（食品科学专业论文）虾头和罗非鱼酶解及酶解产物血管紧张素转化酶抑制性的研究.pdf

摘要 摘要 本论文对虾头、罗非鱼酶解条件及其产物的血管紧张素转化酶( a c e ) 抑制性进 行了研究，并探讨了将水产品加工的废弃物通过酶解转化成动物水解蛋白和有抗 高血压的功能性食品的可行性，以提高水产品综合利用水平和减少对环境的污染。 经研究发现当固液比为l ：2 、温度为6 0 。c 、p h 值为7 0 6 时虾头内源酶酶解 产物中氨基酸态氮含量最高。在以上实验的基础上采用3 因素、5 水平二次旋转 正交实验，对虾头内源酶酶解进行优化。实验结果表明：在固液比为l ：2 ，p h 值为6 8 l ，温度为5 9 下水解5 小时所得到的氨基酸态氮含量为1 1 9 ，并对 该结果进行验证实验，得出的结论与理论十分接近。利用内源蛋白酶与 a 1 c a a s e 2 4 l 、f l a v o u r z y m e 、k o j iz y m e 、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、t r y p s i n 和 p r o t a m e x 对虾头进行复合酶解。与单一的虾头内源蛋白酶酶解比较。 a 1 c a l a s e 2 4 l 与虾头内源蛋白酶复合使用后酶解产物中游离氨基酸的含量为 1 3 4 ，提高了0 1 5 。 罗非鱼酶解研究表明：虾头蛋白酶和k o j i z y m e 酶解产物中游离氨态氮含量较 高分别为1 3 8 和1 3 4 ；f l a v o u r z y m e 、p r o t a m e x 、a i c a l a s e 2 4 l 、r y p s i n 、 木瓜蛋白酶、中性蛋白酶酶解产物中游离氨态氮含量较低( p h 值。 2 以t c a 可溶性蛋白含量为目标的回归方程的建立 阻t c a 可溶性蛋白含量为目标的回归方程如下所示 y = 6 0 6 6 2 3 2 7 1 6 5 4 3 3 x ：一4 。7 6 0 7 1 5 x 。一4 1 6 6 6 1 4 x 。一3 。4 3 1 3 6 x 。x i 一0 9 3 0 6 1 3 x 。x 2 5 8 2 9 9 8 8 x 1 x 。一1 4 8 2 9 9 4 x 2 x 2 + 9 3 6 6 9 8 8 x 2 x 3 1 4 ，1 4 4 7 1 x 。x 。一一一一一一( 2 ) 回归方稷( 2 ) 复相关系数r 2 - - - - 9 2 2 3 ，表明由三个因索及其二次项所构成的回 归方程能解释y 交纯的9 2 2 3 ，霞髓方程熊较好魏叛合郧头内源鬃自酶酶解过程 中生成t c a 可溶性蛋白的过程。在液3 5 中交互项x 。x 。的p 值为0 7 3 4 3 9 l ，表明 交互瑷x ；x 。顼对酶解遵程孛t c a 可溶往往豢自含羹交纯静影响不驻著，帮不存在 时间与温度的交互作用。其它不同的因素组合对水解生成t c a 可溶性蛋臼含量都 有显著静影确。男乡 ，由p 擅可翔，虾头海源蛋鑫酶餮鼹过程串，酶解辩阕、滚 度和p h 值对酶解产物中t c a 可溶性缀白含缴影响狸度顺序为时间 温度 p h 值。 表3 - 5 系数的显著性检验( t c a 可溶性蛋白含量) t a b l e 3 5r e g r e s sc o e f f i c i e n t sa n dv a r i a n c ea n a l y s i so fr e g r e s se q u a t i o n 3 。3 1 3 虾头自溶水解条件的优化绩果 根据虾头内源蛋自酶酶解氨蕊酸生成的数学模型及t c ay 町溶性鬣囱含量斑成的数 学模型，运用期望函数途径优化反虚条件。寻求反应条件使得虾头内源氍白酶酶 解产物中氨基酸态氮含量最搿。设鼹低可以接受变最氨基黢态氮含量l = o 8 ，最 赢可接受变量氨基酸态氮含激y + = 1 。3 。利用s a s 软件编程使x t 、x 。、x 。在 一1 6 8 2 ， 第三章虾头酶解条件优化 + 1 6 8 2 内去步长等于0 2 。运行程序，寻求较大d 值的x 。、x 。、x 。的优化组合， 结果如表3 5 所示。 表3 5 旋转设计优化结果( 氨基态氮含量) t a b l e3 - 5e s t i m a t ev a l u e so fq u a d r a t i cr e g r e s s i o no f o r t h o g o n a la n d r o t a t i o n a lc o m b i n a t i o nd e s i g n 由表3 5 中可以看出，自溶水解反应条件：时间、温度、p h 值分别为5 小时 ( + 1 5 1 8 ) 、5 3 ( + o 1 1 8 ) 、p h = 6 8 1 ( 一1 0 8 2 ) 的时候，试验指标氨基酸态 氮含量理论上可以达到最大值1 1 9 换算成水解率为6 8 7 5 。 3 3 1 4 虾头自溶水解反应最优化条件的验证实验 运用期望函数途径优化出虾头自溶水解反应的条件为：时间= 5 小时( + 1 5 1 8 ) ，温度= 5 9 ( + o 1 1 8 ) ，p h 值= 6 8 l ( 一1 0 8 2 ) 。 实验步骤：称取2 0 克虾头，按固液比l ：2 加入混合缓冲液，然后将虾头打 浆：先测零点，然后将虾液放到5 9 的水浴槽保温5 小时后取出，取i m l 样，加 入8 0 m l 自来水，用酸度计测量p h 值，先用0 0 5 m o l 几的n a o h 溶液将p h 值调到 8 2 ，然后加入1 0 m l 甲醛，搅拌、继续滴定到p h 值为9 2 为止。同时进行空白试 验。记录滴定消耗n a o h 的量，计算氨基酸态氮的含量。做3 次重复实验，求得氨 基酸态氮含量平均值为：1 2 2 ，与理论值相当接近，证明优化结果可信。 水解动物蛋白( h a p ) 是以畜禽或水产为原料经水解工艺制得的纯天然产品，其 中含有人体需要的多种氨基酸，营养价值高，易消化吸收，并且能较好地保持其特 有风味特点，已大量应用于方便食品、休闲食品、高档调味料和营养强化食品，市 场有较大需求；虾头是水产加工的副产品来源广、价格低；反应条件温和较易控 制；利用虾头内源蛋白酶又可减少购买酶制剂的成本。因此，利用虾头内源蛋白 酶生产水解动物蛋白在经济上是可行的。 3 3 2 不同酶对游离氨态氮含量影响 由虾头内源蛋白酶酶解实验可知，虾头内源蛋白酶可以对虾头进行较好的酶 解，因此在进行虾头复合酶解时，以虾头内源蛋白酶为主，与外加蛋白酶配合进 行复合酶解。复合酶解条件为：固液比1 ：2 ，加酶量e s 为2 5 0 u g ，温度为6 0 。c ， p h 值为7 0 6 进行虾头复合酶解实验。由图3 2 可推知，不同种类的蛋白酶的性质 擎蔫理工大学工学磺士学位论文 差异较大，与虾头瞧源蛋宣酶复合鼹，产物中游襄氨酸基酸的含爨也搪羡较大。 与无外加酶比较可知，a l c a l a s e 2 4 l 与虾头内源擞白酶复合使用后，能较大程度 地提赢酶解产物中游离氨基羧的含爨，丽f l a v o u r z y m e 、k o j i z y m e 、木瓜蛋白酶、 中性鬣白酶、t r y p s i n 和p r o t a m e x 与虾头肉源蛋自酶复合后不一定能提高产物中 游离氨基酸的含量，可能在实验条件下这鼹种酶的结构不利于的复合，嫩现相亘 水解失活使酶活力降低。 a l c a l a s e 2 4 l 是一种适于工业使用的碱性蛋白酶，由b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s 经发酵而秘襻，用于谖自质的深度永解，其巾主要成分为c a r l s b e r g 枯草孝于菌蛋白酶( s u b t i l i s i n ) ，怒一种丝氨酸蛋白酶。氨基酸态氮的含量在整 圈3 - 2 复合酶解中游离氨态氮含量变化曲线 f i g u r e3 - 2c h a n g i n gc u r v eo fc o n t e n to fa m i n on i t r o g e ni nm i x e de n z y m e 个实验过程中一直增力珏，在实验开始的i 小时内氨熬酸态氮含量的增加最为明显。 酶解2d , m t 蔷氨基酸态氮的增势趋缓，可能由于酶专一性对酶作髑的限制。 3 ，4 本章小结 3 4 1 采用3 因素、5 水平二次旋转正交实骏，分潮以永解过程中氨基酸态氮含蘸 和t c a 可溶憔蛋白含量为指标，对虾头内源酶酶解进行优化。得出在多个因素影 确下褥到最大氨基酸含量酌濂优化条件为：在嗣液眈为1 ：2 ，p 并德为6 8 1 ，澄瘦 为5 94 c 下水解5 小时所得到的氨基酸态氮禽量最商为1 1 9 。同时，对该结果进 行验诞实验，得崮懿缩论与理论十分接近，证朝谯伍条佟是符合实际祷流豹。辅 第三章虾头酶解条件优化 用虾头内源蛋白酶生产水解动物蛋白生产成本低，产品应用范围广，在经济上是 可行的。 3 4 2 利用内源蛋白酶与a l c a l a s e 2 4 l 、f l a v o u r z y m e 、k o j i z y m e 、木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶、t r y p s i n 和p r o t a m e x 对虾头进行复合酶解。与单一的虾头内源蛋白 酶酶解比较，a l c a l a s e 2 4 l 与虾头内源蛋自酶复合使用后酶解产物中游离氨基酸 的含量为1 3 4 ，提高了0 1 5 。，而f l a v o u r z y m e 、k o j i z y m e 、木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶、t r y p s i n 和p r o t a m e x 与虾头内源蛋白酶复合后没有提高产物中游离 氨基酸的含量。 华南理工大学工学硕士学位论文 4 1 引言 第四章罗非鱼肉的控制酶解 2 0 0 0 年我国罗非鱼产量为6 3 万吨，占世界总产量的6 0 “。出口产品主要是冻 鱼片和冻全鱼两大类，其中罗非鱼鲜冻鱼片在国际市场很受欢迎，但出口产品中精 深加工的产品所占比重较小，加工过程中产生大量的下脚料，造成大量的优良资源 的浪费“。加快罗非鱼下脚料的综合开发利用，不仅可深加工可大大提高其利用率 和附加值，而且可减少对环境的污染。 4 2 实验材料与方法 4 2 1 实验材料与主要试剂 罗非鱼购于市场，去除内脏，清洗后， 备用。罗非鱼肉含蛋白质1 5 4 ，水份8 2 6 。 试剂名称 规格 硫酸铜 a r 硫酸钾 a r 硼酸 a r 氢氧化钠 a r 磷酸 a r 冰乙酸 a r 乙醚 a r 酒石酸钾钠 a r 甲醛 a r 碳酸钠 a r 钨酸钠( n a 。w 0 2 2 h 。o ) a r 钼酸钠( n a 。m o a 2 h z 0 ) a r 浓盐酸 a r 硫酸锂 a r 液溴 a r 去头，去皮，去脂肪，取肉，冻藏 产地与厂家 广州化学试剂厂 广州化学试剂厂 广卅i 化学试剂厂 广卅i 南方化玻厂 汕头市光华化学厂 天津试剂一厂 天津化学试剂研究所 武汉化学试剂厂 汕头光华化学厂 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂 广州市东方红化工厂 天津化学试剂厂 天津化学试剂厂 第四章非鱼肉的复合控制酶解 三氯乙酸a r 上海凌峰化学试剂有限公司 氢氧化钾a r广州化学试剂厂 硫酸 a r 广州化学试剂厂 乙醇 a r 汕头市光华化学厂 干酪素生化上海伯奥生物科技有限公司 酪氨酸生化上海伯奥生物科技有限公司 牛血清蛋白生化上海伯奥生物科技有限公司 实验中的缓冲液采用b r i t t o n r o b i n s o n 广泛缓冲液。“。 表4 - 1 实验所选用的蛋白酶 t a b l e4 - lp r o t e a s eu s e di nt h ee x p e r i m e n t 4 2 2 主要实验仪器与设备 k m t d 一5 0 0 型电热恒温振荡水槽 l d 4 - 2 型离心机 8 0 一2 b 型离心机 g l 一1 6 g i i 高速冷冻离心机 p h s 一2 c 型p h 计 7 5 1 一g 型紫外光栅可见分光光度计 n o 9 5 4 型多功能捣碎机 2 0 2 2 型电热干燥箱 f a j a 型电子分析天平 7 2 1 型分光光度计 7 8 h w l 型恒温磁力搅拌器 上海益恒实验仪器有限公司 北京医用离心机厂 上海安亭科学仪器总厂 上海安亭科学仪器总厂 上海虹益仪器厂 上海分析仪器厂 美国o s t e r 公司。 中华人民共和国上海市实验仪器总厂 上海精密科学仪器有限公司 上海第三分析仪器厂 江苏省金坛市医疗仪器厂 3 l 一 塞塞蝥三态耋三耋壁圭兰堡鎏奎 4 2 3 实验方法 4 2 3 。1 氨基黢态氮食量的测定 参见2 2 ，3 2 的方法 4 2 3 ，2 t c a 硒溶性蟹自含量的测定 参觅2 2 3 3 的方法 4 2 3 3 蛋白酶酶活力的测定 酶活力魏溯定采瘸f o l i n 一酚法潮3 ，酶滔力豹定义为：在适当鹘条停下，一分锋 内水解标准酪摄白释放出的5 z 氯乙酸可溶物与f o l i n 一酚反应的吸光度与1 微克酪 氨酸稻当潜掰褥静酶鬣为一个单位。 蛋白酶酶活力( u g ) ：a o d k 堕登堡塑 t 其中：k 一9 6 6 1 ；t 为水浴反应时间( m i n ) 4 ，2 ，3 ，3 酶簿蠢艺 罗非鱼肉一匀浆一酶解一灭酶一酶解液 4 3 结果与讨论 4 3 1 不同酶对罗非鱼肉酶解的影响 在预备实验的基础上，选用固液比为1 ：2 ，最通p h ，最适温度，加酶缀e s 为 5 0 0 u g 戆条 孛下，逡嚣实验。f l a v o u r z y m e 、p r o t a m e 、a l c a l a s e 2 。4 l 、t r y p s i n 、 k o j i z y m e 、术瓜蛋白酶、中性蛋白酶、虾头鬣白酶所选用酶解的p h 分别为p h 7 0 、 p h 7 。0 、p h 8 ，0 、p h 8 。0 、p h 6 。0 、p h 5 。0 、蜊7 5 秘p h 8 。0 秘澄度条传分别为5 0 、 5 0 、6 0 、4 0 、3 0 、6 0 、5 0 、5 0 。 罗棼鱼疯中存在一些组织蛋白酶，但淫力不是缀裹，瞩此水解过程可以认为主 要为外加酶的作用。网4 - 1 可知，虾头蛋自酶酶解产物氨蕊酸含量最高，说萌虾头 蛋自懿具有比较强且彻底的水解罗非建熊力。饵料因素对消化酶活力密切相关，w 能由于虾饵料蛋白中瓴粉所占比重较高，使虾头蛋囱酶适含罗菲鱼酶解。虾头中掇 取的螂头蛋白酶为多种蛋白酶的复合酶，其中含有晦切酶和端肽酶。端肽酶一般具 有比内切酶更彻底的尔解能力。k o j i z y m e 瓣解产物氨基酸含量较商也证密了这 点。k o j i z y m e 是由选育的曲霉和杆菌菌种缀发酵制提的外切肽酶和内切蛋白酶的复 合体，其中曲霉在该酶制荆中提供了大量氨臁酶和羧敢酶。f l a v o u r z y m e 也含有内镯 酶和外切酶，但罗非熊酶解产物氨基酸含量并不高，可能怒底物的原因。礞白酶的 篁塑童! ! 竺蜜墼茎坌堡型墼墼 水解催化能力与酶本身的性质( 活力和稳定性) 有关，底物的特点也会对水解效果 产生影响，底物的氨基酸序列能限制酶的催化作用。 图4 一l 酶对产物中氨态氮含量的影响 f i g u r e4 - ie f f e c t so fe n z y m eo nc o n t e n to fa m i n on i t r o g e ni nt h ep r o d u c t 由图4 2 可知，中性蛋白酶、a l c a l a s e 2 4 l 和f l a v o u r z y m e 酶解生成的t c a 可 溶性蛋白含量较高，并都在2 小时达到最大值。f l a v o u r z y m e 是由米曲霉菌种经发酵 而制得的，所含酶的种类复杂，其中包含有内切蛋白酶和外切蛋白酶多种蛋白酶。 f l a v o u r z y m e 酶解产物中短肽的含量比较高，但氨基酸含量不高，可能是f 1 a v o u r z y m e 中含有多种蛋白酶的作用，作用的位点比较多，但整体催化能力不强。 由图4 1 和图4 2 可知，a l c a l a s e 2 4 l 和f l a v o u r z y m e 2 小时时t c a 可溶性蛋 白含量和氨基酸含量相差不大，但4 小时时两者水解产物的组成相差比较大，实验 中a l c a l a s e 2 4 l 催化水解产物中含有较多短肽，而f l a v o u r z y m e 水解产物中氨基酸 和短肽所占的比例比较高。由于可以推测a 1 c a l a s e 2 4 l 若能与其它酶复合使可能得 到更高的氨基酸含量。中性蛋白酶酶解产物氨基酸含量比其它内切酶高，说明中性 蛋白酶比f l a v o u r z y m e 、p r o t a m e 、a l c a l a s e 2 4 l 、t r y p s i n 、木瓜蛋白酶更适合对罗 非鱼进行酶解。 图4 1 与图3 2 比较，实验条件下虾头蛋白酶、最适p h 值下，罗非鱼水解开始 兰童堡三奎耋三兰堡圭兰堡丝圣 1 小时内的氨态氮含量增加速度明显慢于虾的氨态氮含量增加速度，也比虾头无外加 酶的速度小。表明虾头所含蛋白比罗非鱼更易水解。比较图4 - i 和图3 - 2 可明显看 出底物对酶活力有很重要的影响，同一种酶酶解虾头和罗非鱼的速度和水解程度有 很大差异。 图4 2 酶对t c a 可溶性蛋白含量的影响 f i g u r e4 - 2e f f e c t so fe n z y m e o nc o n t e n to ft c ad i s s o u b l ep r o t e i n 4 3 2 罗非鱼肉的双酶复合水解 选用虾头蛋白酶、k o j i z y m e 、中性蛋白酶和a l c a l a s e 进行复合酶解实验，每种 酶的加酶量为e s = 2 5 0 u g 。进行复合酶解时，若两种酶的p h 值和温度条件不同时 分步加入；若两种酶酶解的p h 值和温度条件相同时则同时加入。由于酶法水解时p h 值会出现下降，因此复合酶解时先加入p h 值条件高的酶，后加入需p h 值条件低的 酶。将图4 3 、图4 4 与图4 1 、图4 2 比较可知，并不是所有的双酶复合能明显地 提高产量，这可能与酶的特点有关，酶之间也可相互水解；也可能与产物的特点有 关。这些说明酶的复合使用与单酶使用相比，更难控制。 由图4 - 1 可知虾头蛋白酶与k o j i z y m e 酶解产物的特点为游离氨基酸含量比较 高。由图4 3 可知，当虾头蛋白酶与k o j i z y m e 复合使用时，所得产物中游离氨基酸 一1皿昱目一 啪如位啦赳髓p譬 含量最高为i 9 0 ，而单独使用虾头蛋白酶与k o j i z y m e 得到的产物中游离氨基酸 一1 8 18 誉 一1 4 岫1 2 如1 o 嫒0 8 ，0 6 轴0 4 瓣0 2 00 虾 + 虾头蛋白酶 + x o j i 2 蛐8 蛋白酶 + x o j i z y m e 蛋白尊 o23456 时间( 小时) 图4 3 双酶水解对氨态氮含量的影响 f i g u r e4 - 3e f f e c t so fm i x e de n z y m eo nc o n t e n to fa m i n on i t r o g e n 023456 时间(小时) 图4 4 双酶水解对t c a 可溶性蛋白含量的影响 酶酶哪头酶性 白自叫虾白中 蛋蛋”蛋 性性h h 头h i暑目一 嘲如姐啦犁烛po_ 华南理工大学工学硕士学位论文 f i g u r e4 - 4e f f e c t so fm i x e de n z y m eo r lc o n t e n to ft c ad i s s o l u b l ep r o t e i n 含量分别为1 3 8 和1 3 4 ，两者相比氨基酸态氮含量分别提高了0 5 2 和 0 5 6 。虾头蛋白酶或者k o j i z y m e 与其它蛋白酶复合使用时，也可以提高产物中游 离氨基酸的含量，如虾头蛋白酶与a l c a l a s e 复合使用酶解产物中游离氨基酸的含量 为1 5 0 。 由图4 2 可知中性蛋白酶及a l c a l a s e 酶解产物中t c a 可溶性蛋白( 短肽) 含量 较高，由图4 4 可知，第一个酶加入后2 小时内，t c a 可溶性蛋白( 短肽) 含量几 乎己达到最大值，随后加入的酶对t c a 可溶性蛋白含量的影响并不很大。a l c a l a s e 与虾头蛋白酶及a l c a l a s e 与k o j i z y m e 组合中，第二种酶对t c a 可溶性蛋白含量略 有提高。虾头蛋白酶与k o j i z y m e 组合中第二种酶对t c a 可溶性蛋白( 短肽) 含量影 响比较大，这也与此组合中两种酶的性质有关，虾头蛋白酶酶解产生t c a 可溶性蛋 白的能力远弱于k o j i z y m e 。将图4 4 与图4 2 比较可知，两种酶的复合使用并不能 明显提高酶解产物中t c a 可溶性蛋白含量，可能是由于水解最初的2 小时左右对产 物中t c a 可溶性蛋白含量影响最大，而复合酶解时加入酶的总量虽与单酶法相同， 但每次加入量仅为单酶法的一半，因而难以明显提高t c a 可溶性蛋白的产量。 4 4 本章小结 4 4 1 实验表明：虾头蛋白酶和k o j i z y m e 酶解罗非鱼肉产物中游离氨态氮含量较高 反别为1 3 8 和1 3 4 ；f l a v o u r z y m e 、p r o t a m e x 、a l c a l a s e 2 4 l 、t r y p s i n 、木瓜 蛋白酶、中性蛋白酶酶解产物中游离氨态氮含量较低( 0 8 5 ) ：中性蛋白酶、 a l c a l a s e 2 4 l 和f l a v o u r z y m e 酶解生成的t c a 可溶性蛋白含量较高。 4 4 2 当虾头蛋白酶与k o j i z y m e 复合使用时，所得产物中游离氨基酸含量最高为 1 9 0 ，而单独使用虾头蛋白酶与k o j i z y m e 得到的产物中游离氨基酸含量分别为 1 3 8 和1 3 4 ，两者相比氨基酸态氮含量分别提高了0 5 2 和0 5 6 。复合酶 解对提高酶解产物中t c a 可溶性蛋白含量作用不大。 4 4 3 与虾的酶解比较，实验条件下虾头蛋白酶、最适p h 值下罗非鱼肉水解开始1 小时内的氨态氮含量增加速度明显慢于虾的氨态氮含量增加速度，也比虾头无外加 酶的速度小。表明虾头所含蛋白比罗非鱼肉更易水解。底物的性质也会影响蛋白酶 的水解能力；同一种酶酶解虾头和罗非鱼肉产生氨基酸态氮的速度和水解程度有很 大差异。 丝三茎墼丝童丝垒呈至垫型丝堑窒 5 1 概述 第五章酶解产物a c e 抑制性研究 心血管疾病己成为严重危害人类健康的主要疾病之一。因此，研究开发心脑血 管疾病的预防和治疗药物显得十分重要，开发上市的品种逐年增多，在全世界医药 市场的销售中，心脑血管类药物己占到销售总量的1 8 。血管紧张素转换酶抑制剂 是近年来发展迅速的一类心血管药物，由于其独特的药理作用和良好的疗效，被广 泛应用于高血压、心力衰竭和冠心病等心血管疾病的治疗，也是w h o 推荐的一线抗 高血压药物。 治疗心脑血管疾病的药物主要有以下几种类型：1 3 受体一阻断剂，a 受体一阻断 剂，血脂调节剂，抗血栓形成和溶血栓剂，利尿剂，钙桔抗剂和血管紧张素转化酶 抑制剂等。其中血管紧张素转化酶抑制剂( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n g e n z y m e i n h i b i t o r ，a c e i ) 虽然问世时间不长，但发展非常迅速，现已有2 2 种a c e i 上市。 近来研究发现，a c e i 不但能有效降低血压，还可逆转高血压左室肥厚，抑制急性心 梗后心肌重构，改善充血性心衰的血流动力学状态，提高主存质量降低死亡率；a c e i 可产生抗缺血作用，减少急性冠脉事件，降低左心功能不全的病人再发心肌梗塞的 危险性4 。”1 。而且还可改善认知功能，对并发性糖尿病、心绞痛、改善认知功能都 有显著的疗效“。为了进一步开发疗效更好的新a c e i ，人们对于a c e 和a c e i 本身 和它们的相互作用进行了大量的研究。 5 1 1 血管紧张素转化酶抑制剂作用机制 血管紧张素转化酶( a c e ) 能催化水解血管紧张素i ( a n g i o t e n s i ni ，a n 9 1 ) 和a c e i 。a c e 还有降解神经激肽和p 物质的作用，它存在于许多组织，以肺循环最 为丰富呻3 。 自从o n d e t t i 报道从蛇毒提取出第一个a c e i 以来，有关a c e i 的研究得到了飞 速的发展。对于心血管疾病，目前普遍认为主要的机制是前肾素一血管紧张素以及 激肽原在体内的转变过程”。肾素( 血管紧张肽原酶) 刺激血管紧张素原释放一种 非活性的1 0 肽，血管紧张素i 。在血管紧张素转化酶的作用下，通过脱去c 端h i s l e u 二肽，由a n g l 转化成为有生物活性的血管紧张素i i ( a n g i o t e n s i ni i a n gi i ) ， 后者是己知最强的收缩血管物质之一。a c e i 能够抑制a c e 活性使a n gi 无法转化 为a n gi i ，进而抑制醛固酮的合成，并能够抑制舒缓激肽的水解作用，从而可以从 两个方面降低血压。a c e i 在临床上的应用十分广泛。”“”1 华南理工大学工学硕士学位论文 5 1 2 血管紧张素转化酶抑制剂的研究进展 其中a c e 抑制剂虽然问世时间不长，但发展非常迅速。对于a c e i 的研究开始于 f e r r e i r a 等( 1 9 6 5 ) ”4 3 的发现，他们粗提得到美洲茅头蝮蛇( b o t h r o p sj a r a r a c a ) 蛇毒的混合物，发现其中含使猫的血压下降的作用，因为这一混合物有增强舒缓激 肽的作用，放被命名为舒缓激肽增强因子( b r a d y k i n i np o t e n t i a t i n gf a c t o rb p f ) 。 根据从蛇毒中分离提纯得到a c e i 的结构特点，1 9 7 3 年人工合成了第一个用于临床抗 高血压的a c e i t e p r o t i d e ，它的结构与美洲茅头蝮蛇蛇毒中的那些a c e i 里的一种完 全一致“。m a t t h e w se ta l ( 1 9 7 6 ) 说明肠腔中有相当数量的二肽和三肽未经水解可 直接吸收的事实“1 。o s h i m a 等( 1 9 7 9 ) ”6 1 用细菌胶原酶降解明胶，发现酶解产物中 含有对a c e 具有抑制性的物质，理论上说明了个人的膳食结构与高血压之间存在一 定的关系，通过一定的方法可从食物蛋白质中获得a c e i 。s q u i b b 医学研究所1 9 7 7 年合成出甲巯丙脯酸( c a p t o p r i l ) 于1 9 8 1 年经f d a 批准上市，开创a c e i 控制高血 压的新方法。随着对酶分子认识的不断深入，基于酶作用机理的抑制剂的研究已经 成为众多领域研究的热点。而且，近年来血管紧张素转化酶抑制剂在医学领域慢慢 扩大至并发性糖尿病、心绞痛、改善认知功能等方面的治疗中。h i r o y u k if u j i t a ， m a s a a k iy o s h i k a w a 研究小组从1 9 9 2 开始对干鲣鱼嗜热菌蛋白酶水解物中的a c e i 肽进行深入研究，在小规模的临床实验中，高血压患者和高血压边缘患者经口服经 嗜热菌水解干铿鱼表现出持久的抗高血压活力。而且，该产品作为特定健康用途的 食品已得到日本厚生省认可，称为“k a t s u o b u s h i 低聚肽”。 5 2 实验材料与方法 5 2 1 实验材料与主要试剂 市售近缘新对虾( m e t a p e n a e u sa f f l n l s ) ，清洗后切取虾头。近缘新对虾虾头 含水分7 7 1 2 ，总蛋白质1 0 8 1 罗非鱼购于市场，去除内脏，清洗后，去头去皮去脂肪取肉，冻藏备用。罗非 鱼肉含蛋白质1 5 4 ，水份8 2 6 。 试剂名称 硫酸铜 硫酸钾 硼酸 氢氧化钠 磷酸 冰乙酸 规格 a r a r a r a r a r a r 产地与厂家 广州化学试剂厂 广州化学试剂厂 广州化学试剂厂 广州南方化玻厂 汕头市光华化学厂 天津试剂一厂 第五章酶解产物a c e 抑制性研究 乙醚a r 天津化学试剂研究所 酒石酸钾钠a r 武汉化学试剂厂 甲醛a r汕头光华化学厂 碳酸钠 a r 天津化学试剂一厂 钨酸钠( n a 。w o ：2 h 。o )a r天津化学试剂一厂 钼酸钠( n a z m o t 2 h 。0 )a r天津化学试剂一厂 浓盐酸 a r 广州市东方红化工厂 硫酸锂 a r 天津化学试剂厂 液溴 a r 天津化学试剂厂 三氯乙酸 a r上海凌峰化学试剂有限公司 氢氧化钾 a r 广州化学试剂厂 硫酸 a r广州化学试剂厂 乙醇 a r 汕头市光华化学厂 干酪素生化上海伯奥生物科技有限公司 酪氨酸生化上海伯奥生物科技有限公司 牛血清蛋白生化上海伯奥生物科技有限公司 兔肺丙酮粉生化 n o v o n o r d i s k f a p g g生化n o v o n o r d i s k 实验中的缓冲液采用b r i t t o n r o b i n s o n 广泛缓冲液”。 表5 - 1 实验所选用的蛋白酶 t a b l e5 一ip r o t e a s eu s e di nt h ee x p e r i m e n t 名称作用类型最适p h最适温度( ) 测定酶活力 生产厂家 f l a v o u r z y m e内切+ 外切5 0 7 0 5 06 7 万u 克n o v o n o r d i s k p r o t a m e x内切 5 5 7 53 5 6 01 4 万u 克n o v o n o r d i s k a 1 c a l a s e 2 4 l 内切 6 5 8 55 0 6 51 3 万u 克n o v o n o r d i s k t r y p s i n内切 7 5 8 53 5 4 56 7 万u 克上海生化试剂公司 k o i z y m e内切+ 外切5 5 6 5 3 00 8 万u 克n o v o n o r d i s k 木瓜蛋白酶内切 5 0 7 55 0 7 02 3 万u 克广州酶制剂厂 中性蛋白酶内切 7 54 5 5 50 4 万u 克无锡酶制剂厂 虾头蛋白酶内切 6 0 9 04 5 6 50 7 万u 克自制 5 2 2 主要实验仪器与设备 k m t d 一5 0 0 型电热恒温振荡水槽上海益恒实验仪器有限公司 ： 兰塞矍三奎耋三耋堡圭兰堡重苎 l d 4 2 型离心机 8 0 一2 b 型离心机， g l 一1 6 g i i 高速冷冻离心机 p h s 一2 c 型p h 计 7 5 1 一g 型紫外光栅可见分光光度计 n o 9 5 4 型多功能捣碎机 2 0 2 2 型电热干燥箱 f a j a 型电子分析天平 7 2 1 型分光光度计 7 8 h w 一1 型恒温磁力搅拌器 5 2 3 实验方法 北京医用离心机厂 上海安亭科学仪器总厂 上海安亭科学仪器总厂 上海虹益仪器厂 上海分析仪器厂 美国o s t e r 公司。 中华人民共和国上海市实验仪器总厂 上海精密科学仪器有限公司 中华人民共和国上海第三分析仪器厂 江苏省金坛市医疗仪器厂 5 2 3 1a c e 抑制率的测定o ” 兔肺丙酮提取物的制备：将l 克兔肺丙酮粉用l o m lp h 8 3t r i s 缓冲液溶解，于 1 3 0 0 0 r m i n 下离心2 0 分钟。酒红色的上清液具有比较高的a c e 活性，将上清液收集后 于5 保存。在用于分析前，将上清液用p h 8 3t r i s 缓冲液( p h 8 3 ) 稀释1 0 倍。取 样品0 3 m l ，加入p h 8 30 5 m l1 1 m m o l lf a p g g ，加入p h 8 30 6 m l0 8 4 m o l ln a c l ， 混和后于3 7 。c 预保温培养2 分钟，向此混和物中加入p h 8 30 3 m la c e 溶液，于3 7 。c 保温培养5 分钟，并保持反应体系p h 值( 8 卜8 3 ) ，于3 4 0n m 测定保温前和保温后 吸光率的变化。将样品改为去离子水，其它方法和步骤保持不变，即为空白实验。 d 抑制率( ) = ( 1 一兰) 1 0 0 ； 月 a ：空白实验时吸光值的下降值，b ：有抑制剂时吸光值的下降值 5 23 2t c a 可溶性蛋白含量的测定 参见2 2 3 3 的方法 5 2 3 3f o i i n 一酚法测定酶活力 参见4 2 3 3 的方法 5 2 3 4 酶解工艺 罗非鱼肉( 虾头) 一匀浆一酶解一灭酶一酶解液 5 3 结果与讨论 5 3 1 复合酶解对虾头酶解产物中a c e 抑制性的影响 4 0 ，。一 篁三兰墼堡窒塑垒呈呈垫型丝垒窒 在p h 值8 2 ，温度5 0 的反应条件下，选择不同种类的酶与虾头内源蛋白酶进 行复合酶解实验，测定t c a 可溶性蛋白含量将样品稀释2 0 倍测a c e 抑制性。在利用 虾头内源蛋白酶基础上，加入a l c a l a s e 2 4 l 、f l a v o u r z y m e 、k o j i z y m e 、木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶、t r y p s i n 和p r o t a m e x ，比较复合酶解产物a c e 抑制性，选出产物a c e 抑制性较高的酶。 图5 1酶对虾头酶解产物中t c a 可溶性蛋白含量的影响 f i g u r e5 - 1e f f e c t so fe n z y m eo nc o n t e n to ft c ad i s s o l u