r t e r a n dc h e e s em a k e ，i st oa d dw h o l el a c t i ca c i db a c t e r i a ，u n a b l et og r o wa n dt op r o d u c e s i g n i f i c a n tl e v e l so fl a c t i ca c i d ，b u ts t i l ld e l i v e r i n ga c t i v er i p e n i n ge n z y m e sd u r i n g c h e e s ea g e i n g t h i ss t a r t e ri sn o r m a l l yw e a k e n e db yv a r i o u st r e a t m e n t s is t u d i e d l y s o s y m ea n dl y s o s y m ec o m b i n e du l t r a s o u n dm o d i f i e ds t a r t e rc e l li n t h i sp a p e rt h e m o d i f i e ds t a r t e rm a r k sa t ea c t i v i t yo fl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ( l d h ) a n dp r o t e i n a s ea n d t h en u m b e ro fc e l l s m o d i f i e ds t a r t e r sw e r ea d d e dt oc h e e s et os t u d yi t si n f l u e n c eo f c h e e s er i p e n i n g t h er e s u l t ss h o wt h a t ： 1 、t h es t a r t e rc u l t u r ea d d i n g2 0 m g m ll y s o s y m et ow e r et r e a t e df o rl h ru n d e r3 7 。c c a nr e l e a s el d hw i t h4 6 7 8 u ga n dp r o t e i n a s ew i t h7 7 7 1 u g w h i c hi nr u mh i g h e r 3 8 1 7 4 u 悖，2 8 9 2 5 u gt h a nn o tt r e a t e ds t a r t e r , a n do n l ys u r v i v a lr a t ew i t h0 0 0 2 2 ， t h i si n d i c a t e dt h a ts t a r t e rt r e a t e db yl y s o s y m ec a l le f f e c t i v e l yr e d u c en u m b e r o fc e l l ，a n d b e n e f i tt or e l e a s i n gc e l le n z y m e s c o n d i t i o n so fl y s o s y m ea n du l t r a s o u n dt r e a t i n gs t a r t e r w e r ed e f i n e d t h er e s u l ts h o w e dt h a t ：t h es t a r t e rc u l t u r ew e r et r e a t e db yu l t r a s o u n d u n d e r1 2 0 wf o r6 m i na f t e ra d d i n go 8 m g m ll y s o s y m et ow e r et r e a t e df o r4 h ru n d e r3 7 c a nr e l e a s e5 2 2 5 0 u go fl d h ，1 0 8 5 5 u go fp r o t e i n a s e ，w h i c hi nt u r nh i g h e r 4 3 6 4 4 u g , 5 9 7 6 5 u gt h a nn o tt r e a t e ds t a r t e r , a n do n l y0 0 0 0 5 o fs u r v i v a lr a t e t h i s i n d i c a t e dt h a ts t a r t e rt r e a t e db yl y s o s y m ec o m b i n e du l t r a s o u n dc a ne f f e c t i v e l yr e d u c e n u m b e ro fc e l l ，a n db e n e f i tt or e l e a s i n gc e l le n z y m e s 2 、m o i s t u r e ，f a t ，p r o t e i na n d s a l tc o n t e n to fe x p e r i m e n ta n dc o n t r o lc h e e s e sw e r en o t o b v i o u s l yd i f f e r e n c e 伊 o 0 5 ) a f t e rc h e e s ec o m p o s i t i o nw e r ed e t e r m i n e dd u r i n gc h e e s e a g e i n g i tw e r ed e t e r m i n e dt h a tp hv a l u eb e t w e e nc o n t r o l1 ( a d d i n g2 o s t a r t e r ) a n d c o n t r o l2 ( a d d i n g2 0 + 0 5 0 7 s t a r t e r ) d u r i n gc h e e s er i p e n i n g b u tc o n t e n to fw s n t c a - s n ，p t a - s na n df r e ef a t t ya c i di ne x p e r i m e n t a lw e r eh i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p c h e e s ed u r i n gc h e e s ea g e i n g a n dd i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w og r o u p si si n c r e a s i n ga l o n g c h e e s ea g ee x t e n d i n g t h i si n d i c a t et h a tt oa d dm o d i f i e ds t a r t e rb yl y s o s y m ea n d l y s o s y m ec o m b i n e du l t r a s o u n dc a no b v i o u s l yr e s t r a i nl a c t i ca c i db a c t e r i ap r o d u c i n g s i g n i f i c a n tl e v e l so fl a c t i ca c i d , b u ts t i l la c c e l e r a t i n gc a t a b o l i cr e a c t i o no fp r o t e i na n d f a t ，w h i c hb e n e f i tt os h o r t e nt i m eo fc h e e s er i p e n i n g t h er e s u l t so fs e n s o r ya n a l y s i s s h o wt h a t ：t h ea d d e dt h em o d i f i e ds t a r t e rc h e e s eh a sm o r ef l a v o ri n t e n s i t ya n dt e x t u r e t h a nc o n t r o lg r o u p ，w h i c hi n d i c a t e st h a ta d d i n gm o d i f i e ds t a r t e rb yl y s o z y m eo r l y s o z y m ec o m b i n e du l t r a s o u n dc a ns h o r t e np o t e n t l yr i p e n i n gt i m e a b s t r a c t s ：l y s o s y m e ；u l t r a s o u n d ；c h e e s es t a r t e r ；c h e e s er i p e n i n g 1 v 飞厂9 0 0 6 2 0 学位论文独创性声明 止 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：墩! 鎏廷作者签名：镧骚丝 日期：鳗! 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅：有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：丑醴筮日帮止 i 文献综述 1 干酪成熟及干酪成熟期间的主要变化 在一些发展中市场，特别是那些具有良好经济增长特征的市场，液体奶产量 一直保持增长趋势，但在全球范围内，液体奶的销量是停滞不前的，尤其在西欧、 北美和大洋洲等成熟市场表现尤为明显。在这类市场上高附加值和特殊的乳制品 表现出明显的增长趋势，如低脂、低糖以及维生素和钙质丰富的奶品，酸奶和其 他发酵乳制品也呈现出持续增长的迹象【1 】。干酪富含蛋白质和脂肪，此外，还含有 糖，有机酸，矿物质元素钙、磷、铁、锌，腊溶性维生素a 、胡萝h 素和水溶性 维生素等多种成分，具有很高的营养价值1 2 ，因此，被称为“奶中之王”，是奶中附 加值最高的产品，也将是中国继液态奶之后重点发展方向之一。 1 1 干酪及干酪成熟 联合国粮农组织和世界卫生组织( f a o w h o ) 在a 6 号文件中定义的干酪是 以乳、稀奶油、脱脂乳或部分脱脂乳、酪乳或这些原料的混合物为原料经凝乳酶 或其它凝乳剂，并排出部分乳清而制成的新鲜或经发酵成熟的产品。 干酪成熟是指干酪在一定温度和一定湿度条件下，经过一定的时间的贮存而 完成其所需物理和化学变化的过程【3 1 ，不同的干酪有其特有的风味、组织状态和外 观。干酪成熟往往需要很长的时间，尤其是半硬质干酪和硬质干酪，前者如 m o z z a t e l l a 干酪成熟需要三周，后者如p a r m e s a n 和c h e e d a r 干酪成熟大约需要两 年以上。在干酪成熟期间需要严格控制成熟室的温度、湿度、空气质量以防止成 熟过程中的污染，估计1 吨干酪成熟期间消耗的费用达到1 0 0 美元左右1 4 】。因此， 加速干酪成熟、缩短干酪成熟时间的研究具有很大的潜在经济价值和广阔的应用 前景。 1 2 干酪成熟期间的主要变化 干酪促熟研究始于2 0 世纪5 0 年代，在过去的5 0 多年中，l a w 、l e e & o l s o n 5 1 、 b o t t a z z i s c o l a r i1 6 、e ls o d a l 7 1 、f o x l 8 1 、e 1s o d a & p a l l d i 卸【9 】等乳品专家对干酪过程 中的主要变化进行了深入的研究，并在此基础上研制出许多加速干酪成熟的方法， 使干酪促熟技术也得到了较大的发展。由干酪成熟环境决定的乳的主要成分如水、 乳糖、蛋白质和脂肪发生变化形成了干酪的质地、结构和风味。水主要发生物理 状态的改变，乳糖在发酵剂的作用下，经糖酵解生成乳酸、丙酸、醋酸等，蛋白 质在残留在干酪中的凝乳酶、蛋白酶以及微生物酶的作用下逐渐降解成大肽、小 肽以及氨基酸，脂肪在脂肪酶作用下水解成脂肪酸、醛类、醇类等一系列化合物。 1 2 1 水的变化 干酪中的水对成熟所需的微生物相当重要，水在凝乳中有三种或三种以上的 状态包括有酪蛋白结合水、乳清蛋白结合水、乳糖和金属盐结合水、脂肪球膜和 磷脂结合水分 4 1 ，还有游离状态的水，游离状态的水是溶剂，因此游离状态的水决 定了可溶性物质的含量。这些溶解在水中的物质通过压力梯度进入细胞组织以满 足微生物生长代谢，进而影响这些微生物的生长，因此，水分含量越多干酪成熟 的越快。在于酪成熟过程中，水会慢慢蒸发掉，一部分水随着成熟的进行和蛋白 质结合在一起形成结晶水【埘。 1 2 2 乳糖代谢 简单来说，乳糖代谢就是发酵剂分解乳糖产生乳酸的过程。原料乳经发酵、 凝乳、排乳、压榨成型后的生干酪中乳糖含量大约1 2 ，这些乳糖大部分在4 8 h 内被分解，在成熟后两周内消失，所形成的乳酸则变成丙酸或乙酸等挥发酸。这 一反应主要是乳酸菌( l a b ) 在干酪成熟初期发酵乳糖产生乳酸，干酪成熟后期 残留在凝乳中未被发酵剂利用的乳糖被非发酵剂( n s l a b ) 发酵分解。乳糖代谢 后产生的乳酸直接影响干酪的口味，尤其是不含其它风味的新鲜干酪。乳糖还影 响干酪的p h 值可能间接的影响干酪的质地。另外，在干酪中生成的乳酸有相当一 部分被乳中缓冲物质所中和，绝大部分被包裹在胶体中，这样，乳酸以乳酸盐的 形式存在于干酪中，成为干酪中微生物( 如丙酸菌) 生长的重要底物，它的代谢 也是影响干酪风味的重要因素；丁酸菌也可以分解乳酸盐类，如果条件适宜，这 种类型的发酵就会产生氢气、一些挥发性脂肪酸和二氧化碳，这一发酵往往出现 在干酪成熟的后期，氢气会导致干酪的胀裂【1 1 】。干酪成熟期间乳糖和乳酸代谢是 基本反应之一，与其他生化反应相比，乳糖代谢生成乳酸的反应对干酪风味的影 响很小，然而它决定了干酪的p h 值，在调节生化反应方面有着重要的作用；乳酸 的异构化可能对干酪的风味影响也很小，但是一旦发生产丙酸或乙酸的反应，影 响就很显著，乳酸代谢成丁酸的反应对干酪品质有主要影响【”。 1 2 3 蛋白质降解 蛋白质降解是干酪成熟期间发生的三类生化反应中最复杂和最重要的反应。 干酪成熟过程中，蛋白质在一些酶类作用下降解，使干酪风味和质构发生变化泡 括硬度、流变性、黏结性、断裂性、延展性、熔化性、黏附性和乳化性1 。引起干 酪中蛋白质降解的蛋白酶主要有：加入发酵菌剂中的蛋白酶和乳中原有的酶以及 残留在凝块中的凝乳酶。酪蛋白在干酪中的发酵剂蛋白酶和残留凝乳酶作用下首 先分解成高分子量多肽，这一过程中起主要作用的是凝乳酶。高分子量的多肽进 2 一步在发酵剂蛋白酶作用下降解形成低分子量多肽，随后这些肽类在发酵剂肽酶 的作用下进一步降解成氨基酸、胺、含硫化合物等风味前体物质或直接形成风味 物质。s o u s a l l 2 】总结了凝乳酶、发酵剂蛋白酶及肽酶对酪蛋白的降解过程，见下图 酪蛋白 l ( 凝乳酶) 高分子量多肽 ( 凝乳酶) “( 发酵剂肽酶) 低分子量多肽 i ( 发酵剂酶类) 氨基酸 土 氨类胺含硫化合物 干酪成熟过程中蛋白质不同程度的降解能产生多种风味物质，同时也有一些 不良风味物质生成，如蛋白质降解不完全产生的低分子量苦味肽会使干酪具有苦 味( 干酪中的苦昧物质主要是低分子量多肽和氨基酸如氨基、羧基和含硫的组 分v 1 3 1 。 蛋白质的降解程度在很大程度上影响着干酪的质量，尤其是组织状态和风味。 故干酪的成熟，尤其是硬质干酪的成熟，第一个标志和进一步的标志都是蛋白质 的降解。成熟期间的蛋白质变化程度常以总蛋白质中所含水溶性蛋白质和氨基酸 的量为指标。水溶性氮与总氮的百分比被称为干酪的成熟度。一般硬质干酪的成 熟度约为3 0 ，软质干酪的则为6 0 。 1 2 4 脂肪分解 脂肪分解产生的脂肪酸是影响干酪风味最显著的因素【1 4 1 。乳脂中甘油三酸酯 分解产生甘油和脂肪酸，其中些脂肪酸，特别是挥发性脂肪酸如丙酸、乙酸、 辛酸和癸酸等直接构成干酪的风味物质，伴随着水分的不断挥发就形成千酪特有 的质地和硬度。 总之，于酪成熟过程就其本质而言，就是这些反应达到一个理想过程需要的 时间【1 5 】当然，硬质、半硬质和软质干酪这些干酪种类不同，其水分变化、蛋白质 降解、脂肪分解和乳糖代谢也会有所不同，并且同一种类的干酪的品种不同，这 些成分的变化也有显著差别。 2 加速干酪成熟常用的方法 加速干酪成熟的本质是加速成熟过程中的各种反应，尤其是生化反应的进行， 3 在不影响干酪典型风昧的情况下缩短成熟时间。在生产中采用物理、化学、生物 等方法加快蛋白质降解、脂肪分解以及乳糖的代谢，以加快干酪成熟质地和风味 的形成i l 。在干酪促熟的研究中，蛋白质降解始终是人们关注的焦点，几乎所 有的干酪促熟方法大部分都集中在与蛋白质有关的降解上，尤其是硬质、半硬质 干酪和低脂干酪。加速脂肪分解仅对一些具有浓烈风味的干酪，如蓝纹干酪 限o m 褫0 ) 和意大利干酪( p f o v a l o n e ) 促熟意义较大吼因此，多数干酪促熟方法的研 究就是在保持干酪的风味和质地结构不受影响的前提下，加速蛋白质降解及其相 关过程。 干酪促熟方法的研究发展经历了四个阶段：1 9 7 5 年之前，主要集中在添加活 细胞、提高成熟温度、添加游离酶和悬浮液系统这四种方法上；1 9 7 5 年到1 9 8 5 年， 主要是向处理发酵剂细胞和酶微胶囊化领域发展，同时在乳或凝乳中添加游离酶 进行深入研究；1 9 8 5 年到1 9 9 5 年，应用处理发酵剂细胞法加速干酪成熟；1 9 9 5 年 之后，则是运用微胶囊化酶和高压法促熟干酪【1 。”。近来，乳品领域的国内外专家 越来越多的把生物工程应用到加速干酪成熟方法研究，如添加基因工程处理的乳 酸菌，自溶细菌的分离，发酵剂自溶及其加速干酪成熟的研究等【1 8 】。到目前为止， 干酪促熟的方法主要有提高成熟温度、高压处理、酶法、添加成浆干酪悬浮液系 统、处理发酵剂细胞及这些方法的综合运用等，其中酶法和处理发酵剂细胞是研 究较系统、应用较多的促熟方法，提高成熟温度和高压处理法是干酪促熟中应用 成本较低且易实现的方法。 2 1 提高成熟温度法 提高成熟温度所需要的费用低，是最有效的干酪促熟方法之一。提高成熟温 度可增强干酪中残留的凝乳酶、蛋白酶以及其它微生物酶的酶活性，从而加速酶 催化反应进行。一般干酪的成熟温度为8 - 9 c ，温度提高会明显缩短成熟时间 f e d r i c k l l 9 】研究表明干酪在成熟温度为1 5 时，其成熟时间较8 c 下成熟时间可缩短 一半，在1 3 下成熟时间为8 c 下成熟时间的1 3 。c h c d d a l 干酪在3 2 周的成熟期 内，在不影响干酪品质的情况下，成熟温度可提高到1 5 。c ，在此温度下成熟1 2 周 的干酪蛋白降解程度相当于8 c 下成熟3 2 周的蛋白降解程度，1 5 。c 成熟2 0 周相当 于8 c 成熟3 2 周的干酪风味、组织状态【加】，现在工厂能在1 2 1 4 加速所有的硬 质和半硬干酪的成熟，且效果良好。提高成熟温度有利于增强干酪风味，尤其是 硬质干酪如c h e d d a r 干酪，成熟温度直接决定了干酪的风味强度，在1 3 。c 成熟6 个月比6 c 成熟9 个月的风味强度要大【”l 。但温度过高就有可能造成水分过度蒸 发，脂肪渗出，导致蛋白质和脂肪降解程度减少，进一步导致干酪质地坚硬、风 味减弱，这种现象在无外膜包装的干酪( 盐渍干酪) 中表现尤为明显。此外，温度过 4 高还容易造成微生物污染，如霉菌污染等。l a w 和w i g r n o r e1 2 2 j 认为，加速干酪成 熟强调风味平衡，而提高成熟温度可加速各种类型干酪的典型风味形成，但同时也 加速了不良风味的形成。g o u d a 千酪的最高成熟温度为1 4 1 6 ，温度高于1 6 成 熟2 个月，微生物污染严重且干酪的特征性风味较快会消失i 矧。此外，有研究表明 当干酪成熟温度高于正常成熟温度8 c 时非发酵剂生长的较快阿2 5 , 2 6 】这也可能会导 致干酪成熟后期的风味难以控制。因此，通过提高温度来加速成熟方法的应用是 有限的1 2 7 】。 2 2 高压技术促熟法 高压技术( 1 l i g hp r e s s u r ep r o c e s s i n g ，h h p ) 又称静水压技术( h i g hh y d r o s t a t i c p r e s s u r e ，h h p ) 1 2 8 1 。高压技术促熟干酪一般是将原料乳包装或干酪真空包装后放在 高压容器中( 常以水或其他流体介质作为传递压力的媒介物) ，在静高压( 常用的 压力范围是5 0 1 0 0 0 m p a ) 和一定的温度下加工适当的时间，以影响干酪成熟期 间的变化，加速干酪的成熟。干酪乳经高压处理可极大减少乳中有害菌群的数量， 但对乳中的酶、风味物质及营养物质的影响不大，若压力不太高可以提高酶活性， 有利于干酪成熟。另一方面高压可促进乳清蛋白变性，使其进入凝块，从而使干 酪产量增加，尤其可使其保水性增加，提高凝块的质量，缩短凝乳时间。 有关高压促熟干酪的研究报道并不多，y o k o y a m a 日a 请了高压处理促熟干酪的专 利，在2 5 下5 0 2 5 0 m p a 处理可使干酪成熟3 天就能达到正常条件下干酪成熟6 个月 的风味强度；高压处理羊乳硬质干酪经4 0 0 m p a ，5 r a i n 处理蛋白质水解无论在数量 上还是在质量上都有所提高，但5 0 m p a ，7 2 h 处理效果不明显1 2 9 1 。但也有部分报道 高压处理对干酪促熟没有明显效果，如5 0 m p 处理g o u d a 并没有加速蛋白水解作用， 有学者认为干酪加速干酪蛋白质水解是高压处理时的二者复合作用或高温作用的 结果1 3 0 , 3 1 , 3 2 1 。目前，这一方法研究的资料还难以对干酪促熟技术有较大的影响【硼。 2 3 酶法 酶是干酪生产中蛋白质降解和脂肪分解反应中重要的生物催化剂，在干酪生 产和成熟过程中起着重要的作用。但在干酪生产的排乳清工艺中，酶大部分随乳 清排掉，干酪中残留量较少，因此，添加适量的酶可加速蛋白质降解和脂肪分解， 缩短干酪的成熟期。促熟干酪常用的酶有蛋白酶、肽酶、脂眉目酶、b 半乳糖酶， 也有添加乳中固有的酶如血纤维蛋白溶酶。但是特定的酶只能促熟某种类型干酪 形成典型的风味，s o d a 1 7 1 研究认为，蛋白酶、脂酶均能促熟干酪，同时蛋白酶易 产生苦味，脂酶易产生辣昧，几种酶混合使用能取得较为理想的效果，目前应用 广泛的是动物和真菌脂酯酶和蛋白酶。促熟干酪应用的蛋白酶和肽酶通常是从微 5 生物中提取的蛋白降解酶，它们与干酪中残留的凝乳酶、发酵剂细胞中的蛋白酶 以及乳中固有的血纤维蛋白溶酶之间的协同作用，使蛋白质进一步降解产生短肽 和各种氨基酸，形成干酪特有的风味和口感。作为干酪促熟酶已市场化的有 “r u l a c t i n c ”和“f l a v o r a g e ”两种酶，但有关这两种酶的有效性和市场占有率的报道很 少，“a c c e l a s e ”已试用于干酪生产中，实验资料表明若把这种酶加入到凝乳中可以 使干酪在5 个月达到不添加酶干酪9 个月的成熟度，并且还可以增加干酪的风味减 少苦昧。实验研究酶法促熟干酪有很好的效果，但应用于生产中仍有问题存在， 如微生物体内酶的含量不稳定，产量低，还有一些转化反应要求酶与辅助因子的 结合体，而这种结合体只能在完整的细胞内才具有活性【2 7 。 2 4 悬浮液促熟c h e d d a r ( s l u r r i e dc h e e s e ) 法 这种方法是在高湿、3 0 c 下培养包括约4 0 的固体悬浮液体系，在几天后便 形成很强的干酪风味。这种干酪是由成熟一天或未成熟消毒c h e d d a r 凝乳块制得 的，添加1 0 0 m g k g 的谷胱甘肽( g s h ) ，然后在3 0 c 下每日搅拌，培养5 7 d 。g s h 含量为1 0 m g k g 、2 0 0 m g k g 及半胱氨酸盐酸含量为5 0 m k g 的干酪在3 5 * ( 2 下培养 时可产生令人满意的c h e d d a r 干酪风味。当成浆干酪中含有山梨酸钾时，除乳酸杆 菌有显著增加外，其它微生物数量均无显著性交化。添加成浆干酪的干酪中 t c a - s n 含量并无显著增加，但风味和组织状态有较大的改善，成熟期可缩短到 1 5 个月。在c h e d d a r 干酪添加悬浮液若加速h 2 s 的生成和由g s h 生成甲硫醇， 需要具有活性的丫- 谷氨酰转肽酶，乳酸菌对成浆干酪产生h 2 s 羰基化合物、甲硫 醇、二甲基硫醚来说有着重要的意义，而直接酸化制得的干酪中只含有羰基化合 物i ”3 4 1 。悬浮液可加入到酪乳、干酪压榨前的凝乳或压榨的盐化凝乳中，若在后 期添加6 的悬浮液可使于酪含水量增加2 ，并可加速干酪风味的形成，但也会 出现风味缺陷。悬浮液体系中大量的乳酸杆菌能加快干酪风味物质的形成，有效 添加量为1 0 5 1 0 7 c f u g ，在成熟几天之后产生强烈的风味 3 5 1 。目前，这种方法的机 理尚不清楚，并且其过程难以控制，尤其容易出现酵母的风味缺陷。 2 5 增加发酵剂活细胞数量法 添加到酪乳中的发酵剂，一方面可分解乳糖产生乳酸，另一方面可在干酪成 熟过程中释放大量的细胞内酶于干酪质体中，这些酶可催化分解蛋白质和脂肪的 降解反应，进而形成干酪的典型风味。因此，在最早寻找加速干酪成熟方法时， 人们曾通过添加微生物活细胞数目以达到加速干酪成熟的目的。1 9 8 2 年，v l b a r r a q u i o1 3 6 | 等把发酵剂的添加量从1 5 增加到3 应用到f y n b o 干酪中，发现增加发 酵剂的添加量对干酪的风味、外观、颜色、气孔和一般可接受性均没有影响，成 熟期可缩短2 5 3 0 个月。1 9 9 1 年，g t r e p a n i e r1 3 瑚】等在于酪凝乳中分别加入发酵 剂活细胞和细胞匀浆，发现添加活细胞或细胞匀浆可使干酪风味强度较对照组增 加4 0 ，但加入活细胞的干酪p h 值较低，并且这种干酪成熟后易破碎，因此实际 生产中应用较少。 2 6 处理发酵剂细胞法促熟于酪 目前认为微生物酶含量的变化会直接影响到干酪成熟的速度和风味。在不改 变原发酵剂种类和干酪制作工艺的条件下，。提高干酪中微生物酶的含量一种最有 效的方法是增加发酵剂添加量，但这样就会导致发酵剂大量产酸，降低干酪的d h 值，要使添加的这些发酵剂既能在千酪成熟期间释放出具有活性的成熟酶又不会 产生大量的乳酸，必须对这些发酵剂进行处理使，其弱化以符合加速干酪成熟的 要求。目前，应用于加速干酪成熟的处理发酵剂的方法有热休克法、冷冻法、冷 冻干燥法、喷雾干燥法、用溶剂溶解弱化或选择乳糖缺陷变种【州。 2 6 1 热休克处理发酵剂细胞 1 9 7 5 年p e h e r s s o n 和s j s 仃0 m1 3 9 】首次提出了用热休克处理发酵剂细胞加速干 酪成熟。热休克发酵剂在干酪生产中的主要作用是水解中等长度的肽链而不直接 降解酪蛋白【帅, 4 1 1 ，该法也可增强脂肪分解和游离脂肪酸的含量，缩短成熟时间。 加入热休克发酵剂对干酪的p h 值和干酪乳的形成影响不大，但可促进蛋白质降 解，增强干酪风味。a b r e lb a t se t a l 4 2 】用热休克干酪乳杆菌和瑞士乳杆菌加工r a s 干酪，成熟期缩短了1 2 个月。 热休克处理发酵剂最常用的菌种是l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s ，该菌种与其它菌 种相比其肽酶活性较高，因此半数以上的热休克处理发酵剂加速干酪成熟的研究 都采用该菌种。无论采用哪种菌种进行热处理，一定要基于该菌种能够很好的作 为发酵剂或附属发酵剂应用，并且不会导致干酪出现风味缺陷。t r e p a n i e r 等1 4 3 】将 热休克的乳球菌和乳杆菌生长情况进行了比较，发现加入热休克乳杆菌可在m r s 培养基上迅速生长，并抑制杂菌生长，其中的l h e f v e f i c u s 用作主发酵荆或次发酵 剂都能成功地用于干酪生产而不产生风味缺陷，而且因其肽酶含量大、活性高， 在热休克处理发酵剂中应用最广。b a r t e l 等人l 比较热休克保加利亚杆菌、瑞士 乳杆菌和嗜热链球菌对荷兰干酪的促熟效果，发现l h e l v e t i c u s 的作用效果最好， 成熟期缩短1 4 。 热休克处理发酵剂细胞的一般过程为：菌体先在乳中悬浮培养到对数生长期 后期或稳定期早期，然后经离心沉淀收集高密度菌体，沉淀的菌体在乳中再悬浮， 一般采用7 2 1 0 1 5 s 条件进行热休克处理发酵剂，然后冷却，在制作干酪中和原 发酵剂一起加入原料乳中。e x t c r k a t c 等人1 4 5 j 先将发酵剂细胞预冷5 8 0 h 以上或 再悬浮于磷酸缓冲液保护剂中，然后进行热休克处理。经这种方法处理的细胞存 活率低，但经过浓缩的发酵剂细胞热休克前后总量减少不明显。热休克在一定程 度可破坏细胞膜的通透性、影响细胞的正常代谢调节，这种亚致死状态对生物的 生理、代谢、遗传方面的有不利影响可能会致使生物体发生形态、表形的突变进 一步阻碍细胞正常生长繁殖。在菌体生长初期，热休克处理的发酵剂细胞表现为 修复过程，即迟滞期的延长，特别是修复早期，细胞数量增加不明显。随着培 养时间延长，菌体密度逐渐增大，茵体的存活率会升高，这是由于高浓度细胞在 热体克过程中形成了菌胶团保护层，相对地降低了菌体细胞暴露在悬浮介质中的 面积，细胞难以利用其中的营养物质，不能正常的进行生长代谢，造成细胞产酸 能力下降，菌体活性消失。因此，热休克处理发酵剂一方面可抑制或延迟发酵剂 产酸，不影响干酪乳的酸度；另一方面可加速细胞溶解，使细胞中大量的活性酶 释放到干酪乳中，加速蛋白质和肽的进一步降解，产生良好的促熟效果【”】。 在不考虑细菌的种类和热处理温度的情况下，通过对p 1 a s n 、1 a s n 和游 离氨基酸含量的测定及风味的评定，添加热休克处理发酵剂的干酪的蛋白水解程 度和风味都有所提高，苦味有所减少。但是仍可能有一些不理想效果的资料尚未 出版或有待研究，如添加l b u g a d c u s 或s t r e p t o c o c c u st h c r m o p h i l u s 就会产生对干 酪风味不利的影响1 4 4 j 。 2 6 2 冷休克处理发酵剂细胞 1 9 7 5 年，p c t t e r s s o n 和s j s t r o m 3 9 】首次提出用冷休克处理发酵剂细胞。1 9 8 7 年 b a r t c l s 等将细胞经冲洗后浓缩1 0 倍，在2 0 下冷冻一个晚上或更长的时间，加入 乳前4 0 下快速解冻细胞。适用于这种方法处理的细胞很多，但最常用的还是 l h e l v a t i c i l s 。冷休克发酵剂的接种量一般为0 4 2 0 ( w w ) ，相应的细胞数为 1 0 7 1 0 s c f u m l ，凝乳中的活细胞数为1 0 5 1 0 6c f u m l 。在添加冷休克发酵剂的研究中 发现，这种促熟方法对干酪的水分含量和p h 值没有明显的影响但是能极大的提高 蛋白水解的程度，增加干酪中挥发性脂肪酸的含量，并且能明显提高低脂干酪或 u f 。于酪的风味。添加冷休克l h e l v a t i c u s 与l c a s e i 4 ”，l b u l g a r i c u s 或 s t h e r m o p h i l u s t 邶l 相比，前者干酪中的蛋白水解程度和风味形成都有明显的提高，但 用l h e l v a t i c u s 的冷休克添加到干酪中有时会出现不正常的甜味和坚果味f 4 9 】。近来 研究认为l h e l v a t i c u s 能提高蛋白质和脂肪的降解程度，导致产生甜味和含硫特征 的风味，这些都与所采用的菌种有关【删。冷休克对细胞内酶活性的破坏性比热休克 低，添加冷休克细胞可以提高细胞的自溶性加速细胞内酶的释放，从而提高干酪中磷 钨酸氮( p t a s n ) 的含量。冷冻休克的发酵剂不仅可以增强细胞自溶性而且相对 于热休克处理容易操作，但目前还没有用这两种方法处理同一种菌种在干酪中的对 比研究。 2 6 3 溶解细胞壁 用溶菌酶或有机溶剂对破坏发酵剂细胞膜结构使其释放出细胞内酶，据资料 报道有两种方法：一、是溶菌酶处理发酵剂会使发酵剂细胞破壁，释放出细胞内 蛋白酶、肽酶加速干酪成熟。1 9 8 6 年g o u d e d r a n c h e l 5 2 】等在凝乳中直接加入溶菌酶 0 5 1 o g k g 提高了u f s tp a u l m 和c a m e m b e r t 干酪的质地和风味；l a w1 5 2 1 等用 0 1 2 m g m l 的溶菌酶( 最佳条件是o 5 m g m 1 ) 在3 7 下处理无菌水中的入球菌悬 液1 5 r a i n ，可使溶菌酶敏感细胞( 璐c ) 推迟产酸6 h ，然而，与热休克促熟干酪相 比这种方法并没有改善干酪的质地、增加干酪的风味，理论上分析，溶菌酶处理 比热处理会更容易保持发酵剂的酶活性，作者解释是乳球菌细胞内酶仅在蛋白质 二次水解时起作用，并不直接对契达干酪的风味产生作用。二、用n - 丁醇处理， 用n 丁醇有机溶剂处理发酵剂可以改变细胞膜的磷脂结构，使细胞不能够产酸， 并能提高肽酶的活性。在g o u d a 干酪中添加经丁醇处理的发酵剂仅稍微能加速干 酪成熟，但与对照相比在很大程度上可消除苦味。但涉及到成本、安全及法律等 因素可能难以在生产中应用。 2 6 4 乳糖缺陷变种 生物技术在处理发酵剂促熟干酪中的应用已很广泛，如用x - 射线使发酵剂发 生突变以增加细胞内酶的蛋白水解和脂肪降解能力口”，选择乳糖缺陷变种作为处 理发酵剂1 5 4 1 等，缺乏乳糖代谢酶的发酵剂加入干酪，即使浓度很大也不会增大干 酪酸度，但能增强蛋白降解活性。这种方法最早是d u l l y 等人提出，他们分离了 s t r e p t o c o c c u s l a c t i sc 2 的变种，该变种没有发酵乳糖的能力( l a c ) ，不会影响乳的 酸化，因此不必进行任何物理处理就可以作为处理发酵剂。乳糖缺陷变种具有抗 冻性，因此可采用冷冻浓缩的方法增加菌种的浓度，然后与原发酵剂一并添加到 乳中。结果表明干酪中的t c a - s n 含量稍有不同( 这也验证了该变种往往伴随有 缺乏蛋白水解酶( p r t 。) 的特性) ，干酪中的游离氨基( p 1 ：a - s n ) 含量增加，除苦 味有所减少外，对干酪的风味影响不大。r e q u e n a 等在1 9 9 3 年用质体融合法获得 l a c - p r e + - 孚l 球菌，与原发酵剂加入到低脂半硬质干酪中i 卅发现添加变种菌可以提高 蛋白水解程度并使成熟期缩短一半，进_ 步研究发现可使干酪在成熟末期的游离氨 基酸含量提高5 0 ，g c m s 分析挥发性物质含量增加一倍。 这种方法