地中海贫血基因诊断PPT课件.ppt

地中海贫血基因诊断,LOGO,地中海贫血,1925年,Cooley描述了一个幼儿患有贫血,并伴发有有核红细胞增多症.此后,意大利,希腊等地中海区域也陆续发现并报道类似疾病,因该病首先在地中海区域发现,因此被称为地中海贫血.(thalassemia).,“地中海贫血症”来源,地中海贫血症介绍,地中海贫血(THAC)是一种较为常见的单基因遗传性疾病，多出现在我国的南方各省，又以海南及两广沿海地区多发。其主要致病机制为珠蛋白或珠蛋白基因出现缺失或具有缺陷，从而引起血红蛋白中不同肽链出现合成比例失衡，进而导致了溶血性贫血疾病的发生。,珠蛋白基因的结构及表达,1.珠蛋白基因的结构,珠蛋白基因簇16p13,珠蛋白基因簇11p15,地中海贫血的分型,地中海贫血：根据造成人贫血病情的严重性将其分为4种类型。地中海贫血：根据造成病情的严重性分为3种类型：重型地中海贫血中间型地中海贫血轻型地中海贫血,地中海贫血(地贫)的类型,缺失一个基因尚有部分链合成者，+地贫；缺失两个基因链完全不能合成者，0地贫。,4个基因缺失珠蛋白缺失4/高氧亲和力组织严重缺氧,A.HbBarts胎儿水肿综合症,3个缺失4,B.血红蛋白H病（0/+）,高氧亲和力组织缺氧,H包涵体溶血贫血,C.标准型地中海贫血（0/A或+/+）,D.静止型地中海贫血（+/A）,重型地贫：(00、+、00)轻型地贫：(0A、0A、0A)中间型地贫：(+(高F)+(高F)、+)遗传性胎儿血红蛋白持续增多症(HbF22),珠蛋白生成障碍性贫血,A.重型地中海贫血,患者不能合成链链过剩而沉降到红细胞膜上，引起膜的性能改变，发生严重的溶血反应，引起肝脾增大。组织缺氧，促进红细胞生成素分泌，刺激骨髓增生，骨质受损变得疏松，可出现鼻塌眼肿、上颔前突、头大额隆等特殊的“地中海贫血面容”。,B.中间型地中海贫血一般是+地中海贫血基因的纯合子，患者的基因型通常为+（高F）+（高F）或+。病人的症状介于重型和轻型之间，故称为中间型。,C.轻型地中海贫血发生于0或+地中海贫血基因的杂合子，无任何临床症状。,D.遗传性胎儿血红蛋白持续增多症,HbF22遗传缺陷导致和基因表达受到抑制，而链合成却异常增高，使成人红细胞内的胎儿血红蛋白HbF持续增多。,地中海贫血的分子机制,地中海贫血的分子机制,地中海贫血的分子机制,基因缺失：缺失型地中海贫血基因突变：非缺失型地中海贫血,基因缺失基因突变,编码序列突变；转录调控序列突变（TATAbox)；RNA加工和修饰信号序列突变（GT-AG接头）,地中海贫血基因诊断,地中海贫血的基因诊断步骤,PCR扩增缺失型突变检测PCR反应条件为:95预变性5min，9845s，6630s，723min，35个循环，最后72延伸5min。非缺失型突变检测PCR反应条件为:94预变性5min，9460s，5530s，7260s，35个循环，最后72延伸5min。,基因型分析将上述PCR扩增产物与膜条100变性10min，43杂交2h以上，洗膜，加入酶标抗生物素蛋白，再次洗膜，加入酶底物显色，具体步骤按说明书进行操作。杂交及显色完成后，观察膜条上的蓝色斑点，若只有野生型探针处(N)显色，为该位点的野生纯合子;若只有突变型探针处(M)显色，为该位点的突变纯合子;若野生型探针处(N)和突变型探针处(M)均显色，为该位点的杂合子。,地中海贫血的基因诊断结果样本基因型缺失型和非缺失型地贫基因突变检测结果见图1和图2。,图1缺失型地贫基因突变检测结果,图2非缺失型地贫基因突变检测结果,地中海贫血的基因诊断步骤,PCR扩增抽取受检者EDTA抗凝血2ml，按试剂盒操作说明书提取患者DNA,在A、B两管PCR反应液中分别加入提取的DNA2ul。PCR反应条件为:93预变性5min;93变性30s,复性6030s,72延伸1min,35个循环;最后72延伸5min。,反向点杂交(reversedot-blot,RDB)将上述PCR扩增产物与膜条100变性10min,42杂交4h以上,洗膜,加入酶标抗生物素蛋白,再次洗膜,加入酶底物显色,观察结果。具体步骤按说明书进行操作。,杂交结果判定,杂交结果判定杂交膜条上结合的14种ASO探针排列顺序见表1。探针排列成3排,上排和中排分别对应8种常见突变位点的野生型(N)和突变型(M)探针,下排分别对应显色反应控制点,空白点和6种稀少突变位点的突变型(M)探针。杂交及显色完成后,显色反应控制点呈边缘清晰的蓝色圆点,否则需要重新检查杂交过程。所有的野生型(N)显色,突变型(M)不显色为正常人;某一位点的野生型(N)和突变型(M)均显色,为这一位点的杂合子;某一位点只有突变型(M)显色,野生型(N)不显色,为这一位点的突变纯合子;某两个位点的野生型(N)和突变型(M)均显色,为这两个位点的双重杂合子。,地中海贫血的基因诊断,5种突变等位基因,关于基因治疗的展望,不久的将来,人类可望在基因的分子结构上自我认识,了解人体内60兆个细胞中的约10万个基因以及它们的特征和功能,这样影响人类健康的所有疾病均能作预防基因治疗,我们期待着这一天的早日到来。,参考文献,1地中海贫血88例基因诊断结果分析2地中海贫血的基因诊断技术研究3地中海贫血诊断与基因分型4贵州