胚胎体外培养及胚胎评估的培训END课件.ppt

胚胎体外培养及胚胎评估的培训,孙正怡2015-12-22,胚胎体外培养胚胎评估,人员/操作培养流程,胚胎体外培养体系,培养箱外环境,空气及污染物振动、噪音光照室内湿度,挥发性有机化合物VOC,总挥发性有机化合物（TVOC）：熔点低于室温沸点50260挥发性有机化合物的总称,世界卫生组织(WHO,1989),VOC分类,苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）二异氰酸酯（TDI）二异氰甲苯酯有机氯化物（三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷）氟里昂类石油烃类有机酮、醛、胺、醇、醚、酯、酸等,测定VOC,先俘获、后测定各种VOC的俘获方法不同测定总VOC？目前测定的“TVOC”：613个碳原子的苯系有机物其他VOC有各自的俘获测定方法,未知VOC很难测定,尘埃粒子,直径0.5um的悬浮粒子十万级：3500000/m3万级：350000/m3千级：35000/m3,光照,来源：室内照明灯、显微镜光源危害：损害线粒体培养液成分分解紫外线产生活性氧，对所有细胞有害,光照,豚鼠卵，超过一小时，影响后续受精和有丝分裂低照度利于人卵的囊胚形成和妊娠有相反的结论兔卵进行光照2030分钟后，随后的受精率和着床率并未受到明显影响,相对湿度（RH）,1m3空气,25,23g水蒸气,10g水蒸气,RH=绝对湿度/饱和湿度,30,30g水蒸气,RH=43.5%,RH=33.3%,理想的室内相对湿度？,设备,抑制霉菌,人员,减少液体蒸发,0,100,3060%,培养箱内环境,气体温度培养皿液滴培养方式油,气体,二氧化碳培养箱,三气培养箱,桌面式培养箱,气体纯度,99.99%?99.995%?99.999%?,剩余的0.001%是什么？,高浓度氧，胚胎基因表达异常？低氧培养改善体外胚胎发育低氧培养，人囊胚细胞数增加,低氧培养,低氧培养,部分文献不必要低氧?培养液内，添加了抗氧化物质（牛磺酸、丙酮酸）可能消除高氧的不利影响,ASRM，2013年,支持低氧环境利于囊胚形成！,低氧同样利于卵裂期胚胎,LowoxygenconcentrationsforembryocultureinassistedreproductivetechnologiesStephanBontekoe1,*,EleniMantikou1,MadelonvanWely1,PublishedOnline:11JUL2012Assessedasup-to-date:4NOV2011DOI:10.1002/14651858.CD008950.pub2,荟萃分析，随机对照研究1382名IVF/ICSI患者20%vs5%O2活产率从32%提高到43%,温度,鼠胚室温5分钟降低卵裂率15分钟囊胚形成率减半人卵母细胞低温损害纺锤体,温度纺锤体解聚与恢复,33下，5分钟解聚，10分钟完全消失37后,10分钟内恢复28，解聚加快，恢复时间长，20分钟不能完全恢复,液滴/培养方式,单独培养,集合培养,胚胎自分泌、旁分泌作用减小体积适当增加胚胎数目,液滴,自分泌,旁分泌,集合培养依据,鼠、羊、牛胚胎培养证据具体旁分泌因子未确定,集合培养方法,2050ul25个胚胎/液滴盖油（石蜡油、矿物油）,液滴,矿物油,液滴,液滴,集合培养,缺点：不利于单个胚胎的连续观察,解决1：按Day3形态学评分分组培养,解决2：特殊培养皿,液滴,培养液,培养液种类水、离子碳水化合物氨基酸pH值及缓冲物质维生素，抗生素螯合剂抗氧化物质蛋白质，大分子激素，生长因子,培养液种类,序贯培养液单一培养液,序贯培养,mmol/L,Gardner,1998,序贯培养,葡萄糖不利于分裂期胚胎发育囊胚主要能量来源EDTA利于分裂期胚胎发育抑制囊胚内细胞团发育氨基酸,序贯培养系统,Day1Day3:卵裂期培养液Day3Day6：囊胚培养液,单一培养液？,单一培养：简化流程，形成率类似Day3换液Day3不换液！,pH值与缓冲物质,pH：代表氢离子浓度pH与细胞各种生理功能关系极密切pH指示剂：酚红缓冲物质：维持pH稳定，成对或一种：碳酸盐缓冲对、MOPS、HEPES,1,pH值,14,7,pH值与CO2浓度,最重要的缓冲对碳酸盐缓冲对：HCO3-/H2CO2,pH=pKa+lg（）,HCO3,H2CO3,培养系统的pH值,7.2-7.4碳酸盐体系不稳定！暴露空气会使PH迅速升高盖油减少培养基气体交换,CO2浓度影响因素,设定值：5%？6%传感器类型培养箱开门方式温度、湿度,无机离子参与渗透压形成高浓度氯化钠不利于鼠囊胚形成胞外镁和钙的水平与早期胚胎细胞对细胞内稳态调节能力有关磷在含有葡萄糖的简单培养基例如HTF或Earls抑制人胚胎的发育,无机离子,铵,氨基酸代谢及自然分解产生的氨会导致胚胎毒性物质-铵离子的积累铵离子可以改变胚胎分化、代谢及基因表达会严重降低移植后种植率及胎儿发育率,抗生素,培养基中一般均含抗生素例如青霉素、链霉素和庆大霉素主要作用时防止培养基的细菌污染,蛋白质/大分子物质,白蛋白可以降低配子和胚胎表面电荷，避免其粘到玻璃或塑料上便于操作，且可以抵消毒性效应如：人血清蛋白（HSA）和牛血清蛋白、人血浆蛋白粉、5%血浆蛋白注射液、及合成血清替代品（sss）,阻止培养液的蒸发及培养基pH的变化种类：矿物油石蜡油,油,培养液储运,冷链运输，28保持容器密封，有泄漏的容器导致培养液碱化，镁离子沉淀减少细菌污染风险,分装,目的：减少开瓶次数分装量：根据使用情况，一次一支分装容器，与量匹配标记分装日期,胚胎移植移植时期,广泛采用D3（约8-cell）胚胎移植在体内此时的胚胎是在输卵管内，而不是在子宫内卵裂期移植的妊娠率低于D4及囊胚移植,囊胚培养,进一步筛选胚胎灵活的移植时间便于PGD/PGS减少异位妊娠,囊胚的整倍体率,年龄与囊胚的整倍体率,BarisAta2012,年龄,人员及操作,人员数量适当每项关键技术均至少2人能熟练实施确保足够人力实现双人复核,卫生部（卫科教2003176号文件）规定，实验室专业技术人员不得少于3人。年周期超过1000个周期的中心需要适当增加技术人员,每名全职胚胎学家完成250400周期/年,人员及操作,操作时间对卵、胚胎的应激核对,胚胎体外培养胚胎评估,卵巢刺激后获得的胚胎发育潜能不一致减少移植胚胎数，挑选正确的胚胎！胚胎评估、胚胎选择是IVF实验室技术中的核心,常规胚胎形态学评估,始于第一例IVF-ET1981年Edwards阐述了形态学评估的方法,胚胎形态学评估,多种评分体系可进行胚胎形态学评估缺点依赖操作者主观能力优势快速而有效,Alpha,“Toadvancetheartandscienceofclinicalembryologyforthebenefitofthepublicworldwide,throughinternationalpromotionofeducation,communication,andcollaboration.”,objectives,唯一由资深胚胎学家组成的国际组织,Alpha共识,embryomorphologycryopreservationKPIsTheProfessionalStatusoftheClinicalEmbryologist,Istanbulconsensusworkshoponembryoassessment:proceedingofanexpertmeeting2010,胚胎的形态学指标,透明带极体卵周隙,胚胎形状裂球数量裂球形状裂球排列,原核,碎片多核颗粒空泡,致密化,囊胚腔大小ICM形状TE细胞数,早卵裂,Righttime，rightembryo！,评估时间,原核期评分,1998年前后提出原核核仁的数量，排列原核大小及排列胞浆状态,2001年,原核期评分能够预测囊胚形成，与妊娠率相关近10余年一直存在争议，研究多为回顾性2011年time-lapse：对评分方法提出质疑,原核期评分,早卵裂,2427小时的第一次分裂Shoukir，1997年提出早卵裂是发育能力的重要标志后多人研究证实,分裂对称性,卵裂球均等性,0,1,2,0,1,2,Day2卵裂期评分,Day3细胞数,Edwards提出人早期胚胎有相对固定的发育速度超出或低于此速度，均影响后续发育大量文献：细胞数种植率、囊胚形成率！,iAlikaniM.HumReprod2000,碎片,碎片：无细胞核，细胞膜包裹的细胞外胞浆结构（Alikani，1999）细胞代谢或分裂过程异常造成的凋亡过程染色体异常造成碎片？,仅仅是目前我们对碎片的认识,“细胞”大小与DNA,Day2胚胎，卵裂球65-70um小于45um2有DNA大于45um67有DNADay3胚胎，卵裂球55-60um小于40um3有DNA大于40um66有DNA,碎片对胚胎发育的后续影响局部融合,Day4可能发生局部融合部分卵裂球和碎片排除在外,局部融合囊胚质量下降,卵裂球对称性,文献非常少卵裂球严重不均匀的胚胎种植率下降Hardarson，2001,多核现象,可能与染色体异常有关囊胚形成率下降种植率下降妊娠率下降VanRoyen，2003Magli，2007,Day3胚胎形态学评价,细胞数与碎片含量，哪个指标更重要？,在所有形态学指标中，细胞数是最重要的独立的预测胚胎活性的指标！RonitMachtinger，2013,细胞数与囊胚形成率,碎片、细胞数与day6囊胚形成,卵裂期胚胎评估,细胞数少于8个种植能力下降多于8个种植率可能下降碎片:定义:d225%)不需要记录碎片位置多核现象:一个卵裂球内超过一个细胞核;d2评估细胞大小:2-,4-,和8-cell阶段应均匀,卵裂期胚胎分级,day4胚胎形态（桑葚胚）,相关文献很少GradeAF(2011)致密化与滋养层的形成有重要关系,致密化非常重要,Day4胚胎分级,囊胚质量评价,Gardner评分方法16期,6期,5期,4期,3期,2期,A,B,C,A,B,C,囊胚形态学评